Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность

Рисунок 2 Процент больных с бактериовыделением через 3 и 6 месяцев лечения

БАК - бактериостатическая активность крови, Н - изониазид. Статистически достоверна разница в числе больных с бактериовыделением:

а) через 3 месяца лечения между группами 2 и 5 (ч²= 13,28, р<0,001), 3 и 5 (ч²= 12,41, р<0,001), 4 и 5 (ч² =7,94, р=0,005); б) через 6 месяцев лечения между группами 3 и 5 (ч² =17,72, р<0,001).

Рисунок 3 Корреляция значений бактериостатической активности крови и динамики процесса (в усл.ед.)

БАК - бактериостатическая активность крови. Коэффициент корреляции r = 0,532. Статистически достоверна разница: а) в значениях бактериостатической активности крови между всеми группами (р<0,05); б) в динамике процесса между группами 1 и 3, 4, 5, между 5 и 2, 3, 4 ( р0,05). Группы - см. примечания к рис. 1

Рисунок 4 Корреляция значений бактериостатической активности крови и частоты "значительных улучшений" и "улучшений"

БАК - бактериостатическая активность крови. Статистически достоверна разница в частоте "значительных улучшений" и "улучшений" между группами 1 и 3 (ч²=4,27, р=0,04); 1 и 4 (ч²=9,11, р=0,002); 1 и 5 (ч²=27,64, р 0,0001); 2 и 5 (ч² =11,60, р=0,0006); 3 и 5 (ч² =8,57, р=0,003); 4 и 5 (ч² =7,84, р=0,005). Группы - см. примечания к рис. 1.

Использование одновременно двух методов - ускоренного определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови позволяет в короткие сроки - в течение недели, во-первых, выявить множественную лекарственную устойчивость, и, во-вторых, оценить адекватность химиотерапии и в случае необходимости откорректировать ее.

Преимущества методов - простота, дешевизна, короткий срок получения результатов - очевидны в условиях постоянного роста лекарственной устойчивости, и, в особенности, множественной лекарственной устойчивости, так как они позволяют клиницистам в более короткие сроки с помощью индивидуализированной химиотерапии прервать цепочку распространения эпидемиологически более опасных M.tuberculosis.

Изменение свойств Mycobacterium tuberculosis, проявляющееся в широком распространении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, циркуляции на территории РФ штаммов генотипа Beijing, доля которых составляет от 34 до 66% (Нарвская О.В., 2003; Иванов и др., 2004; Маракшин и др., 2004; Медведева и др., 2005 Drobniewski F. et al., 2005; Kovalev S.Y. et al., 2005) требует решить вопрос о соотношении лекарственной устойчивости, вирулентности, жизнеспособности и генотипа возбудителя.

В среднем наиболее высокая скорость роста обнаружена у штаммов M.tuberculosis генотипа Beijing A0 - 17,09+2,75, затем в порядке убывания: В0 - 13,7+2,7, музейные - 13,7+2,0, другие генотипы - 12,9+2,0, LAM - 7,6+2,4. Скорость роста штаммов, принадлежащих к семейству LAM ниже таковой у микобактерий иных генотипов и у музейных культур (рис. 6).

Штаммы, которые принадлежат к семейству Beijing (типы В0 и А0) и сборной группе иных генотипов, проявляют тенденцию к повышению скорости внутриклеточного роста в макрофагоподобных клетках ТНР-1 по сравнению с M.tuberculosis семейства LAM (рис. 7), что может отражать их повышенную вирулентность и трансмиссивность.

Рисунок 6 Скорость роста M.tuberculosis различных генотипов в питательной среде

По оси ординат - кратность увеличения оптической плотности суспензии M.tuberculosis за 6 суток инкубации. Приведен доверительный интервал при р=0,05.

Рисунок 7 Различия между M.tuberculosis разных генотипов по выживаемости в макрофагах

По оси ординат - десятичные логарифмы числа КОЕ M.tuberculosis на 6 сутки роста в макрофагах. Ромбы - значения для штаммов Beijing A0, квадраты - Beijing В0, - LAM, треугольники - M.tuberculosis генотипов не-Beijing, ж - стандартных, линии трендов - сплошная - Beijing В0, пунктирная - Beijing A0, тонкая сплошная - генотипы не-Beijing, пунктир-точка-пунктир - LAM, пунктир-две точки-пунктир - стандартные штаммы.

Отмечали значительное различие у M.tuberculosis различных генотипов в способности индуцировать гибель макрофагов. M.tuberculosis, принадлежащие к семейству Beijing, индуцировали значительно более раннюю и массированную гибель клеток ТНР-1 по сравнению с микобактериями других генотипов. Через 4 суток после заражения при ПБМ 50:1 наибольший цитотоксический эффект оказывали M.tuberculosis генотипа Beijing B0, затем в порядке убывания: музейные, Beijing A0, сборная группа иных генотипов, LAM (рис.8).

Рисунок 8 Цитотоксичность M.tuberculosis различных генотипов. По оси ординат - процент погибших макрофагов (тест окраски трипановым синим)

M.tuberculosis генотипа Beijing и LAM обладали полярными свойствами в отношении влияния на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов клетками линии ТНР-1. M.tuberculosis группы В0 оказывали супрессорный эффект, а LAM - стимулирующий на выработку провоспалительного цитокина TNF-б через 96 ч после заражения. Противовоспалительный цитокин TGF- продуцировался культурой клеток достоверно выше при инфицировании генотипом Beijing, чем LAM (рис. 9 и 10). В целом можно говорить, что M.tuberculosis семейства Beijing "направляют" ответ макрофагов в сторону уменьшения воспаления, что, вероятно, может способстввовать диссеминации инфекции.

Рисунок 9 Продукция TNF- макрофагами через 24 и 96 ч после заражения M.tuberculosis разных генотипов

По оси ординат - концентрация цитокина в пг/мл

Рисунок 10 Продукция TGF- макрофагами после 24 и 96 ч после заражения M.tuberculosis разных генотипов

По оси ординат - концентрация цитокина в пг/мл

Таким образом, при исследовании на модели in vitro инфицирования дифференцированных клеток линии ТНР-1 M.tuberculosis разных генотипов наибольшая вирулентность выявлена у M.tuberculosis генотипа Beijing варианта В0. Количественно она проявляется относительно высокой скоростью роста и высокой цитотоксической активностью, стимуляцией индукции противовоспалительного цитокина TGF-в и супрессией провоспалительного TNF-б. Штаммы сборной группы, не-Beijing, при схожей выживаемости обладали статистически достоверно меньшей способностью активировать некроз макрофагов. M.tuberculosis семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, т.е. имели меньшую скорость роста в макрофагах и в меньшей степени вызывали их некроз обратную картину в отношении цитокинов. Полученные данные коррелируют с рядом клинических характеристик пациентов: - возрастным составом, длительностью заболевания и бактериовыделения. Наиболее неблагоприятная картина наблюдается у больных, выделяющих M.tuberculosis генотипа Beijing.

M.tuberculosis любого генотипа обладают вирулентностью, так как относятся к безусловным патогенным микроорганизмам. Все исследованные штаммы были выделены из патологического материала больных туберкулез органов дыхания и, следовательно, были вирулентны. Высокотрансмиссивные штаммы в большей степени цитотоксичны, модулируют ответ макрофагов в сторону продукции цитокинов, уменьшающих воспалительную защитную реакцию, что может приводить к диссеминации инфекции, характерной для туберкулеза органов дыхания, вызванного M.tuberculosis генотипа Beijing, и к возможности передачи жизнеспособного возбудителя другому хозяину. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis генотипа Beijing В0, сочетающаяся с высокой вирулентностью, свидетельствует о том, что мутации в геноме возбудителя, которые обеспечивают устойчивость к противотуберкулезным препаратам, не сказываются на патогенных свойствах возбудителя туберкулеза.

Для более точного, количественного сопоставления значимости в туберкулезном процессе генетических и фенотипических особенностей организма-хозяина и организма-паразита необходимы дальнейшие исследования. Использованная в настоящей работе модель in vitro изучения вирулентности (цитотоксичности) с помощью клеточной линии ТНР-1, может позволить провести эти исследования. Кроме того, данная модель перспективна для поиска препаратов влияющих на вирулентность, ингибирующих или снижающих способность M.tuberculosis вызывать некроз макрофагов.

ВЫВОДЫ

1. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид пригоден для ускоренного (8 дней) предварительного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к рифампицину.

2. Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов M.tuberculosis в течение 3-7 суток.

3. На основе полужидкой среды разработан ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, который выявляет штаммы с множественной лекарственной устойчивостью в короткие сроки (3-5-7 суток).

4. Методом вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена доказана корреляция величины бактериостатической активности крови и чувствительности M.tuberculosis преимущественно к изониазиду. Применение плотных сред для проведения туберкулостатической пробы некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к изониазиду.

5. Метод вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: в сравнении с внутримышечным эндолимфатическое введение приводит к увеличению концентрации препарата в крови и тканях и пролонгации эффекта.

6. Определение бактериостатической активности крови с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяет в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии. Степень бактериостатической активности крови, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса.

7. Нулевая бактериостатическая активность сочетается с множественной лекарственной устойчивостью M.tuberculosis, наиболее тяжелыми формами заболевания, наибольшей длительностью бактериовыделения, наименьшей частотой благоприятных исходов.

8. Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing B0 проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF-в и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-б. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вишневский Б.И., Маничева О.А. Определение дегидрогеназной активности как метод ускоренной индикации жизнеспособности M.tuberculosis // Пробл. туб. 1992. №7-8. с. 42-44.

2. Вишневский Б.И., Маничева О.А., Вишневская Е.Б., Оттен Т.Ф. Биологические особенности и проблемы выявления возбудителя туберкулеза внелегочной локализации // Пробл. туб. 1998. № 2. с. 34-36.

3. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева О.А. Оценка эффективности комплексной терапии туберкулеза мочеполовых органов. // Пробл. туб.1998. № 2. с. 38-40.

4. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Мякотина Е.Н. Ускоренное определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis с помощью полужидкой среды // Клинич. и лабораторн. диагностика. 2003. №7. С. 50-52.

5. Маничева О.А. Ускоренное определение бактериостатической активности крови у больных туберкулезом с помощью полужидкой питательной cреды // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. № 9. С. 26-29.

6. Маничева О.А. Некоторые аспекты определения чувствительности микобактерий туберкулеза к этамбутолу при использовании полужидкой среды // Пробл. туб. и болезней легких. 2003. №10. С. 47-49.

7. Маничева О.А. Ускоренное выявление полирезистентности Mycobacterium tuberculosis при использовании полужидкой питательной среды // Пробл.туб. и болезней легких. 2005. №11. С. 40-43.

8. Маничева О.А., Павлова М.В., Сапожникова Н.В., Арчакова Л.И., Скворцова Л.А., Вишневский Б.И.. Контроль химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания с помощью БАК-пробы // Пробл.туб. и болезней легких. 2008. № 5. С. 14-17.

9. Маничева О.А., Ласунская Е.Б., Журавлев В.Ю., Оттен Т.Ф., Барнаулов А.О., Мокроусов И.В., Павлова М.В., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Лекарственная чувствительность Mycobacterium tuberculosis в сопоставлении с их жизнеспособностью, цитотоксичностью, генотипом и течением процесса у больных туберкулезом органов дыхания // Пробл.туб. и болезней легких. 2008. № 12. С. 18-21.

10. Ribeiro S.C.M. Suffys P., Narvskaya O., Manicheva O., Lasunskaia E. Characterization of M. tuberculosis strains isolated in different geographic regions of the world: association of genotype with virulence and macrophage response to the bacteria// Jornal Brasileiro de Pneumologia. 2006. Vol.32. Suppl.3. P. 138.

11. Маничева О.А. Ускоренное определение лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови на основе биохимической индикации жизнеспособности M.tuberculosis // "Туберкулез как объект научных исследований": Тр. СПб НИИФ. СПб., 1994. Т.2. C. 75-78.

12. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Мякотина Е.Н. Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Патент на изобретение № 2226398, зарегистрирован 10.04.2004.

13. Вишневский Б.И., Маничева О.А. Новые ускоренные методы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза и бактериостатической активности крови // Материалы IV съезды фтизиатров Казахстана. Алма-Ата, 1992. С. 127-128.

14. Вишневский Б.И., Маничева О.А. Исследование микобактериальных экзоферментов в целях ускоренного определения БАК и лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // "Социально-эпидемические проблемы туберкулеза в территории Крайнего Севера": Мат. конф. Якутск, 1992. С. 92.

15. Ягафарова Р.К., Биспен А.И., Гамазков Р.В., Курашкин Г.А., Маничева О.А. Новые направления в терапии мочеполового туберкулеза // «Внелегочн. туберкулез - актуальная проблема здравоохранения»: Тр. Всерос. науч.-практич. конф. СПб., 1997. С. 56-57.

16. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева О.А., Курашкин Г.А. Фармакокинетика тубазида в зависимости от способа введения у больных мочеполовым туберкулезом // «Человек, окружающая среда и туберкулез»: Матер. конф. Якутск, 1997. С. 88-89.

17. Маничева О.А.. Вишневский Б.И., Соловьева Н.С., Мельникова Н.Н. Бактериостатическая активность крови больных туберкулезом органов дыхания с чувствительными и лекарственноустойчивыми культурами M.tuberculosis // «Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем»: Науч. тр. и матер. Всерос. конф. СПб., 1998. Т.1. С. 162-164.

18. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В.. Маничева О.А. Изучение фармакокинетики изониазида при различных способах его введения у больных туберкулезом органов мочеполовой системы. // "Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем». Науч. тр. и матер. Всероссийск. конф. СПб. 1998.Т.1. С. 194-197.

19. Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Маничева О.А. Особенности фармакокинетики при эндолимфатическом введении препаратов у больных туберкулезом мочеполовой системы // Матер. региональн. науч.-практ. конф.урологов Республики Башкортостан, посвящен. 100-летию со дня рождения проф. Л.П.Крайзельбурга. Уфа, 1999. С. 76-79.

20. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Иванова Л.А., Павлова М.В., Ягафарова Р.К., Гамазков Р.В., Арчакова Л.И. Значение БАК-пробы в лечении больных туберкулезом органов дыхания и мочеполовой системы // "Химиотерапия туберкулеза" / под ред. М.И.Перельмана. М., 2000. С. 91-92.

21. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Мякотина Е.Н. Ускоренное определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза и бактериостатической активности крови с использованием полужидкой среды // Матер. VIII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 2002. Т.3. С. 196-197.

22. Маничева О.А. Использование полужидкой питательной среды для ускоренного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis // «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза»: Науч.тр. Всерос. науч.-практ. конф. СПб., 2005. С. 255-259.

23. Маничева О.А., Вишневский Б.И., Калинина И.Б. Исследование чувствительности Mycobacterium tuberculosis к офлоксацину за период 2004-2005 гг. у больных туберкулезом легочной и внелегочной локализации // «Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза»: Науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. / Под ред. Ю.Н.Левашева). СПб., 2006. С. 229-231.

24. E. Lasunskaia, S.Ribeiro, O.Manicheva, P.Suffis, O.Narvskaya, I.Mokrousov, B.Vishnevsky. Characterization of M.tuberculosis strains isolated in different geographic regions of the world: association of genotype with virulence and macrophage response to the bacteria // Keystone Symposia "Tuberculosis: From Lab research to field trials". March 20-25, 2007. Vancouver, British Columbia, Canada. Poster abstract 280, p. 106.

25. О.А.Маничева, Л.А.Скворцова, М.В. Павлова, Н.В.Сапожникова, Л.И.Арчакова, Б.И.Вишневский. Бактериостатическая активность крови у больных туберкулезом органов дыхания // «Туберкулез в России. Год 2007»: Мат. VIII Рос. съезда фтизиатров. М., 2007. С. 124.

26. О.А.Маничева, Е.Б.Ласунская, Т.Ф.Оттен, И.В.Мокроусов, Б.И.Вишневский, О.В.Нарвская. Вирулентность Mycobacterium tuberculosis различных генотипов в ранней фазе инфекции in vitro // «Туберкулез в России. Год 2007»: Мат. VIII Рос. съезда фтизиатров. М., 2007. С. 142.

Размещено на Allbest.ru