Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: УСКОРЕННОЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ, КОНТРОЛЬ АДЕКВАТНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ, ВИРУЛЕНТНОСТЬ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Маничева Ольга Алексеевна

Санкт-Петербург 2009

Диссертация выполнена в Федеральном Государственном учреждении "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства высоких медицинских технологий"

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор Вишневский Борис Израилевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич

доктор биологических наук, профессор Заикина Надежда Александровна

доктор медицинских наук Кафтырева Лидия Алексеевна

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится "___"___________2009 г. в _______часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан "___"____________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Mycobacterium tuberculosis продолжает оставаться "успешным" патогеном и в XXI веке, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остается актуальной для большинства стран. Высокую адаптивную способность вида Mycobacterium tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым условиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распространение лекарственноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы подъем лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, а также утяжеление ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Вишневский Б.И. и др., 1997; Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р.и др., 2000; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Goldman R.C., et al., 2007; Dye C., 2000; Su W.J., et al., 2008) значительно усложняет задачу лечения туберкулеза. Химиотерапия остается основным методом лечения больных туберкулезом, который обеспечивает прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбудителя. Широкое распространение в последние годы штаммов M.tuberculosis, принадлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмиссивностью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и распространенными формами туберкулезного процесса (Кондакова М.Н., 2005; Нарвская О.В., 2003; Сапожникова Н.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиологически опасных M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. В этих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов определения резистентности M.tuberculosis и контроля адекватности химиотерапии.

Сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в получении результатов определения лекарственной устойчивости в кратчайшие сроки. Учет результатов определения резистентности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена производится на 21 сутки после посева культуры. На жидких средах микобактерии растут быстрее, но есть проблема визуализации их роста. В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны и используются системы бульонного культивирования, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста M.tuberculosis в жидких средах - BACTEC 460, MB-BACT, BBL-MGIT, BACTEC MGIT 960, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001, а, б.; Palomino J.C. et al., 1999; Siddiqi S.H. et al., 1981; Zwolska Z. et al., 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 3-16 сутки прямым или непрямым методом. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду по наличию мутаций в ДНК микобактерий, по сути, в день поступления патологического материала. Но перечисленные выше методы требуют дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации (Грядунов Д.А. и др., 2001; Литвинов В.И., 2001; Скрягина Е.М. и др., 2001; Bergval I.L. et al., 2007; Cardoso R.F. et al., 2007; Sekiguchi J. et al., 2007). Существующие фенотипические микрометоды определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis на основе жидких сред небезопасны, требуют дополнительного оснащения реактивами, расходными материалами, оборудованием (Caviedes L. et al., 2002; Collins L.A., Franzblau S.G., 1997; Banfi E. et al., 2003). В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка дешевых, безопасных, простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, так как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.

Широкое распространении штаммов генотипа Beijing, для которых характерна высокая частота поли- и мультирезистнтности (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), поднимает вопрос о соотношении лекарственной устойчивости и вирулентности M. tuberculosis тем более, что эта проблема до сих пор остается дискуссионной. Сложность изучения факторов вирулентности M.tuberculosis, обусловлена, в частности, тем, что экспрессия генов, кодирующих эти факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроорганизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутствие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко С.В., 1999; Caviedes L. et al., 2002; Srivastava V. et al., 2007). Кроме того, изучение факторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и авирулентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) штаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клинические изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, различия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, могут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адекватной оценки вирулентности M.tuberculosis разных генотипов. Существующие методы исследования вирулентности M.tuberculosis на различных моделях с использованием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинаций очень дороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высокотехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно большого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки. Использование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве модели для изучения одного из свойств вирулентности M.tuberculosis - способности вызывать некроз макрофагов (цитотоксичности), помогает решить проблему в трех планах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, во-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетерогенности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при использовании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, образно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis различных генотипов и ее связь (или ее отсутствие) с лекарственной устойчивостью. Оценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возможным при сравнительном исследовании вирулентности M.tuberculosis генотипов Beijing и иных генотипов.

Цель работы: обосновать применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови для лабораторного контроля адекватности терапии, изучить вирулентность (цитотоксичность) M.tuberculosis в зависимости от генотипа и лекарственной устойчивости возбудителя.

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis посредством биохимической индикации метаболической активности микобактерий.

2. Разработать питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Провести сравнительное исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов M.tuberculosis с помощью ускоренного и стандартного методов.

3. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутоштаммы M.tuberculosis, сопоставить полученные результаты с устойчивостью M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.

4. Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.

5. Исследовать вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis по их способности активировать гибель макрофагов (цитотоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.

Научная новизна

Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры M.tuberculosis на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности - на 7-е после посева суспензии штамма M.tuberculosis. Предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена изменить терапию, что особенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарственной устойчивости.

Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость величины бактериостатической активности крови от устойчивости клинического изолята к изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены результаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов дыхания, и выявлена корреляция степени бактериостатической активности крови и эффективности химиотерапии.

Впервые на модели in vitro при инфицировании дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями туберкулеза разных генотипов показано: наибольшая вирулентность (цитотоксичность) характерна для M.tuberculosis генотипа Beijing варианта В0; штаммы сборной группы других генотипов, обладали меньшей способностью активировать некроз макрофагов; M.tuberculosis семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, вызывая некроз макрофагов в наименьшей степени; высокие цитотоксические свойства обнаружены у M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Положения, выносимые на защиту

1. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов и выявить M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в течение 3-7 суток.

2. С помощью метода вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена показана корреляция величины бактериостатической активности крови больных туберкулезом и чувствительности M.tuberculosis к изониазиду. Применение плотных сред для определения бактериостатической активности крови некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к препарату, однако метод информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: показано увеличение концентрации препарата в крови и тканях и пролонгация эффекта при эндолимфатическом введении в сравнении с внутримышечным.

3. Величина бактериостатической активности крови, определяемой с помощью полужидкой среды, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса: наиболее тяжелые формы заболевания отмечаются при низких и нулевых значениях бактериостатической активности и множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Определение бактериостатической активности с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяют в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии.

4. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing B0 проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-в и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-б. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный на основе использования полужидкой среды ускоренный метод определения устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину, прост, дешев, безопасен и потому доступен любой практической фтизиобактериологической лаборатории.

Метод ускоренного определения бактериостатической активности крови также может использоваться любой лабораторией и является надежным способом лабораторной оценки адекватности химиотерапии. Применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови дает возможность сократить сроки получения необходимых данных в 2-3 раза в сравнении со стандартными методами на плотных средах.

Вирулентность M.tuberculosis различных генотипов можно оценивать по их способности активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1. лекарственный tuberculosis микобактерия макрофаг

Реализация результатов работы

Получен патент на изобретение "Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза" № 2226398 от 10.04.2004.

Результаты исследования внедрены в практику работы Курского областного противотуберкулезного диспансера, используются в клинике легочного туберкулеза ФГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи", а также в учебном процессе на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава».

Апробация диссертационной работы

Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции по внелегочному туберкулезу (Санкт-Петербург,1997); заседаниях общества микробиологов г.Санкт-Петербурга (2000, 2002); VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007); 17-ой Международной конференции "СПИД, рак и общественной здоровье" (Санкт-Петербург, 26.05-29.05.2008); Межрегиональном семинаре для заведующих бактериологическими лабораториями Северо-Западного Федерального Округа РФ (Санкт-Петербург, 29.09-01.10.2008), Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций" (Санкт-Петербург, 29.09-31.09.2008).

Публикации

По материалам работы опубликовано 26 печатных работ, из них 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 72 отечественных и 202 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

1. Методы биохимической индикации роста M.tuberculosis

С целью индикации роста M.tuberculosis в жидкой среде исследовали способность бактериальных суспензий обесцвечивать красители метиленовый синий и малахитовый зеленый. Вследствие нестабильности полученных результатов в последующих опытах в качестве индикатора жизнеспособности M.tuberculosis использовали другое соединение - 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид. В общей сложности в опытах использовали 5 музейных штаммов M.tuberculosis и 193 клинических. Суспензию M.tuberculosis концентрацией 0,5 мг/мл инкубировали в термостате в течение 7 суток. Затем вносили по 0,1 мл 2% раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида и в течение 3, 6, 24 ч осуществляли повторное термостатирование для проявления окраски индикатора. В качестве второго контроля использовали осадок убитых автоклавированием микобактерий. Учет реакции проводили визуально по трехбалльной системе от + до +++. Конечные концентрации противотуберкулезных препаратов в среде Сотона соответствовали таковым при стандартном определении лекарственной устойчивости M.tuberculosis за исключением рифампицина, активность которого в жидкой среде была выше, чем в плотной: - изониазид 1 мкг/мл, рифампицин - 2 мкг/мл стрептомицин - 5 мкг/мл, этамбутол - 2 мкг/мл. Появление розового осадка на средах с противотуберкулезными препаратами свидетельствует о наличии резистентности M.tuberculosis к препарату.

2. Метод ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis с помощью полужидкой среды.

Исследование скорости роста клинических штаммов на разрабатываемой полужидкой среде проводили при помощи модифицированной среды Сотона (Щеголева Р.А., 1989) с добавлением 0,35% питательного агара и 10% (52 штамма) или 25% лошадиной сыворотки (114 штаммов).

При отработке ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину, этамбутолу исследовали 4 музейных штамма - H₃₇Rv-M, H₃₇Rv-ГИСК, Academia, Erdman и в общей сложности 804 штамма M.tuberculosis, выделенных из материала больных туберкулезом различных локализаций. противотуберкулезные препараты вносили в среды в конечных концентрациях: изониазид - 1мкг/мл, стрептомицин - 10 или 7 мкг/мл, рифампицин - 20 или 40 мкг/мл, этамбутол - 5 мкг/мл. Параллельно определяли лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Для контроля качества стандартной и полужидкой сред использовали музейные штаммы M.tuberculosis: H₃₇Rv, Erdman, Academia.

Пропись среды, разработанной для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis, приведена ниже.

Калия двухосновного фосфорнокислого - 0,5 г.

Магнезии сернокислой - 0,5 г.

Железа лимоннокислого аммиачного - 0,05 г.

Натрия лимоннокислого - 2,0 г.

L-аспарагина - 4,0 г.

Глицерина - 60 мл.

Питательного агара - 3,5 г.

Дистиллированной воды до 1 л.

Смесь подогревали до полного растворения солей, разливали в колбы и стерилизовали в автоклаве при 1 атм (120єС) 30 мин. В остывшую полужидкую основу асептически добавляли 25% лошадиной сыворотки. Затем в полужидкую среду вносили разведения противотуберкулезных препаратов конечных концентрациях, указанных выше.

Во всех опытах с использованием полужидкой среды готовили суспензии штаммов M.tuberculosis по стандарту мутности 5 ед., разводили в 10 раз и засевали в объеме 0,2 мл методом поверхностного наслоения (по стенке пробирки на поверхность полужидкой среды так, чтобы сохранялась фазность суспензии M.tuberculosis и среды) без перемешивания и встряхивания. Посевы инкубировали при 37С. В первой серии опытов учет результатов производили на 3 - 22 сутки для выявления оптимального срока наблюдения, в последующих экспериментах - на 3-7 сутки после посева культуры M.tuberculosis.

M.tuberculosis растут в верхней части полужидкой среды в виде взвеси или облачка мелких или более крупных крошковидных колоний. При чувствительности M.tuberculosis к препарату среда остается равномерно прозрачной. Обязательное условие исследования при использовании полужидкой среды: микроскопия мазка по Циль-Нильсену исследуемой культуры M.tuberculosis. Верификация штамма по кислотоустойчивости необходима, чтобы исключить получение ложных данных при росте неспецифической микрофлоры в случае микст-культуры.

3. Методы определения бактериостатической активности крови

3.1. Метод серийных разведений сыворотки с использованием стандартной среды Левенштейна-Йенсена.

При отработке ускоренного метода определения бактериостатической активности крови в качестве метода сравнения использовали метод серийных двукратных разведений сыворотки К.П.Алексеевской (1979) с использованием стандартной плотной яичной среды Левенштейна-Йенсена. Всего проведено 48 исследований.

В 11 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена вносили 1 мл физиологического раствора. Сыворотку крови, взятой на пике концентраций вводимых противотуберкулезных препаратов, вводили в физраствор и разводили последовательно двукратно. Готовили суспензию M.tuberculosis, выделенных от данного больного, плотностью 5 ед. по стандарту мутности, разводили в 10 раз и вносили в разведения сыворотки в объеме 0,2 мл. Пробирки укладывали горизонтально так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность косяка среды. Посевы инкубировали при 37С в течение 14-21 дня.

3.2. Метод вертикальной диффузии.

Поверхность среды Левенштейна-Йенсена в пробирках Шмиделя (Schmiedel A.,1959) засевали 0,2 мл суспензии штамма M.tuberculosis, выделенного из материала обследуемого больного (аутоштамма). Суспензию готовили обычным способом. Посев термостатировали при стандартной температуре в течение суток. Затем вносили сыворотку крови в объеме 0,5 мл и вновь помещали посевы в термостат, располагая пробирки при этом строго вертикально. После 2-х недель инкубации при 37°С измеряли в мм зону задержки роста M.tuberculosis. Бактериостатическую активность оценивали как нулевую, если задержки роста не было, низкую - если зона задержки роста была менее 24 мм, среднюю - от 25 до 40 мм, высокую - более 40 мм (Вишневский Б.И. и др., 1986). Всего исследовано 129 штаммов M.tuberculosis, выделенных из различного патологического материала, а также использовали чувствительные музейные штаммы M.tuberculosis H37Rv-ГИСК и H37Rv-M для определения бактериостатической активности больных без бактериовыделения.

Всего обследовано 174 больных туберкулезом органов дыхания, у которых провели 188 определений бактериостатической активности.

В исследованиях с использованием метода вертикальной диффузии в зависимости от бактериовыделения и чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам все больные ретроспективно были разделены на 4 группы. I группа - 45 человек с туберкулезом органов дыхания без бактериовыделения. II группу (22 чел.) составили больные, выделяющие M.tuberculosis чувствительные ко всем противотуберкулезным препаратам. III группа была представлена 57 пациентами, у которых выделены штаммы, устойчивые к 1-3 противотуберкулезным препаратам за исключением изониазида. IV группа состояла из 50 больных с культурами, устойчивыми к изониазиду или устойчивыми к изониазиду в составе поли- или мультирезистентности. В каждой группе больных туберкулезом органов дыхания после определения бактериостатической активности и проведения соответствующей коррекции химиотерапии оценивали динамику специфического процесса на основании клинико-рентгено-лабораторных данных как "значительное улучшение", "улучшение", "стабилизацию" и "прогрессирование".

Метод вертикальной диффузии также применяли при исследовании фармакокинетики изониазида при различных способах его введения - внутримышечного и эндолимфатического, в крови больных туберкулезом мочеполовой системы, а также для определения концентрации изониазида в послеоперационном материале больных туберкулезным эпидидимитом. Во всех исследованиях при этом использовали музейный штамм M.tuberculosis Н37Rv. Патологический материал измельчали в ступке с песком, заливали 5% спиртом в соотношении 1мл/100мг ткани. Взвесь помещали в стерильную пробирку и оставляли на 24 ч при комнатной температуре для экстракции изониазида. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. 0,5 мл супернатанта вносили в пробирку и проводили исследование описанным выше способом. Концентрацию препарата в экстракте ткани вычисляли с помощью калибровочной кривой, которую строили по данным, полученным при внесении в пробирки разведений изониазида от 0,15 мкг/мл до 4 мкг/мл. (Вишневский Б.И. и др., 1986).

Всего проведено 160 определений бактериостатической активности и бактериостатической активности ткани у 60 больных мочеполовым туберкулезом. В клиническом отделении мочеполового туберкулеза ФГУ СПб НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий обследовали больных двух групп: в первой (25 пациентов) использовали внутримышечное введение изониазида, во второй (35 пациентов) эндолимфатическое.

3.3. Метод ускоренного определения бактериостатической активности с помощью полужидкой среды.

С целью сравнительной оценки определяли бактериостатическую активность при помощи различных сред: двух плотных - яичной Левенштейна -Йенсена (48 исследований, метод К.П.Алексеевской, 1979) и агаризованной Middlebrook 7H10 с ростовой добавкой OADC (фирма Вecton Dickinson, 19 исследований), одной жидкой - модифицированной среды Сотона (Щеголева Р.А., 1989) с добавлением 10% лошадиной сыворотки (10 исследований) и параллельно во всех исследованиях использовали разработанную полужидкую среду. Сыворотку крови больных разводили последовательно двукратно средой Сотона, полужидкой средой или физраствором при использовании плотных сред (объем 1 мл). Готовили суспензию M.tuberculosis по стандарту мутности 5 ед., разводили ее в 10 раз и вносили в объеме 0,2 мл в разведения сыворотки. Посевы инкубировали при 37^оС на полужидкой среде 7 дней, на остальных средах - 14-21 день. Результат учитывали на среде Сотона по росту поверхностной пленки (Ягафарова Р.К. и др., 1986), на полужидкой среде - по появлению в верхней части среды облачка или взвеси мелких или более крупных крошковидных колоний, на плотных средах - стандартно. Бактериостатическую активность считали высокой, если сыворотка задерживала рост M.tuberculosis в 5-10 разведении (1:32 - 1:1024), средней - 3-4 (1:8 - 1:16), низкой - 1-2 (1:2 - 1:4), нулевой - если сыворотка не задерживала рост M.tuberculosis ни в одном из разведений.

С помощью полужидкой среды бактериостатическую активность исследовали в общей сложности у 101 больного туберкулезом органов дыхания с различными его формами. Бактериостатическую активность определяли в начале лечения, сразу после выделения культуры M.tuberculosis. Проводили ретроспективный анализ результатов определения бактериостатической активности в сопоставлении с бактериологическими данными и с клиническим течением специфического процесса. Больных разделяли на группы: 1 группа - высокие значения бактериостатической активности и чувствительность к изониазиду, 2- высокая бактериостатическая активность и резистентность к изониазиду (в составе моно-, поли- или мультирезистнтности). Остальные - аналогичная устойчивость и значения бактериостатической активности: средние - 3 группа, низкие - 4, нулевые - 5. В каждой группе больных рассчитывали средний показатель длительности бактериовыделения и оценивали динамику специфического процесса на основании клинико-рентгено-лабораторных данных как "значительное улучшение", "улучшение", "стабилизацию" и "прогрессирование", которым присвоили условные единицы, соответственно 4, 3, 2 и 1. Величину бактериостатической активности количественно оценивали в условных единицах, соответствующих номеру разведения сыворотки, например, если сыворотка задерживала рост M.tuberculosis в 6-ом разведении (1:64), то бактериостатическую активность считали равной 6. Лекарственную устойчивость M.tuberculosis определяли стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ № 109).

4. Методы исследования вирулентности M.tuberculosis in vitro

В течение 2005-2007 г.г. было исследовано в общей сложности 39 штаммов, выделенных от больных туберкулезом органов дыхания, и 4 музейных штамма: H37Ra, H37Rv, Erdman, M.bovis Ravenel. Информация о генотипах выделенных штаммов была представлена сотрудниками лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН СПб НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (руководитель лаборатории д.м.н. О.В.Нарвская). Принадлежность к генетическому семейству определяли путем сполиготипирования (Kamerbeek J. et al, 1997); штаммы генотипа Beijing далее типировали методом IS6110-RFLP (Van Embden J.D. et al., 1993).

Таблица 1

Генотипы исследованных штаммов

Несколько штаммов из приведенного списка использовали только для отработки дозы заражения, сроков наблюдения.

Лекарственную устойчивость штаммов изучали непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ № 109).

Больных туберкулезом органов дыхания, выделявших исследованные штаммы, объединяли в группы в соответствии с принадлежностью M.tuberculosis к тому или иному генотипическому кластеру: 1 группа - семейство Beijing тип А0, 2 группа - Beijing, тип В0, 3 группа - сборная, 4 - LAM9. Ретроспективно пациентов характеризовали по диагнозу, возрастному составу, давности заболевания, бактериоскопии, длительности бактериовыделения, лекарственной устойчивости возбудителя.

Исследуемые штаммы M.tuberculosis пересевали на среду Левенштейна-Йенсена, в опытах использовали 2-ю - 5-ю генерации, возраст культуры - 3 недели. Готовили взвесь M.tuberculosis с помощью стеклянных бус и встряхивателя "Вортекс", добавляя питательный бульон Middlebrook 7H9 с ростовой добавкой OADC и 0,02% Tween 80. Затем суспензию оставляли на 1 час для осаждения крупных частиц, супернатант обрабатывали ультразвуком (ультразвуковая ванна УЗВ7-0,063/37), чтобы избавиться от агрегатов клеток M.tuberculosis. Затем взвесь клеток доводили до 5 ед. по стандарту мутности, разводили бульоном Миддлбрука в 10 раз и термостатировали при 37С 3 суток. Полученную субкультуру обрабатывали ультразвуком повторно, доводили до оптической плотности, равной 0,066 и 0,033 при 600 нм (спектрофотометр "Ultraspect 2000") с целью получения суспензии микобактерий заданной концентрации для последующего заражения клеток ТНР-1 в определенной пропорции. Для измерения скорости роста посевы инкубировали в течение 6 суток при 37С, затем вновь измеряли оптическую плотность. Скорость роста вычисляли по формуле: v = ОD_6: OD_исх, где v - скорость роста (размножения) штамма, ОD₆ - оптическая плотность суспензии на 6 сутки инкубации, OD_исх - оптическая плотность суспензии исходно.

В опытах использовали клетки ТНР-1 - человеческой моноцитоподобной клеточной линии. Клетки засевали в питательную среду DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров и выращивали при 37С в 5% СО₂ (СО₂ -инкубатор МСО 5АС фирмы "Sanyo"). Затем моноциты помещали в 96-луночный планшет для культур клеток, по 50мкл/лунку. Конечное число клеток/лунку - 3х10^4. Дифференцировку и адгезию клеток осуществляли форболовым эфиром (Sigma), добавляя его в конечной концентрации 50 нМ. Затем клетки инкубировали 48 ч при 37С в 5% СО₂, среду меняли на свежую без форболового эфира и культивировали еще 24 ч часа в тех же условиях. Суспензии культур M.tuberculosis готовили описанным выше образом. Дифференцированные клетки ТНР-1, заражали микобактериями в пропорции 1:1 бактерий/макрофаг. Через 2 часа инкубации при 37С в 5% СО₂, клеточную культуру отмывали от нефагоцитированных M.tuberculosis (однократная отмывка стерильным фосфатным буферным раствором), добавляли свежую питательную среду и клетки культивировали в течение 6 суток. Затем макрофаги лизировали 10% раствором Triton (4 мкл/лунку) через 2 часа после заражения (0 сутки, контроль фагоцитоза) и через 6 суток. Серийные разведения лизатов (пул 2-х лунок) инокулировали в полужидкую среду Сотона (с добавлением 20% лошадиной сыворотки и 2 г/л глюкозы) для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Результат учитывали на 21-28 сутки. Скорость роста M.tuberculosis в макрофагах вычисляли по формуле: v = logКОЕ₆- logКОЕ_ф, где v - скорость роста (размножения) M.tuberculosis в ТНР-1, logКОЕ₆ - десятичный логарифм числа КОЕ M.tuberculosis, высеянных из макрофагов на 6 сутки опыта, logКОЕ_ф - десятичный логарифм числа КОЕ M.tuberculosis, высеянных через 2 часа после заражения макрофагов (фагоцитированные M.tuberculosis). При исследовании цитотоксических свойств M.tuberculosis клетки ТНР-1 заражали в соотношении 50:1. Жизнеспособность макрофагов оценивали, используя тест с окрашиванием трипановым синим, выявляющим мертвые (некротические) клетки (0,2% водный раствор, 100 мкл на лунку). С помощью инвертированного микроскопа подсчитывали процент мертвых клеток через 96 часов после заражения. Для исследования продукции цитокинов ТНР-1 заражали микобактериями в пропорции 10:1. Супернатант собирали через 24 и 96 ч после заражения. Концентрацию цитокинов (TNF- и TGF-в) в супернатанте определяли методом ELISA с помощью парных антител (тест-система CytoSet фирмы "Biosource") на ридере "Stat Fax 2100". С помощью калибровочной кривой вычисляли концентрацию цитокинов, которую выражали в пкг/мл.

Все данные, полученные в экспериментах, обрабатывали статистически с помощью критериев t, r или ^2.

Результаты исследований

Разработка методов ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis была начата с исследования красителей - метиленового синего, малахитового зеленого в качестве индикаторов роста M.tuberculosis, которое выявило их непригодность для решения поставленной задачи. Более стабильные результаты получены при использовании 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида. Тем не менее, низкая специфичность и чувствительность метода в отношении изониазида, стрептомицина, этамбутола ограничивает применение индикатора только для предварительного определения чувствительности M.tuberculosis к рифампицину. Выявлена зависимость активности комплекса ферментов, изменяющих цвет индикатора, от свойств M.tuberculosis: у микобактерий, выделенных при внелегочных локализациях туберкулеза, доля штаммов с низкой ферментативной активностью составляет 47,2% против 20,7% при легочной локализации процесса (р=0,03). Полученные данные свидетельствуют о необходимости разработки ускоренных фенотипических методов определения лекарственной устойчивости, основанных на регистрации роста визуальным, а не биохимическим способом.

С целью создания ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis была разработана полужидкая питательная среда на основе жидкой модифицированной среды Сотона. В ходе исследований провели определение скорости роста возбудителя на полужидкой среде Сотона с добавлением 10% и 25% лошадиной сыворотки. На среде с 10% лошадиной сыворотки средний срок появления колоний M.tuberculosis составлял 5,2+0,6 суток, с 25% - 3,8+0,4 суток (различия достоверны при p 0,01). Среда с 10% лошадиной сыворотки кроме меньшей скорости роста микобактерий показала и больший процент расхождений при определении чувствительности культур к стрептомицину. Чувствительность и специфичность метода с использованием этой среды соответственно колеблется от 55,0% до 80,6% для разных препаратов, В дальнейшем исследования проводили при использовании полужидкой среды Сотона с добавлением 25% лошадиной сыворотки. В целом сроки роста M.tuberculosis на данной среде в 2,8-3,2 раза меньше, чем на стандартной плотной среде Левенштейна-Йенсена. Уже на 3 сутки признаки роста наблюдаются у 42,1% штаммов, на 4-5 сутки у 95,2% штаммов, и на 7 сутки - у 98,3%. Из 804 исследованных штаммов лишь 4 дали рост позже 10 суток, причем у 3 из них отмечался замедленный рост и на плотной среде. Быстрый рост M.tuberculosis на разработанной среде обусловлен рядом факторов. Во-первых, среда по консистенции близка к жидкой (содержание агар-агара 0,08%), а на жидких средах микобактерии растут быстрее. Во-вторых, рост активизирует внесение сыворотки. В-третьих, содержащийся в среде в небольшом проценте агар-агар способствует повышению локальной концентрации микроорганизмов, не давая взвеси клеток опускаться на дно пробирки. Эта же особенность среды обеспечивает и хорошую аэрацию инокулята. Таким образом, разработанная среда сочетает преимущество жидких питательных сред в скорости роста, плотных сред - в его визуализации.

Исследование чувствительности МБТ к рифампицину провели в 3-х сериях опытов, в которых использовали препарат в 2-х концентрациях - 20 и 40 мкг/мл (табл. 11). В первой серии и исследуемая среда и среда сравнения (Левенштейна-Йенсена) содержали 20 мкг/мл рифампицина. Получено 100%-ное совпадение результатов. Но, поскольку по Приказу № 109 от 21.03.03 МЗСР РФ рекомендуется концентрация 40 мкг/мл, во 2-ой серии опытов содержание рифампицина в обеих средах - полужидкой и плотной - повысили до указанного уровня, что привело к 9,1%-ному расхождению результатов. Учитывая эти данные, в 3-ей серии концентрацию рифампицина уменьшили вдвое в полужидкой среде, сохранив ее на уровне 40 мкг/мл в стандартной среде. Частота совпадения результатов возросла до 96,3%. Изучение лекарственной устойчивости M.tuberculosis к стрептомицину в концентрации 10 мкг/мл показало удовлетворительные параметры чувствительности и специфичности метода - 89,9% и 97,1%. Уменьшение концентрации препарата до 7 мкг/мл повысило показатель чувствительности до 96,6%. С целью определения критической концентрации препарата в предлагаемой среде изучали минимальную ингибирующую активность этамбутола. Средние значения минимальной ингибирующей активности препарата для чувствительных и устойчивых штаммов составляли соответственно 4,5+1,4 и 8,5+1,6 мкг/мл. Более того, крайние значения минимальной ингибирующей активности для чувствительных и устойчивых штаммов перекрывают друг друга: 2 - 5 мкг/мл и 2 -10 мкг/мл. По данным литературы, при изучении активности этамбутола в среде Левенштейна-Йенсена у полирезистентных штаммов также выявлен разброс крайних значений минимальной ингибирующей активности - от 2 до 8 мкг/мл, средняя степень устойчивости (медиана) составляла 4 мкг/мл (Севастьянова Э.В. и др., 2002). Концентрация препарата в полужидкой среде, дающая наибольший процент совпадений со стандартным методом (концентрация этамбутола в среде Левенштейна-Йенсена 2 мкг/мл), равна 5 мкг/мл. В начальных опытах выявили близкое совпадение результатов определения лекарственной устойчивости 242 штаммов на стандартной и испытуемой средах: в 90,1% случаев для стрептомицина, 96,7% - для изониазида, 96,3% - для рифампицина. В дальнейшем эти результаты были подтверждены при исследовании еще 407 штаммов. Параметры метода ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis для изониазида, рифампицина, стрептомицина достаточно высоки (табл. 1), что позволяет рекомендовать его для применения в практике фтизиобактериологических лабораторий. Однако определение устойчивости МБТ к этамбутолу ускоренным и стандартным методом выявило более низкий в сравнении с другими препаратами процент совпадений для чувствительных и устойчивых штаммов - 77,6 (для стрептомицина - 90,9%, для изониазида - 92,1%, для рифампицина - 95,0%). Чувствительность метода cоставляет 65,8%, специфичность - 89,2%. На полужидкой среде частота выявления чувствительных штаммов составляет 69,3%, на стандартной - 50,2%, разница составляет 19,1%, критерий ² превышает критические значение при р0,001. Различия в результатах определения чувствительности к этамбутолу с помощью полужидкой среды и среды Левенштейна-Йенсена, возможно, объясняются особенностями препарата (небольшой разницей между критической концентрацией и средней минимальной ингибирующей концентрацией его у устойчивых штаммов M.tuberculosis), наличием или отсутствием глюкозы в составе среды, а также рН среды (Акимова и др., 2003). Таким образом, особенности среды не позволяют применять ее для определения чувствительности МБТ к этамбутолу.

Одно из достоинств предлагаемого метода - простота учета результатов, так как он визуальный и не требует дорогостоящего оборудования для индикации роста. Кроме того, все ингредиенты питательной среды отечественного производства (кроме L-аспарагина), доступны и недороги. Главное преимущество метода - быстрое, в течение 3-5 дней после посева культуры выявление множественной лекарственной устойчивости у 80,2% таких штаммов M.tuberculosis и через 7 дней - у 90,2%. Как известно, M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью особенно опасны в эпидемиологическом отношении.

Таблица 1

Параметры ускоренного метода определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis

Таким образом, впервые разработан фенотипический ускоренный простой, дешевый и доступный для любой практической фтизиобактериологической лаборатории метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину с помощью полужидкой среды, которая сочетает преимущество жидких и агаризованных сред, заключающееся в скорости роста и его непосредственной визуализации. На питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза получен патент на изобретение № 2226398 от 10.04.2004.

При исследовании бактериостатической активности больных туберкулезом органов дыхания методом вертикальной диффузии впервые выявлена четкая зависимость между величиной бактериостатической активности крови и чувствительностью культуры, выделяемой больным, к изониазиду. У 96,2% больных с культурами, чувствительными к изониазиду наблюдали среднюю и высокую бактериостатическую активность, у 4% - среднюю и отсутствие нулевых показателей. При устойчивости к данному препарату распределение значений бактериостатической активности крови иное: средние и высокие у 2,0% больных, низкие - у 54,0%, нулевые - у 44,5% (в сумме низкие и нулевые составляли 98,0%). Прослежена зависимость между частотой высоких и средних значений бактериостатической активности крови и частотой благоприятного течения туберкулеза. Так, при сохраненной чувствительности к изониазиду при средних и высоких значениях бактериостатической активности крови у 100,0-96,5% больных (процент зависит от группы) отмечаются значительные улучшения и улучшения. У больных с низкими и нулевыми значениями бактериостатической активности крови в 22% случаев имело место прогрессирование процесса. Однако, у 52,6% больных с изониазидоустойчивыми штаммами отмечается "улучшение" и у 26,0% - "значительное улучшение", хотя величины бактериостатической активности крови у них низкие. Данное обстоятельство навело нас на мысль, что плохая диффузия в яичной среде препаратов с большой молекулярной массой приводит к занижению значений бактериостатической активности крови в случае, когда культура чувствительна к такому препарату. Вследствие этого применение метода вертикальной диффузии (и в целом плотных сред) не корректно в случае устойчивости аутоштамма к изониазиду.

Тем не менее, метод был высоко информативен при использовании с целью изучения фармакокинетики изониазида при различных путях введения препарата - внутримышечном и эндолимфатическом. В случае применения эндолимфатического введения высокие значения бактериостатической активности крови регистрировали в 2 раза чаще, чем при внутримышечном, более чем в половине случаев получали высокую концентрацию в крови без увеличения дозы изониазида, причем с четким эффектом пролонгации - до 9 часов против 4 при обычном способе введения.

С целью разработки адекватного метода исследования бактериостатической активности крови у больных с устойчивостью к изониазиду использовали полужидкую питательную среду, применявшуюся для определения лекарственной устойчивости. В ходе сравнительного исследования бактериостатической активности крови с применением плотных (яичной и агаризованной) и полужидкой среды показано, что в случае устойчивости клинического штамма M.tuberculosis к изониазиду на плотных средах частота низких и нулевых значений бактериостатической активности составляла 100% (Левенштейна-Йенсена) и 91,7% (среда Миддлбрука) против 58,3% на полужидкой. Полученные данные свидетельствуют о некорректности использования плотных сред для определения бактериостатической активности при наличии резистентности возбудителя к изониазиду, так при этом показатели туберкулостатической пробы занижаются. Вероятно, это обусловлено особенностями диффузии противотуберкулезных препаратов в среду при нанесении разведений сыворотки и из среды - при росте M.tuberculosis. Оптимальными для определения бактериостатической активности крови больных туберкулезом органов дыхания являются жидкие и полужидкие среды.

Подтверждена зависимость между величиной бактериостатической активности крови и чувствительностью аутоштамма к изониазиду: при чувствительности изолята к препарату отмечаются высокие значения, при устойчивости - значения зависят от того, какие среды - плотная или жидкая (полужидкая) используются. Полужидкая среда по результатам не отличается от жидкой, но позволяет получать данные о бактериостатической активности крови в недельный срок. Достоинством метода является и то, что по величине бактериостатической активности крови можно судить о чувствительности аутоштамма в изониазиду: у всех больных с бактериостатической активностью, равной 9, отмечается чувствительность к изониазиду, при 7 или 8 - высокая чувствительность к 1 -2 препаратам при пероральном их приеме, или чувствительность к препаратам, вводимым парэнтерально. Значения бактериостатической активности крови, равные 5, 6 или менее, сочетаются с множественной лекарственной устойчивостью. Следовательно, по величине бактериостатической активности крови можно в определенной степени судить о чувствительности или устойчивости культуры M.tuberculosis больного к назначаемым препаратам еще до получения результатов лабораторного определения лекарственной устойчивости стандартным методом на среде Левенштейна-Йенсена.

С помощью ускоренного метода впервые выявлена обратная корреляция между значениями бактериостатической активности крови и длительностью бактериовыделения (степень - средняя, r=-0,65, р=0,01) (рис. 1 и рис. 2). При обследовании в клинике терапии туберкулеза легких 101 пациента впервые получены данные о корреляции между значениями бактериостатической активности крови и динамикой туберкулезного процесса (рис.3). В случае высоких значений бактериостатической активности крови у 93,8% больных с сохраненной чувствительностью к изониазиду и у 80,0% с устойчивостью к нему наблюдали "значительное улучшение" и "улучшение" (рис.4). В целом, снижение показателей бактериостатической активности крови от высоких к низким и к нулевым характеризуется ухудшением клинико-лабораторных показателей эффективности лечения. К примеру, снижение показателей бактериостатической активности крови до нулевых сопровождается уменьшением частоты благоприятного течения процесса до 18,2%. В группе больных с нулевыми значениями бактериостатической активности крови, кроме того, наблюдали наиболее высокий процент тяжелых форм процесса (казеозная пневмония, кавернозный, фиброзно-кавернозный, цирротический туберкулез, ч² =13,34, р=0,001). Различалось соотношение больных с впервые выявленным туберкулезом, рецидивом и хроническим туберкулезом: при наличии поли- или мультирезистенности процент впервые выявленных больных составлял 78,6% в группе больных со средней бактериостатической активностью против 27,3% в группе с нулевыми ее значениями (ч² =4,80, р=0,03). Следует подчеркнуть, что нулевые значения бактериостатической активности крови четко соотносятся с наиболее неблагоприятным течением процесса и, следовательно, требуют незамедлительной и обязательной коррекции химиотерапии.

Таким образом, определение бактериостатической активности больных с использованием аутоштамма M.tuberculosis и полужидкой среды, является быстрым и надежным лабораторным методом контроля адекватности химиотерапии.

Рисунок 1 Корреляция бактериостатической активности крови и длительности бактериовыделения

По оси ординат: для бактериостатической активности крови - условные единицы, для бактериовыделения - месяцы. Коэффициент корреляции r=-0,576. Статистически достоверна разница между группами 1 и 2, 3, 4, 5; 2 и 4, 5; 3 и 5; 4 и 5 (р0,05). 1 группа - высокие значения бактериостатической активности крови и чувствительность к изониазиду, 2- высокая бактериостатическая активность крови и резистентность к изониазиду (в составе моно-, поли- или мультирезистентности), остальные - аналогичная устойчивость и значения бактериостатической активности крови: средние - 3 группа, низкие - 4, нулевые - 5.