Деградация пиридина и его производных представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus

Рис. 15. Белковые профили (МАЛДИ) штамма Arthrobacter sp. КМ-P на разных средах.

Как и предполагалось, характерный для Arthrobacter sp. КМ-P пик с максимальной интенсивностью и m/z 7297-7299 сохраняется при всех условиях культивирования. Обратим внимание, что наибольшее число значимых пиков наблюдается в спектре, полученном для клеток, выращенных на АМП. Эта среда является наиболее бедной из всех трех использованных, в ней единственным источником углерода, азота и энергии для роста бактерий является пиридин. По всей видимости, в связи с этим, клетки штамма максимально активизируют ферментные системы, что приводит к синтезу белков, обладающих деструктивной и каталитической активностью. Для более удобного визуального сравнения на рис. 16 приведена гистограмма, отображающая относительные интенсивности основных пиков МАЛДИ-профилей, полученных для каждой из трех сред. Интересно, что пики, кроме основного пика с m/z 2797, были общими в спектрах клеток Arthrobacter sp. КМ-P и Rh. wratislaviensis KM-P, выращенных на АМП. В МАЛДИ-профилях клеток Arthrobacter sp. КМ-P, культивируемых на органических средах (СА и МПА), отсутствуют.

Рис. 16. Гистограмма, демонстрирующая совпадение пиков при анализе Arthrobacter sp. KM-Р, на различных средах.

Таким образом, вне зависимости от условий культивирования, штамм бактерий может быть успешно идентифицирован с применением МАЛДИ-МС.

5. Исследование путей деградации пиридина е его производных.

Обычно данные о путях метаболизма органического соединения получают при работе с бесклеточными экстрактами, определяя активности соответствующих ферментов. К настоящему времени с использованием такой методологии достаточно хорошо изучен метаболизм бензольного кольца под воздействием бактерий. Деструкция фенолов, например, проходит с образованием пирокатехина, который далее может подвергаться расщеплению в мета- или в орто-положении. Было показано, что ключевыми ферментами биодеградации фенолов являются пирокатехин-1,2- или 2,3-диоксигеназы, которые были выделены и охарактеризованы [Солянникова, 2007]. О реакциях раскрытия пиридинового кольца однозначной информации нет. Это, с одной стороны, обусловлено физико-химическими особенностями азотсодержащего гетероцикла [Джилкрист, 1996], с другой - безуспешностью попыток получить каталитически активные бесклеточные экстракты, трансформирующие пиридин и его производные. Так как ферменты биодеградации пиридинового кольца не были выделены и охарактеризованы, к настоящему времени нет обоснованных данных о путях деградации этих токсикантов.

Исследования путей деградации этих соединений штаммами актинобактерий проводили в динамике роста их культур. Интермедиаты, накапливаемые в КЖ, были обнаружены и извлечены. Выделенные образцы, состояли, как правило, из смеси веществ, и содержались в малых количествах (мкг). Поэтому идентификацию многих из них удалось осуществить в виде триметилсилилированных производных при использовании хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС).

5.1. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Аrthrobacter sp. КМ-Р. Из экстракта 1 (щелочного) было выделено вещество, которое присутствовало в КЖ в следовых количествах. Основное количество этого вещества (2-3 мг) было выделено из экстракта 3 (кислого). При анализе методом ВЭЖХ оказалось, что время удерживания (R_f) 2,4-динитрофенилгидразона этого соединения идентично R_f 2,4-ДНФ-гидразона синтетического свидетеля - янтарного полуальдегида (120 сек).

Хроматографирование экстракта 2 (нейтрального) показало присутствие соединения, которое окрашивалось FeCl ₂. Оно не соответствовало по значению R_f ни одному гидроксипиридину, что давало основание предположить наличие двух гидроксильных групп в пиридиновом кольце. Хроматомасс-спектральный анализ данного образца доказал наличие в нем нескольких соединений, одно из которых имело м.м. 111 и соответствовало дигидроксипиридину (табл. 7, I).Для разделения этой смеси образец триметилсилилировали и исследовали хроматомасс-спектрометрически. После указанной обработки в образце удалось выявить два соединения: с молекулярными массами 183 и 257.

Масс-спектральный распад первого вещества соответствовал распаду моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина, в котором просилилировался один атом водорода гидроксила (табл. 7, II). Молекулярная масса, а также распад второго соединения указывали на то, что оно является продуктом присоединения воды к молекуле гидроксипиридина в положении С-6 (С-2). Учитывая сравнительно низкую величину времени удерживания (t_уд) для этого соединения на хроматограмме (5 мин 39 сек) которая оказалось близко к t_уд бис-ТМС-производного (см. далее) 2,6-дигидрокси-пиридина. Наиболее вероятной для этого гидрата гидроксипиридина можно считать структуру 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (табл. 7, III).

Для выявления структуры дигидроксипиридина был проведен дополнительный анализ КЖ, снятой в середине экспоненциальной фазы роста культуры. С помощью тонкослойной препаративной хроматографии на силикагеле из экстракта 2 был выделен образец, который давал характерное окрашивание с FeCl₂. После обработки бистриметилилсилилтрифторацетамидоном образец был исследован хроматомасс-спектрометрически. В нем было обнаружено 5 соединений: два изомера с м.м. 255, соответствующие дигидроксипиридинам, в которых два атома водорода замещены ТМС-группами, соединение с м.м. 167, соответствующее гидроксипиридину и два продукта раскрытия пиридинового кольца с м.м. 161 и 248.

Один из изомеров с м.м 255 с большим значением R_f на хроматограмме (6 мин 38 сек) имел хроматографические характеристики такие же, как у синтетического свидетеля ТМС-производного 2,3-дигидроксииридина (6 мин 40 сек).

Время удерживания второго изомера (5 мин 45 сек) резко отличалось от аналогичной характеристики синтетического ТМС-производного 2,5-дигидрокси-пиридина (7 мин 35 сек). Очень короткое время удерживания для выделенного изомера с м.м. 255 свидетельствовало о высокой пространственной затрудненности его атома, что исключает возможность присутствия 2,5-, 3,4- и 2,4-изомеров. Это позволяет предположить для данного соединения единственно возможную структуру бис-ТМС-производного 2,6-дигидроксипиридина (табл. 7, IV).

Масс-спектр гидросипиридина с м.м. 167 был идентичен спектру ТМС-производного синтетического 3-гидроксипиридина.

Анализ соединения с м.м. 161 позволяет предложить для него структурную формулу 3-амино-2 (либо 3)-гидроксипропионового альдегида в виде моно-ТМС-производного(табл. 7, V). Этот альдегид может образовываться из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидро-пиридина при его гидролитическом окислении.

Вещество с м.м. 248 (ТМС-производное) представляет собой, по-видимому, 2-гидроксималоновый полуальдегид. Вероятно, он образуется аналогично предыдущему соединению из 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина в результате его гидролитического дезаминирования (табл. 7, VI).

Таблица 7. Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина (Arthrobacter sp. KM-P)

Соединения	Структура соединений	m/z	Интенсив-ность в % к максималь-ному пику	Процесс образования фрагмента
Дигидрокси-пиридин (I)		111 109 83 82 71 55	12 11 74 29 100 46	М М-2Н М-СО М-СНО М-С2Н2N М-2СО
2,3-дигидрок-сипиридин (моно-ТМС-производное) (II)		183 168 155 150 139 112 73	30 17 4 5 15 4 100	М М-СН3 М-СО М-СН3-Н2О М-СН3-СНО М-СН3-СНО-НСN Si(СН3)3
2,6-дигидрок-си-1,2-дигид-ропиридин (бис- ТМС-производное) (III)		257 215 185 145 129 103 73	30 87 72 100 16 33 72	М М-СН2-СО (М-(СН3)2SiСН2) = А А-C3H4 А-C2H2NО А-C3H4NCО Si(СН3)3
2,6-дигидро-ксипиридин (бис-ТМС-производное) (IV)		255 240 225 156 103 96 73	7 10 38 14 58 15 100	М М-СН3 М-2СН3 М-СНСОSi(СН3)2 СН2ОSi(СН3)3 М-2СН3-Si(СН3)3-2СО Si(СН3)3
3-амино-2-ги-дроксипропи-оновый аль-д (ТМС-производное) (V)		161 146 118 116 103 75 73	2 80 38 20 65 100 50	М М-СН3 М-СН3-СО М-СН3- СН2NН2 М-2СН3-СО (СН3)2 SiОН Si(СН3)3
2-гидрокси-малоновый полуаль-д. (ТМС-производное) (VI)		248 233 218 205 189 147 117 103 89 73	5 2 30 85 40 68 50 20 9 100	М М-СН3 М-2СН3 М-СН3-СО М-СН3-СО2 (СН3)3SiОSi(СН3)2 СООSi(СН3)3 (СН3)3 SiОСН2 (СН3)3SiО Si(СН3)3
5-амино-2-ок-со-4-пентено-воя к-та (бис-ТМС-произ-водное) (VII)		273 258 229 228 214 156 147 117 102 73	16 10 6 6 4 62 52 4 4 100	М М-СН3 М-СН3-СНО М-СН3-СН2О М-СН3-СО2 М-СООSi(СН3)3 (СН3)3 SiОSi(СН3)2 СООSi(СН3)3 СООSi(СН3)2 Si(СН3)3
2,3,6-тригид-рокси-5,6-ди-гидропиридин (VIII)		129 111 101 95 84 60 56 45 44	86 16 16 28 100 52 82 83 86	М М-Н2О М-СО М-2ОН М-Н2О-НСN М-СО-СНСО(С2Н6NО) С3Н4О(С2О2) С2 Н5О С2 Н4O
пигмент азахиноновой природы (IX)		369 368 339 313 299 297 284 256 255 239 237 236 213 200 199 185 71 55	4 6 2 4 3 3 5 13 5 7 5 7 7 4 5 10 40 100	М М-Н М-Н-НСО M-2CO М-NС2О2 М-H-HNС2О2 (М-НNСO-NСO )=A (A-CO) = B (М-2HNСO-CО)=B Б-OH B-H2O B-H2O-H (A-HNCO-CO) = Г Б-2СO Б-СO-СНO Г-СО С2НNO2 С2НNO
бис-ТМС-производное полуамида винной кислоты (X)		293 218 205 191 177 147 133 129 117 103 73	3 20 45 5 5 60 8 9 28 31 100	М М-ОSi(СН3)2 (М-NHSi(СН3)3 )=А М-СН3NSi(СН3)3 М-(СН3)3SiNHCO HOCHCOOSi(СН3)3 A-Si(СН3)2СН2 A-(СН3)2SiНOH COOSi(СН3)3 СН2OSi(СН3)3 Si(СН3)3

5.2. Превращение 2- и 3-гидроксипиридинов штаммом Arthtrobacter sp. KM-Р.

Полагая, что 2- и 3-гидроксипиридины являются одними из интермедиатов начального пути деградации пиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM-Р, была проверена способность штамма расти на этих субстратах. Культура не росла на гидроксипиридинах (0,5-1,0 г/л), хотя клетки оставались жизнеспособными длительное время. Внесение в среду пиридина (до 0,3 г/л) стимулировало потребление гидрокси-пиридинов и рост биомассы. При хроматографировании экстрактов КЖ, выросшего на 2-гидроксипиридине штамма, кроме исходного соединения были обнаружены два вещества, окрашивающиеся 2,4-ДНФГ, а также пигмент интенсивно голубой окраски.

Хроматомасс-спектральный анализ показал, что оба вещества, дающие реакцию с 2,4-ДНФГ, имели м.м. 129. Масс-спектральный распад одного из них соответствовал структуре 2,3,6-тригидрокси-5,6-дигидроксипиридина (табл. 7, VIII), который является продуктом гидратации 2,3-дигидроксипиридина.

Распад второго вещества с такой же м.м. позволил идентифицировать его как 5-амино-2-оксо-4-пентеновую кислоту (табл. 7, VII), которая является продуктом гидролиза 2,3-дигидроксипирдина. Такая структура полностью подтверждается данными ИК-спектра, в которой наблюдали полосы поглощения в области 1680 см^-1 (н_с=0), 1600 см^-1 (н_с=0) и размытую полосу 3400 см^-1 (н_NH+COOH).

Данные масс-спектра голубого пигмента (м.м 369) говорят о том, что он имеет азахиноновую структуру. В масс-спектральном распаде этого пигмента наблюдались многократные потери молекул СО, NCO, HNCO, H₂O, что характерно для таких полиненасыщенных хиноноподобных структур. Крайне малые количества этого вещества не позволили проанализировать его с помощью других физико-химических и спектральных методов исследования. Можно предположить, что обнаруженный нами голубой пигмент является продуктом конденсации трех молекул тригидроксипиридина (табл. 7, IX).

Продукты трансформации 2-гидроксипиридина, обнаруженные хроматомасс-спектрометрически в КЖ после предварительного хроматографического разделения на пластинке с последующим бистриметилсилилированием образцов, включали вещества с м.м. 183, 227, 273 и 293. Первое вещество по R_f 5 мин 5 сек и масс-спектральному распаду отличалось от моно-ТМС-производного 2,3-дигидроксипиридина (R_f = 5 мин 29 сек), который имеет такую же молекулярную массу. Такая малая величина t_уд на хроматограмме может соответствовать только моно-ТМС-производному 2,6-дигидрок-сипиридина, так как R_f для моно-ТМС-производных 2,3-, 3,4- и 2,5-дигидрокси-пиридинов близки между собой, но резко отличаются от R_f 2,6- производного.

Соединение с м.м. 273 соответствовало бис-ТМС-производному 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты (табл. 7, VII). Масс-спектральная фрагментация вещества с м.м. 293 позволила предположить для него структуру бис-ТМС-производного полуамида винной кислоты (табл. 7, X). Появление этого соединения в КЖ можно объяснить как результат раскрытия 2,3,6-тригидроксипиридина с последующим дигидроксили-рованием полуамида малеиновой кислоты.

Как и в опыте с 2-гидроксипиридином, добавление пиридина индуцировало потребление 3-гидроксипиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM-Р.

Анализ экстракта КЖ с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе 1 показал, что кроме исходного 3-гидроксипиридина он содержит еще несколько полярных веществ с близкими значениями R_f. Смесь этих веществ была выделена с помощью препаративной колоночной хроматографии на силикагеле и обработана бистриметилсилилтрифторацетамидом. При хроматомасс-спектральном анализе этой смеси были обнаружены четыре вещества с м.м. 183, 227, 293 и 219. Первое соединение соответствовало по величине R_f и масс-спектру моно-ТМС-производному 2,3-гидроксипиридина, а два других с м.м. 227 и 293-бис-ТМС-производным 2-гидроксипиррола и полуамида винной кислоты. Для вещества с м.м. 219, основываясь на данных его масс-спектра, можно предположить структуру бис-ТМС-производного аминоуксусной кислоты (глицина). Появление последнего в КЖ можно объяснить окислительно-восстановительными превращениями 5-амино-2-оксо-4-пентеновой кислоты, хотя присутствие глицина может иметь неспецефический характер.

Суммируя все вышеизложенное, путь катаболизма незамещенного пиридина штаммом Arthtrobacter sp. KM-Р можно представить следующим образом (рис. 17).

Рис. 17. Катаболизм пиридина (I) штаммом Аrthrobacter sp. КМ-Р

II - 3-гидроксипиридин; III - 2-гидроксипиридин; IV - 2,5-дигидроксипиридин; V - 2,3-дигидроксипиридин; VI - 2,3,5-тригидроксипиридин; VII - 5-амино-2-оксо-4-пентено-вая кислота; VIII - янтарный полуальдегид; IX - пигмент азахиноновой структуры.

5.3. Анализ и идентификация продуктов деградации 2-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2MP. Анализ хроматограмм кислых дихлорметановых экстрактов, полученных из проб, отобранных через 6, 12, 18, и 22 часа роста Arthrobacter sp. КМ-2MP, отражает динамику изменений в составе продуктов биодеградации 2-МП (рис. 18).

Наблюдается уменьшение количества исходного 2-МП до практически полного его исчезновения (рис 18 а-с, пик 1), параллельно с возрастанием количества бутанона-2 (пик 2), 4-оксопентановой кислоты (пик 9) и других продуктов (пики 3-8 и 10-15). Процесс интерпретации масс-спектров оказался не столь простым. Масс-спектры лишь нескольких продуктов трансформации 2-МП были представлены в компьютерных библиотеках масс-спектров (гидрокси-2-МП, 4-оксопентановая кислота, бутанон-2). Спектры остальных соединений были идентифицированы вручную с использованием известных направлений распада органических соединений в условиях электронной ионизации [Лебедев, 2003] и представлены в таблице 8

Таблица 8. Основные интермедиаты деградации 2-метилпиридина

#	Название	R.T. (мин)	m/z	6 часов	12 часов	18 часов	22 часа
1	2-метилпиридин	5,40	93	78,9	63,6	9,69	0,57
2	2-бутанон	5,52	72		7,55	46,5	12,3
3	5-метил-2(3Н)-фуранон	5,65	98		0,38	0,28	0,34
4	бутиролактон	6,10	86		0,06	0,64	0,64
5	2(3Н)-фуранон	6,15	84		0,15	0,43
6	5-метил-2(3Н)-дигидрофуранон	6,45	100	0,09	0,04	0,11	1,44
7	N-ацетилпиррол	6,52	109	18,2	12,1	10,6	0,01
8	N-формил-2-метилпиррол	6,57	109	1,86	6,44	5,32	0,13
9	4-оксопентановая кислота	7,25	116		0,8	2,11	39,0
10	дигидрокси-2-метилпиридин	7,75	125	0,32	0,11	0,45
11	дигидрокси-2-метилпиридин	7,81	125	0,36	2,01	2,04	10,7
12	тригидрокси-2-метилпиридин	7,93	141	0,18	1,9	1,92	1,05
13	3.6-дигидрокси-3.4-дигидро-2-метилпиридин	7,95	127	0,02	3,05	1,15	21,2
14	дигидрокси-2-метилпиридин	8,05	125		1,28	6,27	3,32
15	дигидрокси-2-метилпиридин	8,30	125		0,05	0,3	1,26
16	дигидрокси-2-метилпиридин	8,35	125		0,25	0,17	0,51

Рис. 18. Хроматограммы (ГХ-МС) кислых экстрактов КЖ в динамике роста Arthrobaсter sp. КМ-2MP на 2-МП (а-6, b-12, c-18; d-22 часа)

Одним из самых интенсивных на хроматограммах был пик вещества с t_уд=6,52 мин (рис. 18, пик 7). Его м.м. (109 Да) совпадала с ожидаемой для гидрокси-2-МП как первичного продукта окисления исходного субстрата, однако такие гидроксироизводные характеризуются существенно большими временами выхода. Библиотека масс-спектров также не предложила приемлемого варианта.

Масс-спектр этого вещества (рис. 19), характеризовался интенсивным пиком молекулярного иона с m/z 109. Ион с m/z 67 образуется при элиминировании из М⁺я нейтральной частицы с массой 42 Да. Наиболее вероятной нейтральной частицей является молекула кетена, выброс которого может происходить, если в молекуле присутствует ацетильный фрагмент. Дальнейший распад иона с m/z=67 соответствовал фрагментации пиррола. Исходя из этого, было предположено, что вещество в пике 7 представляет собой N-ацетилпиррол.

Рис. 19. Масс-спектры выделенного из КЖ (А) и синтезированного (Б) N-ацетилпиррола

Для подтверждения образования N-ацетилпиррола как одного из интермедиатов деградации 2-МП, он был синтезирован. Масс-спектры синтези-рованного соединения и обнаруженного в экстрактах КЖ оказались полностью идентичны (рис. 19).

Таким образом, доказано наличие N-ацетилпиррола среди продуктов биодеградации 2-метилпиридина штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP. Предполагаемый путь образования N-ацетилпиррола - раскрытие гидроксилированного пиридинового кольца между С-2 и С-3 атомами с последующей реакцией конденсации по атомам N и C (рис. 20). Такой разрыв связи в химической реакции может быть затруднительным, но энзиматическая реакция весьма вероятна.

Рис. 20. Предполагаемый путь образования N-ацетилпиррола

Пик 8 вещества с t_уд=6,57 мин и м.м. 109 Да мог быть одним из изомеров моногидрокси-2-МП (рис. 18, пик 8). В связи с тем, что по масс-спектральному распаду невозможно установить точную структуру изомеров гидрокси-2-метилпиридина, для идентификации этого интермедиата были проанализированы масс-спектры коммерческих препаратов 6-гидрокси-2-МП и 5-гидрокси-2-МП, а также специально синтезированного 3-гидрокси-2-МП. Времена удерживания оказались следующими: 3-гидрокси-2-МП = 10,00 мин; 5-гидрокси-2-МП = 10,40 мин; 6-гидрокси-2-МП = 10,58 мин; т.е. на 3-4 минуты превышали t_уд вещества из КЖ. Анализ масс-спектра определяемого вещества в пике 8 дал возможность предположить структуру N-формил-2-метилпиррола. Масс-спектр этого соединения (рис. 21) в компьютерных базах данных и в литературе отсутствовал. В условиях электронной ионизации от N-формил-2-метилпиррола отщепляется молекула CO и образуется М⁺я 2-метилпиррола (m/z=81). Дальнейший распад связан с последовательным элиминированием атома водорода (m/z 80) и молекулы НСN (m/z 53).

Рис. 21. Масс-спектр ЭИ N-формил-2-ме-тилпиррола

Ещё одним косвенным доказательством в пользу структуры N-формил-2-метилпиррола было его t_уд=6,57 мин, близкое к t_уд=6,52 мин для N-ацетилпиррола. Можно предположить, что образование N-формил-2-метилпиррола при биодеградации 2-метилпиридина осуществляется по механизму, аналогичному для образования N-ацетилпиррола, но с энзиматическим раскрытием пиридинового кольца между 5 и 6 атомами углерода и последующей конденсацией по атомам N и C (рис. 22).



Рис. 22. Предполагаемый путь образования N-формил-2-метилпиррола

При дальнейшем анализе кислых экстрактов КЖ (рис. 18, пики 10,11,14-16) был обнаружен ряд изомеров с м.м. 125 Да и следы соединения с м.м. 141 (пик 12). В спектрах соединений с м.м. 125 Да присутствовали пики фрагментных ионов, свидетельствующие о наличии в их составе фенольных гидроксилов. Это позволило предположить, что данные соединения являются изомерами дигидрокси-2-МП. Установление положения гидроксильных групп без наличия стандартных образцов невозможно. Количество двух изомеров с м.м. 125Да в смеси было велико, они обнаруживались во всех кислотных экстрактах (3-22 ч) тогда как количество остальных трех изомеров было мало, они определялись только в 12, 15 и 18 часовых экстрактах. Нельзя исключить, что эти соединения являются гидроксилсодержащими пирролами, которые с потерей молекулы воды превращаются в соответствующие зарегистри-рованные пиррольные структуры (рис. 20 и 22).Анализ масс-спектра соединения 13 (рис. 18) с t_уд=7,93 мин (м.м.141 Да), следы которого были обнаружены в 12 и 15 часовых экстрактах КЖ, позволил предположительно идентифицировать его как тригидрокси-2-МП (рис. 23)



Рис. 23. Масс-спектр ЭИ три-гидрокси-2-МП

Для подтверждения предполагаемых структур и обнаружения других интермедиатов, содержащих ОН-группы, было проведено их силилирование в дихлорметановых экстрактах КЖ. Триметилсилильные производные изучаемых соединений имели характерные пики в масс-спектрах, что облегчает их идентификацию. Этот подход позволил детектировать соединение, с m/z 181 и t_уд=10,12 мин (рис. 24). Масс-спектр этого вещества был найден в базе данных и соответствовал триметилсилильному производному гидрокси-2-МП. Однако масс-спектральный распад не позволяет однозначно отнести обнаруженное соединение к 3-гидрокси-2-метил- или 5-гидрокси-2-метилпиридину.

Рис. 24. Масс-спектр ЭИ силильного произвоного гидрокси-2-ме-тилпирдина

Если в КЖ в качестве интермедиата присутствует изомер 3-гидрокси-2-МП, то вещество с м.м. 127 и t_уд=10.60 мин, обнаруживаемое в экстрактах КЖ разного времени культивирования может быть продуктом присоединения воды к 3-гидрокси-2-МП и представлять собой 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-метилпиридин (рис.25).

Рис. 25. Масс-спектр ЭИ 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-МП.

Хотя нами не был однозначно де-тектирован 5-гидрок-си-2-МП в качестве интермедиата, однако обнаружение как 4-оксопентановой кис-лоты, так и N-формил-2-метилиррола подтверждает образование этого соединения при деградации 2-МП.

Как следует из вышеизложенного, нами были идентифицированы, в основном, соединения промежуточных стадий трансформации первичных гидрокси-2-МП: N-ацетилпиррол; N-формил-2-метилпиррол; 4-оксопентановая кислота; 3,6-дигидрокси-3,4-дигидро-2-МП;изомерные дигидрокси-2-МП и тригидрокси-2-МП. При этом основная масса дигидрокси-2-МП подвергается дальнейшему гидроксилированию с образованием тригидрокси-2-МП, который в свою очередь служит субстратом для образования пигмента азахиноновой структуры.

Предполагаемые пути катаболизма 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP. Суммируя полученные данные о структуре образующихся интермедиатов (рис. 26), можно сделать вывод, что штамм осуществляет катаболизм 2-МП в результате реализации несколько необходимых и обязательных реакций.

1. Катаболизм 2-МП штаммом Arthrobacter sp. КМ-2MP начинается с гидроксилирования пиридинового кольца в 3 или 5 положениях, с образованием гидрокси-2-МП.

2. В результате раскрытия кольца 3-гидрокси-2-МП (рис. 26, II) по связи С2-С3, с образованием N-ацетилпиррола (рис. 26, IX). Раскрытие кольца 5-гидрокси-2-МП между С-5 и С-6, аналогично, приводит к образованию N-формил-2-метилпиррола (рис. 26, VIII), которые в дальнейшем подвергаются как окислению, так и восстановлению. Такой путь показан впервые.

3. Гидрокси-2-МП (рис.26, II и III) окисляются в дигидрокси-2-МП (рис.26, IV и V). При раскрытии цикла на этом этапе, образуется 4-оксопентановая кислота (рис.26, X). Тригидрокси-2-МП (рис.26, VI), образующийся при дальнейшем окислении дигидроксипроизводного, в свою очередь быстро конденсируется с образованием пигмента азахиноновой природы (рис. 26, VII).



Рис. 26. Катаболизм 2-метилпиридина (I) штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2МР. II - 3-гидрокси-2-метилпиридин; III - 5-гидрикси-2-метилпиридин; IV - 3,6-дигидрок-си-2-метилпиридин; V - 5,6-дигидрокси-2-метилпиридин; VI - 3,5,6-тригидрокси-2-метилпиридин; VII - пигмент азахиноновой природы; VIII - N-формил-2-метилпиррол; IX - N-ацетилпиррол; X - 4-оксопентановая кислота.

5.4. Анализ и идентификация продуктов деградации 4-МП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-4MP. Хроматографирование (TCХ) щелочного экстракта КЖ показал появление в ней вещества с R_f = 0,38 (система 2). Соединение было выделено в индивидуальном состоянии. При обработке раствором FeCl₂ оно окрашивалось в желтый цвет, что говорило о возможном присутствии ОН-группы в положении 2- или 4-пиридинового кольца [Watson et al., 1974].

При подщелачивании этанольного раствора выделенного вещества, максимум поглощения (л _max = 295 нм) не сдвигался в длинноволновую область спектра, что также свойственно для 2- и 4-гидроксипиридина [Klinsberg, 1962].

Характерную для 2-гидроксипиридина полосу поглощения в области 1660 см ^-1 наблюдали в ИК-спектре [Schofield, 1967]. В масс-спектре анализируемого соединения наблюдался интенсивный пик молекулярного иона, последующая фрагментация которого приводила к образованию фрагментов 109(100)М^+•, 81(10)(М-СО)⁺, 80(54)(М-НСО)⁺, и 53(17)(М-НСО-НСN)⁺, характерных для гидроксипирдинов.

В спектре - ЯМР образца этого вещества, снятого в СDС1₃ (стандарт ТМС - внутренний) наблюдался дублет протона в 6-ом положении пиридинового кольца с химическим сдвигом 6,37 м.д. (J_5,6 = 6,6Гц), уширенный синглет протона Н-3 с химическим сдвигом 6,37 м.д., дублет дублетов протона Н-5 с химическим сдвигом 6,12 м.д. (J_3,5 = 1,7 Гц, J_5,6 = 6,6Гц) и синглет трех протонов метильной группы с химическим сдвигом 2,23 м.д. На основании совокупности спектральных данных структура выделенного интермедиата была определена как 2-гидрокси-4-МП (рис.27, II).

Пигментирование КЖ при росте штамма на 4-МП отличалась от такового при росте на 2-МП и 2,6-ДМП. Анализ (ТСХ) КЖ с нейтральной рН выявил наличие голубого и розового (R_f = 0,69; R_f = 0,8 в системе 2) пигментов, которые препаративно были выделены. Количество розового пигмента оказалось недостаточным для его идентификации. По данным масс-спектров химической ионизации (m/z): 259(100)(МН)⁺, 242(15)(МН-ОН)^+•, 224(4)(МН-ОН-Н₂О)^+•, 215(5)(МН-ОН-HCN)^+•, 168(72)(МН-ОН-Н₂О)^+•, голубой пигмент, возможно, имел структуру замещенного диазафлуорена, который мог образоваться из соответствующего диазахинона в результате ферментативной дегидратации (рис. 26, VI).

Химическая литература конца ХХ века содержит сведения об образовании пигментов интенсивно голубой и слабо-голубой окраски при окислении соединений пиридиновой природы, к которым применили групповое название “азахиноны” [Ensign et al., 1963]. Образование голубых пигментов наблюдали в процессе метаболизма никотиновой кислоты микроорганизмами рода Bacillus [Ensign et al., 1965], никотина [Holmes et al., 1975], 2-гидроксипиридина штаммом A. crystallopoietes [Ensign et al., 1963], тремя видами Arhtrobacter [Kolenbrander, 1977]. Для штамма A. crystallopoietes, который утилизирует 2-гидроксипиридин, характерно образование голубого пигмента диазадифенохиноновой природы [Knackmuss, 1962; Gupta, 1975]. Известно, что он образуется при автоокислении 2,3,6-тригидроксипиридина. По видимому, это соединение является одновременно интермедиатом пути деградации пиридинового кольца и предшественником пигмента [Ensign et al., 1965]. На основании этих данных мы предположили, что розовый и голубой пигменты, образуемые выделенным нами штаммом Arthrobacter sp. КМ-4MP, являются продуктами конденсации 2,3-дигидрокси-4-МП и 2,3,6-тригидрокси-4-МП соответственно (рис. 26, VI).

Хроматограммы кислых экстрактов КЖ были обработаны спиртовым раствором бомкрезолового зеленого. Наблюдали проявление желтых пятен на синем фоне, что свидетельствовало о наличие карбоновых кислот специфического строения. Действительно, на хроматограмме было обнаружено соединение, R_f которого (R_f = 0,15, система 3) был идентичен R_f метилмалеиновой (цитраконовой) кислоты (R_f = 0,17). Клетки Arthrobacter sp. KM-4МР потребляли цитраконовую кислоту в качестве единственного источника углерода без лаг-фазы.

Известно, что при раскрытии кольца 2,3,6-тригидроксипиридина образуется полуамид малеиновой кислоты, малеиновая и фумаровая кислоты [Коростелева и др., 1981]. Можно предположить, что раскрытие 2,3,6-тригидрокси-4-МП аналогичным образом приведет к образованию полуамида метилмалеиновой и метилмалеиновой кислот. Присутствие в среде полуамида метилмалеиновой кислоты доказать не удалось. Участие в процессе метилмалеиновой кислоты было зафиксировано как прямыми, так и косвенными методами (рис. 26, V).



Рис. 27. Катаболизм 4-метилпиридина (I) штаммом Аrthrobacter sp. KM-4МР.

II - 2-гидрокси-4-метилпиридин; III - 3-гидрокси-4-МП,

IV - 4-(N-ацетиламино)-2-оксо-пентен-3-овая кислота;

V - метилмалеиновая кислота; VI - пигмент диазафлуореновой природы.

Следовательно, катаболизм 4-МП штаммом Arthrobacter sp. KM-4МР протекает так, как показано на рисунке.

5.5. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,6-ДМП штаммом Аrthrobacter sp. КМ-2.6DMP. При хроматографическом анализе щелочных экстрактов параллельно со снижением количества субстрата (R_f = 0,8, система 1), наблюдали появление вещества 2 (табл. 9, II), хроматографическая подвижность которого на силикагеле (R_f = 0,43) соответствовала хроматографической подвижности (R_f = 0,42) 3-гидрокси-2,6-ДМП. Для соединения 2 было характерно пурпурное окрашивание раствором FeCl₂, что указывало на возможность присутствия ОН-группы в кольце пиридина. При анализе нейтральных экстрактов была получена аналогичная картина, то есть появление вещества 2 с R_f 3-гидрокси-2,6-ДМП. Используя тонкослойную препаративную хроматографию, соединение 2 было выделено в виде белых кристаллов, температура плавления которых (Т_пл 200-210єС) была идентична Т_пл синтетического свидетеля. При подщелачивании метанольного раствора выделенного соединения 2 до рН 8,0 максимум поглощения сдвигался в длинноволновую область спектра (при рН 7,0 - 288 нм, при рН 8,0 - 311 нм) на 23 нм, что характерно для 3-гидроксипиридина. Результаты масс-спектрального анализа выделенного образца и синтетического свидетеля, представленные в таблице 9, подтвердили их идентичность. В спектре, помимо молекулярного иона наблюдались характерные для метилпиридинов (М-Н)⁺ ионы, а также ионы (М-СО)⁺ и (М-СНО)⁺, что доказывало наличие в структуре ароматической гидроксигруппы, присутствие которой подтверждала также полоса поглощения 3510 см^-1. Отметим, что в начальной фазе роста соединение 2 присутствовало в следовых количествах, максимально накапливалось к 15 ч и изчезало к 24 ч культивирования. Растущие клетки использовали 3-гидрокси-2,6-ДМП в качестве ростового субстрата (табл. 9, II).

Таблица 9. Масс-спектры соединений, интермедиатов распада 2,6-диметил-пиридина (Аrthrobacter sp. КМ-4)

Соединения	Масс-спектры m/z, (I %)	ИК- спектры н см -1	УФ - спектры лmax, нм
3-гидрокси-2,6-ДМП (II)	123(73)М+?, 122(12)(М-Н)+, 108(6)(М-СН3)+, 95(20)(М-СО)+??, 94(100)(М-СНО)+, 81(7)(МСН3-НСN)+, 80(11)(М-СН3-СО)+	3510	рН 7,0 288 рН 8,0 311
3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (III)	139(51)+ ?(M), 111(20)(M-CO)+ ?, 110(100)(M-CHO)+, 96(7)(M-CO-CH3)+?, 95(5)(M-CHO-CH3)+ ?	3525 3490	рН 7,0 276 рН 9,0 302
2,4-динитро-фенилгидразон ацетил-ПВК (IV)	491(2)(МН)+, 474(2)(МН-ОН)+ ?, 447(2)(МН-СО2)+, 266(19)(СН2-С(СООН)-N2-Ar*)+ ?, 237(9)(СН3-С(СН2)-N2H-Ar)+ ?, 223(9)(СН3-С?N+-NH-Ar), 183(42)(NH2-Ar)+ ?, 182(100)(NH-Ar)+, 167(35)(Ar)+	-	-

Ar^* - 2,4(NC₂)₂C₆H₃

При хроматографировании кислых экстрактов было обнаружено присутствие соединения, дающего реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином. На основании масс-спектрального распада бисгидразона, его идентифицировали как бис-2,4-динитрофенил-гидразон ацетилпировиноградной кислоты (табл.9, IV). Присутствие в КЖ кетокислоты такого строения указывало на то, что пиридиновое кольцо раскрывалось между 2-м и 3-м атомами углерода, причем раскрытию предположительно подвергалось кольцо, содержащее две ОН-группы. Таким соединением в данном случае мог быть 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП.

Однако ни в КЖ штамма, растущего на 2,6-ДМП, ни в суспензии неделящихся клеток в присутствии данного субстрата дигидрокси-производное выявлено не было. Его удалось обнаружить в следовых количествах в КЖ культуры, растущей на 3-гидрокси-2,6-ДМП, и при метаболизме 3-гидрокси-2,6-ДМП клетками, выращенными на 3-гидрокси-2,6-ДМП. В обоих случаях наблюдали уменьшение концентрации внесенного субстрата и появление нового вещества с R_f = 0,4 (система 2) соответствующим R_f 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП. Вещество было выделено с помощью тонкослойной препаративной хроматографии и по физико-химическим свойствам (УФ-спектр: при рН 7,0 л _max = 276 нм; при рН 9,0 л _max = 302 нм; масс-спектральный анализ), было идентифицировано как 3,4-дигидрокси-2,6-ДМП (таблица 9, III).

Ни в растущей культуре с 2,6-ДМП, ни в суспензии клеток с 3-гидрокси-2,6-ДМП образование аммиака не наблюдалось. На основании строения выделенных интермедиатов, можно предположить, что азот включается в состав двухуглеродного фрагмента - ацетамида, образующегося при гидролизе ацетил-ПВК (табл. 9, IV). Хотя ацетамид не был обнаружен в КЖ, но культура использовала его в качестве единственного источника углерода и азота.

Итак, первичной ферментативной реакцией при росте выделенного нами штамма на 2,6-ДМП является гидроксилирование его кольца. На основании полученных результатов экспериментальных исследований и литературных данных, предлагаем путь катаболизма 2,6-ДМП штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP (рис. 28).

Рис. 28. Катаболизм 2,6-метилпиридина (I) штаммом Arthrobacter sp. KM-2.6DMP

II - 3-гидрокси 2,6-ДМП; III - 1,3-дигидро-4-оксо-2,6-ДМП;

IV - ацетилпировиноградная кислота; V - ацетамид.

5.6. Анализ и идентификация продуктов деградации пиридина штаммом Rodococcus wratislaviensis КМ-Р. При хроматогравировании щелочного экстракта КЖ штамма, растущего на пиридине, был выделен образец, который по данным хроматомасс-спектрального анализа содержал два вещества. Масс-спектральный распад вещества с м.м. 97, (табл. 10, I) позволяет интерпретировать его как продукт гидратации пиридина. В масс-спектре второго вещества наблюдается пик молекулярного иона с массой 95, что соответствует моногидроксипиридину. (б-пиридону) (табл. 10, II). Такая структура полностью подтверждается масс-спектральным распадом моно-ТМС-производного этого соединения: фрагментация вещества 167 была идентична таковой моно-ТМС-производного синтетического свидетеля 2-ГП.

При хроматографировании кислого экстракта был получен образец, неоднородность которого бала выяснена при анализе его ТМС-производных: на хроматограмме были получены два четких пика разной интенсивности. В масс-спектре количество доминирующего вещества наблюдался пик с м.м. 257. Такая м.м. и фрагментация может соответствовать продукту гидратации 2-гидроксипиридина в виде бис-ТМС-производного. По хроматографической характеристике, и по масс-спектральному распаду, наиболее вероятной для этого соединения является структура 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропиридина (см. табл. 7, III).

Таблица 10. Масс-спектры соединений, интермедиатов распада пиридина

(Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р)

Соединение	Структура соединения	m/z	Интенсивность в % к макси-мальному иону	Процесс образования фрагмента
Гидрат пиридина (I)		97 95 80 79 59 52 43	19 13 70 64 100 41 76	М М-2Н М-ОН М-Н2О М-С3Н2 М-Н2О-НСN НОСN
2-гидрокси-пиридин (II)		95 78 67 52 43	24 84 22 70 100	М М-ОН М-СО М-НОСN НОСN
4-карбонил-амино-3-бутеновая к-та(бис ТМС-производноe) (III)		273 258 230 202 156 147 73	2 16 12 4 100 10 32	М М-CН3 М-СН3-CO М-СН3-2CO М-COOSi(СН3)3 (CH3)3 SiОSi(СН3)2 Si(СН3)3
амид в-гидроксипро-пионовой к-ы (бис-ТМС-производное ) (IV)		233 218 202 130 116 73	4 100 16 19 2 8	М М-CН3 М-ОСН3 М-СН2OSi(СН3)3 (СН3)SiNHCO (СН3)3Si
2,6-дигидрок-сипиридин(моно-ТМС-производное) (V)		183 168 155 150 139 112 100 95 81 73	25 24 6 2 9 4 3 3 4 100	М М-CН3 М-СО М-СН3-Н2О М-СН3- СНО М-СН3-СНО-HCN (CН3)2 SiOCN M-OSi(CH3)2CH2 M-CHOSi(CH3)3 Si(СН3)3

В другом хроматографическом пике, на основании м.м., равной 233, и данных спектрального распада, соединение идентифицировано как амид в-гидрокси-пропионовой кислоты в виде бис-ТМС-производного, которое может образоваться в результате гидроксилирования таутомерной формы этого же соединения по кратной связи с последующим ее разрывом (табл. 10, IV). Кроме того, в экстрактах КЖ Rh. wratislaviensis КМ-Р были обнаружены два вещества, которые изучали в виде ТМС-производных. Одно из соединений, с м.м. 183, по R_t (5 мин 5 сек) и масс-спектральному распаду, соответствовало моно-ТМС-производному 2,6-дигидроксипиридина (табл.10, V). Второе вещество, с м.м. 273, и длительным временем выхода на хроматограмме (11 мин 30 сек), по масс-спектру соответствовало бис-ТМС-производному 4-карбонил-амино-3-бутеновой кислоты (табл. 10, III).Эта кислота может образоваться из 2,6-дигидроксипиридина путем гидролитического расщепления по C-N связи.

При росте Rh. wratislaviensis КМ-Р на синтетической среде с 2-гидроксипиридином потребление субстрата и накопление биомассы происходило только после добавления пиридина (0,3 г/л). Хроматомасс-спектральный анализ ТМС-производных продуктов, выделенных из экстрактов КЖ, позволил идентифицировать вещества с м.м. 183, 273 и 233, которые по своим характеристикам соответствовали соединениям: моно-ТМС-производному 2,6-ДГП (табл.10, VII), бис-ТМС-производным 4-карбониламино-3-бутеновой кислоты и амида в-гидроксипропионовой кислоты (табл. 10, III и IV).

Итак, путь катаболизма пиридина штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р можно изобразить следующим образом (рис. 29).

Рис. 29. Катаболизм пиридина (I) штаммом бактерий Rhodococcus wratislaviensis КМ-Р

II - 2-гидрат пиридина: III - 2-гидроксипиридин; IV - 2,6-дигидрокси-1,2-дигидропири-дин; V - 2,6-дигидроксипиридин; VI - 4-карбониламино-3-бутеновая кислота; VII - амид в-гидроксипропионовой кислоты; VIII - карбаминовая кислота.

5.7. Анализ и идентификация продуктов деградации 2,4-ДМП штаммом Rodococcus erythropolis 2.4DMP. Хроматографирование щелочного и нейтрального экстрактов показало убывание исходного субстрата (R_f=0,7) параллельно с появлением нового вещества с R_f=0,4. В начале роста (6 ч) оно присутствовало в крайне малых количествах, накапливалось в логарифмической фазе (18-20 ч) и убывало в стационарной фазе (30 ч). Препаративной тонкослойной хроматографией это соединение (рис. 31, II) было выделено. С раствором FeCl₂, оно давало розовое окрашивание, характерное для 3-гидроксипиридинов. В УФ-спектре выделенного образца в этаноле (рН 7,0) наблюдали поглощение с максимумом 275 нм, который при подщелачивании раствора до рН 9,0 сдвигался до 297 нм. Такой батохромный сдвиг на 22 нм характерен для гидроксипиридинов с ОН-группой в положении 3 пиридинового кольца [Кlinsberg, 1962]. Окончательно строение выделенного вещества было установлено на основании данных спектра ЯМР, снятого в CDCl₃ (стандарт ТМС-внутренний). В спектре наблюдались синглет протона Н - 2 с химическим сдвигом 7,63 м.д., синглет протона Н - 5 с химическим сдвигом 7,00 м.д., и два трехпротонных синглета 4-СН₃ и 6-СН₃ - групп с химическим сдвигом соответственно 2,30 м.д. и 2,50 м.д. В спектре, так же, присутствовал синглет протона ОН-группы в виде уширенного сигнала с химическим сдвигом 6,20 м.д. Структура соединения исследуемого соединения соответствовала данной картине.

На хроматограммах кислых экстрактов КЖ (система 2) после обработки раствором 2,4-ДНФГ в 2 н HCl в виде ярко-желтых пятен были обнаружены две карбоновые кислоты с R_f=0,37 (IV) и 0.21 (V). Вещества были выделены, очищены с помощью препаративной хроматографии (система 4) на силикагеле и проанализированы в виде их 2,4-динитрофенилгидразидов.



Рис. 31. Катаболизм 2,4-ДМП (I) культурой Rhodococcus erythropolis 2.4DMP.

II - 3-гидрокси-4,6-диметилпиридин; III - лутидиновая кислота,

IV - 2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота;

V - 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота.

По результатам анализа масс-спектров одно из соединений, с большей хроматографической подвижностью, было идентифицировано как 5-(2,4-динитрофенилгидразид)-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовая кислота (IV). Другому соединению с меньшей хроматографической подвижностью на основании анализа его масс-спектра была приписана структура 3-гидрокси-5-(2,4-динитро-фенилгидразида)-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой кислоты (V). Соединения присутствовали исключительно в экстрактах КЖ культур логарифмической фазы роста. Дальнейшее превращение продуктов раскрытия кольца - 2-карбокси-4-формил-иминопентен-2-диовой (IV) и 3-гидрокси-2-карбокси-4-формилиминопентен-2-диовой (V) кислот, можно представить так, как это происходит для близко родственных по строению дикарбоновых кислот-б-(N-ацетиламинометилен) янтарной и б -гидроксиметил-б^?-(N-ацетиламинометилен) янтарной кислот - продуктов раскрытия пиридинового кольца. Они образуются при деградации пиридоксамина штаммом Pseudomonas MA-I и пиридоксина штаммом Pseudomonas-IA [Huynh, 1985].

Хроматографический анализ кислых экстрактов КЖ в стационарной фазе роста показал присутствие еще одной карбоновой кислоты с R_f=0,38, которая была выделена и проанализирована в виде ее бутилового эфира и идентифицирована как дибутиловый эфир 2,4-пиридинкарбоновой (лутидиновой) кислоты (III).

Таким образом, на основании анализа структур выделенных нами интермедиатов можно констатировать, что первичный процесс деградации 2,4-ДМП протекал как за счет гидроксилирования кольца с образованием 3-гидрокси-4,6-ДПМ, так и в результате окисления метильных групп, приводящего к образованию лутидиновой кислоты. Строение двух выделенных трикарбоновых кислот свидетельствовало о раскрытии гидроксилированного пиридинового кольца, (у которого обе метильные группы были окислены до карбонильных групп) между С-5 и С-6 атомами углерода. Однако это не позволило установить, какой процесс являлся первичным - гидроксилирование кольца или окисление метильных групп. Поэтому процесс деградации 2,4-ДМП (I) можно представить следующим образом (рис. 31).

6. Деградация пиридина культурой, суспензионными и иммобилизованными клетками Arthrobacter sp. KM-Р

Анализируя кинетику утилизации пиридина Arthrobacter sp. KM-Р (см. рис. 1), видно, что продолжительность лаг-фазы составляла около 3 часов. Начиная с 6 часов, наблюдалось интенсивное потребление субстрата, которое продолжалось вплоть до 21 часа роста. За это время культурой потреблялось до 90% внесенного субстрата при интенсивном накоплении биомассы. Таким образом, выделенный нами штамм обладает высокой утилизирующей активностью, является одним из наиболее перспективных штаммов-деструкторов и рекомендован для очистки сточных вод от пиридина.

Следует отметить, что несмотря на высокую эффективность биологических способов очистки использование микроорганизмов в очистных сооружениях приводит к накоплению больших объемов избыточной биомассы, которая требует утилизации. Замена суспензии растущих клеток на иммобилизованные частично разрешает эту ситуацию. Хотя использование иммобилизованных клеток микроорганизмов открывает новые возможности биотехнологии, нельзя, тем не мене, обойти молчанием трудности, которые возникают при замене клеток погруженных культур на иммобилизованные.

В качестве носителя для иммобилизации клеток Arthrobacter sp. KM-Р использовали Сa-альгинатный гель. Выбор обусловлен относительно мягкими условиями иммобилизации; обеспечением иммобилизованных клеток питательными веществами и кислородом, а также возможностью отвода продуктов метаболизма, так как материал носителя не создает значительных диффузных препятствий массообменным процессам.

Рис. 32. Деградация пиридина суспензией клеток (А) и иммобилизованными (Б) клетками Arthrobacter sp. KM-4.

Оценивали скорость утилизации пиридина суспензией планктонных клеток и клеток, иммобилизованных в альгинате кальция (рис. 32, А и Б). В колбы Эрленмейера с 200 мл среды вносили пиридин, в концентрациях по 1,5; 2,5; 3,0 и 3,4 г/л; по 8,3 мл суспензии клеток и по 25 мл гранул с клетками. Инкубацию на качалке (200 об/мин) проводили при 28^о-30^оС. Пробы отбирали через 3 часа (1,5 г/л пиридина) и 6 часов (остальные концентрации).

Показано, что скорость утилизации пиридина была выше у суспензионных клеток, чем у иммобилизованных или растущих в культуре клеток. Пиридин, в концентрации 1,5 г/л полностью потребляется суспензионными клетками за 6 часов. Иммобилизованные клетки использовали эту концентрацию за 9 часов. Пиридин, в концентрации 2,5 г/л, для растущих клеток является оптимальной, суспензионными клетками потреблялось за 12 часов, а иммобилизованными - за 18 часов.

Пиридин, в концентрации 3,0 г/л, которая вызывала удлинение лаг-фазы в культуре и 3,4 г/л, которая ингибировала рост штамма, суспензионными клетками утилизировался за 18 часов и 24 часа соответственно. Иммобилизованные клетки эти же количества субстрата разрушали медленнее суспензионных клеток (рис. 32, А), но значительно быстрее, чем культура (см. рис. 1).

Таким образом, продемонстрирована эффективность использования суспензионных или иммобилизованных клеток Arthrobacter sp. KM-Р для деградации пиридиновых токсикантов, присутствующих в очищаемой водной среде в высоких концентрациях (3,0-3,4 г/л)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование содержит сумму доказательств высокой биологической активности групп немицелиальных актинобактерий, широко представленных в различных природных субстратах и обнаруживаемых в большом количестве в длительно консервированных глубоко мерзлых почвенных осадках. Штаммы, выделенные из почв и длительно подвергавшихся воздействию пиридинов, идентифицированные как Arthrobacter и Rhodococcus обладали не только широкой субстратной специфичностью в отношении соединений пиридинового ряда, но способностью утилизировать высокие их концентрации со скоростью, существенно превышающей известные для мировых аналогов, что подтверждено сравнительным анализом полученных результатов и литературных данных (табл. 12).

Таблица 12. Микроорганизмы, утилизирующие пиридин и его производные

Штаммы-деструкторы	Потребляемая концентрация пиридинов	Ссылки
Corynebacterium sp. Brevibacterium sp.	1,5-2,0 г/л (2-5 дн)	Shukla, 1973
Nocardia sp. Z1	10 ммоль/л (50 ч)	Houghton, Cain, 1972
Nocardia sp. KM-2	2,0 г/л (72 ч)	Коростелева, 1981
Nocardioides pyridinolyticus OS4	0,1 г/л	Yoon et al., 1997
Micrococcus luteus	0,8 г/л (48 ч)	Sims et al., [1986]
Shewanella putrefaciens	0,5 г/л (140 ч)	Mathur et al., 2008
Azoarcus evansii pF6	0,2 г/л (60ч)	Rhee et al., 1997
Alcaligenes sp.	0,1г/л(44 ч)	Ronen et al., 1991
Bacillus sphaericus	0,5 г/л на (150 ч)	Mathur et al., 2008
Pseudomonas putida MK1	0,5 г/л (168 ч)	Kim et al., 2006
Pseudomonas pseudoalcaligenes	0,3 г/л	Pan...

Подобные документы

• Почвенные микроорганизмы-антагонисты, активные в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris

  Скрининг почвенных грибов и бактерий, проявляющих антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium и р. Bipolaris. Сравнительный анализ антибиотической активности изолятов в отношении грибов р. Bipolaris и штаммов р. Fusarium.
  
  дипломная работа [3,6 M], добавлен 21.02.2013
  

• Мутационная изменчивость микроорганизмов – производителей антибиотиков

  Способы увеличения продуктивности штаммов: мутагенез и отбор, гибридизация путем скрещивания, конъюгация у бактерий, системы скрещивания у грибов. Типы мутантов и способы их выделения. Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков.
  
  реферат [1,1 M], добавлен 06.12.2010
  

• Влияние производных адамантана с различными характерами заместителей на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека

  Механизмы агрегации тромбоцитов человека. Роль рецепторов плазматической мембраны в процессах агрегации тромбоцитов человека. Биологическая активность производных адамантана. Производные адамантана, влияющие на агрегацию тромбоцитов.
  
  дипломная работа [1,6 M], добавлен 15.12.2008
  

• Селекция микроорганизмов

  Понятие и значение селекции как науки о создании новых и улучшении существующих пород животных, сортов растений, штаммов микроорганизмов. Оценка роли и значения микроорганизмов в биосфере, и особенности их использования. Формы молочнокислых бактерий.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 17.03.2015
  

• Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот

  Бактериальные штаммы. Условия адаптации. Получение штаммов - продуцентов аминокислот, адаптированных к максимальным концентрациям 2Н2О в среде. Изучение ростовых характеристик M. flagellatum. Секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.
  
  статья [1,2 M], добавлен 23.10.2006
  

• Биотехнологический способ получения меченого стабильными изотопами липид-транспортирующего белка чечевицы (Lens culinaris)

  Липид-транспортирующие белки растений в диагностике и терапии аллергических заболеваний. Создание гипоаллергенных аналогов LTP, перспективы вакцинации. Химическая трансформация клеток E.coli. Расщепление гибридного белка, масс-спектрометрический анализ.
  
  дипломная работа [1,8 M], добавлен 16.07.2013
  

• Получение штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae c инактивированным геном NMA111

  Определение понятия апоптоза как процесса самоубийства клетки, служащего у многоклеточных организмов для поддержания постоянного числа клеток и удаления зачаточных органов в эмбриогенезе. Генотипы использованных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
  
  курсовая работа [814,1 K], добавлен 22.10.2011
  

• Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК

  Метод пульс-электрофореза для разделения ДНК индивидуальных хромосом. Выделение ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки и измерение конечной концентрации ДНК. Выделение ДНК из культивируемых клеток: лимфоцитов, прокариот, грибов и растительных клеток.
  
  контрольная работа [576,0 K], добавлен 11.08.2009
  

• Оценка метанолутилизирующей активности биопрепарата экологического назначения для очистки окружающей среды от метанола

  Метанотрофы и метилобактерии в биотехнологии. Использование метанола в газовой промышленности. Выбор штаммов микроорганизмов. Биопрепараты и их получение. Оценка возможности применения метанолутилизирующего препарата в морской воде и засоленной почве.
  
  дипломная работа [575,7 K], добавлен 05.07.2017
  

• Брассиностероиды, их структура, способы получение и биологическая активность

  Биологическая активность и химическая структура брассиностероидов. Синтезы с сохранением углеродного скелета. Формирование функций характерных для циклической части брассиностероидов. Построение боковой цепи с образованием новых углерод-углеродных связей.
  
  курсовая работа [1,2 M], добавлен 07.12.2014
  

• Многообразие живых клеток

  Основные разновидности живых клеток и особенности их строения. Общий план строения эукариотических и прокариотических клеток. Особенности строения растительной и грибной клеток. Сравнительная таблица строения клеток растений, животных, грибов и бактерий.
  
  реферат [5,5 M], добавлен 01.12.2016
  

• Возбудители зоонозых инфекций. Бруцелез, чума, сибирская язва, туляремия. Особенности микробиологическй диагности в связи с патогенезом заболеваний. Принципы лечения, профилактики

  Классификация возбудителя чумы. Прижизненная микроскопическая картина клеток. Температурный оптимум чумы. Бактерии вирулентных штаммов. Природный резервуар чумной инфекции. Механизм развития заболевания бруцелеза, чумы, сибирской язвы, туляремия.
  
  презентация [36,4 M], добавлен 17.03.2014
  

• Микробиологический синтез витамина В12

  История открытия цианкобаламина - витамина В12. Способы микробиологического синтеза витамина В12 с применением новых штаммов. Молекулярная структура и функции витамина. Продуценты витамина, его применение. Технологическая схема получения концентрата.
  
  курсовая работа [1,7 M], добавлен 28.05.2015
  

• Термофильные метанобразующие бактерии

  Изучение морфологии, ультраструктуры, физиологических свойств и таксономического положения термофильных метанобразующих бактерий. Анализ особенностей дыхания, питания, размножения и энергетических процессов. Влияние температуры на активность бактерий.
  
  реферат [215,6 K], добавлен 31.01.2015
  

• Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам

  Методы выделения чистых культур микроводорослей и способы их идентификации. Выделение чистой культуры Euglena glacilis; рассмотрение способов определения жизнеспособности клеток. Изучить влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток.
  
  дипломная работа [1,7 M], добавлен 24.05.2012
  

• Споры как фактор защиты и размножения у микроорганизмов. Термоустойчивость вегетативных клеток и спор бактерий и грибов

  Споры – форма бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Роль спорообразования бактерий и грибов для практики. Строение и особенности химического состава бактериальной споры. Микробиологическое обоснование пастеризации и стерилизации.
  
  контрольная работа [223,5 K], добавлен 02.10.2011
  

• Теломеры. Теломеразная активность

  Изучение строения теломер; их основная функция: участие в фиксации хромосом к ядерному матриксу. Описание принципа маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Концевая недорепликация ДНК. Анализ теломеразной активности соматических и раковых клеток.
  
  презентация [3,7 M], добавлен 14.05.2015
  

• Жизнедеятельность бактерий

  Питание бактерий. Способы поступления питательных веществ в клетку. Классификация бактерий по типам питания, источникам энергии и электронам. Пропионовокислое брожение, его основные участники, их характеристика, использование в народном хозяйстве.
  
  контрольная работа [28,8 K], добавлен 29.11.2010
  

• Многообразие клеток

  Сущность и сравнительная характеристика прокариотов и эукариотов. Понятие и структура вирусов, механизм их жизнедеятельности и оценка влияния на организм. Строение бактерий и их разновидности. Отличительные свойства животных и растительных клеток.
  
  презентация [2,1 M], добавлен 12.02.2017
  

• Биохимическая и физиологическая сущность ферментов

  Ферменты: биохимическое строение и физиологическая роль. Анализ методики определения активности ферментов и ферментативного спектра в жидкостях организма. Основные ферменты в моче в норме и при патологии. Ферментный спектр мочи при заболеваниях почек.
  
  доклад [153,2 K], добавлен 10.03.2015
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам