Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов

03.00.07 - Микробиология

Белимов Андрей Алексеевич

Санкт-Петербург - 2008

1. Общая характеристика диссертации

Актуальность темы

Увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, эффективное и ограниченное использование удобрений и средств защиты растений, а также повышение устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным агроклиматическим условиям и антропогенным воздействиям являются актуальными для сельского хозяйства, а также для решения экологических проблем и охраны окружающей среды. Данные вопросы привлекают внимание многих ученых, работающих в различных областях науки: растениеводстве, почвоведении, агрономии, агрохимии, экологии, микробиологии и других. Особенно важными для решения этих задач являются микробиологические подходы и приемы, которые основаны на использовании потенциала растений и почвенных микроорганизмов, и биологических механизмов взаимодействия компонентов растительно-микробных систем. Известно, что почвенные микроорганизмы активно взаимодействуют с растениями и могут оказывать как положительные, так и отрицательные эффекты на их рост и питание. В настоящее время накоплен большой материал о механизмах положительных воздействий ассоциативных ризосферных бактерий на растения. К таким механизмам относятся фиксация атмосферного азота, продуцирование биологически активных веществ, активизация потребления корнями питательных элементов, биоконтроль фитопатогенов и индуцирование системной устойчивости растений.

Основываясь на знаниях о взаимодействии растительно-бактериальных ассоциаций и примерах улучшения роста и питания растений посредством инокуляции полезными формами микроорганизмов, нами была изучена роль некоторых биотических и абиотических факторов в растительно-бактериальных взаимодействиях и оценена возможность применения ассоциативных бактерий для повышения устойчивости растений к различным стрессовым факторам. Основными предпосылками проведенных исследований были следующие рассуждения. Во-первых, растения, находясь в неблагоприятных условиях среды или атакуемые патогенными микроорганизмами, нуждаются в дополнительных ресурсах питания и энергии, оптимизации гормонального статуса, и снижения интенсивности воздействия стрессоров. Во-вторых, перечисленные выше положительные эффекты ассоциативных бактерий затрагивают именно те процессы метаболизма растений и их взаимодействия с окружающей средой, которые нарушаются при стрессе. Поэтому логично предположить, что бактериальные эффекты потенциально ориентированы против негативных воздействий стрессоров и могут быть особенно важны для растений именно в неблагоприятных условиях. В-третьих, растительно-микробные ассоциации являются надорганизменными системами, обладающими новыми и уникальными качествами, и это может существенно влиять на адаптацию партнеров к стрессовым факторам и повышать уровень гомеостаза самой ассоциации.

Цели и задачи исследований

Основной целью проведенных исследований являлось получение новых знаний о механизмах взаимодействия растений с полезными формами почвенных микроорганизмов в зависимости от биотических факторов, обусловленных активностью и взаимодействием ризосферных бактерий, и условий внешней среды, которые проявляются как абиотические стрессы. С одной стороны, представлялось важным оценить влияние внешних биотических и биотических факторов на взаимодействие растительно-бактериальных ассоциаций, а с другой стороны, изучить роль ассоциативных бактерий в адаптации растений к стрессам.

Особое внимание уделялось изучению преимуществ, которые растения получают при образовании эффективных ассоциаций с полезными микроорганизмами для противостояния негативным воздействиям окружающей среды, и механизмов интеграции растений с микроорганизмами в ризосфере в зависимости от внешних условий. Получение таких знаний направлено на раскрытие значения микробных ассоциаций и взаимодействий бактерий в ризосфере для роста и питания растений, а также на обоснование и эффективное использование потенциала микроорганизмов в их способности повышать устойчивость растений к стрессовым факторам.

Конкретные задачи исследований состояли в следующем:

1. Изучить взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий в питательных средах и ризосфере, а также оценить их влияние на рост и питание растений при совместной интродукции на семена. Описать аддитивные эффекты и механизмы взаимодействия ассоциаций азотфиксирующих и фосфатмобилизующих штаммов с растениями.

2. Выделить и охарактеризовать группу бактерий, доминирующих в ризосфере проростков растений, по их влиянию на рост растений и коллекционных штаммов ростстимулирующих бактерий. Оценить значение фактора взаимодействия производственных штаммов ассоциативных бактерий с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы ячменя.

3. На основе принципа популяционного доминирования бактерий в ризосфере проростков провести селекцию эффективных ростстимулирующих штаммов. Рассмотреть колонизирующую активность интродуцируемых штаммов как фактор, влияющий на эффективности инокуляции.

4. Выделить и изучить штаммы бактерий, активно колонизирующие ризосферу гороха и горчицы сарептской и обладающих АЦК-деаминазной активностью, которая рассматривается как важный механизм стимуляции роста растений в стрессовых условиях.

5. Изучить влияние производственных штаммов и вновь выделенных АЦК-утилизирующих штаммов на устойчивость растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами. Оценить воздействие бактерий на аккумуляцию токсичных и питательных элементов.

6. Показать зависимость эффективности инокуляции бактериями, содержащими АЦК деаминазу, от обеспеченности растений питательными элементами. Изучить влияние уровня минерального питания растений на гомеостаз растительно-бактериальных ассоциаций.

7. Оценить эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами ассоциативных бактерий при стрессах, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, а именно экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы и засухой.

8. Изучить роль фермента АЦК деаминазы в реакции растений гороха и томатов на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в условиях дефицита почвенной влаги.

Научная новизна

В работе использованы оригинальные подходы для изучения взаимодействия штаммов ассоциативных бактерий друг с другом и с аборигенной ризосферной микрофлорой. С одной стороны это позволило экспериментально продемонстрировать важность популяционных отношений интродуцируемых бактерий для проявления их ростстимурирующих эффектов на растение, а с другой стороны дало новую информацию о причинах нестабильности эффектов интродуцентов или искажения ожидаемой реакции растения на инокуляцию. Впервые проведены детальные исследования поведения ассоциативных бактерий в ризосфере в стрессовых условиях, вызванных различными почвенно-климатическими факторами, что внесло вклад в понимание динамики интродуцируемых бактериальных популяций и роли партнеров в формировании растительно-бактериальных ассоциаций в зависимости от условий среды.

Новизной обладают методические приемы селекции и результаты исследований ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу. Изучение функционирования ассоциаций ризосферных бактерий с растениями в стрессовых условиях позволило получить уникальную информацию об устойчивости и механизмах интеграции компонентов таких растительно-микробных систем.

Ниже перечислены наблюдения, закономерности или методические приемы, которые были установлены или разработаны в ходе исследований:

1. Выявлена бинарная ассоциация производственных штаммов Azospirillum lipoferum 137 и Agrobacterium radiobacter 10, в которой азоспириллы активнее фиксируют азот и лучше приживаются на корнях растений. Впервые показано, что проявление симбиотических свойств партнеров ассоциации азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий в ризосфере может быть важным механизмом усиления положительного эффекта интродуцентов на рост растений.

2. Впервые, с использованием метода изотопной индикации, установлено, что фосфатмобилизующие бактерии способны улучшать фосфорное питание растений за счет активизации поглощения фосфорного удобрения. Получены оригинальные результаты показавшие, что проявление аддитивного эффекта совместной инокуляции растений бактериями Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 связано с индивидуальными особенностями механизмов воздействия этих штаммов на азотное и фосфорное питание растения. Образование данной растительно-бактериальной системы приводит к повышению коэффициента использования растениями азотного и фосфорного удобрения.

3. Впервые изучена динамика численности производственных штаммов ростстимулирующих бактерий в ризосфере различных сельскохозяйственных культур и почве. Показано, что штаммы активно колонизируют корни в различных почвенно-климатических условиях, в том числе при выращивании растений на загрязненных и кислых почвах, а также в условиях засухи. Обнаружены индивидуальные особенности штаммов, обусловленные генетическим контролем способности интродуцентов поддерживать численность популяции в ризосфере на определенном уровне.

4. Получены оригинальные данные о важности взаимодействия интродуцируемых штаммов с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы растений. Впервые выделена и охарактеризована ассоциация ростстимулирующего интродуцента с фитопатогенным видом бактерий и описана способность биоконтрольных интродуцентов ингибировать активность полезных форм аборигенных бактерий.

5. Предложен метод селекции эффективных штаммов ростстимулирующих бактерий, обладающих высокой степенью ассоциативности, которая проявляется в их способности активно колонизировать корни проростков растений в нестерильной почве. Были изучены свойства и влияние на растения представителей сообществ культурабельных бактерий, доминирующих на корнях проростков ячменя, гороха и горчицы сатептской при выращивании растений на различных почвах, в том числе на загрязненных металлами почвах, на осадках сточных вод и горных отвалах. В результате исследований отселектированы штаммы с высоким потенциалом колонизации ризосферы, которые не уступают производственным штаммам по ростстимулирующей активности.

6. Впервые выделены и детально охарактеризованы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и колонизирующие ризосферу проростков растений, выращенных на загрязненных почвах. У большинства видов выделенных нами бактерий присутствие АЦК деаминазы ранее не было описано.

7. Впервые показано, что производственные штаммы ризобактерий и выделенные в ходе работы АЦК-утилизирующие бактерии повышают устойчивость инокулированных растений к токсичности кадмия и свинца. Важным механизмом ростстимулирующего эффекта бактерий на растения в присутствие тяжелых металлов является их способность поддерживать нормальное минеральное питание растений, и этим противодействовать негативному действию токсикантов.

8. Проведены оригинальные исследования о зависимости взаимодействия АЦК-утилизирующих бактерий с растениями от уровня минерального питания. Показано, что ростстимулирующий эффект бактерий может нивелироваться при дефиците фосфора и избытке азота в среде.

9. Экспериментально обоснована способность производственных штаммов ассоциативных бактерий повышать устойчивость инокулированных растений к негативному действию стрессов, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, такими как экстремальные температуры, повышенная кислотность почвы и засуха.

10. Впервые с помощью бактериального мутанта с пониженной активностью АЦК деаминазы и химических ингибиторов фитогормона этилена показана важная роль этого фермента в повышении устойчивости инокулированных растений к дефициту почвенной влаги.

11. Впервые описано положительное действие бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на образование симбиоза бобового растения с клубеньковыми бактериями при дефиците влаги. Совместная инокуляция гороха этими бактериями существенно повышала количество клубеньков на корнях, как в оптимальных, так и в стрессовых условиях, вызванных недостаточным увлажнением.

12. Впервые изучен эффект бактериальной АЦК деаминазы на транспорт сигнальных молекул АЦК и абсцизовой кислоты (АБК) из корня в побег. Снижение концентрации АЦК и повышение концентрации АБК в ксилемном соке при инокуляции в условиях засухи указывает на индукцию бактериями системной устойчивости у растений.

13. Впервые обнаружено стимулирующее воздействие АЦК-утилизирующих бактерий на развитие корневых волосков у инокулированных растений.

Практическая ценность

Исследования имеют важное практическое значение для развития экологически безопасного и ресурсосберегающего сельскохозяйственного производства и поиска путей решения ряда экологических проблем:

1. Выделенные штаммы ростстимулирующих ассоциативных бактерий, которые являются активными колонизаторами корней и оказывают положительное действие на рост и минеральное питание растений, представляют собой ценный биологический ресурс для проведения прикладных исследований в земледелии. Штаммы АЦК-утилизирующих бактерий служат перспективными объектами для создания биопрепаратов нового типа, обладающих специализированным антистрессовым эффектом на растения и эффективных в неблагоприятных условиях, вызванных почвенно-климатическими и антропогенными факторами.

2. Экспериментальные данные о воздействиях производственных штаммов на растения и колонизации ризосферы интродуцентами обосновывают возможности эффективного применения биопрепаратов в широком диапазоне варьирования почвенно-климатических факторов, а том числе при стрессах, вызванных экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы, засухой и токсичностью тяжелых металлов.

3. Ряд наблюдений и выявленных закономерностей могут быть использованы в качестве практических рекомендаций для разработки и эффективному применению микробных биопрепаратов в сельском хозяйстве. Например, целесообразность использования комбинаций нескольких штаммов интродуцентов и селекции штаммов с высокой «буферностью» и эврибионтностью популяции, зависимость эффективности инокуляции АЦК-утилизирующими ризобактериями от уровня минерального питания растений, а также необходимость учета микробных взаимодействий в ризосфере при интерпретации данных о реакции растений на инокуляцию.

4. Результаты исследований важны для создания устойчивых к стрессам и высокопродуктивных растительно-микробных ассоциаций и ризосферных микробных сообществ, используемых в технологиях фиторемедиации загрязненных почв и восстановления нарушенных экосистем.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции «Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве» (Чернигов, 1987), на VIII Всесоюзном Баховском Коллоквиуме (Кобулети, 1988), на Всесоюзном совещании «Проблема азота в интенсивном земледелии» (Краснообск, 1990), на V Международном симпозиуме по несимбиотической азотфиксации (Florence, 1990), на Всесоюзных конференциях "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирск, 1990) и "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме (Москва, 1995), на Международных конференциях «Nitrogen fixation with Non-Legumes» (Giza, 1994), «The 1-st European Nitrogen Fixation Confference» (Szeget, 1994), "BIOTECHNOLOGY St.Petersburg' 94" (С.-Петербург, 1994), «BNF Associated with Rice» (Dhaka, 1994), «The 6-th International Symposium AABNF» (Herare, 1994), «Workshop on Associative Interactions of NF Bacteria with Plants» (Саратов, 1995), The 10-th International Congress «Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications» (С.-Петербург, 1995), «BNF with Non-Legumes» (Faisalabad, 1996), «Роль России и Сибири в развитии экологии на пороге XXI века» (Омск, 1997), «The 3-rd European Nitrogen Fixation Conference» (Lunteren, 1998), «New Approaches and Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses» (С.-Петербург, 2000), «Tagungsband of the German Botanical Society» (Jena, 2000), «Trace Elements in Medicine» (С.-Петербург, 2002), «The 11-th International MPMI Congress» (С.-Петербург, 2003), «The 4-th International Crop Science Congress» (Brisbane, 2004), «Irrigation of Horticultural Crops» (Mildura, 2006), «Annual Main Meeting of the Society for Experimental Biology» (Glasgow, 2007), «Abiotic stress in legumes» (Tunis, 2007), и на Всероссийской конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск, 1996).

Исследования проводились в лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ГНУ ВНИИСХМ. Автор представлял результаты на семинарах в Санкт-Петербургском Аграрном Университете, ИБФРМ РАН (Саратов), университетах городов Вюрцбурга и Белефельда (Германия), Ватерлоо (Канада), Тегерана (Иран), Хитоцубаши, Мацуяма, Кобе и Киото (Япония), Сассари (Италия) и Ланкастера (Великобритания). Часть исследований выполнена в сотрудничестве с вышеперечисленными организациями, а также с Сибирским НИИСХ (г. Омск), Краснодарским ВНИИСХ, НИИОЗМСХ и ВНИИ овощеводства (г. Тирасполь), ВНИИМЗ (г. Тверь) и Агрофизическим НИИ (г. Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 печатных работ, из которых 11 статей в международных рецензируемых журналах, 9 статей в отечественных рецензируемых журналах, 12 статей в сборниках и трудах конференций, и 26 тезисов докладов на конференциях.

бактерия ростстимулирующий абиотический стресс

2. Содержание диссертации

1. Обзор литературы

В аналитическом обзоре литературы излагаются современные представления о научных достижениях и проблемах относящихся к теме проведенных исследований, а именно: (1) ризосфере как зоне взаимодействия растений и микроорганизмов; (2) механизмах положительных эффектов ассоциативных бактерий на растения; (3) взаимодействию растений с бактериями, содержащими фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (4) эффективности инокуляции растений смешанными культурами бактерий; (5) взаимодействию интродуцируемых бактерий с ризосферной микрофлорой; (6) колонизации корней ассоциативными бактериями; (7) устойчивости почвенных бактерий к неблагоприятным факторам среды; (8) взаимодействию ассоциативных бактерий и растений в стрессовых условиях.

2. Объекты и методы исследований

Основными объектами исследований являлись: (1) производственные штаммы ассоциативных ростстимулирующих бактерий Azospirillum lipoferum 137, Arthrobacter mysorens 7, Agrobacterium radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30, на основе которых во ВНИИСХМ разработаны биопрепараты комплексного действия (Хотянович, 1991); (2) выделенные из ризосферы ячменя штаммы Arthrobacter sp. ДР12 и Sinorhizobium sp. ДР65 (Белимов и др., 1999); (3) выделенные из ризосферы гороха и горчицы сарептской штаммы, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (Табл. 4). Растительными объектами служили важные сельскохозяйственные культуры: ячмень, горох, рапс, томаты и горчица сарептская.

В работе предложены оригинальные среды для выделения и изучения свойств бактерий: среда РЕ на основе экстрактов растений (Belimov et al., 2001), среда SMC для селекции бактерий утилизирующих АЦК в качестве источника углерода (Belimov et al., 2005) и среда РТМ с пониженным образованием комплексных соединений тяжелых металлов (Белимов и др., 1998). Детально описан предложенный автором метод изоляции ризобактерий из ризосферы проростков растений. Штаммы идентифицировали методами секвенирования гена 16S рРНК (Bulat et al., 1998; Preisfeld et al. 2000) и нумерической таксономии (Hold et al., 1994; Звягинцев, 1991). Активность АЦК деаминазы у бактерий определяли биохимическими методами (Jacobson et al., 1994; Saleh and Glick, 2001). Продуцирование индолов бактериями определяли с помощью реактива Сальковского (Libbert and Risch, 1969). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Hardy et al., 1973; Умаров, 1986). Продуцирование этилена бактериями определяли методом газовой хроматографии, а продуцирование сидерофоров - колориметрически (Schwyn and Neilands, 1987). Цитокининовую активность определяли по методу Кулаевой (Кулаева, 1973). Содержание белка в бактериях определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам и алюминию, а также иммобилизацию кадмия бактериями изучали в периодических культурах по оригинальным методикам (Белимов и др., 1998, 2004). Бактериостатическую активность метаболитов бактерий изучали методом агаровых пластинок (Ковров и др., 1981). Дефектные по активности АЦК деаминазы мутанты V. paradoxus 5C-2M4 и P. brassicacearum Am3Т8-1 получали методом транспозонного мутагенеза с последующей отрицательной селекцией при росте клонов на средах с АЦК (Belimov et al., 2007). Динамику численности бактерий в ризосфере и почве определяли методом интродукции устойчивых к рифампицину и стрептомицину мутантов (Звягинцев 1991) и с помощью вариантов маркированных геном GFP (Suarez et al., 1997). Использовали различные гнотобиотические растительно-бактериальные системы: модифицированные ростовые мешочки по методу Глика (Glick et al., 1997), систему Возняковской с фильтровальной бумагой (Возняковская, 1969) и ее модификацию (Belimov et al., 2001), и оригинальную cистему с агарозной средой (не опубликовано). Влияние бактерий на устойчивость ячменя к Н⁺ и Al⁺³ оценивали в условиях гидропоники (Климашевский 1988).

Были проведены вегетационные опыты, в большинстве которых семена инокулировали суспензиями 3-суточных культур бактерий в количестве 10⁷ кл./семя одновременно с посевом. Семена поверхностно стерилизовали 30% Н₂О₂, этиловым спиртом, конц. H₂SO₄, или 5% Na-гипохлоритом, в зависимости от эксперимента. Как правило, использовали 5-кратную повторность вегетационных сосудов на вариант. В опытах с горохом использовали клубеньковые бактерии R. leguminosarum bv. viciae 1026. Полевые опыты проводили на базе Краснодарского НИИСХ, ВНИИМЗ (г. Тверь) и СибНИИСХ (г. Омск). Растения выращивали по стандартным технологиям, принятым в регионах проведения экспериментов. Использовали бактериальные препараты, которые приготавливали и применяли в соответствии с рекомендациями Хотяновича (1991). Условия проведения, время и дизайн опытов, а также характеристика почв подробно описаны в диссертации. Потребление растениями азотных удобрений изучали методом разведения изотопа ¹⁵N (Rennie and Rennie, 1983; Соколов, 1975). Поступление в растения фосфорных удобрений изучали с помощью изотопа ³³Р (Соколов и Сердобольский, 1954). Содержание ортофосфата (P_i) в растениях определяли методом жидкостной хроматографии. Для изучения элементного состава растений и почв использовали методы Къельдаля, эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, рентгено-флуоресцентного анализа, атомно-абсорбционной спектрофотометрии и пламенной фотометрии. Ксилемный сок из побегов гороха получали по методу Borel and Simonneau (2002), концентрацию АЦК определяли методом газовой хроматографии-массспектрометрии (Birkemeyer et al., 2003), а содержание АБК определяли методом радио-имуннного анализа (Quarrie et al., 1988).

Математические анализы выполнены с помощью программы STATISTICA V-6 (StatSoft, Inc. [1995], USA) в соответствии с рекомендациями Доспехова (1985), Лакина (1990) и Sokal and Sneath (1963).

3. Значение взаимодействия ассоциативных бактерий в ризосфере для эффективности инокуляции растений

3.1 Ассоциации интродуцируемых бактерий, обладающих аддитивным эффектом на питание и рост растений

Целью исследований являлось оценить влияние совместной интродукции производственных штаммов ризобактерий на растения и изучить взаимодействие интродуцентов как дополнительный фактор эффективности инокуляции. На первых этапах работы, результаты которой частично опубликованы (Белимов и Кожемяков, 1988; Белимов, 1990; Belimov et al., 1995), были использованы разные штаммы бактерий и их комбинации, а также различные виды растений. Наиболее интересные результаты были получены со штаммами Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10, которые были известны соответственно как азотфиксатор (Васюк, 1989) и мобилизатор фосфатов (Павлова и Горская, 1987). Установлено, что Ag. radiobacter 10 стимулирует нитрогеназную активность (Табл. 1) и рост штамма Az. lipoferum 137 при совместном культивировании. Вероятными механизмами положительного взаимодействия бактерий являлись потребление агробактериями избытка кислорода и стабилизация рН среды. Повышение нитрогеназной активности (Табл. 1) и приживаемости азоспирилл в ризосфере наблюдалось при инокуляции ячменя смесью штаммов.

Таблица 1. Взаимодействие штаммов Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10, и их влияние на потребление ячменем азотного и фосфорного удобрений

^А Измерения проводили в фазу выхода в трубку. ^Б Сумма зерна и соломы зрелых растений. ^В Побеги в фазу выхода в трубку. Разные латинские буквы указывают на существенное различие по критерию Фишера при Р < 0,05.

Оба штамма были способны активно колонизировать корни растений и поддерживать относительно высокую численность популяции (10⁵ч10⁶ кл./г корней) в течение всего периода вегетации растений. Инокуляция ячменя смесью Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 оказывала максимальный эффект на массу зерна, а в некоторых случаях урожай был существенно выше по сравнению с вариантами инокуляций отдельными штаммами. У инокулированных растений повышались эффективность использования азотного удобрения (Табл. 1). Помимо способности Ag. radiobacter 10 растворять труднодоступные фосфаты, важную роль во взаимодействии этого штамма с растением играет стимуляция потребления фосфора из удобрений (Табл. 1).

Однако Az. lipoferum 137 не влиял на фосфорное питание растений, и не являлся мобилизатором фосфатов (Белимов и др., 1999). Полученные данные указывают на различия в механизмах воздействия данных штаммов на растения, что приводит к аддитивному или синергическому эффекту на их питание и рост при совместной инокуляции. Результаты полевых опытов, в которых использовали биопрепараты на основе штаммов Az. lipoferum 137 (азоризин) и Ag. radiobacter 10 (агрофил), подтвердили более высокую эффективность инокуляции ячменя смесью штаммов (Рис. 1). Применение отдельных препаратов оказалось малоэффективным, за исключением достоверного увеличения урожая с. Темп на 12% при использовании агрофила в 1987 г. Обнаружена вариабельность реакции растений на инокуляцию в зависимости от сорта ячменя: максимальной отзывчивостью на инокуляцию обладал с. Темп, в то же время инокуляция с. Каскад оказалась неэффективной.

Рис. 1. Средние значения эффективности применения азоризина и агрофила для инокуляции ячменя в полевых опытах. Обозначения: (?) сорт Темп, среднее 2-х опытов 1987 и 1988 гг.; (-) сорт Каскад, среднее 2-х опытов 1989 г.; (¦) сорт Циклон, среднее 3-х опытов 1988 и 1990 гг. Символ * означает существенное повышение урожая по критерию Фишера при Р < 0,05.

Наблюдаемые положительные взаимодействия между Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 свидетельствуют об образовании бактериальной ассоциации, в которой азоспириллы не только активнее фиксируют азот, но и лучше приживаются в ризосфере. Находясь в таких ассоциациях, бактерии существенно повышали свой потенциал положительного воздействия на растение. Наряду с этим, совместная интродукция штаммов, дополняющих друг друга по своим ростстимулирующим свойствам, оказывает аддитивные и синэргические эффекты на рост и питание растений. В результате положительных микробных взаимодействий в ризосфере и интеграции эффектов образуется растительно-бактериальная система, которая обладает достаточной устойчивостью и стабильностью функционирования. Результаты исследований, включая полевые опыты, показывают целесообразность совместного использования биопрепаратов азоризина и агрофила.

3.2 Роль взаимодействия интродуцируемых бактерий с аборигенной микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию

В первый этап исследований входило выделение и характеристика представителей аборигенных бактерий (ДР-бактерий) доминирующих в ризосфере проростков ячменя, выращенного на 8 различных почвах. Затем эти ДР-бактерии были использованы для изучения роли аборигенной микрофлоры в эффективности взаимодействия интродуцируемых популяций ризобактерий с растениями. Изучение влияния метаболитов ДР-бактерий (всего 115 штаммов) на рост 22-х коллекционных штаммов ассоциативных бактерий методом агаровых пластинок показало, что 55 ДР-бактерий полностью ингибировали рост хотя бы одного коллекционного штамма, 12 ДР-бактерий ингибировали рост большинства штаммов, а 6 ДР-бактерий полностью ингибировали рост всех коллекционных культур. Только 13 штаммов ДР-бактерий стимулировали рост 1-3 коллекционных культур, которыми, как правило, являлись Flavobacterium sp. Л30 или Ar. mysorens 7.

Штаммы рода Azospirillum были наиболее чувствительны к метаболитам ДР-бактерий. Представители семейства энтеробактерий были сравнительно устойчивы и положительного влияния ДР-бактерий на их рост не обнаружено. Наиболее устойчивыми являлись штаммы, относящиеся к родам Agrobacterium, Arthrobacter и Flavobacterium. Эти результаты согласовывались с данными о выживаемости в почве двух коллекционных штаммов. Так, численность чувствительного штамма Az. lipoferum 137 была существенно выше при внесении в почву рифампицина, который препятствовал развитию аборигенных микроорганизмов. Однако добавление в почву рифампицина не оказало существенного влияния на выживаемость устойчивого к микробным метаболитам штамма Ar. mysorens 7.

Рис. 2. Взаимодействие Az. lipoferum 137 с C. jonsonae Д1 и их влияние на инокулированные растения ячменя сорта Темп. А - нитрогеназная активность Az. lipoferum 137 при культивировании в жидкой среде; Б - численность Az. lipoferum 137 в ризосфере ячменя; В - надземная масса растений в фазу выхода в трубку (¦) и урожай зерна (?) растений ячменя. Варианты опыта на А и Б: чистая культура Az. lipoferum 137 (_); смесь Az. lipoferum 137 и C. jonsonae Д1 (?). Варианты инокуляции на В: без инокуляции (Контроль), Az. lipoferum 137 (137), C. jonsonae Д1 (Д1), смесь Az. lipoferum 137 и C. jonsonae Д1 (137+Д1). Вертикальные отрезки обозначают доверительный интервал при Р < 0,05.

Среди ДР-бактерий был отобран штамм Cytophaga jonsonae Д1, метаболиты которого in vitro улучшали рост Az. lipoferum 137. Динамика нитрогеназной активности у азоспирилл в присутствие C. jonsonae Д1 указывала на то, что бактерии образовывали устойчивую ассоциацию с высокой азотфиксирующей активностью (Рис. 2А). В вегетационном опыте C. jonsonae Д1 повысил также способность Az. lipoferum 137 колонизировать корни ячменя при совместной инокуляции (Рис. 2Б). Тем не менее, совместная инокуляция данными штаммами оказалась неэффективной из-за того, что C. jonsonae Д1 отрицательно повлиял на рост растений (Рис. 2В). Известно, что некоторые штаммы C. johnsonae являются фитопатогенными (Wells et al., 1998).

Из 115 изолированных культур ДР-бактерий 18 изолятов ингибировали, а 10 изолятов стимулировали всхожесть семян ячменя. Методом агаровых пластинок было установлено, что метаболиты производственного штамма Flavobacterium sp. Л30, способного продуцировать антибиотик (Шенин и др., 1996), полностью подавляли рост всех штаммов ДР-бактерий. В вегетационном опыте некоторые штаммы ДР-бактерий повысили урожай зерна ячменя на 17-19% (Табл. 2). В то же время, при совместной инокуляции ДР-бактериями и Flavobacterium sp. Л30, положительного эффекта не обнаружено.

Таблица 2. Влияние Flavobacterium sp. Л30 на эффективность инокуляции ячменя ростстимулирующими ДР-бактериями

(*) Различие между вариантами существенно относительно контроля по критерию Фишера при Р < 0,05).

Результаты исследований показали, что интродуцируемые популяции ассоциативных бактерий вступают в сложные взаимодействия с бактериальной микрофлорой, колонизирующей ризосферу. Выживаемость и эффективность интродуцента зависят от его устойчивости к антагонистическому воздействию аборигенов. Образование ассоциации с фитопатогенами или ингибирование активности полезных аборигенных микроорганизмов приводит к ослаблению ростстимулирующего эффекта интродуцента и аборигенных бактерий, и этим искажает ожидаемую реакцию растений на инокуляцию.

3.3 Популяционное доминирование в ризосфере прорастающих семян как критерий селекции ростстимулирующих бактерий

Нами предложено использовать способность бактерий активно колонизировать ризосферу прорастающих в нестерильной почве семян в качестве предварительного критерия для отбора высокоэффективных ростстимулирующих штаммов. Для реализации этого подхода были использованы два штамма ДР-бактерий Arthrobacter sp. ДР12. и Sinorhizobium sp. ДР65, которые повышали всхожесть и корнеобразование у семян ячменя, продуцировали ИУК, обладали цитокининовой и фосфат-мобилизирующей активностью, но не фиксировали азот, не имели бактериостатической активности и не утилизировали АЦК.

В вегетационных опытах штамм Arthrobacter sp. ДР12 достоверно повысил количество зерен и урожай ячменя на 18-25% (Табл. 3). Положительное влияние Sinorhizobium sp. ДР65 на урожай зерна проявилось в эксперименте 1, при этом инокуляция увеличила также массу соломы относительно производственного штамма Flavobacterium sp. Л30. Изучаемые ДР-бактерии успешно реализуют свою высокую колонизирующую способность при интродукции на семена и поддерживают численность популяции в процессе вегетации на высоком уровне (Рис. 3). Сравнительные испытания эффективности ДР-бактерий в полевых условиях показали, что Arthrobacter sp. ДР12 повысил урожай зерна в двух опытах с ячменем сорта Абава на 6% и 12%, в одном из двух опытов с пшеницей сорта Омская-18 на 9%, и обеспечивал максимальный урожай зерна ячменя сорта Омский-88 и пшеницы сорта Омская-18. Использование биопрепаратов на основе Sinorhizobium sp. ДР65, а также флавобактерина или мизорина в полевых условиях оказалась неэффективной. Результаты показали, что Arthrobacter sp. ДР12 может быть рекомендован для создания ростстимулирующего биопрепарата.

Таблица 3. Влияние ассоциативных бактерий Arthrobacter sp. ДР12 и Sinorhizobium sp. ДР65 на урожай ячменя сорта Темп в вегетационных опытах

(*) Различие между вариантами существенно относительно варианта без инокуляции по критерию Фишера при Р < 0,05.

Были обобщены проведенные нами эксперименты по изучению динамики численности популяций производственных штаммов в ризосфере. Эти исследования доказали способность штаммов активно колонизировать ризосферу различных сельскохозяйственных культур в широком диапазоне почвенно-климатических условий. Показано, что активная колонизация корней является необходимым, но недостаточным условием для эффективного взаимодействия интродуцента с растением. Интродуценты, как правило, реализуют свой потенциал колонизации ризосферы, однако эффект бактерий на растение проявляется не всегда.

Установлено, что независимо от вида растения и условий среды численность штаммов Ar. mysorens 7 и Ag. radiobacter 10 была выше по сравнению со штаммами Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30. Это указывает на ведущую роль генотипа бактерий в колонизации ризосферы и подтверждает важность селекции активных колонизаторов, сохраняющих это свойство в разнообразных условиях. Поэтому перспективным представляется поиск интродуцентов, обладающих высокой «буферностью» и популяционной эврибионтностью - качествами, способствующими активной колонизации ризосферы. Показана также относительная независимость численности интродуцента в ризосфере и реакции растений на инокуляцию, свидетельствуя о том, что способность растения использовать полезный потенциал интродуцируемых бактерий во многом зависит от генотипа растения.

Рис. 3. Численность интродуцированных бактерий в ризосфере ячменя сорта Темп (эксперимент 2). Варианты опыта: Arthrobacter sp. ДР12 (?); Sinorhizobium sp. ДР65 (_); общая численность бактерий на среде без стрептомицина (¦). Вертикальные отрезки обозначают доверительный интервал при Р 0,05.

Таким образом, селекция эффективных штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий по признаку доминирования популяции в культурабельном бактериальном сообществе ризосферы прорастающих семян может быть весьма перспективна. Такой подход учитывает высокую конкурентоспособность микроорганизмов в процессе колонизации корней проростков в реальных условиях с учетом влияния комплекса биотических и абиотических факторов конкретной среды и генотипа растения. Впоследствии это дает возможность успешно интродуцировать полезную для растений популяцию примерно в ту же экологическую нишу, из которой она была первоначально изолирована. Это обосновывает высокую вероятность образования эффективной растительно-бактериальной ассоциации.

4. Роль ризобактерий, содержащих фермент АЦК деаминазу, в устойчивости растений к абиотическим стрессам

4.1 Выделение и характеристика устойчивых к кадмию ассоциативных бактерий содержащих фермент АЦК деаминазу

Исследования были инициированы важностью проблемы поиска новых путей повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. В этой связи интересными являлись публикациями о том, что снижение уровня гормона этилена в корнях растений, опосредованное утилизацией бактериями аминокислоты АЦК с помощью фермента АЦК деаминазы, является одним из механизмов положительного растительно-микробного взаимодействия (Glick et al., 1994; Glick, 1995). Учитывая важную роль этилена в реакции растений на стрессовые факторы, представлялось перспективным выделить и изучить АЦК-утилизирующие бактерии, ассоциированные с корнями подверженных стрессу растений.

В наших исследованиях стрессором послужили кадмий и другие тяжелые металлы, которые являются распространенными и высокотоксичными загрязнителями почв и индуцируют биосинтез стрессового этилена в растениях. Из ризосферы проростков горчицы сарептской и гороха выращенных на загрязненных почвах и осадках сточных вод были селектированы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие АЦК деаминазу. В 1996 г. было выделено 22 АЦК-утилизирующих штамма с использованием питательных сред, содержащих АЦК в качестве единственного источника азота, а в 2001 г. выделено 11 штаммов на среде с АЦК в качестве единственного источника азота и углерода. Во всех использованных почвах присутствовали ассоциативные АЦК-утилизирующие бактерии. Все штаммы были идентифицированы и их свойства детально охарактеризованы.

Штаммы относились к Pseudomonas brassicacearum, Ps. marginalis, Ps. oryzihabitans, Ps. putida и Pseudomonas sp., а также Achromobacter xylosoxidans, Acidovorax facilis, Bacillus pumilus, Rhodococcus sp. и Variovorax paradoxus. У большинства этих таксонов наличие АЦК деаминазы ранее не было описано. В настоящей диссертации представлена информация только о 10 штаммах (Табл. 4).

Таблица 4. Характеристика штаммов содержащих фермент АЦК-деаминазу

(^А) Указан диаметр зоны растворения фосфатов (Ca₃(PO₄)₂ / FePO₄ / Ca-фитат) вокруг колоний бактерий. (^Б) Указаны минимальные ростингибирующие и летальные концентрации при культивировании на агаризованной среде.

Данные штаммы обладали высокой устойчивостью к тяжелым металлам, и многие из них растворяли труднодоступные фосфаты (Табл. 4). Штаммы Am2, Ep2 и 5C-2 продуцировали ИУК, но ни один из штаммов не продуцировал этилен и не обладал нитрогеназной активностью. Впервые показано, что АЦК-утилизиующие бактерии используют АЦК в качестве единственного источника углерода. Ростстимулирующая активность штаммов проявлялась в удлинении корней проростков горчицы сарептской и рапса, как в отсутствие, так и в присутствие кадмия в питательном растворе (Рис. 4). О важной роли АЦК деаминазы в способности бактерий стимулировать удлинение корней свидетельствуют результаты обработки растений аминоэтоксивинилглицином (АВГ, ингибитор АЦК синтазы), ионами серебра (конкурент за рецепторы этилена), АЦК (предшественник в биосинтезе этилена) и этефоном (генератор этилена) (Рис. 4). Производственные штаммы, не имеющие АЦК деаминазной активности, не влияли на длину корней.

Рис. 4. Эффект АЦК-утилизирующих бактерий и химических регуляторов этилена на длину корней проростков рапса в присутствие 300 мкМ CdCl₂. Обозначения: К(Cd) - контроль без инокуляции; АВГ - 10 мкМ АВГ; Ag - 10 мкМ Ag₂SO₄; АЦК- 200 мкМ АЦК; ЕФ - 10 мкМ эфефона. Вертикальные отрезки обозначают стандартное отклонение.

4.2 Взаимодействие АЦК-утилизирующих бактерий с растениями в стрессовых условиях, вызванных токсичностью кадмия

Результаты вегетационных опытов с рапсом показали, что штаммы P. brassicacearum Am3, P. putida Bm3 и P. marginalis Dp1 стимулировали развитие корней у растений, выращенных на незагрязненной почве. При внесении в почву кадмия (35 мг Cd/кг) положительное действие бактерий проявилось также и в повышении биомассы побегов. Однако инокуляция не влияла на содержание Cd в побегах рапса.

В опыте №1 с горчицей сарептской штаммы P. brassicacearum Am3 и V. paradoxus 5C-2 увеличили массу побегов на необогащенной кадмием слабоокультуренной дерново-подзолистой почве. Однако при добавлении в почву кадмия (30 или 60 мг Cd/кг) эффект проявился только в стимуляции роста корней штаммом V. paradoxus 5C-2. Численность P. brassicacearum Am3 в ризосфере снижалась в ходе эксперимента, а при 60 мг Cd/кг популяция элиминировалась из зоны корней. Напротив, V. paradoxus 5C-2 интенсивно колонизировал корни в отсутствии и, особенно в присутствии Cd в почве. Инокуляция не влияла на содержание Cd в побегах горчицы. В опыте №2 горчицу выращивали в коммерческом компосте “Pro-Mix BX” и инокулировали штаммом V. paradoxus 5C-2. Добавление кадмия в компост (24 мг Cd/кг) приводило к ингибированию роста растений, но инокуляция снимала этот негативный эффект и существенно повышала содержание и вынос кадмия побегами (Табл. 5). Возможно, что различное влияние бактерий на аккумуляцию кадмия горчицей связаны со степенью его доступности для растений в дерновоподзолистой почве (после внесения в почву кадмий быстро переходил в нерастворимые формы) и в компосте (в компосте хелатирующие вещества поддерживали микроэлементы в растворенной форме). Можно предположить, что способность бактерий активизировать поступление кадмия в растения может проявляться при условии его высокой подвижности в ризосфере. Полученные результаты указывают на два важных момента в отношении проблемы повышения эффективности технологий фитоэкстракции металлов с использованием горчицы сарептской. Во-первых, необходимо активизировать поглощение корнями и/или повысить мобильность тяжелых металлов в ризосфере инокулированных растений. Во-вторых, при повышенном поступлении токсикантов в растения становится особенно актуальным поиск приемов стимуляции роста растений, в том числе основанных на взаимодействии растений с полезными микроорганизмами.

Таблица 5. Влияние инокуляции на рост и аккумуляцию кадмия побегами горчицы сарептской

Разные буквы указывают на различия по критерию Фишера (Р < 0,05).

Рис. 5. Влияние АЦК-утилизирующих бактерий на биомассу (А, В) и накопление элементов (Б, С) побегами гороха. (А) и (Б) - незагрязненная почва; (В) и (Г) - внесено 10 мг Cd/кг. (Б) и (В) - средние для 4-х генотипов гороха. Варианты: (?) P. brassicacearum Am3, (¦) P. marginalis Dp1, (-) Rhodococcus sp. Fp2. (*) - существенный эффект инокуляции по критерию Фишера (Р < 0,05).

В вегетационном опыте с горохом инокуляция штаммами P. brassicacearum Am3 и P. marginalis Dp1 стимулировала рост корней, как на незагрязненной почве, так и при внесении кадмия. Положительный эффект бактерии оказали также на рост побегов (Рис. 5). Устойчивый к кадмию штамм Rhodococcus sp. Fp2 не стимулировал рост обработанного кадмием гороха. Это вероятно было связано с тем, что в модельных экспериментах кадмий полностью ингибировал АЦК-деаминазную активность этого штамма. Добавление Cd в почву приводило к снижению содержания питательных элементов в растениях. Эффект бактерий на элементный состав побегов существенно варьировал в зависимости от штамма, генотипа гороха и концентрации Cd в почве. Действие инокуляции в основном проявлялось в повышении содержания N, Ca и S, и в тенденции к снижению содержания P и Fe в побегах. Снижение содержания Cd происходило при инокуляции генотипа ВИР-1658 штаммами Dp1 и Fp2, генотипа ВИР-3429 штаммами Am3 и Dp1, и генотипа ВИР-4788 штаммом Fp2. У инокулированных растений повышалось накопление питательных элементов в побегах (Рис. 5).

Rhodococcus sp. Fp2 потерял способность улучшать аккумуляцию растениями N, K, Ca и Fe в условиях загрязнения почвы кадмием. Наблюдаемое повышение накопления P, K, и Fe в побегах было вероятно опосредовано лучшим развитием корневой системы, а повышение аккумуляции N, S, и Ca, могло быть результатом мобилизации этих элементов в ризосфере и стимуляции процессов их ассимиляции и транспорта в побег. Полученные результаты свидетельствуют о том, что: (1) АЦК деаминаза играет важную роль в стимуляции роста растений в присутствие токсичного кадмия; (2) улучшение минерального питания гороха бактериями и эффект бактерий на биосинтез этилена в растении посредством АЦК деаминазы являются частично независимыми процессами; (2) снижение содержания Cd в побегах гороха не являлось причиной улучшения роста инокулированных растений, и не было связано с утилизацией АЦК бактериями.

4.3 Зависимость эффекта АЦК-утилизирующих бактерий от уровня минерального питания растений

Интенсивность биосинтеза гормона этилена у растений зависит от концентрации и доступности питательных элементов. Поэтому мы предположили, что уровень минерального питания может быть важным фактором во взаимодействии АЦК-утилизирующих бактерий с растениями. Была проведена серия опытов с растениями рапса в условиях гидропоники при варьировании состава питательного раствора, в ходе которых выявлены следующие закономерности (Рис. 6А): (1) длина корней проростков уменьшалась с увеличением концентрации фосфора (K₂HPO₄) в растворе; (2) ростстимулирующий эффект ингибитора этилена (Ag⁺) и бактерий проявился только в присутствии фосфора (K₂HPO₄, Ca-фитат или CaHPO₄); (3) при добавлении сульфата аммония стимулирующее действие бактерий исчезало, а эффект Ag⁺ сохранялся. Исключение калия из состава раствора не влияло на рост корней во всех вариантах опыта.

Рис. 6. Реакция проростков рапса на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в зависимости от содержания фосфора и азота в питательном растворе. А - длина корня. Б - образование этилена. Варианты опыта: Норма, полный питательный раствор; -Р, раствор без фосфора; +NH4, дополнительно внесен 1 мМ (NH₄)₂SO₄; 1, без инокуляции; 2, 10 мкМ Ag₂SO₄; 3, A. xylosoxidans Cm4; 4, Pseudomonas sp. Dp2. Вертикальными отрезками обозначены стандартные отклонения.

Количество интродуцированных штаммов на корнях растений в присутствии и отсутствии фосфора было примерно одинаковым и составляло от 2,0 х 10⁶ до 3,3 х 10⁶ кл./мг, свидетельствуя о том, что рост бактерий не был ограничен дефицитом фосфора. Бактерии не влияли на концентрацию P_i в питательном растворе с фосфатами. Не обнаружено корреляции между фосфат-растворяющей активностью штаммов in vitro и их воздействием на корни или потреблением фосфора растениями. В присутствии K₂HPO₄ штаммы P. putida Bm3, A. xylosoxidans Cm4 и Pseudomonas sp. Dp2 снижали содержание (P_i), а обработка Ag⁺ уменьшила накопление P_i в побегах. Масса побегов отрицательно коррелировала с содержанием P_i (r = -0.40; P = 0.015; n = 24). Образование этилена в отсутствии фосфора снижалось и сопровождалось удлинением корней (Рис. 6Б).

Снижение биосинтеза АЦК и этилена является адаптацией, направленной на поиск доступного источника фосфора за счет более развитой корневой системы (Rengel and Kordan, 1988). Инокуляция снижала количество выделяемого растениями этилена только в присутствии фосфора, при этом добавление сернокислого аммония в качестве дополнительного источника азота снижало бактериальный эффект. Вероятно, что при дефиците фосфора количество доступного для бактерий АЦК в прикорневой зоне уменьшалось, взаимодействие растительно-бактериальной ассоциации нарушалось, и это приводило к ослаблению положительного действия бактерий. Высокая концентрация аммония, более доступного источника азота, может ингибировать активность АЦК деаминазы (Jacobson et al., 1994).