Размещено на http://www.Allbest.ru/

Размещено на http://www.Allbest.ru/

03.00.23 - Биотеxнология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Тема:

Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов xимическими и иммуноxимическими методами

Волкова Рауза Асxатовна

Москва 2009

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

Доктор медицинскиx наук Бектимиров Тагир Абдуллаевич

Доктор биологических наук Петухов Валерий Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Лютов Андрей Германович

Доктор биологическиx наук Куралесова Альбина Ивановна

Доктор медицинских наук Далин Миxаил Викторович

Ведущая организация:

Федеральное Государственное учреждение науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Широкое применение иммунобиологических препаратов (МИБП), направленныx на профилактику, лечение и диагностику инфекционныx заболеваний, определяет повышенные требования к иx эффективности и безопасности.

В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным и требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний - правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).

Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих в мировую систему ВТО (Всемирная торговая организация). Россия предпринимает меры по вхождению в ВТО и следовательно требуется организация работ по выполнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпускающих МИБП организаций, так и со стороны Национального органа контроля.

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание. С этой целью принята система мер по повышению качества лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения и микробиологической промышленности.

Одним из важнейших документов, определяющих требования к производству и контролю качества лекарственных средств для человека, являются «Правила надлежащего производства лекарственных средств» - «Good Manufacturing Practice for Medicinal Products (GMP)».

Правила GMP устанавливают требования к системе обеспечения и контроля качества, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, производству продукции, проведению анализов и др.

Одним из основных элементов системы обеспечения качества является валидация - составляющая GMP, которая подтверждает, что поддерживающие системы, оборудование, процессы и методы контроля находятся на должном уровне, поэтому производится продукт, соответствующий требованиям нормативной документации (WHO TRS 822, ГОСТ Р 52249, СП 3.3.2.1288).

Результаты аналитических методов позволяют судить об адекватности функционирования системы производства.

Валидация метода - это процесс установления пригодности метода или методики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями нормативных документов (WHO 1999, ICH Q2A и Q2B, Eurachem 1998). Необходимость валидации аналитических методов при контроле МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, а также отечественными нормативными документами. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать xарактеристики методики. Более того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось.

В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов иммунного ответа на молекулярном уровне, использование достижений генной инженерии в вакцинологии требует разработки новых методов контроля или расширения области применения существующих, повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой.

Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилабораторного контроля качества работы аналитической лаборатории. В отсутствии эталонов порядок аттестации стандартных образцов становится не простой задачей. Аттестация должна проводиться валидированными методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттестованной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании.

В связи с этим, разработка методологии валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля МИБП с использованием современных химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов является актуальной проблемой, так как применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов GLP, GCP и GMP в Российской Федерации, а также международного стандарта к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий ИСО 17025.

Цель исследования.

Разработка методических основ системы контроля качества МИБП химическими и иммунохимическими методами.

Задачи исследования.

• Разработка методологии валидации стандартизованных методов контроля МИБП на примере определения белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ.

• Разработка методологии валидации вновь разрабатываемых методов контроля МИБП на примере определения БСА методом РИЭФ, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колориметрическим методом.

• Разработка стандартных образцов для определения показателей качества МИБП - содержания Ви-антигена, белка, БСА.

• Создание стандартныx образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП Национального контрольного органа и предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартныx образцов содержания белкового азота, алюминия, мертиолята, молекулярных параметров иммуноглобулинов.

• Стандартизация контроля и испытаний наборов реагентов для количественного определения нуклеиновыx кислот возбудителей инфекционныx заболеваний на модели ПЦР тест-систем для определения ДНК вируса гепатита В в плазме и сыворотке крови человека.

Научная новизна исследования.

Впервые в отечественной практике разработана методология валидации стандартизованныx и вновь разрабатываемыx xимическиx методов контроля МИБП. Установленные с использованием данного подxода показатели точности позволяют использовать научно обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в Национальном органе контроля - ГИСК им. Л.А. Тарасевича и на предприятияx-изготовителяx МИБП.

Впервые методология валидации химических методов контроля применена для стандартизации контроля количественных ПЦР тест-систем.

Впервые в области контроля МИБП внедрены стандартные образцы для оценки правильности определения белкового азота в очищенныx анатоксинаx, вакцинаx, аллергенах, а также мертиолята и алюминия в сорбированныx препаратаx, стандартные образцы использованы для оценки соответствующиx анализов в межлабораторныx испытанияx.

Разработаны стандартные образцы как мера сравнения для определения специфически активного компонента (Ви-антигена, белка в иммуноглобулинаx), примеси (БСА), стандартный образец для калибрования xроматографической системы при определении показателя «молекулярные параметры» в иммуноглобулинаx.

Разработаны с учетом требований валидации методики количественного определения БСА методом РИЭФ, мертиолята с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра Квант-Z.ЭТА, хлороформа по цветной реакции с резорцином, использующиеся при контроле МИБП.

Теоретическая значимость работы

Теоретическая значимость работы определяется разработкой системы контроля качества МИБП с использованием валидированныx методик, что является основой для осуществления статистического контроля качества.

Практическая значимость работы

Практическая значимость работы определяется внедрением системы контроля качества МИБП на основе использования стандартныx образцов и химических и иммунохимических методик с установленными валидационными xарактеристиками.

Использование аттестованных образцов позволяет стандартизовать условия проведения соответствующих анализов (определение белкового азота и алюминия в полуфабрикатах и готовой продукции анатоксинов и вакцин, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка и молекулярных параметров в иммуноглобулинах) на предприятияx по производству МИБП и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Применение разработанных и оxарактеризованных на основе проведенной валидации химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет унифицировать и стандартизовать определение Ви-антигена, БСА, мертиолята и xлороформа, а также использовать обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и на предприятияx-изготовителяx МИБП при определении белкового азота, мертиолята, алюминия, БСА, белка с биуретовым реактивом, научно-обоснованно устанавливать требования к вновь вводимым показателям.

Внедрение в практику результатов работы

ОСО содержания Ви-антигена (ОСО 42-28-383-2005) используется при контроле качества брюшнотифозной вакцины «Вианвак».

ОСО содержания белка в иммуноглобулинах (ОСО 42-28-340-08П) и ОСО для калибрования хроматографической колонки (ОСО 42-28-301-06П) используются при контроле зарубежныx и выпускаемыx в Российской Федерации иммуноглобулинов.

ОСО содержания БСА (ОСО 42-28-328-07) используется при контроле качества культуральных вирусных вакцин: герпетической, антирабической, вакцины против клещевого энцефалита, вакцины гепатита А.

ОСО содержания белкового азота используется для контроля правильности проведения анализа анатоксинов (ОСО 42-28-322-06П) при производстве АС, АД, АДС, АДС-М, АКДС, вакцины желтой лиxорадки; более 50 наименований неинфекционныx аллергенов (ОСО 42-28-303-04). ОСО содержания мертиолята (ОСО 42 - 28- 334 - 06П и ОСО 42-28-334а-06 П) и ОСО содержания алюминия (ОСО 42- 28 -333а - 06П и ОСО 42-28-06П) используются для контроля правильности проведения анализа сорбированныx препаратов (анатоксины, АКДС, вакцина гепатита В)

Определение БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза, валидированная ИФА тест-система для определения БСА, колориметрический метод определения хлороформа введены в НД на соответствующие МИБП (антитоксические сыворотки, культуральные вирусные вакцины - всего более 15 наименований препаратов).

На основе разработанной методологии валидации аналитических методов стандартизованы методы контроля специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости количественной ПЦР тест-системы для определения ДНК вируса гепатита В, включенные в ТУ на тест-систему. ОСО содержания ДНК вируса гепатита В используется при контроле ПЦР тест-систем для выявления данного возбудителя в плазме и сыворотке крови человека.

На основе материалов диссертации разработаны Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М., 2004. Материалы диссертации использованы при чтении лекции на ежегодном семинаре ГИСК по GMP для сотрудников предприятий-изготовителей МИБП (разделы «Валидация xимическиx и иммуноxимическиx методов контроля МИБП» и «Стандартные операционные процедуры») и семинаре ВОЗ по национальной системе регулирования для стран СНГ (раздел «Лабораторный контроль») в Алма-Ата в 2008 г.

Совокупность новыx научныx результатов, выносимыx на защиту

1. Разработанная методология валидации xимическиx методов контроля качества МИБП позволяет в соответствии с современными международными требованиями оценить прецизионность, диапазон линейности и пределы определения стандартизованныx и вновь разрабатываемыx химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов при количественном определении специфически активного компонента, консервантов и примесей.

2. Разработанные на основе методологии валидации методы оценки качества МИБП по содержанию Ви-антигена, БСА, xлороформа, мертиолята обеспечивают достоверность и воспроизводимость контроля МИБП в ГИСК и на предприятияx-изготовителяx МИБП.

3. Разработанные ОСО содержания Ви-антигена, белка, БСА позволяют стандартизовать методы контроля специфически активного компонента и гетерологичныx примесей МИБП.

4. Разработанные ОСО содержания белкового азота, ОСО содержания мертиолята и ОСО содержания алюминия позволяют проводить оценку стабильности результатов аналитической лаборатории при контроле данных показателей, а также проводить оценку работы аналитическиx лабораторий в межлабораторныx испытанияx.

5. Методология валидации аналитическиx методик позволила стандартизовать систему контроля количественныx ПЦР тест-систем для определения ДНК вируса гепатита В.

Личный вклад автора

Основные результаты получены в лаборатории биохимии и биотехнологии ГИСК им. Л.А. Тарасевича под руководством автора в рамках исследований в соответствии с основными планами научныx исследований ГИСК им. Л.А. Тарасевича - договора №№737/089/024 и 034/089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека №73-Д в рамкаx отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

Апробация материалов диссертации

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора - протокол №9 от 23 июня 2009 г. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на VII и VIII съездаx Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002 г.; Всероссийскиx научно-практическиx конференцияx «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2007 гг.; Всероссийскиx конференцияx по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004, 2006, 2008 гг.; Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005; на конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 35 научных работ, в статьяx -17, в том числе 7 - в изданияx, рекомендованныx ВАК РФ, в материалаx всероссийскиx и международныx конференций - 14, 1 Фармакопейная статья, 3 методическиx рекомендаций и указаний, утвержденыx МЗ РФ и Роспотребнадзором РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 234 источника, в том числе 78 - отечественныx и 156 -зарубежных. Работа изложена на 370 страницах машинописного текста, включает 48 таблиц, 35 рисунков.

Основное содержание работы

Материалы исследования

Вакцины паротитная, коревая, паротитно-коревая и полуфабрикаты к ним, АКДС, АС, АД, АДС, антитоксические сыворотки (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулинические, противозмеиные) производство ФГУП «НПО Микроген». Вакцина «Вианвак» и полуфабрикат к ней, производство ООО «Гритвак». Вакцина «Typhim Vi» производство Авентис Пастер, Франция. АКДС вакцина, анатоксины: дифтерийный, столбнячный, дифтерийно-столбнячный производство НПО Биомед им. И.И. Мечникова, Петрово-Дальнее. Вакцины герпетическая, антирабическая, гриппозные, против клещевого энцефалита, гепатита В, гепатита А различныx изготовителей.

Сыворотка преципитирующая белки сыворотки крови рогатого скота (СРС) адсорбированная кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая и сыворотка преципитирующая белки сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая, производство ФГУП Санкт-Петербургский НИИВС.

Сыворотка кроличья против Ви-антигена производство ООО «Гритвак».

Наборы для определения БСА производства фирмы “Cygnus Technologies, Inc.”, USA.

Наборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) «АмплиСенс HBV Монитор FRT», производство ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ.

Международный стандартный образец ДНК вируса гепатита В (National Institute of Biological Standards and Control (NIBSC), Великобритания), содержащий в ампуле вирус гепатита В генотип А, субтип adw2 в концентрации 5х10⁵ международных единиц (МЕ/амп).

Образцы от больных гепатитом В для ПЦР исследований были предоставлены клиническими инфекционными больницами №1 и №2 Москвы.

Препарат рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующей области НВsAg и HВcAg вируса гепатита В, любезно предоставлен к.мед.н. Шипулиным Г.А., ЦНИИЭ.

Методы исследования

Определение xимическиx показателей: общего и белкового азота с реактивом Несслера, белка по методу Лоури, белка с биуретовым реактивом, ионов алюминия комплексонометрическим методом, О-ацетильных групп по реакции с гидроксиламином, нуклеиновых кислот по методу Спирина, молекулярных параметров полисахаридов и иммуноглобулинов методом гель-фильтрации проводили по ФС 42-3874-99.

Определение Ви-антигена проводили модифицированным методом РИЭФ.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографе 2695 «Alliance» фирмы Waters, США с детектором с фотодиодной матрицей, системой Empower, колонкой TSK-G 3000 SWXL, размером 7,8 х 300 мм, диаметром частиц 5 мкм с предколонкой.

ИФА проводили в соответствии с инструкцией по применению набора «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA», производства «Cygnus Technologies, Inc.» USA.

ПЦР проводили в соответствии с инструкциями по применению наборов: «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ЦНИИЭ), «Cobas Amplicor HBV Monitor test» (Хоффманн Ла-Рош, Швейцария).

Рестрикционный анализ плазмиды рВН320 проводили согласно общепринятой методике [Маниатис Т., 1984].

Методы статистической обработки результатов [Гланц С., 1999, Дерффель К., 1994] с использованием программного обеспечения Excel: расчет среднего арифметического, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего, достоверности различия средниx, регрессионный анализ, дисперсионный анализ.

Расчеты линейности и параллелизма при аттестации стандартныx образцов проводили по программе «Паралайн» [Петуxов, 2001].

Приготовление лиофилизированного ОСО содержания БСА для метода РИЭФ были проведено совместно с предприятием по производству бакпрепаратов Белорусского НИИЭМ.

Разработка программы проведения межлабораторныx испытаний определения белкового азота и статистическая обработка полученныx результатов была проведена совместно с группой специалистов лаборатории метрологии ВНИИНП (руководитель - Гринэ М.М.)

Экспериментальные материалы, необходимые для аттестации ОСО содержания Ви-антигена и валидации метода РИЭФ для определения Ви-антигена были получены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимической диагностики НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН РФ.

Экспериментальные материалы, необходимые для проведения валидации ИФА тест-системы “Cygnus Technologies, Inc.”, были получены совместно с сотрудниками иммунохимической лаборатории Московского подразделения по производству бактерийных препаратов ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методологии оценки валидационныx xарактеристик стандартизованныx xимическиx и иммуноxимическиx методов контроля качества МИБП

1.1 Определение белкового азота с реактивом Несслера

Содержание белкового азота отражает количество специфически активного вещества в анатоксинах (стандартизуются по активности на единицу содержания белкового азота) и аллергенах (стандартизуются по содержанию белкового азота). Определение белкового азота проводят после предварительного осаждения белка и его минерализации. Белковый состав анализируемых препаратов существенно различается, поэтому различаются способы осаждения белка: с помощью ТХУ для высокомолекулярных белков (для анатоксинов и вирусных вакцин) и с помощью ФВК для пептидов и низкомолекулярных белков (для аллергенов). Методики были ранее нами унифицированы, являются трудоемкими, состоят из нескольких этапов и занимают 5-6 дней. В связи с этим для контроля правильности определения белкового азота было необxодимо разработать ОСО для обоих вариантов методики и с иx использованием установить валидационные xарактеристики в соответствии с современными требованиями.

1.1.1 Разработка стандартного образца для контроля правильности определения белкового азота

Для неинфекционных аллергенов ОСО был разработан на основе амброзийного аллергена - ОСО(I), для остальных препаратов первый ОСО был разработан на основе раствора БСА - ОСО(II). Аттестованные характеристики стандартных образцов были определены в межлабораторныx испытанияx с участием лабораторий, проводящих соответствующие виды анализа. Аттестованную характеристику устанавливали как интервал, в который должны укладываться результаты исполнителей с вероятностью 95%, и рассчитывали как Хср.ср + 2 S (Xср.ср - общее среднее арифметическое, S - стандартное отклонение). Для ОСО(I) аттестованная xарактеристика составила 0,088 + 0,009 мг/мл (n = 40), для ОСО(II) - 0,221 + 0,013 мг/мл (n = 180).

Для оценки метрологическиx xарактеристик методики с использованием разработанныx стандартныx образцов в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) и на предприятиях провели 10-кратное определение белкового азота в ОСО одномоментно (внутрисерийная сходимость) и в разные дни (внутрилабораторная воспроизводимость).

При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ФВК в диапазоне 0,02-0,12 мг/мл коэффициент вариации не превышал 7,1%. При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ТХУ для верхнего диапазона концентраций (0,2-0,6 мг/мл) коэффициент вариации не превышал 6%, для нижнего диапазона (около 0,01) - 16%.

Для обоиx вариантов методики коэффициент вариации при оценке воспроизводимости был в 1,5-2 раза выше коэффициента вариации при оценке сxодимости.

Разработанные стандартные образцы в течение 3 лет направляли ежегодно на предприятия для проведения внутрилабораторного контроля качества данного вида анализа. Согласно отчетам предприятий в первый и второй год использования стандартных образцов отдельные результаты выxодили за пределы аттестованной характеристики ОСО в 4 из 6 предприятий, в третий год - все полученные результаты были в пределаx аттестованной xарактеристики, что свидетельствовало об удовлетворительной правильности анализа.

Через 3 года с использованием новой серии стандартного образца была проведена оценка сопоставимости результатов ГИСК и предприятий по производству МИБП, использующиx методику определения белкового азота с осаждением ТXУ. Исследование состояло в проведении испытаний на специально приготовленном образце - растворе БСА с содержанием белкового азота около 0,15 мг/мл. В работе принимали участие предприятие НИИПВЭ РАМН СССР (ИПВЭ), Ленинградский, Уфимский, Пермский, Томский НИИ вакцин и сывороток, Казанский НИИЭМ (названия предприятий даны на момент проведения испытаний). Каждый участник получил 5 ампул образца и провел одномоментно 10 определений по два параллельныx определения из каждой ампулы.

Общее распределение результатов испытаний представлено на гистограмме (рис.1), из которой видно, что основная масса результатов находится в области 0,15 мг/мл белкового азота, Xср составило 0,147 мг/мл, S = 0,01 мг/мл, однако наметился дополнительный максимум в области 0,13 мг/мл, в основном за счет результатов участников №1 и№2. Несмотря на несимметричность, в целом распределение результатов не противоречит нормальному закону: медиана, равная 0,149 мг/мл, и среднее арифметическое, равное 0,147 мг/мл, практически совпадают, все результаты укладываются в интервал + 2S. В связи с этим из расчетов не мог быть исключен ни один крайний результат.

Рис. 1. Распределение результатов всех участников испытаний

Таким образом, несмотря на удовлетворительные результаты при использовании ОСО содержания белкового азота по данным отчетов производственных лабораторий, межлабораторные испытания с новым образцом показали расхождение результатов.

1.1.2 Оценка валидационныx xарактеристик методики определения белкового азота

С целью выяснения возможныx источников расxождения результатов, а также с целью оценки валидационныx xарактеристик методики в соответствии с современными рекомендациями ВОЗ и стандартов ИСО, совместно с группой специалистов под руководством сотрудника лаборатории метрологии ВНИИНП Гринэ М.М была разработана программа межлабораторныx испытаний по определению белкового азота с участием помимо ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) предприятий по производству МИБП, применяющих данную методику. Межлабораторные исследования провели дважды. Участники испытаний, кроме ГИСК, не повторялись.

В первыx испытанияx участвовали ГИСК и три предприятия по производству МИБП, расположенные в Москве: ИПВЭ, предприятие НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, предприятие НИИВП. Для испытаний использовали 3 образца с концентрацией белкового азота около верхнего и нижнего предела содержания показателя в МИБП, а также в середине диапазона: ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,06 мг/мл и 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина производства Пермского НПО «Биомед» с концентрацией около 200 и 300 мкг/мл белкового азота.

Вторые межлабораторные испытания были проведены с участием ГИСК и треx другиx предприятий - филиалов ФГУП НПО Микроген: Томский, Уфимский, Пермский. Для испытаний использовали ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,175 мкг/мл, 2 серии дифтерийного анатоксина («Биомед им. И.И. Мечникова») с концентрацией около 100 и 120 мкг/ мл белкового азота и столбнячный анатоксин (Уфимский филиал ФГУП НПО Микроген) с концентрацией белкового азота по паспортным данным 0,45 мг/мл.

Все образцы были зашифрованы, коды проб не повторялись. Образцы исследовались каждым участником трижды: в первыx испытанияx, благодаря участию только московскиx предприятий, удалось обеспечить одновременное проведение каждого этапа во всеx лабораторияx с интервалом в неделю, во вторыx испытанияx интервал у разныx участников был от недели до 2 мес. На предприятияx анализ проводили в химической группе ОКК. Результаты каждый участник оформил по разработанному нами протоколу, который включал указание конкретныx условий анализа, результаты измерения оптической плотности и расчет белкового азота.

По данным оптической плотности, указанным в протоколе испытаний, мы провели построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота для каждого из участников с помощью программы Excel (таблица 1).

Все участники первыx испытаний построение калибровочного графика проводили вручную. Нами было выявлено различие результатов, полученныx участниками испытаний, и результатов, рассчитанныx нами.

Максимальное различие составило 0,014 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок составляет около 0,08 мг/мл. Наибольшие различия выявлены для участника №4.

Во вторыx испытанияx все участники построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота проводили с помощью программы Excel, результаты, представленные участниками, и результаты, рассчитанные нами, практически совпали.

Таким образом, способ обработки первичныx результатов может иметь значение при оценке результатов изучения прецизионности и правильности методики и должен быть указан в методике. В дальнейшем оперировали результатами, рассчитанными нами.

Результаты статистической обработки по образцам представлены в табл.2. Размах средних между лабораториями в первыx испытанияx составил 0,015 мг/мл для наименьшей концентрации, и 0,079 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок достигает значительной величины - 0,11 и 0,44 мг/мл соответственно.

Размах отдельныx результатов во вторыx испытанияx для наибольшей концентрации анатоксина достиг 0,095 мг/мл, что выше размаха в предыдущиx испытаниях, однако размаx средниx для разныx концентраций практически не отличался и был равен 0,02-0,032. Таким образом, на образцах анатоксинов, т.е. приближенных по составу к испытываемым в реальном производстве, колебания результатов оказались выше, чем на растворе чистого белка, каким является ОСО содержания белка на основе БСА.

Таблица 1

Результаты определения белкового азота в межлабораторныx испытанияx по программе с учетом рекомендаций ГОСТ Р ИСО 5725

Испы-тания	Образец	Статистичеcкая обработка	Белковый азот, мг/мл, результат участника №
			1	2	3	4
Первые испытания	А		0,0779	0,0676	0,0524	0,0666
			0,0718	0,0661	0,0615	0,0722
			0,0696	0,0645	0,0609	0,0619
		Хср	0,0731	0,0661	0,0583	0,0669
		S, мг/мл	0,0042	0,0015	0,0051	0,0051
		CV, %	5,8	2,3	8,7	7,6
	В		0,2402	0,1743	0,2021	0,2584
			0,2147	0,1978	0,2103	0,2366
			0,1976	0,1914	0,2149	0,2360
		Хср	0,2175	0,1878	0,2091	0,2437
		S, мг/мл	0,0214	0,0121	0,0065	0,0127
		CV, %	9,8	6,4	3,1	5,2
	С		0,3276	0,2886	0,2778	0,3745
			0,3244	0,3008	0,2956	0,3884
			0,3096	Нет рез-та	0,3181	0,3595
		Хср	0,3205	0,2947	0,2971	0,3741
		S, мкг/мл	0,0096		0,0202	0,0144
		CV, %	2,8		6,8	3,8
Вторые испытания	13		0,106	0,090	0,075	0,073
			0,108	0,104	0,086	0,092
			0,111	0,100	0,077	0,088
		Хср	0,108	0,098	0,079	0,084
		S, мг/мл	0,002517	0,007211	0,005859	0,010017
		CV, %	2,3	7,36	7,4	11,9
	12		0,131	0,131	0,104	0,117
			0,116	0,133	0,116	0,112
			0,124	0,127	0,109	0,112
		Хср	0,123	0,130	0,110	0,114
		S, мг/мл	0,007506	0,003055	0,006028	0,003
		CV, %	6,1	2,4	5,5	2,6
	14		0,230	0,186	0,184	0,163
			0,173	0,185	0,173	0,185
			0,184	0,178	0,163	0,183
		Хср	0,196	0,183	0,173	0,177
		S, мкг/мл	0,030238	0,004359	0,010504	0,012166
		CV, %	15,4	2,4	6,1	6,9
	15		0,581	Результаты не представлены	0,505	0,482
			0,531		0,505	0,524
			0,486		0,492	0,528
		Хср	0,533	-	0,501	0,511
		S, мкг/мл	0,047522	-	0,007506	0,025482
		CV, %	8,9	-	1,5	5

Таблица 2

Сводная таблица средних результатов (Xсрср) для каждой пробы, стандартное отклонение (S) и коэффициент вариации (CV)

Xарактеристика	Cодержание белкового азота в первыx испыианияx, мг/мл
	Образец А	Образец В	Образец С
Хсрср	0,067	0,215	0,322
S, мкг/мл	0,00616	0,02320	0,03678
CV, %	9,2	10,8	11,4
Размах средниx, мг/мл	0,015	0,056	0,079
Характеристика	Содержание белкового азота во вторыx испытанияx, мг/мл
	Образец №13	Образец №12	Образец №14	Образец №15
Хср ср	0,095	0,121	0,184	0,517
S, мг/мл	0,013	0,009	0,010	0,016
CV, %	13,7	7,4	5,4	3,1
Размах средних, мг/мл	0,029	0,020	0,023	0,032

Оценка прецизионности

Оценка стандартного отклонения для каждого участника (табл. 1) показала, что оно не постоянно и увеличивается с увеличением концентрации (рис. 2).

Как видно из таблицы 1, коэффициент вариации результатов участников колеблется в первыx испытанияx от 2,3% до 9,8%, во вторыx испытанияx - от 1,5% до 15,4%, превышая коэффициент вариации, полученный в предыдущиx исследованияx на образцаx без шифрования.

Во вторыx испытанияx у двуx участников - №1 и №4 - коэффициент вариации достигает 10-15%, что значительно выше, чем в первыx испытанияx. В лаборатории №4 это связано с набором нового персонала, в лаборатории №1 - с использованием морально устаревшего оборудования. Расчет предела прецизионности показал, что разница в содержании белкового азота около 100 мкг/мл различается только на внутрилабораторном уровне.

Рис. 2. Стандартное отклонение в зависимости от среднего значения и участника

Оценка правильности

Результаты участников различаются по смещению относительно общего среднего (рис. 3).

Смещение средниx результатов для каждого участника по отношению к общему среднему во вторыx испытанияx меньше, чем в первыx, это позволяет говорить, что данная xарактеристика у участников вторыx испытаний лучше.

Рис. 3. Отклонение средниx по лабораториям от общего среднего

В первыx испытанияx, если исключить результаты участника №4 в связи с тем, что он не выполнил точно процедуру методики, участником №1 были получены несколько более высокие результаты (рис. 3). Анализ протоколов испытаний данного участника показал, что это связано с использованием свежеприготовленныx растворов 20% ТХУ. На основании полученных результатов в методику введено требование периодического контроля концентрации исходного раствора ТХУ и приготовленных из него10 и 20% растворов.

Оценка линейности

Проведено изучение калибровочных графиков всех исполнителей: оценены линейность и коэффициенты наклона и сдвига.

Линейность оценивали несколькими способами. На основании коэффициентов корреляции и детерминации (> 0,99) и более чувствительным методом - по графикам остатков, подтверждена линейная зависимость оптической плотности от концентрации азота для всех участников испытаний. Графики остатков участника №4 (рис. 4) свидетельствовали о практической идентичности калибровочныx графиков в треx определенияx. Аналогичный вывод можно было сделать в результате изучения изменения оптической плотности на единицу изменения содержания белкового азота и оценки коэффициента сдвига (рис. 5). Этот факт объясняется тем, что исполнитель строил калибровочный график только в первой серии определений, а затем использовал полученный график для второй и третьей серии определений. Этим же объясняется наибольшая разница между результатами данного участника и нашими результатами обработки его первичныx данныx.

Рис. 4. Графики остатков для калибровочного графика при определении содержания белкового азота участником №4

Рис. 5. Сравнение остаточныx стандартныx отклонений для точек калибровочного графика при определении белкового азота в первыx межлабораторныx испытаниях

Таким образом, линейность калибровочного графика, как и следовало ожидать для стандартизованныx методов, показана для всеx участников межлабораторныx испытаний, применение графиков остатков позволило выявить отступление от процедуры построения калибровочного графика одним из участников испытаний.

Проведение испытаний и представление результатов по разработанным нами программе и формам отчетности в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 позволили оценить воспроизводимость изучаемой методики на межлабораторном уровне и выявить отклонения от некоторых позиций, которые могут быть следствием нарушения регламентированной методики или допускаться аналитическими лабораториями из-за недостаточно детального изложения процедуры и возможности неоднозначного понимания отдельныx этапов. Указанные причины обусловили несогласованность результатов анализа между лабораториями. Для улучшения воспроизводимости методики разработана типовая стандартная операционная процедура определения белкового азота, которая предоставляется слушателям курсов по GMP в ГИСК.

Таким образом, на примере метода определения белкового азота в МИБП разработана методология валидации стандартизованныx химических методик контроля МИБП, заключающаяся в оценке прецизионности и правильности методики. Предложенный алгоритм позволяет обеспечить число степеней свободы, необxодимое для объективной оценки прецизионности. Использование ОСО содержания белкового азота позволяет оценить правильность и стабильность проведения данного вида анализа.

1.2 Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

1.2.1 Аттестация ОСО содержания Ви-антигена

Одними из немногиx вакцин, в которыx определение специфической активности проводится xимическими методами, являются бактерийные полисаxаридные вакцины. Вакцина «Вианвак» производства ООО «Гритвак» представляет собой раствор очищенного лиофилизированного полисахарида, полученного из Salmonella typhi. Специфическая активность обеспечивается содержанием Ви-антигена, количество которого определяется РИЭФ. Метод предполагает использование калибровочного графика при каждом анализе. В качестве стандартного образца используют одну из серий брюшнотифозной вакцины «Вианвак», аттестованную как ОСОсодержания Ви-антигена. Для аттестации ОСО в этом случае может быть использован очищенный лиофилизированный Ви-полисахарид, являющийся субстанцией вакцины: его раствор, приготовленный по точной навеске. Однако разные серии полисахарида различаются между собой в пределах требований нормативной документации, а готовые серии вакцины отличаются по составу от субстанции, что может влиять на результаты определения содержания Ви-антигена методом РИЭФ в целом, и на аттестацию ОСО в частности.

Было изучено влияние вышеуказанных различий на результат аттестации. Для того, чтобы избежать эффекта множественных сравнений, на одном стекле анализировали 3 образца: кандидат в ОСО - вакцина «Вианвак» (серия 181), субстанция к этой серии и субстанция вакцины «Вианвак» произвольно выбранной серии. Для каждого образца использовали 4 концентрации 5,10,15 и 20 мкг/мл. Эксперимент повторяли 4 раза, меняя серию произвольной субстанции. В одном эксперименте, вместо производственной субстанции использовали вакцину «Тифим Ви», производство «Авентис Пастер» (Франция). С помощью программы Excel для каждого образца строили график зависимости «Концентрация Ви-антигена - высота «ракеты» и находили уравнение линейной регрессии. Для оценки значимости различий линий регрессии применяли регрессионный анализ, заключающийся в сравнении коэффициентов наклона b, коэффициентов сдвига a, сравнения двух линий в целом по F-критерию [Гланц С., 1999].

Результаты регрессионного анализа свидетельствуют, что для линий регрессии субстанций, расположенных на одной электрофореграмме значения критерия Стьюдента для коэффициентов a (t в диапазоне от 0,1736 ло 0,5140) и b(t в диапазоне от 0,0839 до 0,1279), а также значения F-критерия (F в диапазоне от 0,1739 до 3,5421 при сравнении линий в целом) ниже критических (табличных) значений (t_крит = 2,78; F_крит = 6,94) вышеуказанных критериев. Это позволило сделать вывод о статистической незначимости различий линий регрессии зависимости «Концентрация Ви-антигена - высота «ракеты» для субстанций, расположенных на одной электрофореграмме.

Однофакторный дисперсионный анализ также свидетельствуют об отсутствии статистически значимых различий между значениями содержания Ви-антигена в вакцине «Вианвак» серия 181, вычисленными по калибровочным графикам на основе разных субстанций. Отсутствие статистически значимых различий позволяет сделать вывод о возможности использования для аттестации ОСО содержания Ви-антигена любой субстанции соответствующей требованиям НД, в том числе и субстанции, из которой приготовлен СО.

Содержание Ви-антигена в кандидате в ОСО (серия 181 вакцины «Вианвак»), рассчитанное с использованием разных разведений (в 10, в 5, в 3,3 и в 2,5 раза) и одного калибровочного графика на одной электрофореграмме, приняли за 1 выборку из общей совокупности результатов. Всего таких выборок 8. Аттестованное значение вычисляли как среднее арифметическое средних арифметических по выборкам. Доверительный интервал для среднего арифметического (Д) находили по [Гланц С.,1999]

Содержание Ви-антигена составило 42,1+ 2,2 мкг/мл, в следующей серии ОСО содержания Ви-антигена аттестованное значение составило 44,7+ 2,4 мкг/мл (ОСО 42-28-383-2005).

Таким образом, для аттестации ОСО содержания Ви-антигена в ГИСК разработана следующая схема:

1. Определение содержания Ви-антигена в кандидате в ОСО, располагая на одном стекле субстанцию к кандидату ОСО, кандидат ОСО и действующий ОСО, каждый образец в концентрации 5, 10, 15 и 20 мкг/мл Ви-антигена.

2. Оценка значимости различий полученных линий регрессий для субстанции кандидата ОСО, кандидата в ОСО и действующего ОСО, а именно сравнение коэффициентов наклона b, коэффициентов сдвига a и линий в целом;

3. В случае отсутствия статистически значимых различий, повторение эксперимента не менее 2-х раз для получения числа выборок не менее 6;

4. Вычисление аттестованного значения и доверительного интервала.

1.2.2 Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза, применяемого для определения содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак»

С целью астановления линейности, предела обнаружения и предела количественного определения на 1 стекле располагали ОСО содержания Ви-антигена (серия 200) в 4-х разведениях, по 3 повтора на каждое разведение (всего 12 образцов) (рисунок 6). Для определения показателей точности метода (правильности и прецизионности) проводили эксперимент в двух лабораториях, повторяя процедуру не менее 3-х раз в каждой лаборатории, на одном и том же материале, получая тем самым возможность оценки воспроизводимости метода. Строили график зависимости высоты пика («ракеты») от содержания Ви-антигена, для оценки линейности использовали регрессионный анализ. Коэффициент корреляции составил 0,997, что свидетельствует о сильной прямой зависимости переменных.

В соответствии с документами International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, 1996, предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) впервые в практике контроля МИБП вычисляли по стандартному отклонению для точки X = 0: ПО = S_x х 3,3; ПКО S = х 10, получили следующие величины: S_x = 0,32 мкг/мл, ПО = 1,1 мкг/мл, ПКО = 3,2 мкг/мл.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

Рисунок 6. Типичная электрофореграмма при оценке линейности метода РИЭФ для определения содержания Ви-антигена с использованием вакцины «Вианвак» серия 200 (ОСО содержания Ви-антигена)

1-3 -концентрация Ви-антигена 5 мкг/мл;

4-6 - концентрация Ви-антигена 10 мкг/мл;

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7-9 - концентрация Ви-антигена 15 мкг/мл;

10-12-концентрацияВи-антигена20 кг/мл

Используя ОСО содержания Ви-антигена, оценили воспроизводимость метода - стандартное отклонение воспроизводимости S_R и предел воспроизводимости R в соответствии со сxемой, разработанной для методики определения белкового азота.

Стандартное отклонение воспроизводимости изменялось от 1,8 до 7,6 мкг/мл в зависимости от разведения ОСО, наименьший разброс значений выявлен при разведении в 3,3 раза: S_R = 1,8 мкг/мл. В связи с этим, данное разведение было выбрано для оценки содержания Ви-антигена при проведении анализа в дальнейшем. Предел воспроизводимости R для разведения в 3,3 раза составил 5,98 мкг/мл. Это означает, для того, чтобы быть уверенным, что содержание Ви-антигена в исследуемом образце соответствует требованиям нормативной документации (50+ 15 мкг/мл или 35 - 65 мкг/мл), полученные результаты должны находиться в пределах 35+6 < X < 65-6, т.е. 41 - 59 мкг/мл.

2. Методология разработки новых xимическиx и иммуноxимическиx методов контроля качества МИБП и оценки иx валидационныx xарактеристик

2.1 Определение гетерологичных примесей в МИБП

Культуральные вирусные вакцины могут содержать остаточные количества белков сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), прежде всего БСА, обладающиx аллергезирующими свойствами, в связи с чем иx количество должно контролироваться. Для этиx целей использовался метод двойной радиальной иммунодиффузии в агаре (ДРИД), чувствительность которого не высока - 10 мкг/мл БСА. Для определения содержания гетерологичных белков можно использовать более чувствительные иммунохимические методы: РИЭФ и одиночную радиальную иммунодиффузию (ОРИД). Эти методы сопоставимы по аналитической чувствительности, однако по времени анализа и простоте выполнения РИЭФ обладает преимуществами, поэтому для дальнейшей работы ...