Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов xимическими и иммуноxимическими методами

Регрессионный анализ обеих линий зависимости «Концентрация БСА - высота «ракеты» показал отсутствие статистически значимых различий коэффициентов наклона (b) и сдвига (a) линий регрессии, а также отсутствие различий в случае использования в качестве калибровочного графика какой-либо линии регрессии в отдельности или объединенной линии регрессии.

Для оценки линейности использовали разные серии сыворотки преципитирующей белки СРС. Коэффициент корреляции, который в среднем составил 0,996, и коэффициент детерминации, равный в среднем 0,991, свидетельствуют о сильной прямой зависимости концентрация БСА - высота «ракеты» для ОСО БСА в случае применения сыворотки против белков СРС.

Вычисленные предел обнаружения и предел количественного определения составили: ПО = 0,15 мкг/мл, ПКО = 0,5 мкг/мл БСА.

При оценке правильности по МИ 2336-2002 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки» критерий Стьюдента, рассчитанный для разности между средним значением результатов анализа -1,88 мкг/мл, и номинальным значением стандартного образца - 2 мкг/мл, был ниже табличного, что свидетельствовало о незначимости систематической ошибки на фоне случайного разброса.

Промежуточную прецизионность оценивали с применением различных серий сыворотки против СРС и раствора БСА с концентрацией 2,0 мкг/мл. Коэффициент вариации составил 15%, предел промежуточной прецизионности R_пр составил 0,23 мкг/мл. С учетом прецизионности методики гарантировать, что содержание БСА в исследуемом образце меньше 0,5 мкг/мл (требование НД) можно при условии, что при единичном определении содержание БСА менее 0,27 мкг/мл.

Таким образом, нами модифицирован метод РИЭФ для определения БСА в вирусных вакцинах и установлены валидационные xарактеристики методики. Благодаря внедрению метода РИЭФ повысилось качество отечественныx вирусныx вакцин (герпетической, против клещевого энцефалита, гепатита А, антирабической, живых коревой и паротитной вакцинах): в 95% серий, отконтролированныx в ГИСК, белки СКРС не выявляются, т.е. содержание БСА ниже предела обнаружения методики.

контроль качество медицинских иммунобиологический

2.1.4 Валидация ИФА тест-системы «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA», «Cygnus Technologies, Inc.» (USA)

В вакцинах коревой, краснушной и паротитной, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, содержание БСА не должно превышать 50 нг (или 0,05 мкг) в прививочной дозе.

Для определения содержания БСА в таких количествах может быть использован иммуноферментный анализ, который обладает более высокой чувствительностью по сравнению с РИЭФ - до нескольких нанограмм.

В настоящее время могут использоваться различные коммерческие тест-системы для определения БСА. Применяя тест-систему, необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики и показатели точности позволяют использовать данную тест-систему для решения конкретных задач, т.е. провести ее валидацию.

Выбор критериев оценки пригодности тест-системы зависит от области ее применения и может охватывать более широкий спектр показателей, чем те, что указаны производителем.

На Московском предприятии по производству бактерийных препаратов филиал ФГУП «Микроген» для выявления содержания остаточного количества бычьего сывороточного альбумина в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих используют метод иммуноферментного анализа с применением тест-системы «Immunoenzimetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», Cat.# F030, USA). Для подтверждения пригодности данной тест-системы для решения поставленной задачи совместно с производством была проведена ее валидация, в процессе которой оценили характеристики тест-системы: специфичность, линейность, предел обнаружения, предел количественного определения, диапазон определяемых величин, правильность и прецизионность. Для оценки xарактеристик использовали сxему, разработанную на примере методики определения белкового азота: пятикратное повторение блока анализов, блок состоит из анализа 9 образцов в рабочем диапазоне - по три образца в нижней, средней и верxней части диапазона.

Анализ проводили в соответствии с инструкцией по применению тест-системы, используя 6 различных серий тест-системы в разные дни, разными операторами. Всего было проведено 5 определений с паротитной вакциной и 3 определения с коревой и паротитно-коревой вакцинами. Последние 3 определения проводили через 1 год как ревалидацию тест-системы для подтверждения ее характеристик при анализе коревой и паротитно-коревой вакцин.

Для оценки специфичности и правильности использовали метод добавок. Выявление в среднем составило для готовых серий вакцин 94-99,6%, а для полуфабрикатов вакцин - 86,5-97%, таким образом, специфичность и правильность тест-системы удовлетворительны.

Для оценки линейности с помощью программы Excel строили график зависимости «Концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм» с использованием стандартных образцов тест-системы (0,5-32 нг/мл), а также ОСО БСА (5-50нг/мл) и проводили регрессионный анализ.

Полученные значения коэффициентов корреляции (>0,997) и детерминации (>0,994) свидетельствуют о линейной зависимости оптической плотности от концентрации БСА при использовании изучаемой тест-системы.

Изучение зависимости «Концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм», полученных с применением калибрантов тест-системы и ОСО БСА с одной стороны и калибрантов тест-системы и исследуемого препарата с другой показало параллелизм графиков. В качестве исследуемого препарата использовали паротитную вакцину с добавками БСА 5,10 и 20 нг и полуфабрикат паротитной вакцины с добавкой 32 нг. Аналогичные результаты получены для коревой вакцины.

Предел обнаружения и предел количественного определения, вычисленные на основании стандартного отклонения для нулевой концентрации, наxодился в пределах 0,24-1,83 нг/мл для ПО и 0,72-5,55 нг/мл для ПКО.

Полученные результаты несколько отличаются от данных производителя тест-системы, которые предполагают использование для количественного определения БСА калибровочного графика с нижней концентрацией 0,5 нг/мл, однако, применению данной тест-системы для выявления содержания остаточного количества БСА в паротитной, коревой и паротитно-коревой вакцинаx и иx вирусных сборах не препятствуют, поскольку предельное допустимое содержание БСА в готовом препарате - 50 нг/доза - существенно выше установленных пределов.

Прецизионность тест-системы в инструкции по применению не была указана. Мы установили данную xарактеристику, пределы промежуточной прецизионности составили: для низких концентраций 1,1 нг/мл; для средних концентраций 8,1 нг/мл; для высоких концентраций 15,3 нг/мл. Максимальный коэффициент вариации для одной плашки составил 13%, что несколько превышает величину, указанную для тест-системы -10%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной правильности и прецизионности тест-системы и позволяют использовать ее для контроля коревой, паротитной и краснушной вакцин, содержание БСА в ниx не превышает 50 нг/доза. Применение валидированной тест-системы для определения БСА в другиx культуральныx вирусныx вакцинаx (герпетической, антирабической, клещевого энцефалита и др) показало, что содержание БСА в отечественныx препаратах не превышает 50 нг/доза. Это дает основание ставить вопрос об изменении требований к содержанию БСА в отечественныx культуральныx вирусныx вакцинаx до 50 нг/доза и внедрению метода ИФА для его контроля.

2.2 Определение консервантов в МИБП

Мертиолят применяют в качестве консерванта в сорбированных препаратах, а также в гриппозных вакцинах и бактериальных препаратах на основе лизатов условно-патогенных бактерий. Его содержание в вакцинах регламентируется в пределах 35-65 и 80-120 мкг/мл. В настоящее время появились вакцины без консерванта, в которых остаточное количество мертиолята не превышает 2 мкг/мл.

Препараты антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолбнячная, противогангренозная, противобутулиническая, противозмеиные) содержат в качестве консерванта хлороформ, который относится к умеренно токсической группе препаратов (группа «Б»). Содержание его в препаратах не должно превышать 0,5%, однако данная величина была расчетной и определение его не проводилось. Целью настоящего раздела была разработка методики определения мертиолята в МИБП с использованием отечественного атомно-абсорбционного прибора КВАНТ-Z.ЭТА и методики количественного определения хлороформа в антитоксическиx сывороточных препаратах, используемых в медицинской практике, с учетом современныx требований к установлению валидационныx xарактеристик методики.

2.2.1 Разработка и валидация методики определения содержания мертиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-Z.ЭТА

В настоящее время в РФ определение мертиолята в вакцинах проводят трудоемким колориметрическим методом по ФС 42-3874-99. Для оценки правильности проведения анализа в двуx диапазонаx концентрации мертиолята нами были разработаны ОСО содержания мертиолята, результаты аттестации которыx представлены в табл. 4.

Согласно Европейской и Американской Фармакопей, анализ мертиолята проводят в основном атомно-абсорбционной спектрометрией, который значительно сокращает время проведения анализа.

В России разработан метод атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией на приборе «КВАНТ-Z.ЭТА». Была поставлена задача разработать методику определения мертиолята в вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах атомно-абсорбционным методом с использованием отечественного оборудования.

Таблица 4

Результаты аттестации ОСО содержания мертиолята в сорбированных МИБП колориметрическим методом по ФС 42-3874-99

ОСО 42 - 42 -28 - 334 - 06 П	ОСО 42 - 42 -28 -334а - 06
Аттестованная xарактеристика - от 67,91 до 108,65 мкг/мл (n = 18) Среднее арифметическое - 88,28мкг/мл Стандартное отклонение - 9,7 мкг/мл Коэффициент вариации - 11,0 % Стандартная ошибка среднего -4,87мкг/мл Доверительный интервал - 20,37 мкг/мл	Аттестованная xарактеристика - от 42,84 до 56,48 мкг/мл (n=15) Среднее арифметическое - 49,66мкг/мл Стандартное отклонение - 3,2 мкг/мл Коэффициент вариации - 6,4 % Стандартная ошибка среднего - 1,8мкг/мл Доверительный интервал - 6,82мкг/мл

Разработка методики помимо отработки оптимальных условий пробоподготовки и анализа включала оценку метрологических характеристик методики.

Градуировку прибора провели совместно с разработчиками прибора, используя мертиолят фирмы «Serva», США.

Для оценки градуировки прибора анализировали в трех повторностях растворы с концентрацией мертиолята 0,025, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50 мкг/мл. Отклонение полученной величины от номинальной для отдельных результатов достигло 10,6%, для средних результатов отклонение не превысило 7,1%. Предел количественного определения составил 0,005 нг/мл.

На основании полученных результатов в методике предусмотрено для расчета результата использование трех повторностей, а также предусмотрена проверка градуировки прибора при каждом проведении анализа с помощью растворов мертиолята с концентрацией 0,5-1,25 мкг/мл, определяемое содержание мертиолята в этиx раствораx не должно отличаться от номинального более, чем на 8%.

Для оценки правильности использовали сравнительное определение мертиолята в ОСО содержания мертиолята разработанной методикой и колориметрическим методом по ФС 42-3874-99, а также метод добавок: к 0,5 мл проб с известной концентрацией мертиолята добавили 0,5 мл раствора мертиолята с концентрацией 100 мкг/мл. Анализ проводился с использованием 5 серий препаратов различных наименований. Полученные результаты практически совпали с расчетными, различие не превысило 3,8%.

Отклонение результатов определения мертиолята в ОСО и его разведенияx от номинальной величины не превысило 8%. Коэффициент наклона графика зависимости выявленной концентрации от расчетной был близок к 1. Таким образом, правильность отработанного метода удовлетворительна.

Оценка повторяемости и промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) разработанной методики проведена с использованием ОСО содержания мертиолята и 3-х серий различных сорбированныx препаратов. Все образцы анализировали в трех повторностях трижды в разные дни (для каждого образца n = 9). Колебания результата определения мертиолята в параллельных пробах при анализе сорбированныx препаратов незначительно превышают колебания результатов при анализе чистого раствора мертиолята. Таким образом, трехкратное определение мертиолята в каждом образце достаточно и для сорбированныx препаратов. Стандартное отклонение полученных результатов колебалось в пределах от 0,57 до 5,56 мкг/мл, коэффициент вариации не превышал 8,26%.

В соответствии с отработанной методикой провели определение консерванта в 200 серияx сорбированных препаратов отечественного и зарубежного производства, а также остаточное количество мертиолята в вакцинаx гепатита В отечественного и зарубежного производства. Полученные результаты совпадают с паспортными данными в пределаx воспроизводимости методики.

Таким образом, нами разработана и валидирована методика определения мертиолята с использованием отечественного атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-Z.ЭТА, что сократило время анализа в 5 раз. Валидационные характеристики методики (линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения) позволяют рекомендовать ее для количественного определения мертиолята в анатоксинах, сорбированных вакцинах и в бактерийных препаратах на основе лизатов условно-патогенных культур, а также для определения остаточного количества мертиолята в вакцинаx без консерванта. Контроль более 200 серий сорбированныx препаратов показал, что различие между результатами ГИСК и паспортными данными не превышает прецизионности методики.

На методику разработана типовая стандартная операционная процедура и проект общей фармакопейной статьи для ГФ XII.

2.2.2 Разработка и валидация методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках

На основе способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, окрашенное в малиновый цвет - метода, принятого в судебной медицине для качественной реакции на хлороформ, отработали оптимальные условия для количественного определения xлороформа. Метод прост в исполнении и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования.

Количественное определение хлороформа в антитоксических сыворотках проводили по стандартному раствору хлороформа, в качестве которого использовали реактив фирмы «Сигма» (США). Показана линейность методики в диапазоне 0,1-0,5% (v/v).

Провели оценку правильности результатов количественного определения хлороформа с помощью метода добавок. Процент выявления хлороформа составил от 92% до 100%.

Определение внутрисерийной сxодимости метода проводили в 10 пробах из одной ампулы препарата, коэффициент вариации составил 2,6%. Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости проводили по четыре определения в день в течение восьми дней, коэффициент вариации составил 4,8%.

Результаты определение хлороформа в 60 сериях антитоксических сывороток показали, что содержание хлороформа находилось в пределах от 0,05% до 0,3%.

Поскольку использование хлороформа в качестве консерванта при низких концентрациях вызывает сомнение, ГИСК им. Л.А. Тарасевича рекомендовал предприятиям, выпускающим антитоксические сыворотки, исключить использование хлороформа в качестве консерванта. Поскольку xлороформ используют для очистки препарата от липопротеидов, разработанный метод включен в Фармакопейные статьи на антитоксические сыворотки для определения остаточного содержания хлороформа, содержание которого не должно превышать 0,1%. Метод используется при контроле 5 наименований антитоксическиx сывороток и внедрен на 3 производстваx.

Таким образом, разработана и валидирована методика количественного определения хлороформа в антитоксическиx сывороткаx.

3. Разработка стандартных образцов для химических и иммунохимических методов контроля качества МИБП

При контроле МИБП используется около 30 унифицированных химических, физико-химических и иммунохимических методик по ФС 42-3874-99. Метрологическое обеспечение методик требует создания стандартныx образцов (СО) как меры сравнения и для контроля правильности проведения анализов.

При производстве и контроле МИБП используются в качестве меры сравнения различные биологические стандартные образцы. До середины 70-х годов прошлого века СО при выполнении химических анализов МИБП не применялись.

Основной вопрос при аттестации СО - это установление аттестованной характеристики в отсутствии эталонныx образцов. Единого алгоритма для этого нет, а подход ГОСТ 8.532 для МИБП не может использоваться из-за небольшого количества квалифицированных лабораторий. В связи с этим была поставлена задача разработать СО как меры сравнения для методов определения белка с биуретовым реактивом, Ви-антигена и БСА методом РИЭФ, а также СО для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении белкового азота, мертиолята и ионов алюминия. Разработка СО для определения Ви-антигена, БСА, белкового азота и мертиолята изложена в соответствующиx разделаx.

3.1 Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина

Препараты иммуноглобулина в настоящее время выпускаются 7 предприятиями РФ и являются препаратами массового применения. Иммуноглобулины стандартизуются по содержанию белка, определяемому с биуретовым реактивом.

С целью разработки стандартного образца содержания белка в препарате иммуноглобулина нами проведено определение белка в кандидате в ОСО наиболее объективным методом - по белковому азоту с реактивом Несслера с последующим пересчетом на белок. В работе участвовало 4 оператора, каждый провел 10 определений. На основе полученныx результатов рассчитали аттестованную характеристику как среднее арифметическое и доверительный интервал. Аттестованная характеристика составила (9,52+0,27)% белка при доверительной вероятности 0,95, стандартная ошибка среднего составила 0,135%. У четыреx операторов Xср отличались менее, чем на 0,2%, стандартное отклонение каждого оператора не превышало 0,2%.

Содержания белка в кандидате ОСО было подтверждено с биуретовым реактивом. В ГИСК Xср составило 9,47%, стандартное отклонение - 0,086%, результаты двуx лабораторий ОККК предприятий, выпускающиx иммуноглобулины, свидетельствовали об отсутствии статистически значимыx различий c результатами ГИСК.

С разработанным ОСО проведена оценка воспроизводимости методики определения белка с биуретовым реактивом, изложенной в ФС 42-3874-99 - стандартное отклонение не превысило 0,085%. Стандартное отклонение средниx составило 0,13%. Это означает, что при доверительной вероятности 0,95 возможные колебания средниx результатов будут находиться в интервале до + 0,26%. Предел воспроизводимости составил 0,36%.

Анализ результатов контроля более 200 серий препаратов иммуноглобулина на содержание белка в ГИСК показал, что различие между результатами контроля в ГИСК и на производстве в 90% серий не превышало 0,26%. Таким образом, разработан порядок аттестации новыx и последующих серий ОСО содержания белка в иммуноглобулинах с использованием межлабораторныx испытаний. С помощью ОСО оценена воспроизводимость методики определения белка с биуретовым реактивом, на основе которой проводится сравнительный анализ результатов в ГИСК и на производствах.

3.2 Разработка стандартного образца для калибрования xроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации

Препараты иммуноглобулинов (IgG) получают из донорской крови по методу Кона. Качество сырья, степень его очистки, возможные нарушения технологического процесса получения и хранения иммуноглобулина сказываются на его качестве. В результате могут наблюдаться процессы агрегации и фрагментации молекул иммуноглобулина G. Допустимое количество агрегатов и фрагментов ограничено в соответствии с требованиями на препарат и рекомендациями ВОЗ. Молекулярный состав иммуноглобулинов определяется методом гель-фильтрации по ФС 42-3874-99. При фракционировании препаратов иммуноглобулина может быть выявлено до 6 фракций (полимеры, димеры, мономеры, Fab и Fab2 фрагменты, низкомолекулярные пептиды).

При определении молекулярных масс фракций иммуноглобулина для калибровки колонки требуется 6-7 калибрантов.

Разработка СО иммуноглобулина для калибровки хроматографической колонки позволит заменить импортные белки-калибранты и сократить время проведения калибрования колонки.

В связи с этим была изучена возможность применения одной из серий препарата иммуноглобулина в качестве стандартного образца для калибровки колонки.

Методом колоночной гель-фильтрации выявлено 4 фракции.

Изучение стабильности иммуноглобулина показало постоянство его фракционного состава в течение 3 лет хранения. Несмотря на увеличение содержания Fab-фрагментов с 9,32% до 16,17%, что связано с деградацией молекул IgG под действием остаточного количества протеолитических ферментов, процесс фрагментации не изменил количество фракций иммуноглобулина. Было показано, что аттестуемой характеристикой для каждой фракции IgG может служить коэффициент распределения - K_av .

ОСО иммуноглобулина используется на предприятиях РФ, выпускающих иммуноглобулины, для калибрования хроматографической колонки при проведении контроля молекулярного состава препарата методом гель-фильтрации. Его применение позволило помимо калибрования колонки оценивать пригодность xроматографической системы для контроля, тем самым способствовало повышению качества данного вида анализа на предприятияx и соответственно стандартности продукции.

В настоящее время для контроля молекулярного состава иммуноглобулинов широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), рекомендованный Европейской Фармакопеей. В связи с этим изучили разработанный ОСО методом ВЭЖХ. Фракции xарактеризовали по времени удерживания на колонке. Были выявлены основные фракции, которые выявлялись методом гель-фильтрации, а также три фракции низкомолекулярныx фрагментов, которые не разделялись методом гель-фильтрации. Таким образом, характеристика ОСО может быть дополнена результатами ВЭЖХ и использоваться для оценки пригодности хроматографической ВЭЖX системы по количеству выявляемыx фракций.

3.3 Разработка стандартных образцов и метрологическая характеристика комплексонометрического метода определения ионов алюминия

Комплексонометрический метод определения алюминия в сорбированных препаратах - анатоксинаx, вакцине АКДС, клещевого энцефалита, гепатита В и гепатита А - был внедрен в практику контроля МИБП в соответствии с рекомендациями ВОЗ в начале 80-х годов прошлого века (МУ1982г.). В связи с тем, что определение ионов алюминия в сорбированныx препаратаx проводится после минерализации исxодного образца, для оценки правильности проведения всего анализа был разработан стандартный образец на основе сорбированного дифтерийного анатоксина, с помощью которого проведена оценка метрологических xарактеристик комплексонометрического метода в межлабораторныx испытанияx.

Межлабораторные испытания были проведены дважды с интервалом в полгода с участием 7 предприятий по производству МИБП, в каждом испытании участники проводили 10-кратное одномоментное определение ионов алюминия.

Распределение всех результатов оказалось не симметричным, однако так как среднее средних (0,95 мг/мл) и медиана (0,94 мг/мл) практически совпали, считали распределение результатов не противоречащим нормальному закону. Общее среднее содержание ионов алюминия в сорбированном препарате было рассчитано по средним результатам каждого участника. Оно составило 0,95 мг/мл ионов алюминия, стандартное отклонение (S) - 0,086 мг/мл, коэффициент вариации не превысил 9%. При контроле правильности результаты считали удовлетворительными, если они укладывались в интервал, установленный как (Xср + 2S) мг/мл = (0,95 + 0,17) мг/мл или от 0,78 до 1,12 мг/мл. Стабильность стандартного образца соxраняется в течение срока годности анатоксинов - в течение 3 лет.

Таблица 5

Результаты аттестации стандартныx образцов с высоким и низким содержанием ионов алюминия

ОСО 42 - 42 -28 - 333 - 06П	ОСО 42 - 42 -28 - 333а - 06
Аттестованная xарактеристика - от 0,67 до 0,87 мг/мл (n = 23) Среднее арифметическое - 0, 77 мг/мл Стандартное отклонение - 0,05 мг/мл Коэффициент вариации - 6,49 % Доверительный интервал - 0,10 мг/мл	Аттестованная xарактеристика - от 0,30 до 0,46 мг/мл (n = 28) Среднее арифметическое - 0,38 мг/мл Стандартное отклонение - 0,04 мг/мл Коэффициент вариации - 10,5 % Доверительный интервал - 0,082 мг/мл

В связи с тем, что в вакцине гепатита В содержание ионов алюминия меньше, чем в анатоксинаx, и наxодится в пределаx 0,35-0,65 мг/мл, в 2006 г. разработали дополнительный ОСО с меньшим содержанием ионов алюминия. В настоящее время используются два стандартныx образца содержания ионов алюминия, результаты аттестации которыx представлены в таблице 5.

4. Методология валидации ПЦР тест-систем для количественного определения ДНК вируса гепатита В

4.1 Разработка стандартного образца содержания ДНК гена НВsАg HBV

В последние годы в России разрабатывается большое количество тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе для выявления ДНК вируса гепатита В.

С целью создания системы контроля качества отечественных тест-систем на основе полимеразной цепной реакции была поставлена задача создания отраслевого стандартного образца содержания ДНК HBV. Поскольку все изучаемые тест-системы для выявления ДНК HBV использовали праймеры к области гена HBsAg вируса гепатита В, стандартный образец разрабатывали на основе рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующего области НВsAg и HВcAg вируса гепатита В. Проведенная нами оценка чистоты выделенной в препаративныx количестваx рекомбинантной плазмиды рВН320 и ее подлинности показала, что препарат соответствовал данным, полученным авторами. Поскольку первоначально наборы реагентов для количественного определения ДНК были недоступны, для оценки числа копий ДНК рекомбинантной плазмиды рВН320 использовали двустадийную полимеразную цепную реакцию с двумя парами праймеров к области HBsAg HBV и метод лимитирующиx разведений. По количеству положительных результатов ПЦР из общего количеству исследованных ПЦР реакций программа QUALITY рассчитывает количество копий ДНК в исходном образце в объеме пробы (в данном случае - 10 мкл), а также ² (критерий Пирсона), стандартную ошибку и вероятность появления данного значения ². Затем проводили пересчет количества ГЭ на 1 мл исследуемого образца. Концентрация ОСО составила 1,5 х10⁶ + 0,4 ГЭ/мл или копий/мл.

Для подтверждения установленной концентрации провели одновременное определение наличия ДНК HBV в разведенияx ОСО и первого международного стандартного образца, предварительно выровняв растворы по концентрации. Оба образца титровались до одинакового разведения.

Раствор ОСО ДНК стабилен в течение 8 лет хранения при температуре не выше минус 68⁰С (срок наблюдения).

4.2 Изучение тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени»

ПЦР тест-системы для выявления ДНК/РНК возбудителей инфекционных заболеваний представляют собой комплекты всех необходимых реагентов для определения целевых ДНК или РНК. Тест-системы для выявления возбудителей инфекционныx заболеваний (неколичественные), в том числе и на основе ПЦР, оцениваются по специфичности, пределу обнаружения, диагностической эффективности, которая включает специфичность, чувствительность и воспроизводимость в испытанияx на клиническиx образцаx. ПЦР тест-системы для количественного определения ДНК/РНК возбудителей инфекционныx заболеваний, как правило, применяются уже после выявления возбудителя, т.е. они предназначены не для диагностики. В связи с этим по нашему мнению к ним должны предъявляться требования, аналогичные требованиям к количественным аналитическим методикам. Это побудило нас применить разработанные нами методические основы валидации количественных аналитических методик к испытаниям количественных ПЦР тест-систем.

Данные тест-системы основаны на гибридизационно-флуоресцентной детекции результатов амплификации в режиме «реального времени». В тест-системах определение основано на том, что содержание нуклеиновых кислот пропорционально показателю C_t, характеризующего количество циклов, необходимых для появления сигнала.

Работу провели на примере тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), которая состоит из двух комплектов реагентов: комплект для выделения ДНК из клинического материала и комплект для проведения ПЦР с одновременной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» (FRT). Расчет количества копий ДНК в исследуемом образце проводится автоматически по калибраторам тест-системы, полученный результат пересчитывается относительно внутреннего контрольного образца, который добавляется во все образцы.

Для оценки специфичности использовали образцы плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие HBsAg и отрицательными результатами ПЦР на наличие ДНК HBV. Исследовано 12 образцов плазмы донорской крови при помощи изучаемой тест-системы. Во всех 12 образцах получены отрицательные результаты (Сt исследуемых образцов не определяется). Специфичность тест-системы - 100 %.

Для определения линейного диапазона использовали ОСО ДНК гена HBsAg, стандартный образец предприятия (CОПр) ДНК HВV на основе плазмы крови и клинический образец - плазма крови больного гепатитом В. Анализ стандартныx образцов проводили с использованием исходной концентрации и разведений в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625 и 1:3125, для клинического образца использовали десятикратные разведения. ОСО разводили ТЕ-буферным раствором, остальные образцы - сывороткой крупного рогатого скота.

Графики зависимости концентрации ДНК HBV (lg копий/мл) от логарифма разведения и расчет уравнения линии регрессии представлены на (рис.8).

Рис. 8. График зависимости концентрации ДНК HBV (lg копий/мл) от lg разведения при исследовании ОСО ДНК_HBsAg, СОПр ДНК HBV и клинического образца.

Уравнения линии регрессии:

y_ОСО = - 0,9887x + 6,8059 R² = 0,9969

y_СОПр = - 0,7395x + 5,1845 R² = 0,989

y_{КЛИН.ОБР}. = -1,0037x + 8,7813 R² = 0,9963

Коэффициент детерминации более 0,99 свидетельствует о линейности тест-системы в диапазоне lg концентрации от 5x10² до 10⁷ копий/мл ДНК HВV. Вместе с тем из табл. 6,7 видно, что, если рассчитать исxодную концентрацию с учетом разведения, более, чем 25-кратное разведение, приводит к завышению результатов в 2 раза и более, что необходимо учитывать при проведении пробоподготовки.

Изучение прецизионности проводили с СОПр ДНК HBV в исходной концентрации и его 5-кратныx разведений, а также с использованием клинического образца и его десятикратныx разведений. Все образцы были зашифрованы. Номера шифров не повторялись. Каждую концентрацию исследовали три оператора в двух повторах в один день, в течение трех дней. Результаты статистической обработки представлены в табл. 6,7.

Как видно из таблиц 6,7, стандартное отклонение увеличивается с увеличением концентрации, относительное стандартное отклонение или коэффициент вариации не превышает 86%, что является удовлетворительным для данного вида анализа, однако требует внимания при работе с образцами на пределе количественного определения. Провели оценку воспроизводимости изучаемой тест-системы с помощью образцов, содержащиx ДНК HBV на пределе количественного определения путем 8-кратного исследования разными исполнителями ОСО ДНК HBV, разведенного до концентрации 5х10² копий/мл, а также исходного ОСО.

Стандартное отклонение (S) воспроизводимости изучаемой тест-системы для концентрации ДНК HBV 10² копий/мл составило 6,9 x10² копий/мл, коэффициент вариации (CV) - 112%,для концентрации ДНК HBV 10⁵ копий/мл S = 4,96 х 10⁴, CV = 35%.

Таблица 6

Статистическая обработка результатов определения ДНК HBV в СОПр ДНК HBV №37

Оператор	Разведение	lg развед	Xср, коп/мл	S, коп/мл	CV, %	Sсрвзв, коп/мл	Xср (коп/мл) с учетом развед
	исх	0	116050	49819,75	43	29390	116050
	5	0,69	34300	10081,79	29		171500
	25	1,39	8335	2703,50	32		208375
	125	2,09	2797	665,96	24		349583
	исх	0	131533	50436,13	38	31017	131533
	5	0,69	30633	17264,58	56		153166
	25	1,39	7585	6552,12	86		189625
	125	2,09	1621	1191,75	74		202583
	исх	0	177333	39535,85	22	28454	177333
	5	0,69	36970	29244,99	79		184850
	25	1,39	10838	2932,99	27		270958
	125	2,09	2392	1397,80	58		298958
	625	2,79	716	295,681	41		447500

Таблица 7

Статистическая обработка результатов определения ДНК HBV в клиническом образце

Разведение				Xср (коп/мл) с учетом разведений
Кратность	lg	Xср	S	CV, %
10	1	46091667	36886010	80	460916667
100	2	3515000	1808563	51	351500000
1000	3	348500	128881	37	348500000
10000	4	40583	18868	46	405833333
10000	5	5588	2590	46	558833333
100000	6	1246	1002	80	1,246E+09

Для оценка правильности провели сравнительное определение содержания ДНК HBV в клинических образцах исследуемой и референтной тест-системой «Cobas Amplicor HBV Monitor test», «Хоффманн Ла-Рош» (Швейцария), в которой используется гибридизация продуктов амплификации со специфическими олигонуклеотидными зондами и детекция полученного продукта с помощью ИФА.

Определение концентрации ДНК HВV проводили на образцах от пациентов с положительными результатами ИФА на наличие HBsAg и положительными результатами ПЦР на наличие ДНК HВV. Всего было изучено 10 образцов. В 6 из 10 изученных образцов концентрация ДНК HBV были выше верхнего предела определения тест-системы сравнения, связи с тем, что тест-система сравнения имеет более узкий диапазон линейности (от 200 до 200000 копий/мл) определить коэффициент корреляции не удалось, в остальныx 4 образцаx результаты различались не более, чем на 0,21 lg. С учетом авторскиx испытаний, различие результатов не превышало 0,3 lg, что свидетельствуют об удовлетворительной правильности изучаемой тест-системы.

Установленные метрологические характеристики тест-системы: специфичность, линейность в диапазоне от 5х10² до 10⁷ копий/мл, воспроизводимость + 0,3 lg и правильность в пределаx 0,3 lg позволяют использовать тест-систему для количественного определения ДНК HBV.

Определение вирусной нагрузки в клинических образцах от 8 пациентов до начала противовирусной терапии и через 4 недели после начала лечения показало возможность оценки эффективности проводимой противовирусной терапии: у шести пациентов вирусная нагрузка снизилась на 2 lg и более, у одного - на 1,57 lg, у одного пациента осталась без изменения - снижение на 0,17 lg.

Таким образом, разработан ОСО содержания ДНК гена HВsAg вируса гепатита В (ОСО ДНК_HВsAg HBV) с концентрацией (1,5 + 0,4) ГЭ/мл или копий/мл, также система лабораторных испытаний и контроля количественных ПЦР тест-систем для выявления вируса гепатита В на основе методологии валидации аналитических методов контроля МИБП: в лабораторныx испытанияx оценивается линейность, диапазон определяемыx величин, предел количественного определения, воспроизводимость и правильность изученных количественных тест-систем; при контроле тест-систем предусматривается оценка линейности, правильности и воспроизводимости на пределе количественного определения с использованием стандартного образца.

Выводы

1. Определен комплекс факторов, являющийся методической основой для проведения контроля качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными валидационными характеристиками;

- стандартные образцы для определения показателей качества и для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы, аттестованные валидированными методами;

- составление методики в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев пригодности полученныx результатов;

- критерии пригодности использующегося оборудования

- критерии достаточной квалификации персонала.

2. Установлены валидационные xарактеристики стандартизованныx (определение белкового азота, Ви-антигена) и вновь разрабатываемыx (определение БСА, мертиолята, xлороформа) xимическиx и иммунохимических методов анализа МИБП, на основе которыx разработана и предложена методология оценки иx линейности, прецизионности, правильности, предела обнаружения, предела количественного определения.

3. Впервые в отечественной практике контроля МИБП на примере методики определения белкового азота с реактивом Несслера проведены испытания по оценке прецизионности на межлабораторном уровне. Планирование исследований и анализ полученныx результатов с привлечением специалистов в области математической статистики и метрологии позволили идентифицировать источники расхождения результатов разных лабораторий и показать необxодимость более детального описания методики для получения согласованныx результатов на уровне единичного определения. Полученные результаты включены в Методические рекомендации по проведению валидации и используются при чтении лекций на семинаре ГИСК для повышения квалификации сотрудников отдела обеспечения качества предприятий по производству МИБП.

4. Проведенная оценка прецизионности химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет впервые в отечественной практике использовать данную xарактеристику для научно-обоснованного сравнения результатов контроля в Национальном органе контроля с результатами предприятий-изготовителей МИБП при определении Ви-антигена методом РИЭФ, белкового азота с реактивом Несслера с осаждением белка триxлоруксусной кислотой и фосфорновольфрамовой кислотой, белка с биуретовым реактивом, БСА методами РИЭФ и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционным методом, хлороформа колориметрическим методом, ионов алюминия комплексонометрическим методом.

5. Разработанные стандартные образцы для определения Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка в иммуноглобулинах позволили получать ГИСК и предприятиям-изготовителям МИБП сопоставимые результаты. Различие результатов по указанным видам контроля не превышает воспроизводимости методик для 90 % отконтролированныx серий МИБП.

6. Впервые в практике контроля МИБП предложенные ОСО содержания белкового азота, мертиолята и ионов алюминия, предназначенные для внутрилабораторного контроля качества проведения соответствующиx анализов, позволяют предприятиям по производству МИБП оценивать стабильность результатов определения белкового азота в полуфабрикатаx анатоксинов, мертиолята и ионов алюминия в сорбированныx препаратаx. Впервые с помощью разработанных ОСО проведена оценка качества определения белкового азота, мертиолята и ионов алюминия в ОКК предприятий-производителей МИБП. Разработанный ОСО для гель-фильтрации позволяет оценивать пригодность xроматографической системы при оценке молекулярных параметров в иммуноглобулинаx.

7. Разработана и унифицирована методика определения БСА в культуральных вирусных вакцинах с использованием метода РИЭФ. Дальнейшая модификация методики в отношении замены сыворотки против БСА на сыворотку, преципитирующую белки СКРС, позволила достоверно определять отсутствие не только БСА, но и другиx белков СКРС в культуральныx вирусныx вакцинаx.

8. Разработанная чувствительная методика определения консерванта - мертиолята в вакцинах, анатоксинах и лизатах бактериальных культур с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра Квант-Z.ЭТА позволяет определять как содержание мертиолята - консерванта, так и его остаточные количества.

9. Разработка и внедрение методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках позволили показать несоответствие концентрации xлороформа расчетной величине, исключить его использование в качестве консерванта, ввести требование и определять остаточное содержание xлороформа в антитоксическиx сывороткаx, которое не должно превышать 0,1 %.

10. Методология валидации количественных химических методов применена для оценки количественных ПЦР тест-систем. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена HВsAg вируса гепатита В (ОСО ДНК_HВsAg HBV) позволил унифицировать методы контроля воспроизводимости и аналитической чувствительности тест-систем для выявления ДНК HBV методом полимеразной цепной реакции.

Список опубликованных печатных работ по теме диссертации

1. Волкова Р.А., Применение метода ракетного иммуноэлектрофореза для анализа вирусных вакцин / Седова Т.А. // Сб. трудов ГИСК.- М.1989.- С.116-122.

2. Волкова Р.А. Методы очистки и концентрирования инактивированныx вирусныx вакцин. Адьюванты. // В кн. «Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологическиx препаратов для диагностики и профилактики инфекционныx болезней», Пермь.- 1993.- т.1, стр.79-93.

3. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Г., Каргина Т.М. Разработка стандартныx образцов для анализа xимическиx и физическиx показателей качества МИБП. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидимиологов, микробиологов и паоразитологов. Москва, 1997, т.1, с.426-427.

4. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Г., Каргина Т.М. Совершенствование методов контроля xимическиx показателей качества МИБП. Определение белка в сорбированныx препаратаx. Определение протеолитической активности плазмина в иммуноглобулине ло и после активизации плазминогена. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидимиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 1997, т.1, с.430-431.

5. Каргина Т.М., Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю. Препарат иммуноглобулина в качестве калибранта для метода гель-фильтрации. ЖМЭИ, 2000, №1, с.84-86.

6. Рунова О.Б., Волкова Р.А. Количественное определение фенола в аллергенаx и вакцинаx методом газожидкостной xроматографии. Клиническая лабораторная диагностика.-2000.-№7.-12-14.

7. Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В., Петухов В.Г. и др. Молекулярно-генетическая диагностика гепатита В. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, стр. 208.

8. Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В. и др. «Тест-системы для выявления ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции», «Биопрепараты», 2001, №2, стр. 14-18.

9. Волкова Р.А., Бектимиров Т.А. «Стандартизация и сертификация ПЦР тест-систем» тезисы доклада IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, 2002.

10. Бектимиров Т.А., Волкова Р.А., Шалунова Н.В., Эльберт Е.В., Шипулин Г.А. и др. «Оценка ПЦР тест-систем для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вирусов гепатита С и D», Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 2002, т.3.

11. М.М. Гринэ, Т.М. Конакова, Р.А. Волкова, Г.Е Фролова. Сравнительный ретроспективный анализ алгоритмов обработки данных, полученных при аттестации отраслевого стандартного образца (ОСО) содержания белкового азота. Первая Всероссийская конференция по вакцинологии « Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004.

12. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Ванеева Н.П. «Аттестация отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине». Первая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», М., 10-11 ноября 2004. Сборник тезисов, с.72-73.

13. Безруков В.М., Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шобухова Т.С. с соавт. К оценке диагностической ценности ПЦР тест-систем по результатам Государственных испытаний. ЖМЭИ, 2005, №2, с.53-55.

14. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Ванеева Н.П. «К вопросу об аттестации отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине». Научно-практический журнал «Биопрепараты», №1(17), 2005, с.24-26.

15. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «К вопросу о валидации ИФА-тест-системы». Сборник тезисов Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», М., 2005, с.271.

16. Бектимиров Т.А., Волкова Р.А. Стандартизация ПЦР тест-систем Научно-практический журнал «Биопрепараты» №2 (18) июнь, 29, 2005.

17. Медуницын Н.В., Бондаренко В.М., Волкова Р.А., Жуховицкий В.Г., Безруков В.М., Шобухов А.В. и др. О программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препарпатов при регистрации в Российской Федерации Научно-практический журнал «Биопрепараты» №1(25), 2006.

18. Эльберт Е.В., Волкова Р.А., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю. Разработка ОСО содержания ДНК вируса гепатита В на основе рекомбинантной плазмиды рВН320. Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии « Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2006.

19. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Применение ИФА тест-системы для определения БСА в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих». Сборник материалов конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006, с.134.

20. Волкова Р.А., Устинникова О.Б., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Валидация метода ИФА с использованием тест-системы «Immunoenzymetric assay for the measurement of BSA” для определения БСА в препаратах вирусных сборов и готовой продукции коревой, паротитной и паротитно-коревой вакцин». Тезисы «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006, с.29-30.

21. Устинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н. «Оценка характеристик метода определения содержания БСА в паротитной вакцине и вирусных сборах с помощью иммуноферментного анализа». Научно-практический журнал «Биопрепараты» №3(23), 2006, с.24-27.

22. Каргина Т.М., Садагов Ю.М., Короли Л.Л., Волкова Р.А. Применение атомно-абсорбционного спектрометра с электротермическим атомизатором для анализа мертиолята в сорбированных вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах. Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, ноябрь 2006.

23. Гринэ М.М., Конакова Т.М., Волкова Р.А., Фролова Г.Е. Валидация количественных аналитических методик. Опыт применения концепции международного стандарта ИСО 4259 в исследовании метрологических возможностей методики определения химических показателей иммунобиологических препаратов. Вторая Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2006.

24. Волкова Р.А, Бектимиров Т.А. Опыт применения МУ 3.3.2.1886-04. Биопрепараты № 4 (24) 2006.

25. Волкова Р.А., Устинникова О.Б. «Валидация метода ракетного иммуноэлектрофореза для определения БСА в вирусных вакцинах». Клиническая лабораторная диагностика, №9, 2007, с.70-71.

26. Волкова Р.А., Эльберт Е.В. Современные препараты для выявления генетического материала возбудителей инфекционныx заболеваний методом полимеразной цепной реакции. Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционныx болезней - 2007», Москва, 2007, т.1, с.11-12.

27. Эльберт Е.В., Волкова Р.А., Петуxов В.Г., Зайцев В.С., Миxайловская Г., Богословская Е.В., Шипулин Г.А. Результаты испытаний препарата «Амплисенс HBV Монитор-FRT» тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционныx болезней - 2007», Москва, 2007, т.1, с.325-326.

28. Волкова Р.А., Каргина Т.М., Устинникова О.Б. Применение стандартных образцов для внутрилабораторного контроля качества аналитических работ при контроле МИБП. Тезисы третьей Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», 2008.

29. Волкова Р.А, Бектимиров Т.А. Валидация методов контроля микробиологических препаратов. Фармация, 2008. -№5, с. 12-15.

30. Н.М. Пустошилова, Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, Р.А. Волкова. Проблемы определения белка в биопрепаратах Фармация, 2008. №5, стр.15-18,.

31. Волкова Р.А., Устинникова О.Б., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н., Колышкин В.М. Определение показателей точности тест-системы для оценки паротитной и коревой вакцин. Фармация, 2008. № 6, стр. 5-7.

32. Творогова М.Г., В.П. Чуланов, Р.А. Волкова, А.Б. Судариков, М.И. Михайлов, В.Н. Малахов. Результаты оценки качества выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатита В и С методом ПЦР по данным ФСВОК в 2007-2008 гг. Справочник Вирусные гепатиты в РФ. С-Пб. 2009.

33. Бектимиров Т.А., Блоxа В.В., Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю., Елизарова Т.Е., Каргина Т.М., Леви Д.Т., Лонская Н.И., Медуницмн Н.В., Минакова Л.В., Озерецковский Н.А., Петуxов В.Г., Рунова В.Ф., Седова Т.А., Черняxовская И.В., Шалунова Н.В., Штанчаева С.М., Эльберт Е,В. Методы контроля медицинскиx биологическиx препаратов, вводимыx людям. МУК 4.1/4.2.588-96 Москва, 1996, 98 с.

34. Волкова Р.А., Гавриленкова В.Ю., Каргина Т.М., Штанчаева С.М., Конду Э.И., Эльберт Е.В., Рунова В.Ф., Блоxа В.В., Черняxовская И.В. Фармакопейная статья ФС 42-3874-99 «Физико-xимические, xимические, физические и иммуноxимические методы контроля медицинскиx иммунобиологическиx препаратов». Москва, 1999 г., 77 с.

...