5.3 Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов чс эндогенных ретровирусов

Работа проводилась Е.В. Гогвадзе, Е.А. Стукачёвой, Е.Д. Свердловым и А. Буздиным.

На первом этапе работы были проанализированы все человек-специфические ретроэлементы HERV-K (HML-2) и для дальнейшего анализа были отобраны все LTR (13 индивидуальных ретроэлементов), расположенные в интронах известных генов человека в противоположной направлению транскрипции данного гена ориентации и удаленные от ближайшего экзона не более, чем на 5 т.п. н. (рис.9)

Рисунок 9. Схематическое изображение геномных локусов, отобранных для дальнейшего анализа, и расположение праймеров, использованных в работе.

Для каждого из исследуемых локусов были дизайнированы праймеры на экзоны, фланкирующие LTR (Gfor и Grev, рис.9), а также праймер на 3' - и 5' - концевую часть LTR. Праймеры Gfor+Grev применяли для определения уровня транскрипции гена, а Gfor+LTRfor и Gfor+LTRfor2 - для определения уровня транскрипции LTR, расположенного в интроне анализируемого гена. В качестве матрицы для ПЦР использовали первые цепи кДНК, синтезированные с помощью олиго (dT) - праймера на суммарной РНК нормальной паренхимы яичка человека и герминогенной опухоли - семиномы. Методом ОТ-ПЦР с праймерами Gfor+Grev и Gfor+LTRfor был определен уровень транскрипции исследуемых генов, а также уровень транскрипции LTR, находящегося в интроне. В результате было отобрано 9 LTR, для которых было показано, что они транскрибируются в исследуемых тканях.

Однако для того, чтобы понять, действительно ли транскрипция начинается внутри LTR, необходимо было найти 5'-конец образующейся РНК. Для этого был применен метод 5' - RACE (Rapid Amplification of cDNA ends). Схема метода и полученные результаты представлены на рисунке 10.

Для всех LTR, транскрибирующихся в нормальной паренхиме и семиноме, было проведено два раунда ПЦР с праймерами на 5' - адапторную последовательность кДНК и на ближайший к LTR экзон. В результате продукт был получен только в случае LTR, расположенного между 23 и 24 экзонами гена SLB (selective LIM binding factor, rat homolog; AC074117) и между 5 и 6 экзонами гена SLC (solute carrier family 4; AC027750). Эти продукты были отсеквенированы и оказалось, что точка начала транскрипции находится внутри LTR на границе R и U5 областей (826 нуклеотид консенсусной последовательности человек-специфического LTR), что совпадает с полученными нами ранее данными о точке начала транскрипции LTR семейства HERV-K. Таким образом, было показано, что из 13 человек-специфических LTR, расположенных в интронах известных генов в противоположной направлению транскрипции гена ориентации и удаленных от ближайшего экзона не более чем на 5 т.п. н., только 2 служат промоторами для транскриптов, перекрывающихся с экзонами клеточного гена. В дальнейшем проводился анализ только двух данных локусов.

Рисунок 2.4.2. Поиск точки начала транскрипции внутри изучаемых LTR.

(А) Схема метода 5'-RACE. В качестве матрицы используются первые цепи кДНК, синтезированные с использованием «cap-switch» эффекта. На первой стадии проводят ПЦР с супрессионным адаптором А1, внутренняя часть которого комплементарна олигонуклеотиду, использованному при синтезе кДНК, и праймером на известную последовательность гена (Gfor1) (в данном случае, на последовательность близлежащего к LTR экзона); положительный контроль проводят для проверки работы праймера на кДНК. Во втором раунде ПЦР используется супрессионный адаптор А2, внутренняя часть которого комплементарна внешней части праймера А1, и заглубленный праймер на экзон (Gfor2); отрицательный контроль проводится с использованием только праймера А2 для проверки качества работы супрессионных адапторов.

(Б) Результаты 5'-RACE для LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC.

Для более полной характеристики этих двух случаев был определен уровень транскрипции генов SLB и SLC, а также находящихся в них LTR для еще десяти тканей человека: скелетной мышцы, печени, сердца, легкого (нормы и опухоли), гиппокампа и эмбриональных тканей мозга (лобной доли, затылочной коры, базальных ядер и гипоталамуса). Транскрипционная активность LTR, находящегося в интроне гена SLC, была показана только для нормальной паренхимы яичка, семиномы и эмбриональных затылочной коры, гипоталамуса и лобной доли. Причем во всех случаях уровень транскрипции LTR был ниже уровня транскрипции гена.

Транскрипт LTR, находящегося между 23 и 24 экзонами гена SLB, был найден во всех проанализированных тканях кроме нормальной ткани легкого. В большинстве случаев, как и для LTR в гене SLC, уровень транскрипции LTR оказался в 4-8 раз ниже уровня транскрипции гена (эмбриональные лобная доля и гипоталамус, печень, лёгкое (опухоль) и гиппокамп). В случае эмбриональных базальных ядер и затылочной коры LTR и ген транскрибируются на одном уровне. Для скелетной мышцы, сердца, паренхимы яичка и семиномы был показан более высокий уровень транскрипции LTR по сравнению с геном. Особого интереса заслуживает нормальная паренхима яичка, в которой LTR транскрибируется в 16 раз интенсивнее гена.

Для доказательства того, что во всех случаях мы имеем дело именно с транскриптами, комплементарными РНК гена, был проведен синтез первых цепей кДНК с праймером, избирательно связывающимся с антисмысловыми к гену РНК. После этого была поставлена ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor и Gfor. Во всех случаях ПЦР-продукт получался на тех же циклах, как и при амплификации кДНК, синтезированной с oligo (dT) - праймером. Следовательно, найденные нами ранее транскрипты LTR действительно являются антисмысловыми к гену. А для доказательства того, что транскрипция антисмысловых РНК начинается внутри LTR, были поставлены ОТ-ПЦР с праймерами на 5' - конец LTR (LTRfor2) и на экзон анализируемого гена (Gfor). В большинстве случаев продукт не детектировался или же появлялся на значительно более поздних циклах, из чего следует, что промотором для антисмысловых транскриптов в этих случаях действительно служит 3'-конец LTR.

После этого была предпринята попытка определить 3'-конец транскриптов, начинающихся в LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC. Нам не удалось получить необходимые результаты с помощью метода 3'-RACE, поэтому мы решили провести ОТ-ПЦР с праймером на 3'-конец LTR и серией праймеров, постепенно удаляющихся от LTR.

В результате серии ОТ-ПЦР было показано, что в случае гена SLB существует, по крайней мере, 2 типа транскриптов: один включает в себя только экзон 23 (транскрипт 1), а второй - экзоны 23 и 22 (транскрипт 2) (рис.11). Интересно отметить, что "длинный" транскрипт был найден только в нормальной паренхиме яичка, для которой была показана значительно большая активность LTR по сравнению с геном. В случае гена SLC 3'-конец транскрипта найден не был, но было определено, что весь экзон 5 входит в его состав (транскрипт 3).

Рисунок 11. Схематическое изображение транскрипционно активных LTR в интронах генов SLB и SLC и типы транскриптов, образующихся с промотора LTR.

На следующем этапе работы необходимо было определить, могут ли найденные транскрипты оказывать влияние на экспрессию соответствующих клеточных генов. Для этого предполагалось получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие изучаемые транскрипты, и посмотреть, изменяется ли в этих клетках уровень транскрипции генов SLB и SLC.

Нами был проведен скрининг 8 клеточных линий человека и для дальнейшего анализа были отобраны линии Tera-1 и NGP127, для которых был показан наиболее высокий уровень транскрипции генов SLB и SLC.

На основе плазмиды pcDNA3.1 Hygro - были созданы три конструкции, каждая из которых содержала под контролем конститутивного цитомегаловирусного промотора (Pcmv) участок ДНК, соответствующий найденным в работе LTR-транскриптам (рис 12). Этими конструкциями были трансфицированы клетки Tera-1 и NGP127 и в результате получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие интересующие нас транскрипты. Для каждой клеточной линии было проведено четыре трансфекции: 3 опытные (плазмидами, содержащими вставку соответствующего транскрипта) и 1 контрольная (плазмидой без вставки).

Рисунок 12. Схематическое изображение плазмид, использованных для трансфекции клеточных линий NGP127 и Tera-1.

Фрагмент ДНК, соответствующий анализируемому транскрипту, был помещен в плазмиду pcDNA 3.1 Hygro- между промотором цитомегаловируса (PCMV) и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста (BGHpA). Стрелками внутри экзонов показано направление транскрипции генов SLB (плазмиды 1 и 2) и SLC (плазмида 3). В случае успешной интеграции плазмиды 1 в ДНК NGP127/Tera-1 получалась клеточная линия, стабильно экспрессирующая траскрипт 1 (см рис25); интеграция плазмиды 2 приводила к стабильной экспрессии транскрипта 2, а плазмиды 3 - к стабильной экспрессии транскрипта 3. Плазмида 4 - контрольная конструкция, не содержащая вставки. Трансформанты отбирались на среде с антибиотиком гигромицином.

В результате опытов по трансфекции, мы получили 4 линии клеток NGP127 (NGP127-1 - клетки, стабильно экспрессирующие транскрипт 1, NGP127-2 - стабильно экспрессирующие транскрипт 2, NGP127-3 - стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и NGP127-К - контрольные клетки, транфицированные плазмидой без вставки) и 4 линии клеток Tera-1 (Tera1-1-3 - стабильно экспрессирующие транскрипты 1-3, соответственно) и Tera1-K (контрольные клетки). Из всех клеточных линий была выделена РНК, методом ОТ-ПЦР показана эксперессия изучаемых LTR-транскриптов в полученных линиях клеток и определён её уровень, после чего проводили ОТ-ПЦР в реальном времени для определения уровня экспрессии генов SLB и SLC. Результаты ПЦР представлены в таблице 1.

Таблица 1. Уровень транскрипции генов SLB и SLC в клеточных линиях NGP127 и Tera1, стабильно экспрессирующих антисмысловые к гену транскрипты.

В случае клеточной линии NGP не было выявлено статистически достоверного изменения уровня транскрипции генов SLB и SLC в опытных клетках по сравнению с контрольными. В данных клетках антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR не регулируют транскрипцию соответствующих клеточных генов. Возможно, это связано с нарушением процессов РНК-интерференции в данной клеточной линии. В случае же линии Tera1 было показано уменьшение количества РНК SLB в клетках, экспрессирующих транскрипт 1 (транскрипт, включающий только экзон 23 гена SLB) в 2,6 раза по сравнению с контрольными клетками (Pvalue<0,01), а также снижение уровня мРНК гена SLC в клетках, экспрессирующих транскрипты 2 и 3, в 2,5 и в 2,9 раз, соответственно.

Таким образом, можно сделать вывод, что антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR, могут уменьшать уровень транскрипции соответствующего клеточного гена (как было показано для клеток Tera-1).

6. Новое семейство химерных ретроэлементов эукариот

Неожиданным результатом анализа библиотеки чс внедрений L1 стало открытие нового семейства ретроэлементов, образованных при происходящей in vivo РНК-рекомбинации в ходе обратной транскрипции. Упомянутый механизм образования ретроэлементов впервые предложен в ходе данной работы.

В ходе анализа полученной с помощью TGDA библиотеки чс L1-фланкирующих последовательностей, был найден клон, соответствовавший внедрению ретроэлемента необычной структуры. Последовательность вставки была гомологична геномной ДНК человека хромосомного локуса 10p13 (код доступа в GenBank AL138764). Ретроэлемент представлял собой химеру полной копии U6 малой ядерной (мя) РНК с 3'-концевой частью L1. Её 5'-часть является полноразмерной последовательностью U6 мяРНК длиной 107 пн, 100% идентичная консенсусной последовательности человеческой U6 (взята из базы данных RepBase Update, http://www.girinst.org/server/RepBase/). Сразу за U6 следует 3' - концевая последовательность элемента L1 семейства L1Hs в прямой ориентации длиной 1324 пн. На своём 3' - конце эта последовательность несёт поли-А “хвост” длиной 40 пн. Химерный ретротранскрипт фланкирован прямыми повторами длиной 20 пн. Гексануклеотид TTAAAA, расположенный на 22 пн выше сайта интеграции U6-L1, идентичен последовательности T₂A_4, которую предпочтительно узнаёт эндонуклеаза L1 (L1-EN), инициирующая интеграцию L1 копий в соответствующие сайты генома.

Предпринятый поиск в геномных базах данных человека выявил 56 химерных ретротранскрипта, сходных с вышеупомянутым. Все химеры U6-3'-L1 фланкированы прямыми повторами длиной 11-21 пн, что свидетельствует об интеграции химеры как единой последовательности. Все они имели рядом со своими 5' - концами либо гексануклеотид TTAAAA, либо его производные с однонуклеотидными заменами A/G либо T/C. Перечисленные выше особенности сайтов интеграции химер свидетельствуют о том, что их внедрения в геном были произведены интеграционным аппаратом ретротранспозонов L1.

Образование химер происходило вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории человека, поскольку некоторые интеграции U6-L1 уникальны для генома человека. Кроме того, по крайней мере одна интеграция химеры U6-L1 является полиморфной в человеческой популяции.

Другие химерные ретроэлементы. Для того, чтобы понять, является ли случай U6-L1 уникальным примером, мы провели анализ геномных баз данных с целью поиска новых химер, образованных фрагментами других псевдогенов. Для этого в геноме человека были идентифицированы 735 псевдогенов наиболее часто встречающихся типов, дивергировавшие от своих консенсусных последовательностей от 0 до 10%, и для них был проведён детальный структурный анализ.

Было установлено, что химерные ретротранскрипты, напоминающие U6-L1, могут образовываться и из других транскрибируемых компонентов генома. Затем поиск химерных ретроэлементов провели для всех опубликованных геномных последовательностей. При этом двухчастные структуры, аналогичные вышеописанным (Рис.13), обнаружили во всех геномах млекопитающих, а также в геноме одного паразитического нитчатого гриба: в сумме в ДНК человека, мыши, крысы и гриба Magnaporthe grisea нашли 82, 116, 66 и 31 химеру, соответственно (Табл.2). Химеры состоят из ДНК копий клеточных транскриптов, либо непосредственно объединённых друг с другом, либо, чаще, объединённых с 3'-концевой частью ретроэлементов, относящихся к LINE (например, L1). Клеточные транскрипты, соответствующие химерам, относятся к мРНК белок-кодирующих генов, рибосомным РНК, малым ядерным РНК, а также 7SL RNA (Табл.2).

Рисунок 13. Схема двухчастных химерных ретроэлементов, найденных в геномах эукариот. Вставки в геномах млекопитающих расположены ниже мотива TTAAAA. Вставки в геномах млекопитающих и гриба содержат поли (А) последовательность или А-богатый микросателлит и фланкированы прямыми повторами геномной ДНК длиной 10-25 пар нуклеотидов.

Таблица 2. Сопоставление 5' - и 3'-концевых частей химерных ретроэлементов млекопитающих с известными последовательностями РНК.

^aНазвания клеточных транскриптов, соответствующих данной части химеры. Компоненты химер из генома гриба M. grisea не указаны, поскольку функция и локализация РНК WEIRD остаются неизвестными.

^bКоличество и доля последовательностей данного типа среди химер.

^cФункция соответствующих РНК в клетке.

Для химер характерны следующие общие свойства: (1) их 5'-концевые части являются полноразмерными копиями клеточных РНК; (2) 3'-части химер - это 5'-укороченные копии соответствующих РНК (в основном LINE); (3) обе части объединены в одной и той же ориентации относительно направления транскрипции; (4) химеры несут поли (A) хвост или А-богатый микросателлит на 3' конце, (5) химеры фланкированы короткими прямыми повторами геномной ДНК пре-интеграционного сайта.

Последняя особенность подчёркивает, что эти элементы внедрялись в геном уже в виде двухчастных ДНК-копий. Все химеры млекопитающих несли выше 5' конца гексануклеотид T₂A₄ или его варианты, что соответствует последовательности T₂A_4. Одновременность интеграций обеих частей химер была затем подтверждена в ходе экспериментов, основанных на исследовании эволюционного инсерционного полиморфизма.

Важно отметить, что создающий химеры механизм часто объединяет функциональные копии клеточных транскриптов, часто не имеющих ничего общего с мобильными элементами. Многие химеры можно рассматривать как новые гены, поскольку они транскрибируются, причём некоторые из них - тканеспецифически.

По-видимому, все химерные ретроэлементы были созданы по механизму, включающему смену матрицы при обратной транскрипции. Хотя основной энзиматической активностью обратной транскриптазы (ОТ) является синтез кДНК на неизменной матрице РНК, ОТ также способна к смене матриц в ходе обратной транскрипции. Например, известно, что "прыжки" ОТ ретровирусов с одного сайта матричной РНК на другой необходимы для образования LTR.

Вцелом, данные анализа геномов, эволюционных исследований, а также экспериментальные доказательства, убедительно свидетельствуют, что смена РНК-матриц может проходить в ходе обратной транскрипции LINE. Нам удалось найти соответствующие химеры во всех геномах млекопитающих, но не в ДНК амфибий, рыб и беспозвоночных. Однако же, химерные элементы были найдены в геноме гриба-паразита риса Magnaporthe grisea, что говорит о консервативности этого механизма среди представителей царств животных и грибов.

Некоторые особенности химерных ретроэлементов грибов