Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В основе научного прогресса лежит эволюция методических приемов, используемых для решения современных задач иммунологии. Внедрение новой методологии, совершенствование методов исследования - главный фактор повышения уровня знаний в области молекулярной биологии иммунного ответа, где ключевую роль играют антитела, рецепторы иммунокомпетнтных клеток, межклеточные взаимодействия. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета основаны на межклеточной кооперации трех основных популяций лейкоцитов: макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, которые на разных этапах онто- и иммуногенеза включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р., 2008). Иммунокомпетентные клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами (МкА), были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation - символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека и животных. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы, характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Ройт А. и др., 2000, Рабсон А. и др., 2006, Бурместер Г.-Р. И др., 2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы, обеспечивают защиту от микро - организмов, поврежденных и генетически измененных клеток (Ярилин А.А., 1999, Давтян Т.К. и др., 2005, Сидорова Е.Б., 2006 и др.). Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (секретируемые антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязанных белков IgSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fc - рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR - антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы (Кирюхин А.В. и др., 2003, Добротина Н.А. и др., 2005, Артюхов В.Г и др., 2006 и др.).

Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработка методов исследования IgSF, характеристика их биологических свойств, а именно функциональных и рецепторных, в процессах онто- и иммуногенеза является перспективным направлением для определения иммунологической эффективности биологических препаратов, создания новых безопасных вакцин - основу специфической профилактики болезней животных.

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Haines D.M. и West K.H., 2005, Саидов М.З. и др., 2006, Высочин И.В. и др., 2006 и др.). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель работы - разработка современной методологии идентификации белков суперсемейства иммуноглобулинов и характеристика их биологических свойств в процессе фило - ., онто- и иммуногенеза.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) рогатого скота.

2. Получить моноспецифические антисыворотки для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, А в биологических жидкостях организма рогатого скота и провести сравнительный анализ с моноклональными антителами к Ig.

3. Усовершенствовать методы изучения и оценки растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов

4. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IgM.

5. Изучить протективные свойства белков суперсемейства иммуноглобулинов у мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

6. Дать характеристику секретируемым и мембранным (sIg) формам Ig крупного рогатого скота и овец в различные периоды онтогенеза.

7. Провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.90 г. в соавторстве);

- разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение №2277421 от 5 апреля 2005 г. в соавторстве);

- разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение №2288008 от 27 ноября 2006 г. в соавторстве);

- разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.

Впервые для определения состояния иммунной системы животных выбран критерий взаимосвязи растворимых и мембранных форм иммуноглобулинов.

Практическая значимость. Систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

Разработаны в соавторстве и утверждены в установленном порядке:

- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ №9388-0039-00008064-96, 1996 г.;

- временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии №13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.;

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина G в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г.;

- технологический регламент по изготовлению, контролю и применению набора реагентов для количественного определения иммуноглобулина А в биологических жидкостях рогатого скота, 2010 г.

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

- методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол №1) (авторы: Ю.Н. Федоров и И.Ю. Ездакова);

- методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол №2) (автор: И.Ю. Ездакова);

- методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г., протокол №2) (автор: И.Ю. Ездакова);

- методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец (секция «Инфекционные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.04.2010 г. протокол №2) (авторы: И.Ю. Ездакова и Т.А. Чеботарева)

Получены: серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке «Золотая осень» «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.); золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.); медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 г. и в 2008 г. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных; «Звезда И.И. Мечникова» за инновационное развитие и продвижение научного наследия И.И. Мечникова в 2010 г.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000); Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001); Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (Москва, 2004); научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (Москва, 2005); секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005, 2008); Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р. Коваленко (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (2006); 20 - 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS) (Гдыня, 2006; Сан-Себастьян, 2007; Эгмонд, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ (1995-2008); VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе 15 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных», 1 авторское свидетельство и 3 патента на изобретение.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.б.н., профессору Л.П. Дьяконову, д.б.н., профессору О.А. Верховскому, к.б.н. Т.А Чеботаревой и сотрудникам лаборатории иммунологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 313 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей и 53 рисунками. Список литературы включает 377 источников, из них 204 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и совершенствование методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т - лимфоцитов, В-лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания секретируемой и мембраносвязанной форм Ig крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;

- функциональные и рецепторные свойства IgSF иммунокомпетентных клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.

Материалы и методы исследований

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко в период 1985-2010 гг. Общая схема исследований представлена на рис. 1.

В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии BALB/c, гибриды F1 (BALB/c х DBA/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, овцы, куры, норки, серебряные караси, карпы.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы, кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей.

Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о. Лисий. Образцы крови норок и кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО «Ветзвероцентр»).

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученных препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Иммуноблоттинг проводили в буферной системе H. Towbin et al (1979).

Иммунизацию кроликов породы «Советская шиншилла» с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А. Мисниковой и А.Ю. Самострельским в нашей модификации.

Моноклональные антитела к IgM (Сологуб В.К. и др., 1988) и IgA (Феоктистова Т.А. и др., 2003) рогатого скота получали по разработанной схеме на основе методики P.S. Paul et al. (1985).

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х., 1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии - РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Е-РО) (Кондрахин И.П. и др., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В., 2002), антигенном розеткообразовании (А-РО) (Лебедев К.А. и др., 1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (РКВ) (Горбачева Л.Д. и др., 1981).

Тест-системы с использованием моноклональных антител основаны на «сэндвич» - варианте твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве конъюгатов использовали МкА 6В8 к IgA рогатого скота, меченные пероксидазой хрена (Sigma). Изотипы Ig мышей определяли с помощью биотин-антииммуноглобулинового и авидин-пероксидазного конъюгатов, согласно инструкции фирмы производителя (Sigma ImmunoChemicals). Результаты оценивали с помощью фотометра «Multiskan MCC/340» по коэффициенту оптического поглощения (ОП 492).

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест - ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток - ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию иммунофлуоресценции - РИФ (Новикова М.С., 1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05.

Результаты исследований

Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные - мембраносвязанные ILT - рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и лейкоцитов с ILT-рецепторами.

Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации г-глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IgG с примесями.

В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции иммуноглобулинов использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации NaCl от 0,1 М до 0,4 М.

Осажденные г-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с DEАЕ Sepharose 6B. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Tris-HCl, рН 7,2 с 0,1М, 0,15М, 0,25М и 0,4М NaCl.

Методом иммуноэлектрофореза установлено, что IgG элюировался в первом белковом пике при 0,1 M NaCl, IgA во втором при 0,15 M NaCl, а IgM в третьем при 0,25 M NaCl. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000. Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН.

Образцы подвергали термоденатурации в присутствии 2-меркаптоэтанола, в объеме 2 мкл наносили на пластины с полиакриламидным гелем. Предварительно в образцах определяли концентрацию белка по методу Лоури. Из 2 мл г-глобулинов крупного рогатого скота, нанесенных на колонку с DEАЕ Sepharose 6B, получали 1,0 мл IgG с содержанием белка 10-15 мг/мл.

Разработка способа получения IgА из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота

Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной.

Для выделения S-IgA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR. Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).

Иммунохимические свойства моноклональных антител к IgM и sIgA рогатого скота

В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0 получены гибридомы-продуценты МкА к иммуноглобулинам классов M и A крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитических препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов определена иммунохимическая характеристика МкА. Проведены исследования и показана возможность использования полученных МкА для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных методами «сэндвич» - ИФА и РИД.

В результате проведенных исследований установлено, что моноклональные антитела С ₂, С₄, G₉, С₁₁, В₃ взаимодействуют только с IgM, не реагируя IgG и IgА, а МкА 4G₁₁, 1F₃, 7E₇, 6B₈ только с IgА. По результатам иммуноблоттинга, МкА клонов С₂, С₄ и G₉ реагируют только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. Моноклональные антитела клонов С₁₁ и В₃ взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с µ - цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА (табл. 1).

иммуноглобулин рецепторный белок суперсемейство

Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM и IgА крупного рогатого скота и овец

МкА	IgG	IgA	IgM	Тип эпитопа
		Димер	Цепи	Пента мер	Цепи
			б	L		м	L
С2	-	-	-	-	+	-	-	конформационный
С4	-	-	-	-	+	-	-	конформационный
G9	-	-	-	-	+	-	-	конформационный
С11	-	-	-	-	+	+	-	линейный
В3	-	-	-	-	+	+	-	линейный
4G11	-	+	-	-	-	-	-	конформационный
1F8	-	+	+	-	-	-	-	линейный
7Е7	-	+	+	-	-	-	-	линейный
6B8	-	+	-	-	-	-	-	конформационный

В результате проведенных исследований были отобраны клоны С₂ и G₉, продуцирующие МкА, которые взаимодействуют с нативной молекулой IgM и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации. Использование моноклональных антител в РИД предполагает наличие преципитирующих свойств Ig. МкА к IgM клонов С₂ и G₉ обладали такими свойствами, а вот МкА к IgA только при сочетании нескольких МкА различных клонов. Анализ иммунохимических свойств МкА показал, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.

Для определения минимальных концентраций IgA в биологических жидкостях крупного рогатого скота (молоко, моча) оптимизированы условия постановки «сэндвич» - ИФА с использованием МкА. Испытаны сочетания МкА, где одни из них использовали в качестве иммобилизирующих антител, а другие, конъюгированные с пероксидазой, для определения связанного антигена. В результате проведенных экспериментов подобран вариант, позволяющий идентифицировать и количественно определять уровень как мономерного сывороточного IgA, так и sIgA в различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты).

На основе полученных МкА к IgM и IgA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА.

Разработка метода идентификации Ig-рецепторов В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относят поверхностные иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота, плотности распределения мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов крови у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. С использованием поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам, возможно изучение локализации sIg клетки и определение количества В-лимфоцитов.

Несмотря на очевидный интерес к данной теме (Murakami K. et al, 2004, Usui T., 2006 и др.), в доступной отечественной литературе очень мало данных по исследованию поверхностных иммуноглобулинов лимфоцитов у крупного рогатого скота. Поверхность является своеобразным «паспортом» клетки, по которому можно идентифицировать тип и функции лимфоцита. Основные мембранные молекулы, участвующие в распознавании антигенов, принадлежат к IgSF. Мембранные Ig и антитела образуют своеобразную систему иммунного контроля за клеточной мембраной лимфоцитов, являясь сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма. Следует отметить, что многие механизмы экспрессии s-Ig лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки мало изучены и до сих пор неизвестны. В связи с этим следующим этапом работы был поиск адекватного метода для изучения Ig-рецепторов клетки.

Известно, что иммуноглобулины в организме могут быть в мембранной (sIg), цитоплазматической (cIg) и секретируемой (Ig) формах, которые являются также и показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

Для определения соотношения первых двух форм иммуноглобулинов В-клеток лимфоидных органов у интактных мышей использовали иммунопероксидазный метод.

Относительное содержание Ig-клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - IgМ, 27,5% - IgG и 20,5% - IgА в цитоплазматической форме, что подтверждает важную роль этого органа в синтезе антител. Зафиксировано 10,3% лимфоцитов с sIgM. В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% мононуклеарных клеток с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано 7,5% лимфоцитов с sIgМ, 7,1% - sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IgG, являются В-клетками памяти. В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Мембранный IgG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3% - неравномерное распределение окраски, 5,2% - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм Ig-рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. Установлено, что большинство антител лимфатических узлов относятся к IgG-изотипу. В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% клеток с sIgМ; 2,6% с sIgG и 3,8% с цитоплазматической формой IgА.

На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения поверхностных иммуноглобулинов В-клеток крупного рогатого скота с использованием МкА к IgМ и поликлональные антитела к IgG, IgА крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы.

На рис. 4 показано, что при обработке клеток 1%-ной лимонной кислотой (ЛК), количество иммуноглобулинов на поверхности клетки значительно уменьшается (рис. 4-б). Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов (рис. 4-а) на поверхности клетки, по-видимому, обусловлена способностью молекул Ig к образованию поперечных сшивок. FcгRII-рецептор В-лимфоцитов связывает только IgG и с довольно низким сродством (<10⁷М^-1). В кислой среде нековалентные взаимодействия между Fc-рецептором клетки и Fc-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные IgG диссоциируют с поверхности лимфоцита.

Мембранные IgМ ориентированы Fab-областью по направлению к внешней среде, тогда как Fc-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. S-IgM содержит на С-концах тяжелых цепей домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу Ig на наружной поверхности мембраны.

Таким образом, в иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител, полученных к молекуле IgM, определяли sIgM-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками - лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины различных изотипов. Используемые в данном исследовании антисыворотки к IgG и S-IgA крупного рогатого скота, представляют собой набор антител ко всем антигенным детерминантам Ig, в том числе, и к эпитопам легких цепей, которые у всех изотипов иммуноглобулинов являются идентичными. Поэтому при добавлении к лимфоцитам данных антител, происходит их взаимодействие со всеми изотипами Ig, находящимися на поверхности клетки. С другой стороны, моноклональные антитела к IgM крупного рогатого скота, полученные к одной антигенной детерминанте на молекуле IgM, соответственно, взаимодействуют только с ней. На фотографиях (рис. 5) отчетливо видно, как располагаются sIg по периметру лимфоцита.

Поликлональные антитела, образовавшие иммунные комплексы с поверхностными иммуноглобулинами различных изотипов, в том числе и с s-IgМ, распределяются диффузно по всей мембране клетки (рис. 5-а).

Моноклональные антитела взаимодействуют только с одним эпитопом IgM и, поэтому специфическое окрашивание не так интенсивно, как при использовании поликлональных антисывороток (рис. 5-б).

В результате проведенных исследований установлено, что количество sIgM-клеток в периферической крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у коров в возрасте 5-7 лет - 22,8%. Уровень клеток с мембраноассоциированными молекулами IgG и IgA в крови коров находится в пределах 10,7%. - 12,9%

Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) экспрессируются на поверхности клеток периферической крови крупного рогатого скота.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод для его дальнейшего использования при определении поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных IgSF в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток (перитонеальные макрофаги). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные - многорецепторные (МРОК) - и неполные - малорецепторные (мРОК). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2) и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней - опытная серия, ВИЭВ) этиологии.

Повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-и сутки после введения вирус-вакцины (табл. 2), что обусловлено различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами.

Таблица 2. Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе поствакцинального иммунного ответа

Группы животных	Сутки иммунного ответа
	0	1	2	3	7	10	14	21
1 (Т/ПМ)	26,0 ±0,5	52,0 ±0,7	70,3 ±1,0	200,7 ±12,0	21,0 ±0,3	40,1 ±0,4	21,0 ±0,8	20,0 ±0,7
2 (Т/ПМ)	30,5 ±0,9	34,8 ±0,32	212,3 ±30,4	70,7 ±0,91	56,1 ±0,3	260,3 ±35,9	125,5 ±15,8	26,2 ±0,4

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2-е сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдалось резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, которая сопровождалась морфологическими и биохимическими изменениями клеток.

В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10-14-е сутки) обусловлен выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75%, контроль - 15%), число которых на 2-е сутки снижается вдвое (рис. 6). На 7-е сутки поствакцинального иммунного ответа, их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль - 11%) и тимусе (60,0%, контроль - 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14-ти суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).

В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирус-вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках только в костном мозге на 14-е сутки после вакцинации. Это подтверждает различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены.

Таким образом, на изменение адгезивной активности макрофагов вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала Т-лимфоциту.

Возрастание CD2-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-и - вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами иммунной системы.

Таблица 3. Коэффициенты корреляции показателей реакции розеткообразования в процессе иммунного ответа (r)

Источники клеток	Тимус	Костный мозг	Лимфатические узлы	Селе- зенка	Кровь	Макро- фаги
Тимус	-	0,07	0,63	0,4	0,62	-0,32
Костный мозг	0,07	-	0,65	-0,61	-0,04	-0,44
Лимфатические узлы	0,63	0,65	-	-0,03	0,36	-0,64
Селезенка	0,4	-0,61	-0,03	-	0,39	0,45
Кровь	0,62	-0,04	0,36	0,39	-	0,37
Макрофаги	-0,32	-0,44	-0,64	0,45	0,37	-

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62), тимуса и лимфатических узлов (r=0,63) и костного мозга и лимфатических узлов (r=0,65). Сопряженность между данными параметрами объясняется развитием иммуногенеза, а именно введение антигена служит началом цепных иммунных реакций, где главную роль играет рецепторная активность CD2-рецепторов Т-клеток костного мозга, тимуса и лимфатических узлов.

Значительное повышение уровня многорецепторных клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о прямой зависимости рецепторной активности лимфоцитов первичных и вторичных лимфоидных органов в процессе иммунного ответа. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифичных лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию. Корреляционный анализ иммунологических данных показал прямую зависимость рецепторной активности CD2-антигена от функций активированных Т-клеток на разных этапах иммунного ответа.

Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа

Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных Ig-рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест. Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней (штамм ВР-2) в дозе 0,2 мл, ревакцинировали через 30 дней по аналогичной схеме.

Контрольным животным вводили 0,2 мл физиологического раствора. Процент погибших клеток (В-лимфоциты) определяли на 1-е, 7-е и 14-е сутки первичного и вторичного иммунного ответа.

При первичном иммунном ответе увеличение В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль - 12,0%), и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии sIg на клетках. Помимо количественного определения В-лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию IgG1.

В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток и уровень IgG1, тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.

В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются Ig-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные нами результаты подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки и зависимость sIg-рецепторной активности от стадии дифференцировки лимфоцита в процессе иммуногенеза.

Корреляция уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота

Антитела к различным антигенным детерминантам являются растворимыми формами мембранных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела в разной степени - гомологи антигенсвязывающих участков клеточного рецептора В-лимфоцита.

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма имеет важное прогностическое значение при вакцинации стельных коров, так у животных с низкими показателями возможен неадекватный иммунный ответ, проявляющийся в отсутствии формирования специфических протективных антител, которые обеспечивают защиту новорожденных телят

В оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи. (Михайленко А.А. и соавт., 2000). Положительная корреляция уровней ранних (IgM) и поздних (IgG) иммуноглобулинов, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при плодоношении.

Как видно из данных таблицы 4, корреляционные взаимосвязи между различными изотипами иммуноглобулинов в сыворотке крови нестельных коров являются слабо положительными (r=0,24-0,35).

Отсутствие корреляции (r=0,07) между показателями IgG и IgA косвенно подтверждает данные об относительной независимости системного и местного иммунитета у нестельных коров.

Таблица 4. Коэффициенты корреляции уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови стельных и нестельных коров

Показатели	Нестельные коровы (n=15)	Стельные коровы (n=15)
IgG/IgM	0,24	0,49
IgM/IgA	0,35	0,51
IgG/IgA	0,07	0,76

В соответствии с представленными результатами, следует отметить, что принцип мозаичности функционирования органов и систем организма, подтверждается деятельностью иммунной системы: многочисленные структурные компоненты, которой при каком-либо воздействии на нее функционируют не одновременно. С повышением специфической нагрузки - возрастает количество компонентов, участвующих в реализации ее функций; при снижении - число активно функционирующих элементов иммунной системы сокращается (Михайленко А.А. и соавт., 2000). Указанный принцип реализован в наших экспериментах. Динамика коэффициентов корреляции IgG /IgM с 0,24 до 0,49 и IgА /IgM с 0,35 до 0,51 показывает тенденцию к усилению взаимосвязи иммунологических показателей с увеличением срока стельности.

Корреляция между показателями циркулирующего IgG и местно секретируемого IgА (r=0,76) характеризует высокую степень сопряженности этих классов иммуноглобулинов у стельных коров.

Анализ взаимосвязи основных изотипов иммуноглобулинов в периферической крови овец в онтогенезе

Для оценки состояния иммунной системы (ИС) определяют количественные и функциональные показатели ее структурных компонентов. Но значения этих показателей, ввиду индивидуальной вариабельности, не всегда отражают нормальное состояние иммунной системы. Так уровень иммуноглобулинов у животных подвержен значительным колебаниям, обусловленным возрастом, полом, генетическими особенностями, внешними факторами, различными периодами онтогенеза, например, периодом плодоношения и лактации. Вместе с тем, различные компоненты ИС могут компенсировать функции друг друга, изменяя тем самым значения показателей, соответствующих статистическому определению нормального состояния иммунной системы.

В связи с этим, появляется проблема определения статистической нормы для показателей иммунного статуса. Измерять ли средние величины и возможные отклонения для каждого возраста, породы животного, периода онтогенеза, места обитания или охарактеризовать в динамике взаимосвязи основных иммунологических показателей, необходимых для нормального функционирования иммунной системы.

По нашему мнению, для адекватной оценки иммунного статуса животных, а также механизма формирования поствакцинального иммунного ответа, необходимо использовать как традиционное определение нормы, так и корреляционный анализ взаимосвязей между показателями уровня IgSF. Одной из основных характеристик состояния иммунной системы является уровень иммуноглобулинов в периферической крови. Положительная корреляция уровней сывороточных иммуноглобулинов G и M в периферической крови человека, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей при различных физиологических состояниях организма.

На примере определения коэффициента корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов обосновывается диагностический критерий для оценки нормального состояния иммунной системы у овец. В эксперименте использовали образцы периферической крови и носовых секретов овец. При проведении эксперимента животные были разделены на две группы, сформированных по принципу аналогов. Первая группа состояла из овец (№1-5) романовской породы в возрасте 5 лет. Вторая группа (№6-10) из овец в период 4-5 мес. суягности и последующей лактации. В третью группу (n=5) вошли ягнята, родившиеся от овец второй группы. Образцы крови и носовых секретов брали однократно в середине месяца в течение 10 месяцев у овец и 6 месяцев у ягнят. У животных определяли количество иммуноглобулинов M, G, A в сыворотке крови и концентрацию IgA в носовом секрете методом радиальной иммунодиффузии.

В результате проведенных исследований в первой группе животных отмечалась положительная корреляционная связь между показателями концентрации иммуноглобулинов изотипов G и М (r=0,29), М и А (r=0,1) слабой силы, а между IgG и IgA - средней силы (r=0,5). Слабая связь также наблюдалась между уровнями IgM в сыворотке крови и секреторного IgA (sIgA) в носовом секрете. Слабая отрицательная корреляция установлена между количеством сывороточных IgG и IgA, и уровнем sIgA.

Изучение спектра основных изотипов сывороточных иммуноглобулинов в первой группе овец подтверждает их взаимосвязь в процессе функционирования. Отсутствие корреляции между уровнями IgA в сыворотке крови и носовом секрете, как в первой, так и во второй группе животных, показывает относительную независимость системного и местного иммунитета.

Вторая группа животных представлена овцами в период поздней суягности и лактации. Как видно из данных таблицы 5, корреляция между показателями сывороточных иммуноглобулинов не отличаются от коэффициентов корреляции у овец первой группы. Таким образом, зависимость между количественными показателями циркулирующих Ig изотипов G, M и A у клинически здоровых животных, в том числе в период суягности и лактации, является конституционной и выражается положительным значением коэффициента корреляции.

Однако, коррелятивная связь между сывороточными Ig и секреторными IgA отсутствует у животных первой группы, а у овец второй группы коэффициент корреляции между IgM и sIgA (r=0,49^*0,02) свидетельствует о средней степени сопряженности этих показателей.

Таблица 5. Коэффициенты корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов в крови и носовых секретах у овец (n=10)

№	IgG/IgM	IgG/IgA	IgM/IgA	IgG/sIgA	IgM/sIgA	IgA/sIgA
1	0,33	0,48	0,09	0,2	0,24	-0,29
2	0,35	0,42	-0,17	-0,09	0,37	-0,5
3	0,28	0,4	-0,03	-0,16	0,5	0,15
4	0,32	0,69	0,31	-0,46	0,12	-0,05
5	0,18	0,53	0,3	-0,42	-0,25	-0,36
Mm	0,29*0,02	0,5*0,05	0,1	-0,186	0,196	-0,21
6	0,65	0,59	0,32	0,35	0,5	0,07
7	0,14	0,15	-0,08	0,17	0,37	-0,03
8	0,33	0,47	-0,32	0,07	0,46	0,06
9	0,54	0,53	0,14	-0,15	0,54	-0,007
10	0,3	0,55	0,23	-0,12	0,59	-0,13
Mm	0,39*0,16	0,46*0,12	0,06	0,06	0,49*0,02	-0,0074

Появление коррелятивной связи данных показателей перед родами и в течение лактации, свидетельствует о большем функциональном напряжении иммунной системы в этот период за счет необходимости включения большего количества ее структурных компонентов. В лактационный период данные Ig передаются с молозивом и молоком новорожденному ягненку и являются первым иммунным барьером на пути проникновения антигена в его организм. SIgA и sIgМ присутствуют на поверхности слизистых оболочек, блокируя первую фазу прилипания энтеропатогенных бактерий к энтероцитам, маскируя поверхностные рецепторы этих клеток. Данные иммуноглобулины являются протективными изотипами иммунной системы слизистых оболочек. Механизм иммунного исключения является основным при защите слизистых оболочек от внешних антигенов.

Также колостральные, абсорбированные IgA и IgМ поступают в системную циркуляцию новорожденных, способствуют нейтрализации бактериальных энтеротоксинов и энтеротропных вирусов и оказывают агглютинирующее действие на большое количество энтеропатогенных микроорганизмов.

По нашему мнению, средняя степень сопряженности показателей IgM в сыворотке крови и sIgA в носовом секрете у овец в период лактации подтверждает их важную роль в защите молодого организма от широко распространенных патогенов в первые 6 месяцев жизни.

...