Поэтому сульфат аммония нивелировал только эффект бактерий, но не химического ингибитора этилена Ag⁺. Эти результаты являются оригинальным подтверждением участия АЦК деаминазы во взаимодействии бактерий с растениями. В вегетационных опытах положительный эффект бактерий на массу побегов рапса повышался примерно в два раза при внесении в почву фосфорных удобрений. Содержание питательных элементов (P, K, S, Mo, Zn и Ba) в побегах инокулированных растений не повышалось или понижалось (в зависимости от штамма интродуцента) и отрицательно коррелировало с биомассой побегов. Это указывало на то, что происходило разбавление концентрации элементов массой растений, а специфические эффекты бактерий на ассимиляцию питательных элементов не проявлялись. Таким образом, уровень фосфорного и азотного питания растений оказывает существенное влияние на реакцию растений на инокуляцию бактериями содержащими АЦК деаминазу. Стимуляция роста растения происходит при относительно высоком уровне гормона этилена, и при отсутствии факторов ингибирующих активность АЦК деаминазы.

4.4 Роль АЦК деаминазы в реакции растений на дефицит почвенной влаги

Инокуляция штаммом V. paradoxus 5C-2 и обработка ингибитором биосинтеза этилена (10 мкМ АВГ) стимулировали рост корней и побегов гороха сорта Sparkle в большей степени при недостаточном увлажнении почвы по сравнению с вариантами оптимального увлажнения. Ростстимулирующий эффект сопровождался повышением транспирации воды, пропорциональным массе побегов. Однако влияние мутанта V. paradoxus 5С-2M4, который имел активность АЦК деаминазы в 7 раз ниже дикого типа, на рост растений и транспирацию воды было несущественным.

При выращивании гороха в условиях дефицита влаги до стадии полной спелости растения инокулированные V. paradoxus 5C-2 превосходили контрольные по количеству семян, массе семян и накоплению в них азота (Табл. 6). Содержание азота в семенах не изменялось, поэтому повышение накопления азота было обусловлено увеличением биомассы. При оптимальном режиме полива положительное действие V. paradoxus 5C-2 на рост растений проявилось только в виде тенденции. Инокуляция стимулировала образование клубеньков таким образом, что полностью снимала ингибирующий эффект засухи на клубенькообразование.

Инокулированные растения образовывали дополнительные побеги и зацветали на 1-2 дня раньше контрольных. Образование дополнительных побегов приводило к затенению участков почвы вокруг растений, и это могло снижать потери влаги, испаряющейся с поверхности почвы. V. paradoxus 5C-2 активно колонизировал корни гороха во всех экспериментах при оптимальном и недостаточном увлажнении, а его численность в конце опытов была около 1 млн кл./г корней. В условиях дефицита влаги количество биомассы семян в расчете на 1 литр поливной воды было на 12% больше (Р=0,02) при инокуляции, свидетельствуя о повышении эффективности использования воды растениями.

Таблица 6. Эффект V. paradoxus 5C-2 на рост и азотфиксирующий симбиоз гороха сорта Sparkle в зависимости от уровня увлажнения почвы

^АРастения инокулировали R. leguminosarum bv. viciae 1026. Разные латинские буквы указывают на существенные различия (критерий Фишера, Р < 0,05).

Дефицит влаги приводил к повышению содержания АЦК и АБК в ксилемном соке растений (Рис. 7А). При недостаточном увлажнении наблюдалось снижение концентрации АЦК у обработанных АВГ и инокулированных растений. Это наблюдение имеет большое значение для понимания механизма воздействия АЦК-утилизирующих бактерий, поскольку указывает на то, что АЦК деаминаза вызывает не только локальные эффекты на корни, но может индуцировать системную устойчивость. Содержание АБК, основной сигнальной молекулы в реакции растения на засуху, также повышалось при дефиците влаги, свидетельствуя о развитии стрессовой реакции (Рис. 7Б).

Инокуляция диким типом V. paradoxus 5C-2 и его мутантом 5С-2М4 не повлияла на концентрацию АБК по отношению к соответствующим контролям. Однако наиболее заметное повышение АБК при дефиците влаги происходило у растений, инокулированных диким типом V. paradoxus 5C-2, вероятно в результате более быстрой ассимиляции ограниченного ресурса поливной воды. Это указывает на то, что передаваемый посредством АБК сигнал, может ограничивать ростстимулирующее и антистрессовое воздействие АЦК-утизирующих бактерий. С другой стороны высокая концентрация АБК могла ограничивать потери воды листьями за счет транспирации.

Рис. 7. Содержание АЦК (А) и АБК (Б) в ксилемном соке гороха в зависимости от инокуляции и режима увлажнения почвы. Варианты: (?) контроль; (-) АВГ на (А) или мутант М4 на (Б); (¦) дикий тип V. paradoxus 5C-2. Вертикальными отрезками обозначены ошибки средних. Разные латинские буквы указывают на существенные различия (критерий Фишера, Р < 0,05).

В вегетационном опыте с карликовым сортом томатов MicroTom растения выращивали в узких, но объемных (диаметр 10 см; 10 кг компоста) пластиковых колоннах, что позволяло вырастить их до фазы зрелых плодов при полном прекращении полива в начале вегетации. При поддержании полива инокуляция V. paradoxus 5C-2 не оказала существенного эффекта на массу плодов. В условиях засухи масса плодов снизилась в 6 раз, но урожай инокулированных растений был на 30% выше относительно контроля, что свидетельствовало о повышении эффективности использования воды растениями. Численность интродуцента в ризосфере составляла около 5 млн. кл./г корней, при этом прекращение полива не изменяло его колонизирующую способность. Используя агарозную гнотобиотическую систему, было установлено, что V. paradoxus 5C-2, P brassicacearum Am3 и его мутант Am3T8-1, имевший активность АЦК деаминазы в 37 раз ниже дикого типа, стимулируют удлинение корневых волосков у томатов. Микроскопирование показало, что маркированные GFP бактерии интенсивно колонизируют корневые волоски. Стимуляция развития корневых волосков может вносить вклад в улучшение водного питания инокулированных растений, однако этот эффект не зависит от активности АЦК деаминазы бактерий.

5. Взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий с растениями в зависимости от агроклиматических факторов

5.1 Экстремальные температуры среды

Штаммы Az. lipoferum 137, Ar. mysorens 7, Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 используются во многих регионах, которые существенно различаются по температурному режиму. В связи с этим, представлялось важным изучить, как температура влияет на эффективность инокуляции растений данными бактериями. Для этого были проведены вегетационные опыты, в которых инокулированные растения ячменя выращивали в климатических камерах, имитируя оптимальное (+18^оС), холодное (+14^оС) и жаркое (+23^оС) лето. Ar. mysorens 7 повысил массу зерна не только при оптимальной, но и при пониженной температуре, при этом эффект составил соответственно +17% и +25%. Положительный эффект от штамма Ag. radiobacter 10 был существенен только при пониженной или повышенной температурах. При повышенной температуре отмечена тенденция увеличения массы зерна при инокуляции Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30 на 9% и 12%, однако, разница с контролем была несущественной. В среднем для всех испытанных штаммов реакция растений на инокуляцию была выше при экстремальных температурах.

Поддержание пониженной и повышенной температур приводило к существенному снижению массы зерна растений, свидетельствуя о том, что растения были подвержены сильному стрессу. Температура культивирования растений не влияла на численность интродуцированных бактерий в ризосфере в фазы всходов и кущения. В дальнейшем численность Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 была выше при имитации жаркого лета, но снижалась при имитации холодного лета. Активная колонизация корней во всех режимах указывает на способность бактерий легко адаптироваться к различным температурам и поддерживать численность популяции относительно стабильной. Вероятно, что повышение реакции растений на инокуляцию при неблагоприятных температурах связано не с популяционными эффектами температуры на бактерии, а с изменением их активности и метаболизма, которые могут быть зависимы от самого растения.

5.2 Повышенная кислотность почвы

При культивировании на питательной среде штамм Ar. mysorens 7 был наиболее устойчив к подкислению среды и нормально развивался при рН=4,5. Ингибирование роста Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 наблюдалось при рН=5,0ч4,5. Сильное ингибирование роста наиболее чувствительного штамма Az. lipoferum 137 происходило уже при рН=5,0. При рН=6,5 все штаммы обладали относительно высокой устойчивостью к ионам Al⁺³. Однако при подкислении среды (рН=4,5) токсичность алюминия существенно повышалась, и рост бактерий прекращался при концентрации 30ч40 мг Al⁺³/л.

В условиях гидропоники при создании стрессовых условий (рН=4,5 и добавлении 5 мг/л Al⁺³) инокуляция стимулировала рост корней проростков различных сортов ячменя примерно на 15ч25%. Однако в оптимальных условиях (рН=5,8 без добавления Al⁺³), ассоциативные бактерии не оказали влияния на рост корней. В вегетационных опытах использовали кислые дерновоподзолистые почвы, кислотность которых изменяли добавлением мела. В опыте №1 с сортом Целинный-5 положительное действие на продуктивность растений ячменя проявилось только при инокуляции Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30 в условиях слабокислой реакции почвы (рН=5,0), но не в нейтрализованной почве (рН=6,1) (Рис. 8А). Содержание свободного пролина в корнях инокулированных растений было в 4 раза ниже по сравнению с контрольными, свидетельствуя о способности бактерий понижать интенсивность стресса, вызываемого неблагоприятными условиями.

Рис. 8. Взаимодействие ячменя Целинный-5 с Az. lipoferum 137 в зависимости от рН почвы. (А) - эффект бактерий на урожай зерна (г/сосуд) и накопление азота в зерне (мг N/сосуд). Численность интродуцента в ризосфере (Б) и в почве без растений (В). Обозначения: рН почвы 6,1 (?, _) или 5,0 (¦, ?). (*) означает существенную разницу с контролем по критерию Фишера (Р<0,05). Вертикальные отрезки обозначают ошибку средних.

Сравнение популяционных кривых бактерий полученных для ризосферы и почвы без растений позволило установить, что в слабокислой почве присутствие растения улучшало выживаемость Az. lipoferum 137 (Рис. 8Б, В) и Flavobacterium sp. Л30. Важно отметить, что именно эти штаммы стимулировали рост растений, свидетельствуя об образовании эффективных ассоциаций в данных условиях. Однако в опыте №2, когда рост растений был сильно ингибирован при рН почвы 4,5, инокуляция Az. lipoferum 137 или Ar. mysorens 7 снижала соответственно массу соломы или урожай зерна. Отрицательный эффект возможно связан с утилизацией бактериями органических кислот, выделяемых корнями для хелатирования алюминия (Foy and Lee, 1987), и повышением его подвижности в ризосфере.

5.3 Дефицит почвенной влаги

Расчет средних значений прибавок массы зерна в серии вегетационных опытов показал, что инокуляция всеми штаммами была более эффективной в условиях дефицита влаги в почве (Рис. 9А). Вероятно, что целый ряд известных механизмов действия бактерий на растения мог быть вовлечен в наблюдаемый эффект. Стимуляция роста корней бактериями могла быть исключительно важна при засухе, поскольку лучшее развитие корневой системы обеспечивает растение дополнительной влагой. Биологическая азотфиксация и улучшение минерального питания инокулированных растений могло снижать возникающий дефицит и ограниченный транспорт питательных элементов.

Продуцирование бактериями ауксинов, антагонистов стрессового фитогормона АБК, могло ослаблять процессы, останавливающие рост растения в условиях дефицита влаги. Режим увлажнения почвы существенно повлиял на выживаемость бактерий в ризосфере растений: численность всех штаммов в середине и в конце вегетации поддерживалась на более высоком уровне при недостатке почвенной влаги. Сравнение популяционных кривых выживаемости бактерий в почве без растений и в ризосфере показало, что при дефиците влаги более благоприятные условия для интродуцентов создаются на корнях растений по сравнению с почвой (Рис. 9 Б, В). Это указывает на активную роль растения в образовании ассоциаций с интродуцентамии и может служить аргументом в пользу того, что в условиях стресса растение ведет поиск дополнительных ресурсов, которые могут стать доступны ему благодаря активизации функций полезной ризосферной микрофлоры.

Возможно также, что при дефиците влаги в ризосфере ослабевали конкурентные и антагонистические взаимодействия между интродуцируемыми штаммами и аборигенной микрофлорой, а внесение большого количества клеток интродуцента при инокуляции позволяло ему успешно конкурировать с аборигенными микробами, колонизирующая способность которых была снижена недостатком влаги.

Рис. 9. Взаимодействие ячменя Целинный-5 с ассоциативными бактериями в зависимости от влажности почвы. (А) - эффект бактерий на урожай зерна (г/сосуд). Штаммы: А-137 - Az. lipoferum 137, А-7 - Ar. mysorens 7, А-10 - Ag. radiobacter 10 и Л30 - Flavobacterium sp. Л30. Римскими цифрами обозначено количество проведенных опытов, а арабскими цифрами обозначено количество опытов с достоверной прибавкой урожая (критерий Фишера, Р<0,05). Численность Az. lipoferum 137 в ризосфере (Б) и в почве без растений (В). Обозначения: влажность почвы 60% ПВ (?, _) или 30% ПВ (¦, ?). Вертикальные отрезки обозначают ошибку средних.

5.4 Загрязнение почвы тяжелыми металлами

Целью данной работы являлось изучение возможности применения биопрепаратов ассоциативных бактерий на загрязненных почвах для получения качественной продукции растениеводства. При культивировании на питательных средах бактерии были устойчивы к относительно высоким концентрациям Pb, Cd, Cu, Ni и Zn, за исключением штамма Flavobacterium sp. Л30, который оказался высокочувствительным к Cd (Табл. 7).

Важным результатом стало обнаружение стимуляции продукции индолов у обработанных кадмием бактерий (Табл. 7). Устойчивые штаммы были способны активно сорбировать Cd при культивировании на питательной среде (Табл. 7), при этом максимальный коэффициент распределения Cd (соотношение концентраций Cd в клетках и среде) получено у Az. lipoferum 137 и равнялось 5000 ± 500. В гидропонной культуре в присутствии кадмия все штаммы увеличили массу корней ячменя, а Ar. mysorens 7 повысил также массу побегов. В отсутствии кадмия бактериальный эффект выражался в повышении содержания питательных элементов (Р, К, Mg, Ca, Fe и Mn) в корнях и/или побегах. Кадмий ингибировал поступление питательных элементов в растения.

Таблица 7. Влияние кадмия на ассоциативные бактерии и их взаимодействие с растениями ячменя на загрязненной почве

^А Указаны минимальные летальные концентрации металлов. ^Б Указано соотношение интенсивности продуцирования ИУК (мкг/мг) в присутствии и отсутствии CdCl₂ в питательной среде. ^В Растения выращивали в почве обогащенной 75 мг Cd/кг. (*) Указывает на существенное влияние инокуляции (критерий Фишера, Р 0,05). (н/о) не определяли.

Эффект бактерий на элементный состав растений был сходным в присутствии и отсутствии Cd. Бактерии повышали накопление К, Mg, S, Fe, Mn и Zn в корнях, а также накопление P, K, S, Zn и Na в побегах, при этом воздействие разных штаммов на аккумуляцию элементов было сходным. В вегетационном опыте инокуляция ячменя стимулировала рост растений в присутствии токсичных концентраций кадмия в почве (Табл. 7). В побегах инокулированных растений содержание Cd снижалось (Табл. 7), но содержание питательных элементов (Р, К, S и Ca) в некоторых случаях повышалось. Все штаммы активно колонизировали корни ячменя на почве загрязненной свинцом или кадмием, за исключением Cd-чувствительного штамма Flavobacterium sp. Л30, который в середине вегетации не обнаруживался в ризосфере. В некоторых случаях численность других штаммов в ризосфере повышалась в присутствии тяжелых металлов, что вероятно было связано с конкурентными преимуществами устойчивых к металлам интродуцентов по отношению к аборигенной микрофлоре.

Результаты трех полевых опытов показали, что применение биопрепаратов азоризина, мизорина, агрофила и флавобактерина проявлялось в повышении урожая зерна и активизации потребления растениями питательных элементов, таких как P, K, S и Ca. Известно, что эти элементы играют важную роль в процессах детоксикации тяжелых металлов растениями, однако токсичные металлы ингибируют ассимиляцию растениями питательных элементов. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о способности инокулированнных растений более эффективно противодействовать отрицательному эффекту тяжелых металлов на усвоение питательных элементов, и это может быть важным механизмом положительного действия бактерий на устойчивость растений.

Содержание Pb и Cd в зерне обработанных биопрепаратами растений не повышалось, а в отдельных случаях снижалось. Вероятными механизмами такого эффекта бактерий может быть иммобилизация металлов в ризосфере и активизация защитных реакций растений бактериальными биологически активными веществами. Результаты проведенных исследований показали, что биопрепараты на основе ассоциативных бактерий могут быть успешно применены для бактеризации ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием.

Выводы

1. Совместная инокуляция растений производственными штаммами Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 превосходит по эффективности инокуляцию отдельными штаммами. Данные штаммы образуют ассоциацию в периодической культуре и при интродукции в ризосферу. Механизмами аддитивных и синергических эффектов смеси данных штаммов являются активизация и сбалансированность минерального питания растений за счет интенсивного поглощения азотных и фосфорных удобрений, а также повышенная азотфиксирующая активность и лучшая приживаемость Az. lipoferum 137 на корнях.

2. При интродукции на семена производственные штаммы Az. lipoferum 137, Ag. radiobacter 10, Ar. mysorens 7 и Flavobacterium sp. Л30 способны активно колонизировать корни различных видов и сортов сельскохозяйственных растений, выращиваемых в различных почвах и климатических условиях. Установлены детерминированные штаммом сходства популяционной динамики и различия в численности популяций на корнях инокулированных растений, что позволяют оценить экологическую пластичность и адаптационный потенциал ризобактериальных интродуцентов по таким характеристикам как «буферность» и эврибионтность популяций. Однако активная колонизация ризосферы ростостимулирующим штаммом не является достаточным условием реализации его положительного действия на растение.

3. Интродуцируемые ассоциативные бактерии активно вступают в конкурентные и в меньшей степени симбиотические взаимодействия с аборигенной почвенной микрофлорой. Приживаемость в ризосфере и эффективность инокуляции во многом зависит от устойчивости интродуцента к воздействию аборигенных микроорганизмов. Образование ассоциаций интродуцента с микрофлорой, ингибирующей рост растений, а также антагонизм интродуцента к полезным формам аборигенных бактерий искажает ожидаемую реакцию растений на инокуляцию.

4. Скрининг штаммов ассоциативных ростостимулирующих бактерий по признаку доминирования популяции в культурабельном бактериальном сообществе ризосферы прорастающих в почве семян является перспективным приемом для обнаружения интродуцентов с высокой колонизирующей способностью. Предложенный метод позволил селектировать высокоэффективные штаммы Arthrobacter sp. ДР12, Sinorhizobium sp. ДР65 и V. paradoxus 5C-2, которые обладают высокой колонизирующей активностью.

5. Во всех использованных нами почвах, отвалах горных пород и осадках сточных вод различного типа и географического положения присутствуют устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и способные активно колонизировать корни прорастающих семян. Изолированные бактерии относятся к различным таксономическим группам, при этом впервые наличие АЦК деаминазы описано нами у видов Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas marginalis, Rhodococcus sp. и Variovorax paradoxus.

6. Инокуляция производственными штаммами и вновь выделенными ризобактериями, содержащими АЦК деаминазу, повышает устойчивость растений к токсичности тяжелых металлов, таких как кадмий и свинец. Степень антистрессового эффекта бактерий существенно варьирует в зависимости от штамма, генотипа растения и токсиканта. Важными механизмами ростостимулирующего эффекта бактерий в условиях токсичности тяжелых металлов являются: (1) стимуляция роста растений благодаря продуцированию бактериями ауксинов и снижению негативных этилен-зависимых реакций растения на стресс посредством АЦК деаминазной активности; (3) иммобилизации бактериями токсикантов в прикорневой зоне; (4) снижение ингибирующего действия металлов на потребление питательных элементов инокулированными растениями за счет стимуляции роста корней и активизации процессов ассимиляции или мобилизации элементов.

7. Инокуляция изучаемыми ассоциативными бактериями, как правило, не приводит к повышению содержания токсичных тяжелых металлов в растениях, а в некоторых случаях противодействует аккумуляции этих элементов в надземных органах. Для интенсификации процесса фитоэкстракции тяжелых металлов с помощью ассоциаций растений и ростстимулирующих бактерий необходимо разрабатывать дополнительные приемы и средства, направленные на мобилизацию металлов в ризосфере.

8. Уровень минерального питания растений оказывает существенное влияние на реакцию растений на инокуляцию бактериями содержащими АЦК деаминазу. Стимуляция роста растения происходит (1) в присутствии доступного фосфора, который обеспечивает высокий уровень гормона этилена в корнях, и (2) при отсутствии избытка доступного азота в виде аммония, который ингибирует активность фермента АЦК деаминазы, Дефицит фосфора для растений и избыток доступного азота для бактерий могут нарушать растительно-бактериальное взаимодействие, которое приводит к ограничению или нивелированию положительного действия АЦК-утилизирующих бактерий на растения.

9. Изучаемые штаммы АЦК-утилизирующих бактерий растворяют малодоступные фосфаты in vitro на питательных средах, однако не повышают потребление фосфора растениями из почвы. Поэтому роль мобилизации фосфатов данными бактериями в их ростостимулирующем эффекте на инокулированные растения несущественна.

10. Эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами варьирует в зависимости от температуры среды, при этом положительный эффект бактерий на рост растений может быть достигнут при пониженных и повышенных температурах. Установлено, что для каждого из штаммов имеются особенности во взаимодействии с растением, обусловленные влиянием температуры. Популяции интродуцированных бактерий в ризосфере легко адаптируются к экстремальным температурам.

11. Производственные штаммы ассоциативных бактерий, за исключением Az. lipoferum 137, способны развиваться в кислой среде при рН=4,5 и устойчивы к относительно высоким концентрациям ионов Al⁺³. Направленность бактериального эффекта на рост растений в почвах с повышенной кислотностью существенно варьирует от положительной до отрицательной в зависимости от генотипа растения и, возможно, от особенностей реакции сортов на кислотный стресс.

12. Ассоциативные бактерии повышают адаптацию растений к стрессу, вызванному дефицитом влаги в почве, стимулируя рост корней и увеличивая доступ к дополнительным ресурсам находящейся в почве влаги. В этих условиях АЦК-утилизирующие бактерии способны стимулировать рост корней за счет регуляции уровня этилена. Снижение концентрации сигнальной молекулы АЦК в ксилемном соке инокулированных растений указывает на присутствие не только локального эффекта АЦК деаминазы на корни, но и на индукцию системного антистрессового эффекта. Концентрация гормона абсцизовой кислоты при этом остается высокой, что ограничивает потери воды листьями за счет транспирации.

13. Различия в популяционных кривых выживаемости производственных штаммов в ризосфере и почве, а также корреляция между численностью интродуцента и его эффектом на растения в зависимости от условий роста растений служат доказательствами активной роли растения в формировании ассоциаций с полезными формами ризобактерий при неблагоприятных условиях среды.

14. Инокуляция гороха АЦК-утилизирующими бактериями стимулирует образование азотфиксирующих клубеньков на корнях. Данный эффект в большей степени проявился в стрессовых условиях ингибирования клубенькообразования дефицитом влаги. Поэтому положительное действие ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями является важным механизмом их антистрессового эффекта.

15. Вероятность получения положительного ростостимулирующего эффекта от инокуляции ассоциативными бактериями выше в таких условиях, в которых рост растений лимитирован некоторыми биотическими или абиотическими факторами. При этом необходимыми условиями реализации ростостимулирующего эффекта являются устойчивость бактерий к данному фактору и способность бактерий противодействовать негативному проявлению этих факторов. Такое воздействие бактерий может быть направлено на регуляцию роста и метаболических процессов в растении, а также на благоприятные для растений изменения в окружающей растение среде.

Список основных публикаций по материалам диссертации