При удлинении конечности в скелетных мышцах удлиняемого сегмента происходит активация энергетических путей обмена (в том числе и «резервных»), межорганных циклов (Кори и аланиновый), реакций перекисного окисления, что приводит к снижению уровня белка в ткани и изменению кинетических характеристик сократительных белков. Подобные биохимические сдвиги, но только более низкой интенсивности, происходят и в мышцах контралатеральной конечности. Отмеченные изменения носят обратимый характер, восстановление метаболического профиля начинается с момента снятия дистракционных нагрузок.

Метаболические изменения в мышцах после скелетной травмы сопровождаются высокой интенсивностью белкового обмена, реакций перекисного окисления и антиоксидантного звена на фоне компенсированных энергетических затрат. Восстановление энергетического метаболизма скелетных мышц при ранних сроках снятия аппарата происходит в течение трех месяцев после лечения.

Введение низкомолекулярных белковых факторов в область перелома не только стимулирует процессы репаративной регенерации кости, но и вызывает анаболический эффект в скелетных мышцах, способствуя накоплению гликогена и белка в ткани за счет пролонгированного антипротеолитического эффекта. Пероральное применение смеси аминокислот предупреждает потери креатина и креатинфосфата в скелетных мышцах и является фактором, регулирующим межорганный обмен энергетических субстратов.

Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови является диагностически ценным и доступным критерием оценки поражения скелетных мышц при травмах и оперативном удлинении конечности.

Научная новизна. Впервые комплексно изучены изменения процессов энергетического, белкового обмена в скелетных мышцах при оперативном удлинении костей голени по Илизарову. Впервые изучено состояние системы перекисного окисления и антиоксидантной защиты в мышцах удлиняемого сегмента. Разработана концепция поведения скелетных мышц в ответ на удлинение конечности. Обнаружено явление активации межорганных обменных путей в ходе оперативного удлинения. Обнаружен феномен снижения количества фракций саркоплазматических белков в скелетных мышцах удлиняемой конечности. Впервые изучены кинетические характеристики миозина, выделенного из скелетных мышц подверженных удлинению. Обнаружен эффект активации «резервных» метаболических путей в мышцах в ответ на возрастающие дистракционные нагрузки. Продемонстрирована высокая лабильность обменных процессов скелетных мышц в ответ на дистракцию и снятие дистракционных нагрузок. Впервые показано, что в мышцах контралатеральной конечности происходят метаболические изменения той же, что и в удлиняемой конечности направленности.

Впервые обнаружено, что метаболические изменения в скелетных мышцах после перелома костей голени в условиях стабильной фиксации аппаратом Илизарова происходят на фоне компенсированных энергетических затрат. Впервые изучены кинетические свойства миозина из скелетных мышц голени после лечения оскольчатого перелома костей голени методом Илизарова. Впервые изучены метаболические особенности в скелетных мышцах голени в зависимости от сроков лечения оскольчатых переломов костей голени. Впервые изучены метаболические изменения, происходящие в скелетных мышцах контралатеральной, не травмированной конечности. Показано, что для процесса регенерации при оперативном удлинении конечности скелетная мышца в основном использует внеклеточные пластические и энергетические источники, при репаративной регенерации в посттравматический период - внутриклеточные.

Впервые продемонстрированы анаболические свойства низкомолекулярных белковых факторов, выделенных из костной ткани, оказываемых на скелетную мышцу при ее посттравматической регенерации. Обнаружена способность смеси аминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин) предупреждать потерю и стимулировать синтез креатина в скелетных мышцах, регулировать межторганный обмен гликогена. Обнаружены гепатотропные свойства данной смеси.

Практическая значимость работы. Полученные данные о существенных изменениях метаболических процессов в мышечной ткани дают обоснования для научного планирования мероприятий по предупреждению нарушений и восстановлению функциональных характеристик скелетных мышц в ходе лечения и в периоде реабилитации пациентов ортопедотравматологического профиля.

Полученные результаты дают теоретическое обоснование для разработки и внедрения фармакологических препаратов и биологически активных добавок на основе аминокислот и белков костной ткани для стимуляции репаративной регенерации костной и мышечной ткани.

Оценена информативность ряда биохимических показателей и предложены наиболее доступные тесты для лабораторной оценки состояния скелетных мышц, что может быть использовано в практической травматологии и ортопедии в качестве дополнительного критерия оценки тяжести скелетной травмы, а также для мониторинга состояния пациентов ортопедотравматологического профиля в период лечения и реабилитации.

Внедрение результатов исследования. По результатам работы в клинико-диагностическую лабораторию центра внедрены методы исследования, характеризующие состояние скелетных мышц при дистракционном остеосинтезе. Материалы работы включены в программу кафедры травматологии и ортопедии ФПК и ППС ГОУ ВПО ТюмГМА, используются в курсе лекций по биохимии для студентов факультета естественных наук Курганского государственного университета. Получены три патента РФ на изобретение.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационного исследования доложены: на научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в медицине» (Курган, 2000); на региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Ижевск, 2001); на международной научно-практической конференции «Медицина в XXI веке: эстафета поколений» (Курган, 2001); на IV всероссийской конференции «Актуальные вопросы применения гипербарической оксигенации в хирургии, травматологии и ортопедии» (Курган, 2002); на IV Зауральском фестивале научно-исследовательского, технического и прикладного творчества молодежи «Новые горизонты_2002» (КГСХА, 2002); на VI международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания» (Сочи, 2002); на всероссийской конференции «35 лет гипербарической оксигенации: итоги, проблемы, перспективы» (Москва, 2003); на II Всероссийском симпозиуме «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004); на международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004); на I и II съездах травматологов и ортопедов Уральского федерального округа (Екатеринбург, 2005; Курган, 2008); на всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые: новые идеи и открытия» (Курган, 2006); на международном конгрессе по наружной фиксации (Каир, 2007); на всероссийской научно-практической конференции «Клеточные и нанотехнологии в биологии и медицине» (Курган, 2007); на юбилейной конференции посвященной 10_летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008); на V международной конференции АСАМИ (Санкт-Петербург, 2008); на всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Современные технологии в хирургии позвоночника и периферических нервов» (Курган, 2008); на областном научном обществе ортопедов и травматологов (декабрь 2002; декабрь 2005, апрель 2007, ноябрь 2007). По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе 2 главы в коллективной монографии. Из печатных работ 12 опубликовано в рецензируемых ВАКом изданиях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы, 65 таблиц, 57 рисунков, трех схем. Библиографический указатель включает 411 источников: из них 120 - отечественные, 391 - зарубежные. Диссертационное исследование выполнено по плану НИР ФГУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий».

Содержание работы

илизаров скелетный мышца конечность

Материалы и методы

Работа выполнена на базе клинико-экспериментального лабораторного отдела ФГУ «Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий». Объектами исследований являлись собаки, крысы и лабораторные мыши, использовался клинический материал. Материалом исследования служили: мышечная ткань, печень, сыворотка крови. В ходе выполнения данной работы применялись биохимические, экспериментальные и статистические методы.

Проведение экспериментальных и клинических исследования разрешено комитетом по этике при ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Росмедтехнологий». Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755) и требованиями инструкции № 12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.1973 г.

Особенности метаболизма скелетных мышц в ходе онтогенеза, при скелетной травме и в условиях оперативного удлинения конечности по методу Илизарова изучали на беспородных собаках, которые были разделены на три серии.

1 серия. На 38 беспородных собаках на разных сроках онтогенеза (от новорожденных, до животных с выраженными старческими изменениями) изучали становление мышечного метаболизма в ходе индивидуального развития.

2 серия. На 43 взрослых беспородных собаках изучали метаболизм скелетных мышц в условиях оперативного удлинения костей голени по Илизарову. У 35 животных режим дистракции составлял 1 мм/сутки за 4 приема, у 8 - 3 мм/сутки в автоматическом режиме.

3 серия. На 35 взрослых беспородных собаках изучали метаболизм скелетных мышц при моделировании оскольчатого перелома костей голени с последующим лечением аппаратом Илизарова. Объектом исследования во всех сериях служила передняя большеберцовая и икроножная мышца, во 2_й и 3_й сериях - это были мышцы как оперированной, так и контралатеральной конечности. В динамике эксперимента изучали биохимические показатели сыворотки крови.

Эффективность препаратов для регуляции метаболических процессов в скелетных мышцах на различных экспериментальных моделях оценивали на лабораторных крысах-самцах лини Вистар и мышах-самцах линии СВА.

Действие низкомолекулярных белковых факторов, выделенных из костной ткани, изучали на лабораторных интактных мышах линии СВА и крысах. Фармакологические свойства и дозозависимые эффекты при различных способах введения белкового препарата изучали на 92 взрослых интактных мышах-самцах.

Основную часть исследования проводили на крысах, которые были разделены на четыре группы:

1 группа. Интактные животные. 10 здоровых взрослых крыс.

2 группа. «Пилотная» (10 крыс). Изучали изменения системных показателей крови, особенности костной репарации и мышечного метаболизма в условиях моделирования перелома большеберцовой кости для определения оптимальных сроков введения белкового препарата.

3 группа. Контрольная (24 крыс). В условиях заживления экспериментального перелома большеберцовой кости изучали изменения метаболизма в передней большеберцовой и камбалавидной мышце травмированной и контралатеральной конечности. На 7_е сутки эксперимента внутримышечно в зону перелома вводили физиологический раствор.

4 группа. Опытная (20 крыс). В условиях заживления экспериментального перелома большеберцовой кости изучали изменения метаболизма в передней большеберцовой и камбалавидной мышце травмированной и контралатеральной конечности на фоне разового внутримышечного введения низкомолекулярных белковых факторов на физиологическом растворе. Инъекцию осуществляли на 7_е сутки эксперимента.

Эффективность перорального потребления смеси аминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин, в соотношении 1:1:1:1) для коррекции нарушений обмена креатина изучали на взрослых половозрелых мышах-самцах линии СВА (средний вес 25-30 г.). Животные были разделены на 4 экспериментальные серии.

У животных первой серии (54 животных) моделировали перелом костей голени. Во второй серии - моделировали гипокинезию для мышц задней конечности лишением их опоры в модели «вывешивания» (антиортостатическая гипокинезия, АОСГ) (54 животных), в третьей серии после моделирования перелома костей голени животных лишали опоры в модели АОСГ (54 животных). Внутри каждой серии, в зависимости от пищевого рациона, животные были распределены на три группы. Первый рацион - обычный сбалансированный по белку (3,3г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам рацион вивария (приказ № 1179 от 10.10.83. «Об утверждении нормативов затрат кормов лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Второй - изокалорийный углеводный, обедненный белком рацион (0,88г/сутки перевариваемого протеина) (ИКОБР), в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию лизина, метионина, треонина; третий - аналогичный второму суточный рацион, в котором недостаток белка восполняли смесью аминокислот L_ряда: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин (все аминокислоты высокой очистки фирмы Sigma) в отношении 1:1:1:1, в количестве, равном суммарному содержанию аминного азота в стандартном рационе. Животным четвертой серии (144 животных) моделировали острую печеночную недостаточность (вызывали путем внутрибрюшинного введения 20 % раствора четыреххлористого углерода [ЧХУ] на оливковом масле), после чего их делили на три группы, соответственно трем экспериментальным моделям, внутри которых, в зависимости от рациона, мыши были разделены на три подгруппы.

Клинический материал составили пациенты травматологического и ортопедического профиля. Изучали биохимические показатели сыворотки крови 77_и пациентов с закрытыми изолированными переломами костей голени и 29_и - с множественными закрытыми переломами костей конечностей на разных сегментах. Все пациенты травматологического профиля были пролечены с применением аппарата Илизарова по методикам Центра. Ортопедическая патология: изучали показатели сыворотки крови 24_х пациентов больных ахондроплазией, которым проводили удлинение конечностей методом моно-, полилокального и полисегментарного чрескостного дистракционного остеосинтеза и 12 соматически здоровых людей, которым проводили косметическое удлинение конечностей (т.н. субъективно низкий рост).

Для изучения обменных процессов в скелетной мышце, из ткани приготавливали саркоплазматическую вытяжку на 0,03М растворе KCl. У собак исследовали переднюю большеберцовую мышцу (ПББМ) и латеральную головку икроножной мышцы (ИКМ), у крыс вместо икроножной мышцы забирали камбалавидную мышцу (КМ). Миофибриллярные белки выделяли в 0,6М растворе КСl.

В саркоплазматической вытяжке изучали активность следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), глюкозо_6_фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), каталазы, аланин - (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), кислой фосфатазы (КФ), оценивали суммарную протеолитическую активность. Для ЛДГ определяли изоферментный спектр. В супернатанте находили концентрацию общего белка, продуктов гликолиза - молочной (МК) и пировиноградной (ПВК) кислот. Интенсивность перекисного окисления оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) и уровню продуктов перекисного окисления белков (ПОБ). Непосредственно в сырой ткани определяли содержание гликогена, общих липидов, креатина и креатинфосфата. В сыворотке крови определяли ферментативную активность ЛДГ, КК, АсАТ, АлАТ, находили концентрацию общего белка, мочевины, креатина, глюкозы, общих липидов, общего холестерина, триглицеридов, МК, ПВК, МДА, продуктов ПОБ. Проводили электрофоретическое разделение сывороточной ЛДГ и КК. В эритроцитах определяли активность супероксиддисмутазы (СОД).

Активность КК, ЛДГ, КФ, АсАТ, АлАТ, а также концентрацию МК, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина, триглицеридов определяли на биохимическом фотометре Stat Fax® 1904 Plus (США), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostic (РФ). Каталазную активность в тканевом супернатанте определяли по методу М.А. Королюка с соавт., активность Г6ФГД по Ф.Е. Путилиной. Общую протеолитическую активность определяли по M.B. Jorgensen, в модификации М.А. Ковинька, протеазную активность выражали в количестве аминокислот, образующихся в ходе реакции, за единицу времени (мг а.к./мин). Активность СОД в эритроцитах определяли по реакции, основанной на способности фермента конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50 % ингибирования реакции восстановления НСТ. Активность СОД в эритроцитах выражали в мкмоль НСТ на 10⁹ эритроцитов в минуту. Активность тканевых ферментов рассчитывали на грамм саркоплазматического белка, который определяли по Лоури. Электрофоретическое разделение ЛДГ, КК и саркоплазматических белков проводили на системе Paragon (Beckman, США) с использованием реактивов и пластин этой же фирмы.

В депротеинизированном саркоплазматическом и сывороточном растворе определяли содержание МДА - по реакции с тиобарбитуровой кислотой, концентрацию ПВК - по методу Umbright в модификации Бабаскина, АТФ - при помощи наборов реагентов фирмы «Boehrenger» (Австрия). Содержание креатина в скелетных мышцах находили по реакции с диацетилом, креатинфосфата (КрФ) - по содержанию фосфора в безбелковом тканевом экстракте. Уровень гликогена в мышцах определяли непрямым антроновым методом, в печени - прямым антроновым методом. Содержание общих липидов в мышцах и печени находили гравиметрическим методом, после их экстракции хлороформ / метаноловой смесью (2:1). Общие липиды сыворотки крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы La Chema (Чехия). Продукты ПОБ определяли в белковом осадке по реакции с 2,4 - динитрофенилгидразином. Продукты реакции регистрировали при длинах волн 270 нм (ПОБ₂₇₀), 363 нм и 370 нм (ПОБ_363+370). Степень окисленной модификации белков выражали в единицах оптической плотности (ед. оп. пл.) на 1 мг белка. Общий белок сыворотки крови определяли с помощью биуретовой реакции. Концентрацию продуктов обмена в мышечном супернатанте выражали в моль на грамм сырой ткани, гликогена в мг на г ткани, общих липидов - в процентах от массы сырой ткани.

Для оценки кинетических характеристик миозина получали его очищенный лиофилизированный препарат. Выделение проводили согласно схеме, основанной на растворимости миозина в растворах солей различной ионной силы, которая сводились к многократному, последовательному осаждению и растворению миозина в растворах хлористого калия разной концентрации. Об активности фермента судили по количеству неорганического фосфата, который образовался при действии миозина на АТФ в присутствии ионов кальция.

Результаты исследования обрабатывали методами непараметрической статистики, поэтому в таблицах и на графиках они представлены в виде медианы, 25_го и 75_го процентиля. Достоверность различий между двумя выборками оценивали с помощью W_критерия Вилкоксона для независимых выборок и критерия знаков. Достоверность межгрупповых различий определяли с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна. Статистический анализ достоверности различий между группами по качественным критериям (т.н. бинарные признаки) проводили с помощью критерия ч² для таблицы сопряженности 2х2 с поправкой Йейтса. Корреляционную зависимость между выборками, подчиняющихся нормальному распределению, оценивали по критерию Пирсона, не подчиняющихся закону распределения - по критерию Спирмена. Результаты корреляционного анализа представляли в виде коэффициента корреляции с уровнем значимости р?0,05 и уравнения регрессии. Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Факторный анализ проводили методом главных факторов, метод оценки общностей - анализ главных компонент.

Результаты исследования

Некоторые типологические особенности метаболизма скелетных мышц собак в ходе онтогенеза. Проведенное нами исследование позволило обнаружить некоторые закономерности формирования метаболического профиля скелетных мышц различного типа у собак в ходе онтогенеза. Наибольшие изменения претерпевали процессы энергетического метаболизма скелетных мышц. На фоне изначальных различий в энергообмене ПББМ и ИКМ, с возрастом наблюдалось снижение его интенсивности в обеих мышцах, что приводило к «сглаживанию» их типологических особенностей. Так, в ПББМ активность ЛДГ при рождении была достоверно выше, чем в ИКМ, соотношение ЛДГ_ПББМ/ЛДГ_ИКМ составляло 1,22 (рис. 1). В последующие сроки соотношение активности ЛДГ в изучаемых мышцах изменялась в обратную сторону, и у взрослых животных соотношение ЛДГ_ПББМ/ЛДГ_ИКМ было уже меньше единицы и составляло 0,88. Значительно выше в ИКМ собак при рождении была активность КК - 14,90 мккат/г белка, в ПББМ - 7,66 мккат/г белка (различия значимы при р=0,05). Однако в дальнейшие сроки развития уровень данного фермента в ПББМ и ИКМ снижался и между мышцами достоверно не отличался, составляя у животных 1-3 лет 4,26 и 5,19 мккат/г белка соответственно для ПБММ и ИКМ. Типологические особенности ПББМ также характеризовались более высоким содержанием МК, как при рождении, так у взрослых и старых животных (рис. 1).

Рис. 1. Активность лактатдегидрогеназы и содержание молочной кислоты в скелетных мышцах собак на разных сроках онтогенеза. * - различия между мышцами достоверны при р?0,05

Наиболее ярко типологические различия между ПББМ и ИКМ проявлялись в изоферментном спектре ЛДГ. При рождении в спектре ЛДГ в ПББМ, в отличие от спектра взрослых животных, была значительно повышена доля ЛДГ1 и ЛДГ2 фракций, в 5,4 (р=0,01) и в 1,6 (р=0,02) раз соответственно. В ИКМ изоферментный спектр ЛДГ у новорожденных животных практически не отличался от спектра взрослых животных. В течение первых шести месяцев индивидуального развития изоферментный состав ЛДГ в скелетных мышцах собак претерпевал существенные изменения, приближаясь к спектру взрослых животных. Прежде всего в ПББМ снижалась доля аэробных ЛДГ1 и ЛДГ2 фракций, тогда как в ИКМ процентное содержание этих фракций возрастало. В результате таких перестроек у взрослых животных в ПББМ доля ЛДГ1 и ЛДГ2 составляла около 10 % от общей активности фермента, доля ЛДГ4 иЛДГ5 - 64 %. В ИКМ - 17 % и 57 % для аэробных и анаэробных фракций соответственно. У животных с выраженными старческими изменениями (более 8 лет) мы наблюдали интересные изменения изоферментного спектра ЛДГ в скелетных мышцах. В ПББМ резко возрастала доля ЛДГ1 и ЛДГ2 фракции, их суммарное содержание составляло около 22 % от общей активности, доля анаэробных также оставалась высокой - 60 %. Обнаруженные данные демонстрируют, что с развитием старческих изменений в ПББМ собак происходило формирование особого изоэнзимного профиля ЛДГ, характеризующегося высоким содержанием как аэробных, так и анаэробных фракций.

Таблица 1. Содержание белков саркоплазмы (мг/100 мг ткани) в скелетных мышцах собак на разных сроках онтогенеза (Медиана; 25_йч75_й процентили)

Примечание. ПББМ - передняя большеберцовая мышца, ИКМ - икроножная мышца. Верхний индекс - уровень значимости различий (р) по сравнению со животными 1-3 лет. * - статистическая значимость различий по сравнению с икроножной мышцей при р?0,05

Другие изученные нами показатели обмена мышц имели следующую динамику: с возрастом в обеих мышцах возрастало, а затем снижалось содержание саркоплазматических белков (табл. 1) и активности каталазы. Закономерно снижалась активность трансаминаз в ткани, увеличивалось содержание продуктов перекисного окисления, гликогена и общих липидов (рис. 2).

Рис. 2. Изменение содержания гликогена и общих липидов в передней большеберцовой (ПБММ) и икроножной (ИКМ) мышцах собак на разных сроках онтогенеза. Примечание: * - статистически значимые отличия с возрастом 1 год при р=0,05.

Метаболизм скелетных мышц собак в условиях оперативного удлинения костей голени методом Илизарова. Проведенное нами исследование обнаружило значительное повышение активности ЛДГ в ПББМ и ИКМ удлиняемого сегмента на всех сроках эксперимента. На этапе фиксации в мышцах удлиняемой конечности отмечалось также достоверное увеличение активности КК. Аналогичные изменения активности ферментов, но только более низкой интенсивности, происходили и в мышцах контралатеральной конечности. В изоферментом спектре ЛДГ в ПББМ обеих конечностей в ходе дистракции и фиксации увеличивалась доля аэробных фракций. В ИКМ удлиняемой конечности также увеличивалось содержание аэробных фракций, тогда как в ИКМ не оперированной конечности, наоборот, увеличивалось содержание анаэробных фракций.

Суммарное содержание продуктов гликолиза в ПБММ и ИКМ удлиняемой и контралатеральной конечности на этапах удлинения и фиксации было ниже уровня здоровых животных. Такое снижение содержания продуктов гликолиза в исследуемых мышцах было связано: 1) с увеличением реакций переаминирования в ткани (в ходе удлинения мы наблюдали повышение активности обеих аминотрансфераз), способствующие утилизации из мышц ПВК и аминного азота в составе аланина (аланиновый цикл); 2) с активацией цикла Кори, в результате которого из мышц утилизировался лактат. В пользу обеих предположении свидетельствовал рост концентрации МК в сыворотке крови на фоне снижения содержания в ней ПВК. Кроме того нами обнаружена обратная зависимость между уровнем лактата в сыворотке крови и его содержанием в мышцах удлиняемого сегмента: для ПББМ r_{(кровь/ПББМ)}= -0,67 (р=0,05), для ИКМ r_{(кровь/ИКМ)}= -0,69 (р=0,05).

Таблица 2. Содержание гликогена (мг/100 мг ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25_йч75_й процентили)

Примечание. ОПБ и КПБ - передняя большеберцовая мышца оперированной и контралатеральной конечности соответственно, ОИМ и КИМ - икроножная мышца оперированной и контралатеральной конечности соответственно. Верхний индекс - уровень значимости различий (р) по сравнению со здоровыми животными

В ходе эксперимента в ПББМ удлиняемого сегмента мы отмечали значительное снижение уровня гликогена: к середине дистракции его содержание в мышце составляло лишь 37,2 % от нормы (р=0,01), а к концу фиксации 27,8 % (р=0,05) (табл. 2). При этом в ПББМ контралатеральной конечности уровень гликогена на этапах дистракции и фиксации превышал его содержание в здоровых мышцах более чем вдвое. В ИКМ оперированной и контралатеральной конечности содержание гликогена статистически значимо от нормы на всех сроках наблюдения не отличалось. В результате данного наблюдения мы приходим к заключению, что в удлиняемой ПБММ источником энергии являлся гликоген ткани, в контралатеральной ПБММ и в ИКМ обеих конечностей - гликолиз. Высокая интенсивность гликолитического процесса в этих мышцах поддерживалась за счет сохранения высокого уровня глюкозы в крови наблюдаемого нами в ходе дистракции. Одними из энергетических источников в ИКМ на этапах удлинения и фиксации, могли являться внутриклеточные липиды, снижение уровня которых в ИКМ удлиняемой и контралатеральной конечности мы наблюдали на этапе фиксации и через месяц после снятия аппарата (табл. 3).

Таблица 3. Содержание общих липидов (% от массы сырой ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25_йч75_й процентили)

Внеклеточные источники липидов, присутствующие в крови, либо вообще не использовались тканью, либо использовались в незначительных количествах, т. к. достоверных изменений концентрации общих липидов, триглицеридов и общего холестерина на сроках наблюдения не обнаруживалось. Хотя для общих липидов и наблюдалась тенденция к снижению концентрации в сыворотке крови с конца этапа дистракции до конца фиксации.

Рис. 3. Концентрация АТФ в передней большеберцовой мышце удлиняемой и контралатеральной конечности собак при оперативном удлинении костей голени

Таким образом, активация энергетического обмена в скелетных мышцах в ходе оперативного удлинения костей голени происходила как в мышцах удлиняемой, так и контралатеральной конечности. Однако на фоне наблюдаемых изменений наименьшая эффективность энергетического обмена была в ПББМ удлиняемой конечности. Основным фактором, способствующим этому, являлось то, что на эту мышцу приходились максимальные биомеханические нагрузки при дистракции, величина прироста длины этой мышцы была больше, чем достигнутое конечное удлинение кости. Подтверждение высказанному выше предположению - существенное снижение уровня АТФ в ПББМ удлиняемого сегмента конечности, как относительно нормы, так и относительно мышцы контралатеральной конечности (рис. 3). Снятие дистракционных нагрузок на мышцы удлиняемой конечности, равномерное перераспределение статической нагрузки на обе конечности на этапе фиксации, способствовало восстановлению энергетического метаболизма в ткани, увеличению уровня эндогенных энергетических субстратов и АТФ в ней.

Таблица 4. Содержание саркоплазматических белков (мг/100 мг ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25_йч75_й процентили)

В ПББМ обеих конечностей нами было также обнаружено статистически значимое снижение содержания саркоплазматических белков в период с 14_х суток дистракции до 1_го месяца после снятия аппарата (табл. 4). Снижение концентрации белков саркоплазмы в ИКМ оперированной и контралатеральной конечности было не столь длительным и продолжалось с конца этапа дистракции до конца периода фиксации.

Электрофоретическое разделение белков саркоплазмы на этапах удлинения показало, что на 14_е сутки дистракции у всех животных как в мышцах оперированной, так и контралатеральной конечности, обнаруживалось восемь фракций (рис. 4б). На 28_ых сутках дистракции и на всех сроках этапа фиксации спектр белков саркоплазмы в ПББМ и ИКМ удлиняемой конечности был представлен только семью фракциями (рис. 4в, отсутствовала фракция № 5). В безаппаратный период в мышцах устанавливалось соотношение, наблюдаемое у интактных животных: у половины собак после снятия аппарата в обеих мышцах обнаруживалось восемь фракции, у другой половины - семь.

Рис. 5. Содержание миофибриллярных белков в передней большеберцовой (ПББМ) и икроножной (ИКМ) мышце удлиняемой (опыт) и контралатеральной (контр) конечности собак при удлинении голени

В мышцах удлиняемой конечности, помимо снижения уровня саркоплазматических белков, снижалось и содержание миофибриллярных белков, экстрагируемых 0,6М раствором хлорида калия (рис. 5). Для сократительных белков в ходе удлинения нами обнаружено не только снижение их абсолютного числа, но изменение кинетических параметров миозина, определяющих его сократительные свойства. Оказалось, что K_m миозина, выделенного из ПББМ после оперативного удлинения, была выше, чем у миозина, полученного из мышцы здоровых животных (рис. 6). Аналогичная картина наблюдалась и для ИКМ. При этом максимальная скорость реакции (V_max) в удлиненной и здоровой мышце не изменялась: пересечение графиков с осью OY было в одной точке.

Рис. 6. График двойных обратных величин для миозиновой АТФ-азы скелетных мышц собак на момент снятия аппарата

Отмечаемое снижение уровня мышечных белков в мышцах удлиняемой конечности могло быть связано с интенсификацией протеолиза в ткани. Однако увеличения активности протеаз на этапе дистракции в мышцах удлиняемой и контралатеральной конечности нами обнаружено не было. Мало того, в этот период, на уровне тенденции, мы отмечали снижение активности КФ в ткани. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что снижение содержания белков в скелетных мышцах в ходе удлинения, было связано с недостаточной активностью белкового синтеза в ткани на фоне повышенных нагрузок как на мышцы оперированной, так и контралатеральной конечности. В пользу данного предположения говорило и то обстоятельство, что концентрация конечного продукта катаболического распада аминокислот и белков - мочевины в сыворотке крови собак в ходе эксперимента не повышалось, а на этапе дистракции даже статистически значимо снижалось.

Таблица 5. Концентрация малонового диальдегида (нмоль/г ткани) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25 йч75 й процентили)

Снижение уровня саркоплазматических и сократительных мышечных белков, а также изменение кинетических параметров последних, может быть связано и с активацией синтеза активированных форм кислорода, приводящих к росту реакций перекисного окисления в ткани. Нами обнаружено возрастание уровня МДА в мышцах как оперированной, так и не оперированной конечностей к концу дистракции (табл. 5). Однако в ИКМ удлиняемой конечности высокие концентрации МДА сохранялись на этапе фиксации и через три месяца после снятия аппарата. Полученные данные доказывают, что дистракция вызывала активацию реакций перекисного окисления липидов в скелетных мышцах, причем более значительную в ИКМ. Активация перекисного окисления вызывало также незначительное увеличение содержания продуктов перекисного окисления белка в мышцах, параллельно этому в обеих мышцах удлиняемой и контралатеральной конечности на этапе дистракции увеличивалась активность каталазы (табл. 6).

Таблица 6. Активность каталазы (мккат/г белка) в скелетных мышцах собак при оперативном удлинении костей голени (Медиана; 25_йч75_й процентили)

Рис. 7. Содержание МДА, продуктов ПОБ, регистрируемых при 270 нм (ПОБ270), в сыворотке крови (а) и активность СОД в эритроцитах собак (б) в динамике оперативного удлинения костей голени. Примечание: по оси ОХ - сроки эксперимента: 1 - до операции, 2-7_е сутки дистракции, 3-14_е сутки дистракции; 4-21_е сутки дистракции, 5-28_е сутки дистракции; 6-15_е сутки фиксации; 7 - конец фиксации (30_е сутки); 8 - 1 месяц после снятия аппарата. * - значимость различий по сравнению с нормой при р?0,05

Наблюдаемые изменения в системе перекисного окисления и антиоксидантной защиты в скелетных мышцах при удлинении конечности можно отнести к реакциям неспецифического ответа ткани на внешнее воздействие, т. к. подобные изменения данных показателей обнаруживались и в сыворотке крови. Так, в ходе этапа дистракции происходило увеличение в крови продуктов перекисного окисления липидов и белков на фоне роста активности антиоксидантного фермента - супероксиддисмутазы в эритроцитах (рис. 7).

Проведенные исследования позволили разделить наблюдаемые изменения метаболизма в скелетных мышцах на специфические (тканевые), связанные с реакциями энергообеспечения ткани и отвечающие за адаптацию мышц к удлинению, и неспецифические (системные), возникающие на уровне организма и вызываемые действием комплекса факторов, действующих в ходе эксперимента (операция, дистракция, снятие аппарата).

ЛДГ, мккат/г белка КК мккат/г белка Г6ФДГ, мккат/г белка

Рис. 8. Активность ферментов энергетических циклов в передней большеберцовой мышце удлиняемой конечности у собак с различным темпом удлинения. Примечание. По оси абсцисс: 1 - здоровые животные; 2 - конец дистракции; 3 - конец фиксации; 4 - месяц после снятия аппарата

На основе данной гипотезы мы предположили, что увеличение интенсивности дистракции должно приводить к более значительному росту реакций энергообмена в ткани, снижению антиоксидантных ресурсов в ней и активации ПОЛ. Для подтверждения высказанного предположения мы провели исследование метаболических процессов, происходящих в скелетных мышцах при увеличении интенсивности дистракционных нагрузок, когда величина удлинения в сутки составляет 3 мм в отличие от стандартного темпа в 1 мм в сутки. Ожидаемого компенсаторного роста активности ферментов на этапе дистракции, вызванного увеличением темпа удлинения, не наблюдалось. Однако, оказалось, что реактивные изменения процессов энергетического метаболизма в ткани развивались после снятия дистракционных нагрузок, на этапе фиксации, когда в ПББМ удлиняемого сегмента у животных с темпом удлинения 3 мм/сутки отмечался всплеск активности ЛДГ и КК (рис. 8). Кроме того, в ПББМ удлиняемой конечности у собак с темпом удлинения 3 мм/сутки значительно повышалась активность Г6ФДГ. Увеличение темпа дистракции не вызывало значительного снижения уровня белков саркоплазмы, МДА и активности каталазы в ПББМ оперированной конечности, а также в сыворотке крови собак относительно изменений у животных при режиме удлинения 1 мм/сутки.

Метаболизм скелетных мышц собак при моделировании оскольчатого перелома костей голени с последующим лечением аппаратом Илизарова. Нами обнаружено, что активность ЛДГ и КК статистически значимо увеличивалась вначале в мышцах контралатеральной конечности (14_е сутки после перелома), тогда как в мышцах травмированной конечности она возрастала в поздние сроки фиксации (на 28_е и 21_е сутки соответственно для ЛДК и КК). Активность ЛДГ оставалась повышенной в мышцах обеих конечностей в течение месяца после окончания лечения. В изоферментном спектре ЛДГ в ПББМ и ИКМ травмированной конечности вначале увеличивалась доля анаэробных фракций (до 21_ых суток), затем возрастало содержание аэробных фракций.

Концентрация МК в ПББМ травмированной конечности в ходе лечения статистически значимо не изменялась, тогда как в ИКМ отмечалось значительное ее снижение. Такие изменения уровня МК происходили на фоне существенного увеличения концентрации ПВК в обеих мышцах травмированной конечности. Наблюдаемое снижение МК в ИКМ обеих конечностей в период фиксации было также связано с утилизацией этого метаболита в межорганном цикле Кори, о чем свидетельствовал рост уровня лактата в крови. Кроме того, мы обнаружили обратную корреляционную зависимость между концентрацией МК в ИКМ и в сыворотке крови: r= -0,83 (р=0,005), r= -0,62 (р=0,05), соответственно для ИКМ травмированной и контралатеральной конечности. Суммарное содержание продуктов гликолиза после окончания лечения было значительно выше в мышцах животных, которым аппарат снимали на 28-35_е стуки фиксации, в отличие от животных, срок фиксации которых составлял 49 суток (рис. 9).

Рис. 9. Произведение МК*ПВК в скелетных мышцах травмированной конечности собак 1_й (аппарат снимали на 28-35_е сутки) и 2_й (аппарат снимали на 49_е сутки) экспериментальных групп в динамике лечения оскольчатого перелома костей голени. Примечание: по оси ОХ - сроки лечения: 14Ф - 14_е сутки фиксации; 21Ф - 21_е сутки фиксации; кФ - конец фиксации; 30БА - 30_е сутки; 90БА - 90_е сутки без аппарата

Содержание гликогена в мышцах травмированной и контралатеральной конечности на сроках фиксации находилось в пределах нормы, однако в ПББМ травмированной конечности отмечалась тенденция к снижению данного показателя в первые три недели после травмы (рис. 10а). Уровень общих липидов в ПББМ травмированной конечности в ходе лечения практически не менялся, в ИКМ - с увеличением срока фиксации наблюдалась тенденция к его снижению (рис. 10б). Изменение концентрации липидов сыворотки крови в динамике лечения не имело достоверных отличий по сравнению с дооперационными значениями.

Рис. 10. Содержание гликогена (мг/100 мг ткани) (а) и общих липидов (% от сырой массы) (б) в мышцах травмированной конечности собак в динамике лечения оскольчатого перелома костей голени. Примечание. 14Ф и т. п. - сутки фиксации

Таким образом, сопоставляя данные, характеризующие углеводно-энергетический обмен в мышцах в посттравматический период можно сделать вывод, что энергетический метаболизм в ПББМ и ИКМ травмированной конечности был в достато...