Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ДЕГРАДАЦИЯ ПИРИДИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ РОДОВ ARTHROBACTER И RHODOCOCCUS

Специальности 03.02.03 - микробиология

03.01.06 - биотехнология

ХАСАЕВА Фатимат Машировна

Москва, 2010 г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время практически все природные среды подвергаются антропогенным воздействиям. Интенсивное развитие химической промышленности привело к тому, что в биосферу постоянно и в возрастающих количествах поступают вещества-загрязнители. Попадая в окружающую среду, они широко распространяются в природных ландшафтах, циркулируют в трофических цепях и накапливаются в организмах животных и человека. Это серьезно угрожает здоровью, и даже жизни всех живых существ, включая человека, повреждая клетки и вызывая мутации, ведущие к развитию злокачественных процессов или наследственных заболеваний. Особую опасность для природных экосистем представляют сточные воды коксохимических, нефтеперерабатывающих, фармацевтических и других предприятий химической промышленности. Они содержат токсичные и канцерогенные органические вещества первого и второго классов опасности, составляющие наиболее многочисленную группу (от 60% - 80% контролируемых веществ), интервал допустимых концентраций которых составляет от 10^-4 - 10^-7 мг/л. В течение года в природные резервуары поступает до 100 тыс различных химических соединений, 60 млн т синтетических материалов и до 5 млн т пестицидов [Кузнецов, Градова, 2006].

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость ксенобиотиков различных классов, для изучения процессов их деградации были выбраны азотсодержащие ароматические арены, к которым относятся пиридин и его производные [Rogers et al., 1985].

Санитарным законодательством предельно-допустимая концентрация (ПДК) для пиридина в питьевой воде установлена на уровне 0,2 мг/л, пиколинов и лутидинов 0,05мг/л, паров в воздухе 0,0015 мг/л [ГН 2.1.5.2280-07, 2007], а для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение - 0,01 и 0,001 мг/л, соответственно [Перечень рыбохозяйственных нормативов, 1999]. Такие значения ПДК предполагают глубокую очистку сточных вод. На данный момент предложены различные физико-химические способы очистки: адсорбция [Akita, 1993; Sabah, 2002], адсорбция с электросорбцией [Niu, 2002], озонирование [Stern, 1997], ионный обмен [Алиева, 1987], но ни один из современных методов химической очистки не может считаться ни экономичным, ни эффективным. Биологический метод очистки обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых относится его экологичность: в процессе биологической очистки не образуется чуждых природной среде соединений и происходит деструкция органических загрязнений до СО₂ и Н₂О [Лохова, 2009].

Современный уровень развития общества, промышленного производства, экологическое состояние окружающей среды обусловили повышение требований к качеству сточных вод, сбрасываемых в водные объекты, а традиционные технологии биологической очистки в аэротенках уже не позволяют достичь необходимой степени очистки.Одним из наиболее эффективных и очевидных способов увеличения окислительной мощности и улучшения ряда технологических показателей традиционных биологических очистных сооружений является применение иммобилизации биомассы на нерастворимых в воде материалах [Демаков и др., 2009].

В связи с этим первостепенное значение приобретает разработка микробио-логических способов очистки, предусматривающая поиск эффективных микро-организмов-деструкторов, всестороннее их изучение, подбор оптимальных способов хранения, обеспечивающих сохранение, как жизнеспособности, так и ферментативной активности, исследование путей и химических превращений ксенобиотиков и дальнейшее использование этих микроорганизмов в процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первичной реакцией метаболизма бензольного кольца является его гидроксилирование с образованием диоксисоединений [Арчаков, 1983; Leslie, 1985; Кулинский, 1999; Соляникова, 2007]. Последующее раскрытие кольца может проходить по одному из известных типов окислительного его расщепления: орто-, мета- и расщепление по пути гентизиновой кислоты.

В отличие от бензольного, реакции раскрытия пиридинового кольца не имеют однозначной интерпретации. Это, с одной стороны, обусловлено тем, что пиридин является электронодефицитным соединением, поскольку замена в кольце бензола одного атома углерода более электроотрицательным атомом азота приводит к резкому перераспределению электронной плотности в ядре так, что в положениях 2- и 4- электронная плотность понижена [Гранберг,1973, Пожарский,1986]. В результате наряду с повышенной основностью пиридина (за счет свободной пары электронов азота), его электрофильность резко подавлена, а нуклеофильные реагенты атакуют б- и г - положения в ядре. Таким образом, нуклеофильная атака, например, введение ОН-группы, становится более легкой по сравнению с электрофильным замещением (Джилкрист, 1996). С другой стороны, до сих пор не удалось получить бактериальные бесклеточные экстракты, способные трансформировать молекулу пиридина: отсюда многие стадии его деградации остаются неизученными.

Немногочисленные данные о микробном метаболизме пиридина и алкилпиридинов свидетельствуют о различающихся процессах их разложения

Такие штаммы бактерий как Brevibacterium sp. [Shukla, 1973]; Corynebacterium sp. [Shukla, Kaul, 1974]; Bacillus sp. шт. 4 [Watson, Cain, 1972]; Nocardia sp. [Watson, Cain, 1975]; Micrococcus luteus [Sims et al., 1985, 1986] могут использовать пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при его концентрации 1,5-2,0 г/л и времени утилизации от 2 до 5 дней. Первыми идентифицированными интермедиатами оказались насыщенные алифатические кислоты, янтарный и глутаровый полуальдегиды, присутствие которых свидетельствует о восстановлении пиридинового кольца [Shukla, 1973; Watson, Cain, 1975]. Вполне вероятно, что интермедиатом при деградации пиридина является 1,4-дигидропиридин (Watson, Cain, 1972), однако прямых доказательств этого процесса нет, первичные продукты восстановительной реакции не были выделены. Исследования девяностых годов дали несколько другие результаты. Бактерия Nocardia sp. КМ-2 (Коростелева, 1982) утилизировала пиридин в качестве единственного источника углерода и азота при максимально потребляемой концентрации 0,2% за 96 часов. В КЖ накапливался интермедиат, который был идентифицирован как 3-гидроксипиридин, что предполагает раскрытие кольца пиридина, предшествующее его окислению. И в этом случае в качестве интермедиата был идентифицирован янтарный полуальдегид.

На данный момент в научной литературе представлены работы по изучению биодеградации небольшого ряда алкилпиридинов, в основном метил- и этил- производных пиридина. [Bai, 2008; Stobdan, 2008; McCulloch, 2009.] В основном описаны кинетические зависимости разрушения субстратов ограниченным числом различных видов микроорганизмов, и достаточно скудно представлены материалы по изучению путей метаболизма этих соединений. К настоящему времени нет четких, обоснованных данных о путях деградации пиридина и его производных, а также диагностике штаммов, обладающих высокой деструктивной активностью по отношению к этим сильнейшим токсикантам. Так как до сих пор не удалось получить бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридины, не были определены и охарактеризованы ферменты биодеградации пиридинового кольца.

Цель. Целью работы было исследование микробной деструкции пиридиновых загрязнителей: поиск и выделение высокоактивных штаммов-деструкторов пиридина и его производных; изучение их физиологической активности; а также исследование путей и направлений биохимических реакций разложения пиридинов для использования выявленных закономерностей и выделенных бактерий - деструкторов в биотехно-логических процессах очистки промышленных сточных вод и биоремидиации почв.

Основные задачи исследований:

1. Поиск и выделение высокоактивных бактерий-деструкторов пиридиновых соединений, идентификация выделенных штаммов бактерий.

2. Изучение кинетических параметров и подбор оптимальных условий для утилизации пиридина и пиридиновых производных выделенными штаммами.

3. Оценка выживаемости и сохранения утилизирующей активности бактерий-деструкторов по отношению к исследуемым субстратам после 20 лет хранения штаммов.

4. Выделение, характеристика и определение структуры индивидуальных продуктов интермедиатов биодеградации пиридинов, методами хроматографии и хроматомасс-спектрометрии.

5. Установление путей деградации пиридина и его производных в процессе их разрушения выделенными бактериями.

7. Масс-спектрометрический анализ белкового профиля бактерий родов Arthrobacter sp. КМ-Р и Rhodococcus wratislaviensis KM-P, утилизирующих пиридин, методом матрично-активированной лазерной десорбции /ионизации (МАЛДИ).

8. Иммобилизация клеток бактерий Arthrobacter sp. КМ-Р, утилизирующие пиридин, в альгинате кальция для разработки основ биотехнологического процесса деструкции ксенобиотиков этого класса.

Научная новизна работы. Выделены бактерии-деструкторы пиридинов из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» и предприятия по синтезу легких пиридинов. Выделенные штаммы обладали исключительно высокой деградирующей активностью, были идентифицированы на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств и результатам сиквенирования 16S рРНК как представители родов Аrthrobacter и Rhodococcus .

Исходный штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 и полученные варианты обладали широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина.

Установлено, что деградация, как незамещенного пиридина, так и его производных выделенными микроорганизмами происходит по окислительному пути: гетероциклическое кольцо на первом этапе подвергается гидроксилированию вС-2 и (или) С-3 положении цикла. Впервые в качестве промежуточных продуктов метаболизма пиридина выявлены 2-гидрокси-, 2,3-дигидрокси- и 2,6-дигидроксипро-изводные. Обнаружение продуктов гидратации пиридина у Аrthrobacter sp. КМ-P и Rhodococcus wratislaviensis KM-P предполагает происхождение атома кислорода в гидроксильных группах у С-2 и С-6 из воды. На основании анализа продуктов раскрытия дигидроксипроизводных установлено, что пиридиновое кольцо подвергается гидролитическому разрыву по С-N связи обоими штаммами бактерий. Впервые при изучении метаболизма 2-МП показано, что раскрытие кольца гидрокси-2-МП между 2-м и 3-м атомами углерода с последующей реакцией конденсации приводит к образованию N-ацетилпиррола. Раскрытие кольца между 5-м и 6-м атомами углерода, аналогично, приводит к образованию N-формил-2-метилпиррола, т. е. раскрытие кольца наблюдается и в орто- и в мета-положении. В процессе метаболизма 4-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4МР образуются розовый и голубой пигменты, которые являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4- и 2,3,6-тригидрокси-4-МП, соответственно. Метаболизм 2,4-ДМП сопровождается окислением как кольца гетероцикла, так и метильных групп. Утилизация 2,6-ДМП сопровождается образованием 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридина, с раскрытием кольца в мета-положении.

Практическое значение работы. Из почв, длительное время подвергавшихся воздействию пиридина и его производных, выделены штаммы бактерий родов Аrthrobacter и Rhodococcus, которые способны разлагать устойчивые азотсодержащие поллютанты - незамещенный пиридин, 2-метил-, 4-метил-, 2,4-диметил- и 2,6-диметил-пиридины. Создана коллекция штаммов бактерий, адаптированных к высоким концентрациям токсикантов и характеризующихся высокой скоростью их разложения. Штамм Аrthrobacter sp. КМ-4 за 24 часа утилизировали 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП. Варианты штамма, утилизирующие: пиридин - Аrthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин - Аrthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин - Аrthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-ДМП - Аrthrobacter sp. КМ-2.6DMP.

Штамм Rhodococcus wratislaviensis KM-P за 24 часа утилизировал 2,5 г/л пиридина, Rhodococcus erythropolis 2.4DMP - 2,0 г/л 2,4-диметилпиридина в течение 36 часов. Штаммы утилизировали пиридин и его производные до СО₂ и Н₂О. Аrthrobacter sp. КМ-4 депонирован в ВКМ (Ас-1098Д).

Лабораторные испытания по биодеградации пиридиновых оснований, содержащихся в сточных водах коксохимического производства с помощью бактерий Аrthrobacter sp. КМ-4 показали их высокую деструктивную активность: снижение концентрации пиридинов с 75-90 мг/л до 8-15 мг/л в течение 6 часов.

Штаммы Rhodococcus wratislaviensis KM-P и Rh. erythropolis 2.4DMP утилизирующие пиридин и 2,4-диметилпиридин рекомендованы для очистки промышленных сточных вод коксохимической и химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Материалы диссертационной работы используются в лекционной работе профессорско-преподавательским составом ВУЗов КБР.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы представлены и обсуждались на 4-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Амстердам, Голландия, 1987); на конференции «Охрана окружающей среды» (Братислава, Чехословакия, 1988); на 8-м Международном симпозиуме по биотехнологии (Париж, Франция, 1988); на 3-м Симпозиуме актиномицетологов (Будапешт, Венгрия, 1988); на 5-м Международном конгрессе по коллекциям культур (Вашингтон, США, 1988); на 2-м Международном симпозиуме по микробиологии (Киото, Япония, 1989); на 3-м Съезде ВМСО и всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007); на Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); на Международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ» (Москва, 2008); на 56-ом съезде по масс-спектрометрии (Денвер, США, 2008); на 3-м Европейском конгрессе по микробиологии (Гётеборг, Швеция, 2009); на 18-ой Международной конференции по масс-спектрометрии (Бремен, Германия, 2009), на 3-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений" (Москва, 2010).

Защищаемые положения диссертации.

· Представители немицелиальных актинобактерий из р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus обладают высокой деградативной способностью в отношении широкого спектра пиридиновых токсикантов.

· Широкая субстратная толерантность, свойственная исходному выделенному из природных образцов штамму, восстановлена после хранения в виде спектра выщипившихся диссоциантов, высокоактивных в отношении отдельных субстратов.

· Бактерии-деструкторы, утилизирующие пиридин и его производные и не способные расти на их индивидуальных интермедиатах разложения пиридина, могут индуцироваться исходным субстратом (пиридином).

· Первой стадией разложения пиридина и его производных актинобактериями р.р. Аrthrobacter и Rhodococcus могут быть не только восстановление, но окисление гетероцикла, аналогично начальному этапу окисления ароматического кольца при биодеструкции замещенных фенолов.

· Разрыв окисленного кольца пиридина может идти по нескольким путям: орто-, мета- или между C-N, аналогично многочисленным путям разрушения ароматического кольца у замещенных фенолов. Дальнейшие превращения окисленных пиридинов могут осуществляться по нескольким независимым путям.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 35 работ, из них 14 экспериментальных статей в рекомендуемых ВАК`ом изданиях, 1 патент, тезисы 15 докладов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 236 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы, который включает 327 источников, содержит 27 таблицы и 40 рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры микробиологии биологического и лаборатории органического анализа химического факультетов МГУ им. М.В. Ломоносова оказавшим помощь и поддержку на всех этапах выполнения представленной работы. Автор признателен научным консультантам настоящей работы профессору Александру Ивановичу Нетрусову (Биологический ф-т, МГУ, зав. каф. микробиологии) и профессору Альберту Тарасовичу Лебедеву (Химический ф-т, МГУ, зав. лабораторией масс-спектрального анализа) за внимание и постоянный интерес к работе, а также за помощь в обсуждении результатов работы.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. В обзоре описаны основные пути микробной деструкции соединений, содержащих пиридиновое кольцо, с помощью микроорганизмов, также обобщены данные о применении метода МАЛДИ для масс-спектральной характеристики сапротрофных групп микроорганизмов по белковым профилям.

Материалы и методы исследований

Материалы. Используемые реактивы были аналитической чистоты. В качестве субстратов для деградации использовали свежеперегнанные препараты незамещенного пиридина; 2-метил- и 4-метилпиридина; 2,4- и 2,6-диметилпиридина. Чистота реактивов после перегонки составила 98% (данные ГХ-МС). В качестве соединений «свидетелей» использовали коммерческие препараты 6-гидрокси-2-метилпиридина и 5-гидрокси-2-метилпиридина. Соединения: 3-гидрокси-2,6-диметилпиридин; 4-гидрокси-2,6-диметил-пиридин; 3,4-дигидрокси-2,6-диметилпиридин; 3-гидрокси-2-метилпиридин; 2-гидрок-си-4-метилпиридин; 2,3-дигидрокси-4-метилпиридин; N-ацетилпиррол; N-формил-2-метилпиррол - были синтезированы.

Микроорганизмы. Штаммы бактерий выделяли из почв, отобранных с территорий химико-фармацевтического предприятия «Акрихин» (г. Купавна, Московская обл.) и Авдеевского коксохимического завода (г. Авдеевка, Украина) по синтезу легких пиридинов, длительно подвергавшихся воздействию пиридинов в сточных водах. Выделение бактерий проводили методом накопительных культур на жидкой синтетической среде Шуклы [Shukla, 1973]., культивировали в колбах 750мл с 200 мл среды, на качалке (200 об/мин) при 28-30⁰С. Пересевы производили до появления видимого роста микроорганизмов, с каждым разом увеличивая концентрацию вносимого субстрата. После нескольких пересевов, источник азота в виде (NH₄)₂SO₄ исключали. Чистые культуры получали по методу Коха [Нетрусов, 2005]. Морфологические особенности штаммов изучали с помощью микроскопии, используя иммерсионную систему, фазово-контрастное устройство и электронно-микроскопическую технику (Hitachi-S-405A). Идентификацию штаммов проводили согласно Берджи [Bergey's, 1986].

Секвенирование последовательности гена 16S рРНК. ДНК из клеток бактерий выделяли по методу [Булыгина, 2002]. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием системы универсальных праймеров [Edwards, 1989]. Состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры по 25 пмоль, каждого; 10 Ч буфер - 2,5 мкл; 2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата - 2,5 мкл; Bio Taq-полимераза 5Е/мкл - 0,2 мкл («Диалат», Москва); ДНК-матрица - 50 нг; Н₂О - до 25 мкл. Реакцию проводили по схеме: до 30 циклов амплификации при следующем температурном режиме: денатурация ДНК при 94^оС - 0,5 мин; отжиг праймеров при 45^оС - 1 мин; элонгация при 72^оС - 1 мин; окончательная полимеризация - 7 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Использовали систему видеодокументации BioDocII (Biometra, Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing, (Promega, США), согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Для сиквенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры. Чтение проводили в двух направлениях.

Первичный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью сервера BLASTA, и выравнивание последовательностей - с помощью программы CLUSTAL.W [Thompson, 1994]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer, 1994].

Количественные определения потребления пиридинов из культуральной жидкости (КЖ) проводили на спектрофотометре «Hitachi-200-20» (Япония) при следующих длинах волн: 255 нм для пиридина (П); 262 нм для 2-метилпиридина (2-МП) и 4-метилпиридина (4-МП); 260 нм для 2,4-диметилпиридина (2,4-ДМП); 268 нм для 2,6-диметилпиридина (2,6-ДМП). Для этого культуру подкисляли HCl, отделяли клетки центрифугированием, 1 мл супернатанта доводили до 100 мл 0,1 н раствором HCl и определяли величину оптической плотности. Калибровочную кривую строили по анализируемым субстратам.

Хранение исходного штамма Arthrobacter sp. KM-4. Лиофилизацию клеток осуществляли на центробежно-сублимационной установке (Edvards High Vacuum Company, Англия). Высушивание - 3 часа на первичной сушке 3ОРI при остаточном ваккуме 110 мм рт.ст., t рефрижератора - 45^оС и t сублиматора - 22^оС. Ампулы с клетками с остаточной влажностью 2,0-3,0 %, запаивались под ваккумом и хранились при 4^оС без доступа света [Герна, 1983]. Тест на «ускоренное хранение» проводили по методу [Banno, Sakane, 1981]. Криоконсервацию суспензии клеток проводили ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения ~ 400 град/мин путем непосредственного погружения в жидкий азот и последующим хранением при -196^оС.

Определение потребления пиридина суспензией и иммобилизованными клетками Аrthrobacter sp. KM-P Скорость утилизации пиридина оценивали суспензией свободных и иммобилизованных в альгинате кальция клеток на среде следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄·7H₂O - 0,2; FeSO₄·7H₂O - 0,01; CaCl₂·2H₂O - 0,02; MnSO₄·H₂O - 0,002; Na₂MoO₄ - 0,001; pH 7,0-7,2.В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях по 1,5, 2,5, 3,0 и 3,4 г/л. В каждую из колб ввели по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками и культивировали при аэрации и 28^о-30^оС. Пробы на предмет утилизации 1,5 г/л пиридина отбирали через каждые 3 часа и через каждые 6 часов для остальных концентраций.

Выделение и идентификация индивидуальных продуктов деградации пиридинов. Экстракты 1-3, полученные при рН 8,0-9,0; 7,0-7,5 и 2,0-3,0 из 1-2 л КЖ, упаривали, остаток растворяли в 0,5-1,0 мл этанола и проводили разделительную хроматографию на пластинках “Silufol UV - 254” (DC-Alufolies Kieselgel 60 F_254, Merck, Германия) и пластинках с целлюлозой (TLC-Ready Plastic Sheets F_1440, Merck, Германия). Использовали следующие системы растворителей 1 - хлороформ-метанол (20:3); 2 - хлороформ-ацетон-этанол (7:2:2); 3 - этанол-аммиак-вода (20:1:4); 4 - петролейный эфир-этилацетат (1:5). Хроматограммы проявляли в УФ-свете или парами йода. Фенольные соединения - опрыскивая хроматограммы 2% спиртовым раствором FeCl₂; кетокислоты - 0,5% раствором 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 н растворе HCl; карбоновые кислоты - 0,05% спиртовым раствором бромкрезолового зеленого (рН 7,0-8,0). Для препаративного выделения индивидуальных продуктов использовали тонкослойную и колоночную хроматографию. В первом случае экстракты, растворенные в этаноле, хроматографировали на силикагеле (PSC- Fertigplatten Kieselgel 60 F_254, Merck, Германия), используя системы растворителей 1, 2 и 3. Хроматографические зоны сорбента вырезали и элюировали этанолом, полученные растворы фильтровали, фильтраты упаривали, осадок анализировали.

Для препаративного выделения карбоновых кислот использовали колоночную хроматографию (30х1,7) на целлюлозе (Silicagel L 40/100, Chemapol, CzSR) в системе растворителя 3, а также тонкослойную препаративную хроматографию в системах растворителей 2, 3 и 4. Структуру выделенных индивидуальных соединений доказывали анализом их масс-, УФ-, ИК- и ЯМР-спектров. 2,4-динитрофенилгидразоны кетокислот получали путем обработки образцов раствором 2,4-ДНФГ в хлорной кислоте с последующим разделением в тонком слое силикагеля, в системе петролейный эфир-этилацетат-уксусная кислота (26:14:3).

Триметилсилилирование полученных образцов проводили по методу, описанному в [Gehrke, Laking, 1971]: к исследуемому образцу добавляли 25 мкл ацетонитрила, 25 мкл дихлорэтана и 50 мкл бистриметилсилилтрифторацетамида (Regisil BSTFA), смесь выдерживали 30 мин при 150-160^оС.

Хроматомасс-спектральный анализ проводили на приборе «Varian-MAT-211» со стеклянной капиллярной колонкой (50м x 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-30. Масс-спектры получали на приборе « Finigan МАТ-4615» методом химической ионизации (газ-реагент NН₃) при энергии ионизации 70 эВ с прямым вводом вещества в ионный источник. Спектры ЯМР ¹Н сняты на спектрометре «Tesla BS-467» в растворе СDСl₃, внутренний стандарт - тетраметилсилан (ТМС).

Выделение и идентификация продуктов деградации 2-МП Пробы отбирали в динамике роста культуры в объеме 200 мл, подкисляли до рН 2,0-3,0 HCl, клетки отделяли центрифугированием, 30 мл супернатанта трижды экстрагировали 10 мл свежеперегнанного дихлорметана. Суммарную кислотную дихлорметановую вытяжку (~30 мл) упаривали на роторном испарителе до объема ~3 мл (экстракт 1). Оставшийся водный раствор подщелачивали до рН 8,0-9,0 40% раствором NаOH, после чего трижды экстрагировали 10 мл дихлорметана. Суммарную вытяжку упаривали до объема ~3 мл (экстракт 2). Для получения дериватизированных экстрактов 30 мл КЖ упаривали досуха на роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 2 мл дихлорметана, в полученный раствор добавляли 1 мл раствора BF₃ в метаноле, кипятили 2 мин и трижды промывали дистиллированной водой. Конечный объем составлял ~3 мл (экстракт 3). Аналогичным образом была проведена дериватизация кислотного экстракта (экстракта 1), к которому добавляли 1 мл раствора BF₃ в метаноле и кипятили 2 мин, после чего экстракт трижды промывали дистиллированной водой, упаривали до конечного объема 3 мл (экстракт 4). Силилирование продуктов деградации 2-МП из экстрактов КЖ проводили N,O-бис(триметилсилил)-ацетамидом. К 1 мл экстракта добавляли 10 мкл силилируещего агента. Процесс проводили в ультразвуковой бане в течение 2 часов при 60^оС. Затем аликвоту объемом 100 мкл доводили дихлорметаном до 1 мл. Анализ продуктов, содержащихся в экстрактах, проводили на масс-спектрометре ГХ-МС (LECO Pegasus 4D, Германия), снабженном капиллярной силиконовой колонкой RTX-5MS (30 м), при энергии ионизующих электронов 70 эВ. Диапазон регистрируемых масс - от 29 до 500 Да. Экстракты хроматографировали в температурном режиме: 2 мин при 50^oС, 2 мин при 280^оС, скорость нагрева - 20^оС/мин. Объем вводимой пробы - 0,1 мкл. Компоненты анализируемых смесей идентифицировали с помощью компьютерных библиотек масс-спектров органических соединений: 1) NIST - National Institute of Science and Technology, библиотека на 130 тысяч соединений; 2) WILEY-библиотека на 275 тысяч соединений, а также вручную с использованием известных направлений распада молекулярных ионов органических соединений [Лебедев, 2003].

Количественный масс-спектрометрический анализ КЖ 2-МП, проводили в пробах, отобранных в динамике роста культуры (3; 6; 9; 12; 18; 20 и 22 ч). В качестве внутреннего стандарта использовали пердейтерированный нафталин, в количествах 10-100 мкг в зависимости от соотношения аналитических сигналов самого стандарта и определяемых компонентов. Определение проводили по площадям хроматографических пиков по полному ионному току и по отдельным характеристическим ионам в масс-спектрах при использовании метода внутреннего стандарта. Количество определяемого вещества рассчитывается по формуле: m_x = S_x х m_st/S_st, где S_x и S_st - площади хроматографических пиков продукта и внутреннего стандарта соответственно, а m_х и m_st - их количество [Золотов, 2002].

Синтезом соединений - «свидетелей» подтверждали структуры интермедиатов, обнаруженных в ходе анализа. N-ацетилпиррол синтезировали по методу, предложен-ному в работе [Drew et al., 1985], 3-гидрокси-2-метилпиридин - в работе [Williams et al., 1955].

Результаты и обсуждение

1. Выделение штаммов-деструкторов и оценка утилизации ими пиридина и его производных. Из почв, которые в течение долгого времени подвергались воздействию сточных вод, содержащих пиридин и его производные, были выделены в виде чистых культур, штаммы бактерий - деструкторов пиридинов. По результатам идентификации штаммов на основании фенотипических и генетических методов анализа, они были отнесены к родам Аrthrobacter и Rhodococcus.

Утилизацию субстратов изучали в динамике роста штаммов на минеральной среде, содержащей пиридины как единственные источники углерода, азота и энергии.

Штамм Arthrobacter sp. КМ-4 обладал широкой субстратной специфичностью по отношению к производным пиридина и исключительно высокой деградирующей активностью: за 24 часа штамм утилизировал по 2,5 г/л пиридина и 2-МП, 1,5 г/л 4-МП и 3,0 г/л 2,6-ДМП. Arthrobacter sp. КМ-4 был способен использовать перечисленные субстраты, как по отдельности, так и в смеси, самая высокая концентрация (3 г/л), которой не должно было превышать для их полной утилизации. В процессе работы с Arthrobacter sp. КМ-4, когда культивирование штамма проводили исключительно на индивидуальном субстрате, были изолированы 4 варианта исходной культуры: вариант штамма, утилизирующий пиридин - Arthrobacter sp. КМ-Р; 2-метилпиридин - Arthrobacter sp. КМ-2МР; 4-метилпиридин - Arthrobacter sp. КМ-4МР и 2,6-диметилпиридин - Arthrobacter sp. КМ-2.6DMP (рис. 1-4).

Рис. 1. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-Р на пиридине.

Изучение влияния температуры на скорость утилизации субстратов с учетом их летучести показало, что оптимальной для их метаболизма является 28-30^оС. Однако процесс мог протекать и при более низкой (22-24^оС), при которой полное потребление веществ наблюдается за 40 ч роста, и при более высокой (40^оС) температуре. Для роста штамма бактерий оптимальной была концентрация пиридина 2,5 г/л, которая утилизировалась за 24 часа (рис. 1). Аналогичны показатели и для 2-МП (рис.2).

Рис. 2. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-2МР на 2-МП.

Для 4-МП оптимальной была концентрация 1,5 г/л: утилизировался бактериями за 24ч (рис. 3).

Рис. 3. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-4МР на 4-МП.

Наибольшая деградирующая активность у штамма проя-вилась относительно 2,6-ДМП: за 24 часа было потреблено 3,0 г/л этого субстрата (рис. 4).

Рис. 4. Утилизация субстрата (а) и накопление (б) биомассы при росте штамма Arthrobacter sp. KM-2.6DМР на 2,6-ДМП.

Перекрестные пересевы каждого их вариантов на другие субстраты, показало, варианты, утилизирующие 2-МП и 2,6-ДМП без лаг-фазы расли и взаимно утилизировали оба субстрата, тогда как варианты, утилизирующие пиридин и 4-МП росли исключительно на своих субстратах.

Штамм Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р обладал высокой деструктивной активностью по отношению к пиридину, утилизируя 2,5 г/л субстрата за 24 часа (рис. 5). При этом катаболизм пиридина штаммом проходил без длительного лаг-периода.

Рис. 5. Утилизация субстрата (a) и накопление (б) биомассы при росте штамма Rhodococcus wratislaviensis KM-P на П.

Наиболее интенсивное потребление субстрата (30%) наблюдалось между 18 и 21 час и рост штамма на пиридине не сопровождается образованием пигмента

Штамм Rhodococcus erythropolis 2.4DMP, обладал довольно высокой деструктивной активностью по отношению к 2,4-ДМП: 2,0 г/л субстрата утилизировалось за 36 часов (рис. 6). Для штамма была характерна узкая субстратная специфичность, он утилизировал только 2,4-ДМП, на котором был выделен.

Рис. 6. Утилизация субстрата (a) и накопление биомассы (б) при росте штамма Rh. erythropolis 2.4DMP на 2,4-ДМП.

2. Кинетика утилизации пиридина штаммами Arthrobacter sp. KM-Р и Rhodococcus wratislaviensis KM-P. Штамм Rh. wratislaviensis KM-P, в отличие от Arthrobacter sp. КМ-Р, целенаправленно выделяли, используя в качестве ростового субстрата пиридин, и обладал узкой субстратной специфичностью. Время утилизации (24 ч) и концентрации пиридина (по 2,5 г/л) для обоих штаммов идентичны. Для более полного описания утилизирующей активности штаммов, были рассчитаны следующие кинетические параметры: удельная скорость роста культуры, экономический коэффициент Ys и удельная утилизирующая активость биомассы q. Графики, использованные для расчета удельной скорости роста и экономических коэффициентов Rh. wratislaviensis КМ-Р и Arthrobacter sp. КМ-Р приведены на рис. 7, 8 и рис. 9, 10, соответственно.

Рис. 11. Жизнеспособность Аrthrobacter sp. KM-4 по результатам «теста на ускоренное хранение» в: а) лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита (46 лет); b) 5% раствор трегалозы (4 года); c) сухом молоке (5 лет).

Из их анализа следует, что на лошадиной сыворотке с 5% раствором мезо-инозита титр жизнеспособных клеток снизится до ~ 10² кл/мл за 46 лет (а); 5% растворе трегалозы - за 4 года (b); на сухом молоке - за 5 лет хранения (с).

Прогнозирование выживаемости лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4, основанное на «тесте ускоренного хранения», базируется на следующих теоретических положениях. Первое состоит в том, что скорость снижения выживаемости лиофилизированных клеток подчиняется уравнению кинетики 1-го порядка. Отсюда зависимость выживаемости от времени хранения при постоянной температуре носит экспоненциальный характер. Второе теоретическое положение основано на использовании уравнения Аррениуса при описании зависимости константы скорости К от температуры хранения. Результаты расчетов коэффициента К уравнения Аррениуса согласно [Banno, Sakane, 1981; Griffin et al., 1981] представлены на рисунке 11.

Рис. 11. Расчет коэффициента К уравнения Аррениуса [Banno, Sakane, 1981, Griffin, et al.,1981].

Как видно из рисунка, экспериментальные значения lg К=f (I/Т?10³), соответствующие использованным нами температурам 4^о, 28^о и 37^оС, легли на одну прямую, что подтверждает возможность применения теста для прогнозирования возможного времени хранения лиофилизированной культуры.

Оценка утилизирующей активности лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 после хранения при разных температурах (4^о, 28^о и 37^оС) показала, что при использовании всех защитных сред и разных температурных значений способность утилизировать 2,6-ДМП сохранялась на высоком уровне (табл. 4).

Таблица 4. Результаты «теста на ускоренное хранение» лиофилизированных клеток штамма Arthrobacter sp. KM-4 в различных защитных средах (утилизация 2,6-ДМП)

*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа

3.3. Криоконсервация. Криоконсервация в настоящее время является наиболее перспективным методом длительного хранения коллекционных штаммов микроорга-низмов [Shannon, et al., 1975, Calcott, 1978, Пучков и др., 1983, Пушкарь и др., 1983].

Для криоконсервации штамма Arthrobacter sp. KM-4 в качестве криопротекторов были выбраны: 10% раствор глицерина; 12% раствор сахарозы; 5% раствор трегалозы и лошадиная сыворотка с 5% раствором мезоинозита (табл. 5).

Таблица 5. Жизнеспособность штамма Arthrobacter sp. KM-4 при криоконсервации

Наиболее высокий титр жизнеспособных клеток ~ 40% от исходного, был получен при использовании 10% глицерина: жизнеспособность клеток за 9 месяцев хранения снизилась только на 5%. Эти данные согласуются с имеющиеся в литературе (Аркадьева, 1983) сведениями о том, что глицерин является одним из универсальных криопротекторов. Наиболее низкое значение жизнеспособности ~10% от исходного, было получено при использовании 12% сахарозы: за время хранения наблюдалось резкое падение титра жизнеспособных клеток до ~ 0,75%. В вариантах криоконсервации Arthrobacter sp. KM-4 в 5% трегалозы, а также лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита титр жизнеспособных клеток сразу после консервации был значительно ниже, чем при использовании глицерина. Однако в лошадиной сыворотке с 5% мезо-инозита за 9 месяцев хранения жизнеспособность не снижалась и составила ~ 20%, как и сразу после криоконсервации. За это же время при использовании 5% трегалозы наблюдалось снижение жизнеспособности с ~ 27 до ~ 20%(табл. 5).

Утилизирующая активность штамма Arthrobacter sp. KM-4 после криоконсервации сохранялась на высоком уровне при использовании лошадиной сыворотки с 5% мезо-инозита и была равна 100%, тогда как на остальных криопротекторах наблюдалось некоторое снижение активности (табл. 6).

Таблица 6. Утилизация 2,6-диметилпиридина штаммом бактерий Arthrobacter sp. KM-4

*Примечание: за 100% утилизирующую активность принята утилизация штаммом Arthrobacter sp. KM-4 3,0 г/л 2,6-диметилпиридина за 24 часа

Таким образом, исследования по оценке эффективности использованных защитных сред при лиофилизации и криоконсервации как жизнеспособности клеток, так и их утилизирующей активности по отношению к 2,6-ДМП, и подтвержденные «тестом на ускоренное хранение» позволили рекомендовать для длительного хранения штамма Arthrobacter sp. KM-4 использование лошадиной сыворотки с 5% раствором мезо-инозита в качестве защитной среды.

После 20 лет хранения штаммов - деструкторов количество жизнеспособных клеток составило 10⁷ кл/мл, что достаточно для восстановления бактериальной популяции [Ившина, 2005]. Исходная плотность клеток в суспензии для консервации составляла 10⁹ кл/мл. Оценка утилизирующей активности штамма при росте на среде, содержащей 2,6-ДМП как источник азота, показала, что способность утилизировать субстрат, на котором он был выделен, сохранилась на высоком уровне. К деструкции пиридина, 2-МП и 2,6-ДМП, варианты штамма Arthrobacter sp. KM-4 приступали без лаг-фазы. Первоначальная активность бактерий (1,5, 2,0 и 3,0 г/л упомянутых субстратов соответственно за 24 ч), восстановилась за несколько пассажей на минеральной среде с субстратами. В результате многократных пересевов активность вариантов штамма значительно возросла и в настоящее время оценивается утилизацией по 2,5 г/л пиридина и 2-МП за 24 часа. Восстановительный период для штамма Rhodococcus wratislaviensis KM-Р, разрушающего пиридин, длился месяц. При длительных пересевах активность штамма возросла с 1,5 г/л за 36 часов до 2,5 г/л за 24 часа. Для штамма Rhodococcus erythropolis 2.4DMP разрушающего 2,4-ДМП, адаптационный период был длительным (1 год).

4. Масс-спектрометрический анализ клеток бактерий. Масс-спектрометрия была впервые применена для анализа микроорганизмов по типу «отпечатков пальцев» в 70-х годах прошлого века [Anhalt, Fenselau, 1975], используя в качестве одного из маркеров белки. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) позволяет получить информацию о молекулярной массе белков, и продуктов их энзиматического расщепления. Наиболее часто используемые матрицы при исследовании белкового профиля бактерий: 2,5-дигидроксибензойная (DHB); б-циано-4-гидроксикоричная (HCCA); синапиновая кислоты (SA).

4.1. Сравнительный анализ биодеградирующих штаммов Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis КМ-Р методом МАЛДИ. Исследуемые штаммы - деструкторы пиридина представлены грамположительными клетками, их суспендирование проводили в 50% растворе ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУК) с обработкой клеток ультразвуком для разрушения клеточной стенки. Первый этап работы включал подбор подходящей матрицы. Были опробованы DHВ, HCCA, SA. При использовании DHВ не удалось получить хорошего разрешения анализируемом диапазоне масс. На рис. 12 приведены два спектра МАЛДИ для штамма Arthrobacter sp. КМ-P, полученных на HCCA и SA. Видно, что при использовании SA визуализируется гораздо больше пиков, следовательно, полученный МАЛДИ-спектр является более полным.

Рис. 14. Сравнение относительной интенсивности пиков, общих для штаммов Arthrobacter sp. KM-Р и Rh. wratislaviensis KM-P.

Таким образом, для двух немицелиальных актино-бактерий разных видов при анализе методом МАЛДИ удалось выявить сходство их белковых профилей. Можно предположить, что белки, дающие сигнал в спектре обоих штаммов, относится к ферментной системе, осуществляющей деградацию пиридина.

4.2. Влияние условий культивирования на МАЛДИ-профиль бактерий. Анализ проведен на примере штамма Arthrobacter sp. KM-P. Постулируется, что вне зависимости от условий культивирования клетки конкретного микроорганизма вырабатывают определенный набор белков, пики молекулярных ионов которых должны присутствовать в спектре [Bernardo et al., 2002]. При этом, безусловно, возможны существенные изменения в интенсивности соответствующих пиков.

ля проведения сравнительного анализа белковых профилей, полученных методом МАЛДИ, клетки Arthrobacter sp. КМ-Р выращивали на трех различных средах: агаризованной минеральной среде с пиридином (АМП), сусло-агаре (СА) и мясо-пептонном агаре (МПА). На рис. 15 приведены полученные для всех трех вариантов спектры.