Размещено на http://www.allbest.ru/

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Роль мобильных элементов в микроэволюционных процессах у растений на примере Aegilops speltoides (Triticeae, Poaceae).

Специальность: 03.00.15 - Генетика

БЕЛЯЕВ Александр Александрович

Санкт Петербург - 2009

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики растений Института эволюции Университета Хайфы.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бадаева Екатерина Дмитриевна

доктор биологических наук Гагинская Елена Романовна

доктор биологических наук Шнеер Виктория Семёновна

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН

Защита состоится 2009 г. на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт- Петербург, Университетская наб. 7/9, СпбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 2009 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроэволюция - это эволюционные преобразования внутри вида на уровне популяций и демов, ведущие к внутривидовой дивергенции и видообразованию (Воронцов 1999). Микроэволюцию можно определить как систематическое изменение частот гомологичных аллелей, участков хромосом или целых хромосом в локальной популяции. Иначе говоря, микроэволюцией называют любое увеличение или уменьшение частоты в генофонде какой-либо вариантной формы, которая продолжает встречаться в популяции из поколения в поколение (Четвериков 1929, Шмальгаузен 1968, Тимофеев-Ресовский 1958, Грант 1991, Воронцов 1999). Исследованию микроэволюции посвящено много работ, однако природа ее молекулярных механизмов, прдолжает широко дискутироваться.

Дикие пшеницы, как полиплоидные, так и диплоидные, - представляют собой прекрасную модель для исследования микроэволюционных процессов. Немаловажно, что у них крупные хромосомы, и генетика этой группы видов исследована достаточно хорошо. Детальному исследованию пшениц уже больше ста пятидесяти лет, что позволяет проводить сравнительный анализ собственных результатов, полученных экспериментальным путём, и данных, уже имеющихся в литературе.

Данное исследование посвящено изучению микроэволюционных процессов в природных популяциях диких пшениц. В основу были положены несколько гипотез, основанных как на изучении существующей литературы, так и на почти десятилетних полевых наблюдениях над дикими пшеницами Израиля. Первая гипотеза предполагает, что в современных популяциях диких пшениц и в настоящее время продолжается интенсивный процесс формо- и видообразования (Жуковский 1928, Zohary и Imber 1963). В основу второй гипотезы легло предположение о том, что активность мобильных элементов является основной движущей силой изменчивости генома в небольших краевых популяциях диплоидной дикой пшеницы Ae. speltoides. Третья гипотеза предполагает, что активность мобильных элементов и хромосомные перестройки - процессы взаимозависимые, приводящие, в отдельных случаях, к быстрому возникновению репродуктивной изоляции, т. е. к видообразованию по симпатрической модели. Таким образом, настоящее исследование находится на стыке эволюционной биологии, цитогенетики и молекулярной генетики, и послужит ещё одним шагом к пониманию механизмов микроэволюционных процессов. В работу включён материал, относящийся только к диплоидным видам диких пшениц, и не затрагиваются проблемы видообразования путём полиплоидизации.

Цель работы. Данная работа ставила своей целью дальнейшее изучение механизмов формо- и видообразования на молекулярно-цитогенетическом уровне у Aegilops speltoides.

Основные задачи исследования. Ниже приведён ряд нерешённых вопросов, которые и послужили отправными точками настоящего исследования:

· идёт ли в данный момент процесс видообразования в группе Sitopsis, и если «да», то по какой модели, чем видообразование вызвано, и какова эволюционная связь Aegilops speltoides с родственными видами в группе Sitopsis;

· каковы цитогенетические и молекулярные механизмы видообразования, и существует ли связь между ними;

· какова роль этих механизмов в образовании репродуктивных барьеров;

· какова пространственная и временная динамика мобильных элементов в геноме Ae. speltoides;

· играют ли мобильные элементы какую-либо роль в образовании новых форм в небольших краевых популяциях растений, где, как известно, прцессы формообразования интенсифицированны (Тимофеев-Ресовский и др. 1977). Исходя из поставленных вопросов, был разработан алгоритм исследования генома Ae. speltoides. Планировался сбор растений из ряда популяций втечении нескольких лет. В качестве первого шага лабораторных исследований, предполагалось разработать метод выявления на хромосомах консервативных / лабильных районов хроматина. Затем, для лабильных районов предполагалось молекулярно-цитогенетическими методами определить количественное и качественное содержание мобильных элементов (копийность и присутствие хромосомных кластеров элементов определённого типа в геноме). Предполагалось клонирование высококопийных ретротранспозонов и транспозонов с последующим использование полученных клонов в качестве молекулярных проб для in situ гибридизации, а также сравнительное исследование хромосомного распределения различных мобильных элементов в нескольких популяциях Ae. speltoides. Для выявления общих закономерностей предполагалось провести сравнительный анализ хромосомного распределения мобильных элементов у других видов Poaceae. Планировалось также исследовать динамику изменения копийности мобильных элементов во времени путём анализа ряда поколений, а также транспозиционную и транскрипционную активность мобильных элементов в генеративных и вегетативных тканях, особенно у растений с различными хромосомными аберрациями. Для более детального анализа процессов формо- и видообразования на хромосомном уровне и динамики мобильных элементов во времени была выбрана небольшая популяция Ae. speltoides, расположенная рядом с прибрежными дюнами Хайфского залива по берегам реки Кишон. Анализировалась также близлежащая, самая северная, крупная популяция Ae. sharonensis родственного вида, также принадлежащего к группе Sitopsis.

Подобный подход, сочетающий в себе как детальный анализ отдельной популяции, так и сравнение нескольких популяций и видов, предполагал достаточно детально представить вариабельность генома Ae. speltoides на уровне хромосомных перестроек, хромосомного распределения мобильных элементов а также их пространственную и временную динамику. Научная новизна работы. Данная работа является первым комплексным исследованием процессов формо- и видообразования у диких диплоидных видов пшениц. Применение новейших методов молекулярной цитогенетики и молекулярной генетики позволило впервые описать микроэволюционные процессы на молекулярном уровне, происходящие в небольшой краевой популяции Ae. speltoides. Впервые показана активная роль мобильных элементов, относящихся к различным классам, в изменениях генома растений при видообразовании. Разработан метод молекулярно-цитогенетического разделения районов хромосом по степени их эволюционной стабильности, и показано, что у Ae. speltoides в процессе видообразования наиболее значимо изменяют свой нуклеотидный состав районы терминального гетерохроматина, обогащённые ретротранстозонами Класса I (элементами родственными ретровирусам, которые могут составлять до 80% генома злаков, и перемещающихся по геному с помощью промежуточной РНК) семейств Ty1-copia и LINE.

Показано, что хромосомное распределение ретротранспозонов семейства Ty3-gypsy (Класс I) и Ас транспозонов (Класс II - активных элементов, перемещающихся по геному путём вырезания-вставки) неодинаково в популяциях из различных климатических зон, что предполагает определённую зависимость активности мобильных элементов от факторов внешней среды.

Впервые показана активация En/Spm транспозонов (Класс II) в процессе гаметогенеза у Ae. speltoides. Кластеры мобильных элементов этого типа обнаружены в районах крупных хромосомных перестроек, а также совместно с нерегулярными кластерами 5S рДНК, что свидетельствует об их активной роли как в переносе 5S рРНК генов по геному, так и в процессе изменения структуры хромосом, постоянно происходящего в небольших краевых популяциях злаков.

В той же небольшой краевой популяции Ae. speltoides был отобран ряд генотипов и получены уникальные данные по динамике копийности мобильных элементов во времени. При этом симулировались реальные условия, когда при воздействии неблагоприятных внешних условий перекрёстноопыляемые растения переходят к самоопылению. Была отмечена повышенная активность мобильных элементов, относящихся к разным классам. Периоды подъёма копийности чередовались со снижением в ряду поколений при самоопылении. Активность мобильных элементов сопровождалась морфологическими и хромосомными аберрациями.

На основании комплекса полученных данных выдвинута и частично обоснована гипотеза о том, что в популяциях Ae. speltoides идёт активный процесс формо- и видообразования, и данный вид может являться предковым для группы видов секции Sitopsis.

Практическая ценность работы. Ещё одним немаловажным аргументом в пользу выбора объекта явилось то, что пшеница - одно из самых древних культивируемых растений. Значение этого растения для Европейской цивилизации трудно переоценить. Интерес к диким пшеницам вызван в первую очередь возможностью обогащения генетического пула культивируемых сортов (Вавилов 1987), и по уровню финансирования научных исследований пшеница стоит на третьем месте после риса и ячменя. Селекционеры постоянно работают над созданием новых сортов пшениц как традиционными методами, так и современными методами генетической и хромосомной инженерии. Однако, очень часто, подобные работы выполняются экстенсивным методом, и пары для скрещиваний подбираются без учёта индивидуальных особенностей геномов родителей. Знание закономерностей формо- и видообразования в естественных популяциях позволит рациональнее планировать селекционные программы, избегая значительных материальных затрат.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на различных международных и всероссийских конгрессах, конференциях и семинарах, в том числе: 3-й Конференции по Кариологии растений (Санкт Петербург, Росси, 1992), Международном семинаре «Организация генома и эволюция» (Хайфа, Израиль, 2001), 4-м Международном Triticeae конгрессе (Кордоба, Испания, 2001), 14-й Международной хромосомной конференции (Вюрсбург, Германия, 2001), Кейстоун конференции С6 «Сравнительная геномика растений» (Таос, Нью Мексико, США, 2004), 15-й Международной хромосомной конференции (Лондон, Великобритания, 2004), 5-й Международной конференции по кариологии и кариосистематики (Санкт Петербург, Россия, 2005), 8-й Гатерслебенской конференции (Гатерслебен, Германия, 2005), семинаре «Новые горизонты эволюционной биологии» (Хайфа, Израиль, 2007), Международной конференции в честь столетия открытия Ааронсоном популяций дикой тетраплоидной пшеницы (Тверия, Израиль, 2007), 6-й Европейской Цитогенетической конференции (Стамбул, Турция, 2007). Кроме того, по материалам исследований в 2007 году были прочитаны лекции в Хельсинском университете, в MTT Agrifood Research Finland и в университете Беер-Шевы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ в ведущих международных и отечественных научных журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 250 страницах, включая 47 рисунков, 13 таблиц, список литературы, содержащий 271 ссылку и приложение, включающее клонированные нуклеотидные последовательности, опубликованные в базе данных GeneBank. Она состоит из введения, четырёх глав, выводов и заключения.

цитогенетический видообразование пшеница репродуктивный

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается выбор темы и объекта исследования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из пяти разделов: (1) проблема видообразования; (2) род Aegilops: систематика, эволюция; (3) секция Sitopsis рода Aegilops; (4) мобильные элементы: их открытие, свойства, классификация и возможная роль в эволюционном процессе; (5) мобильные элементы как основная составляющая высокоповторяющейся фракции ДНК генома злаков. В конце каждой главы ставятся вопросы для последующего изучения.

Раздел 1.1 Проблема видообразования

В этом разделе изложена кратка история исследования видообразования и рассмотрены основные современные работы в этой области (Четвериков 1929, Dobzhansky 1935, 1937, Mayr 1942, Stebbins 1950, Lewis 1953, Lewis и Roberts 1956, Lewis и Raven 1958, Lewis 1962, Тимофеев-Ресовский и др. 1977, White 1978, Grant 1981, Rieseberg 2001, Gavrilets 2003, Coyne и Orr 2004).

Обсуждено понятие вида в современной литературе. Отмечено, что точки зрения на процесс видообразования и его движущие силы значительно различаются.

Особое внимание уделено симпатрической модели видообразования. Приведена современная классификация репродуктивных барьеров применительно к растениям.

Определён круг вопросов, требующих объяснения, а также дана краткая характеристика современных методов молекулярной цитогенетики, исползуемых для решения некоторых из этих вопросов (Woo и др. 1994, Hanson и др. 1995, Fuchs и др. 1996, Mikhailova и др. 1998, Lysak и др. 2001, 2003, Ali и др. 2000, Kotseruba и др. 2003, Silkova и др. 2006).

Раздел 1.2 Род Aegilops: систематика, эволюция

В разделе дана краткая история систематики рода Aegilops (Жуковский 1928, Eig 1929, Kihara 1963, Stebbins 1956, Morris и Sears 1967, Цвелёв 1976, Тахтаджян 1987), и современная точка зрения на происхождение группы фестукоидных злаков (Невский 1937, Цвелёв 1976, Tchernov 1988). Также в этом разделе по литературным данным характеризуется влияние Четвертичного оледенения на эволюцию флоры Леванта (Жуковский 1928, Zohary 1973).

Раздел 1.3 Секция Sitopsis рода Aegilops

В этом разделе дано описание видов, входящих в секцию Sitopsis рода Aegilops. Секция включает пять видов: Ae. speltoides Tausch., Ae. longissima Sweinf. et Muschl., Ae. searsii Feldman et Kislev, Ae. sharonensis Eig и Ae. bicornis Forssk. Внутри секции Ae. speltoides, являющийся основным модельным объектом данной работы, выделяется по морфологии, жизненной форме и условиям произрастания (Dvorak и Zhang 1992, Kimber и Feldman 1987). Ae. speltoides диморфный вид (Zohary и Imber 1963), причём ssp. auchery и ssp. ligustica долго считались отдельными видами (Жуковский 1928, Eig 1929, Гончаров 2002). Но Сирс (Sears 1941) на основе изучения рекомбинантных растений и растений с промежуточным фенотипом предположил наличие группы сцепленных генов. На основе подробного анализа литературных данных нами была выдвинута гипотеза о том, что Ae. speltoides может являться материнским видом секции Sitopsis.

Раздел 1.4 Мобильные элементы: их открытие, свойства, классификация и возможная роль в эволюционном процессе

В этом разделе приведена краткая история открытия мобильных элементов, их классификация, особенности работы с данной фракцией ДНК и современные точки зрения на роль мобильных элементов в эволюции генома, которые можно разделить на две группы (Doolittle и Sapienza 1980, Orgel и Crick 1980 Golding и др. 1986, Hartl 1988, Charlethworth и Langley 1989, Preston и Engels 1989, Starlinger 1993, Maynard Smith и Szathmary 1995, Engels 1996). Первая группа гипотез предполагает, что:

· мобильные элементы присутствуют и распространяются по геному благодаря мутациям, вызванных их активностью;

· мобильные элементы обусловливают новые временные и пространственные паттерны экспрессии генов;

· мобильные элементы могут генерировать новые регуляторные единицы (состоящие из двух и более членов);

· мобильные элементы могут лежать в основе возникновения новых генов;

· мобильные элементы являются основным источником генетической вариабельности и геномных перестроек, т.е. генерируют эволюционнозначимое многообразие нуклеотидных последовательностей;

· вышесказанное предполагает серьёзную ревизию теории неодарвинизма.

Вторая группа гипотез предполагает, что:

· мобильные элементы - это последовательности эгоистической ДНК, т.е. паразиты;

· мобильные элементы снижают приспособленность популяций к внешним условиям; излишек ДНК - это энергетическое бремя для организма-хозяина (и зачастую мобильные элементы играют деструктивную роль);

· активность мобильных элементов не даёт немедленных фенотипических эффектов, и, соответственно, никакого селективного преимущества, т.е. мобильные элементы не могут быть основной действующей силой процесса видообразования.

Раздел 1.5 Мобильные элементы как основная составляющая высокоповторяющейся фракции ДНК генома злаков

В этом разделе рассматриваются особенности генома злаков, в котором мобильные элементы могут составлять до 80% от ядерной ДНК. Рассматривается важнейшая особенность мобильных элементов - их способность внедряться преимущественно в одни и те же хромосомные локусы, а внутри локусов - в подобные элементы (Voytas 1996, SanMiguel и др. 1996), что предопределяет кластерность их распределения по хромосоме. Рассмотрена модель организации генома злаков «Lego» (Flavell и др. 1993, Moore и др. 1995) и на основании литературных данных выдвинуты гипотезы о возможных механизмах изменения генома при видообразовании.

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

В этой главе сформулированы цели и задачи исследования

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В этой главе приводится список видов и популяций, использованных в исследованиях (таблица 1). Приведены методы, использованные в данной работе, и, в частности: выделения ДНК, амплификации, клонирования, секвенирования и идентификации фрагментов мобильных элементов, ПЦР (полимеразная цепная реакция) скрининг на сайт-специфичное внедрение транспозонов, количественный RT (real-time) ПЦР; LD (long distance) ПЦР; дот-блот гибридизация и анализ; IRAP (inter-retrotransposon amplified polymorphism) для определения транспозиции мобильных элементов. Описаны также методы in situ гибридизации и дифференциальной окраски хромосом, включающие приготовление препаратов митотических, мейотических хромосом и ДНК фибрилл, мечение проб, непосредственно in situ гибридизацию, а также послегибридизационную окраску хромосом, хромосомную идентификацию и анализ внутихромосомного распределения гибридизационного сигнала. В этой главе также приводятся использованные нами методы статистической обработки данных, такие как нормализация, централизация и анализ главных компонент (PCA).

Таблица 1. Виды и образцы растений, использованные в экспериментах.

* USDA - коллекция United States Department of Agriculture, США.

** U.Calif,Riverside - коллекция университета Калифорнии, Риверсайд, США

*** WIC - коллекция института Вейсмана, Израиль.

**** IE - коллекция института Эволюции, Хайфа, Израиль.

***** AARI - коллекция Aegean Agricultural Research Institute, Турция.

****** БИН - коллекция Ботанического института РАН.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 4.1 Выявление в пределах хромосом Ae. speltoides районов, обогащённых видоспецифичными повторами ДНК

Одной из первых задач данного исследования было нахождение на хромосомах «горячих точек» эволюции, т.е. определение районов с повышенным содержанием видоспецифичных нуклеотидных последовательностей. Для выявления в пределах хромосом Ae. speltoides районов различной степени консервативности и их физического картирования применялась модификация GISH метода (геномной in situ гибридизации), разработанная нами (Belyayev и др. 1998, 2001а). Идея данного подхода заключается в одновременной гибридизации с хромосомами модельного вида смеси двух геномных ДНК - собственной, меченной биотином с последующей детекцией FITC или Alexa 488 (зелёная флуоресценция), и ДНК другого вида, меченной дигоксигенином с последующей детекцией антидиг-родамином (красная флуоресценция). В серии экспериментов подбираются виды различного эволюционного сродства к модельному - от близкородственных, до видов другого рода, семейства и даже класса. В результате районы хромосом модельного вида, имеющие общие высокоповторяющиеся ДНК-повторы с видом, ДНК которого используется в данном эксперименте, будут иметь оранжево-жёлтую флуоресценцию (комбинированный зелёно-красный сигнал), в то время как районы, обогащённые видоспецифичными повторами, будут иметь зелёную флуоресценцию (сигнал собственной ДНК). В дальнейшем данный метод с успехом был также использован на хромосомах животных (Ivanitskaya и др. 2005).

Разрешительная способность метода достаточно высока: даже при гибридизации смеси ДНК двух популяций Ae. speltoides из разных флористических областей - Средиземноморской (TS-84) и Ирано-Туранской (TS-24) на хромосомы TS-84 были обнаружены небольшие дистальные и теломерные зелёные блоки, располагающиеся в основном на границах гетеро- и эухроматина. Был сделан вывод, что именно эти районы хромосом изменялись первыми в процессе микроэволюции.

Следующий эксперимент, в котором смесь геномных ДНК Ae. speltoides (зелёный сигнал) и близкородственной Ae. bicornis (красный сигнал) гибридизовалась с хромосомами Ae. speltoides, показал обогащённость части терминального гетерохроматина видоспецифичными повторами.

Был сделан вывод о том, что процесс видообразования и последующей межвидовой дивергенции у цветковых растений, в часстности у злаков, связан со значительными изменениям в высокоповторяющейся фракции ДНК. Геномная in situ гибридизация позволила выявить наиболее нестабильные районы хромосом у Ae. speltoides первыми меняющие свой нуклеотидный состав в процессе эволюции. Ими оказались большинство терминальных гетерохроматиновых районов, что согласуется с данными других исследователей. Наиболее вероятным выглядит предположение, что подобные изменения могут быть вызваны активным внедрением и аккумуляцией мобильных элементов и их фрагментов в этих районах хромосом.

Раздел 4.2 Хромосомное распределение мобильных элементов Класса I, и их роль в преобразовании генома при формо / видообразовании

Полученные данные о хромосомной локализации районов, обогащённых видоспецифичными нуклеотидными повторами, позволили поставить вопрос о причинах, вызывающих подобные изменения в геноме. A priori было предположено, что именно мобильные элементы своим внедрением могут вызывать значительные изменения в нуклеотидном составе отдельных районов хромосом, что, в свою очередь, «включает» механизмы молекулярной синхронизированной эволюции (cocerted evolution, Elder и Turner 1995).

Для локализации мобильных элементов Класса I в качестве пробы применяются фрагменты гена обратной трансклиптазы (RT) - наиболее консервативного гена в составе ретротранспозонов, что и позволяет выявить подавляющее большинство мобильных элементов данного типа. Данная методика достаточно хорошо отработана. Уже первая гибридизация смеси RT фрагментов показала их неоднородное распределение по хромосомам Ae. speltoides. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) выявила кластеры Ty1-copia элементов во всех терминальных гетерохроматиновых районах хромосом Ae. speltoides и в районах вторичных перетяжек (ядрышковых организаторов, NOR). В эухроматине эти элементы распределены более или менее равномерно. Похожее распределение продемонстрировали и LINE элементы. Полученные данные свидетельствуют о значительной роли Ty1-copia и LINE элементов и их производных в формировании части гетерохроматиновых блоков. Сравнение положения кластеров Ty1-copia и LINE элементов и районов, обогащённых видоспецифичными нуклеотидными повторами, выявило практически их полное совпадение. Следовательно, активность Ty1-copia и LINE элементов может приводить к значительному изменению нуклеотидного состава отдельных, в основном гетерохроматиновых, районов хромосом. Это может быть непосредственное внедрение элементов и/или провоцирование эктопических обменов, поскольку в каждой из хромосом (и это характерно для растений) находятся десятки и даже сотни копий Ty1-copia и LINE элементов одинакового нуклеотидного состава.

Мобильные элементы Ty3-gypsy, возможно, наиболее вариабельны по нуклеотидному составу. Эта группа ретротранспозонов близка к ретровирусам, и единственным отличием является отсутствие «конверта» (“envelope”) - гена позволяющего ретровирусу покидать клетку. Другой важной особенностью Ty3-gypsy элементов является их значительное присутствие в центромерных районах хромосом растений (Aragon-Alcaide и др. 1996; Jiang и др. 1996, Ananiev и др. 1998; Presting и др. 1998, Hudakova и др. 2001; Fukui и др. 2001, Belyayev и др. 2005). В связи с этим предполагается возможность участия элементов этой группы в образовании неоцентромер.

Для получения наиболее полного представления о распределении Ty3-gypsy элементов по хромосомам и определения их возможной роли в процессах микроэволюции, был проведён ряд экспериментов с клонированными фрагментами RT, относящимся к разным группам этого типа ретротранспозонов и максимально отличающимися друг от друга по нуклеотидному составу. Для сравнения, ряд экспериментов был проведён также и на хромосомах дикого ячменя H. spontaneum - самоопылителя, относящегося к той же трибе Triticeae. Сходство или различие полученных данных позволило бы судить об определённых закономерностях в распределении Ty3-gypsy элементов у злаков с большими геномами. FISH эксперименты с различными фрагментами RT выявили мини-кластеры Ty3-gypsy элементов по всей длине хромосом как у Ae. speltoides, так и у H. spontaneum. Кластеры были обнаружены в гетеро- и эухроматине. Несмотря на трудности в картировании мобильных элементов (малые размеры большинства кластеров, различная конденсация хромосом на анализируемых пластинках, определённый уровень полиморфизма гомологов), второй раунд гибридизации на тех же цитологических препаратах с хромосомными маркерами, такими как рДНК, и последующая диференциальная окраска хромосом нуклеотид-специфичными флюорохромами и Гимзой, позволяет достаточно точно локализовать кластеры мобильных элементов. Внутрипопуляционные различия в хромосомном паттерне Ty3-gypsy элементов у растений с нормальной морфологией минимальны. В основном различается интенсивность флуоресцентного сигнала отдельных кластеров. Для определения уровня межпопуляционного полиморфизма был проведён сравнительный покластерный анализ присутствия / отсутствия сигнала.

Согласно полученным данным, мини-кластеры Ty3-gypsy ретротранспозонов могут быть условно разделены на три группы по степени их стабильности (встречаемости в различных популяциях): (1) стабильные видо-специфичные кластеры, (2) вариабельные кластеры, и (3) популяционно-специфичные кластеры. Наиболее стабильные (видо-специфичные) кластеры обеих групп элементов были обнаружены в районах 45S рДНК на хромосомах 1 и 6 у Ae. speltoides и на хромосоме 6 у H. spontaneum. На хромосоме 7 (5H) H. spontaneum было обнаружено внедрение Ty3-gypsy элементов в 45S рДНК кластер, и вполне возможно, что часть рибосомальных генов этого района инактивировано, поскольку внедрение мобильных элементов часто вызывает метилирование окружающей ДНК (Finnegan и др. 1998). Как известно, кластеры 45S рДНК находятся вместе с GC-обогащёнными блоками гетерохроматина, которые могут быть выявлены при дифференциальном окрашивании. В отличие от районов 45S рДНК, где кластеры Ty3-gypsy элементов наблюдались постоянно, лишь однажды была обнаружена ассоциация кластера Ty3-gypsy элементов и 5S рДНК района на хромосоме 5 Ae. speltoides. Стабильные мини-кластеры Ty3-gypsy элементов также постоянно фиксировались в центромерах и перицентромерном гетерохроматине.

76% кластеров Ty3-gypsy элементов у Ae. speltoides и 26% кластеров у H. spontaneum присутствуют только в нескольких популяциях (вариабельные кластеры). При анализе хромосомного распределения Ty3-gypsy ретротранспозонов отмечена важная особенность: на хромосомах существует ограниченное число районов, где возможно нахождение кластеров Ty3-gypsy элементов, и у растений с обеднённым паттерном часть «позиций» не заполнена. Похожая ситуация наблюдалась и в геноме Drosophilla virilis (Evgen'ev и др. 2000).

Ещё одной важной особенностью хромосомного распределения Ty3-gypsy ретротранспозонов является то, что в различных популяциях гомологичные кластеры могут иметь неодинаковое соотношение элементов разного типа, т. е. была обнаружена популяционная специфичность состава блоков Ty3-gypsy элементов.

Наиболее редки популяционно-специфичные кластеры, которые составляют 6-10% от всех кластеров Ty3-gypsy элементов. Это в основном цитологически видимые внедрения Ty3-gypsy ретротранспозонов в районы центромерных центральных доменов отдельных хромосом. Даже те небольшие популяционно-специфичные внедрения отдельных Ty3-gypsy элементов в центромеры, обнаруженные нами, могут иметь далеко идущие последствия. Изменение структуры высококонсервативного цетрального домена центромеры гомологичных хромосом может вызывать нарушения мейоза, межцентромерные связи между негомологичными хромосомами (Saifitdinova и др. 2001), и, в конечном итоге, приводить к элиминации растения-носителя. Но в отдельных случаях можно предположить фиксирование подобных изменений, особенно в небольших краевых популяциях, если учесть, что при неблагоприятных внешних условиях даже перекрёстноопыляемые растения часто переходят к самоопылению (см. ниже). Подобные популяционно-специфичные хромосомные аномалии могут быть первым шагом к возникновению репродуктивной изоляции внутри вида, и, в конечном итоге, к видообразованию (Grant 1981). В связи с этим необходимо отметить тот важный факт, что 75% популяционно-специфичных кластеров у Ae. speltoides найдено в небольших, южных популяциях на краю ареала (популяции 2.22 и 2.36). Аналогичная ситуация наблюдалась и у H. spontaneum, где 77% популяционно-специфичных кластеров было обнаружено в популяциях из пустыни Негев и станции 2 Нахаль-Орен с экологическими условиями близкими к пустынным.

Обобщая полученные данные о хромосомном распределении мобильных элементов I группы, можно отметить следующие ключевые положения:

· Мобильные элементы типа Ty1-copia и LINE образуют крупные кластеры в гетерохроматиновых районах хромосом обогащённых видоспецифичными нуклеотидными повторами, что свидетельствует об активной роли мобильных елементов в преобразовании высокоповторяющейся фракции ДНК при видообразовании.

· Обнаруженная внутривидовая изменчивость хромосомного распределения Ty3-gypsy элементов даёт возможность предположить, что активность данного типа ретротранспозонов может вызывать хромосомные аномалии, особенно в популяциях с экстремальными для данного вида условиями внешней среды, и, в первую очередь, в краевых популяциях.

Раздел 4.3 Хромосомное распределение мобильных элементов класса II и их роль в процессах реорганизации генома

В этой главе приведены цитогенетические доказательства активной роли транспозонов двух типов Enhancer/Suppressor-mutator (En/Spm) и Activator-(Ac) (Класс II) в процессе геномных перестроек у Ae. speltoides. Недавно были получены данные о высокой копийности и консерватизме En/Spm элементов у видов семейства Poaceae (Mao и др. 2000; Wicker и др. 2003; Langdon и др. 2003). Эти транспозоны могут активизироваться несколько раз втечение одного поколения, и была показана их повышенная активность в мейозе (Joanin и др. 1997, Raskina и др. 2004a). Экспрессия и транспозиция En/Spm элементов не зависит от их положения на хромосоме, и их хромосомное распределение может меняться даже в клетках одного организма. Тем не менее, предварительные эксперименты показали, что в определённых районах кластеры En/Spm транспозонов встречаются чаще. Элементы Класса II показали достаточно высокую консервативность фрагментов транспозазы (TPasе - консервативного гена в составе транспозонов, обеспечивающего мобильность элемента), что наиболее вероятно объясняется их постоянной активностью в геноме. Фрагменты TPase En/Spm элементов, выделенные из генома Ae. speltoides, на 96% идентичны аналогичным районам, полученных из геномной ДНК Triticum aestivum (Staginnus и др. 2001). В пределах консервативной части TPasa Ac элемента нами была обнаружена дупликация фрагмента. Нуклеотидная последовательность, послужившая основой для создания праймеров, имеет длину 296 пн (Chernyshev и др. 1988) в то время как полученная нами - 783 пн. Участки длиной 20 пн с 5' и 3' концов имеют практически 100% гомологию с исходным фрагментом, в то время как центральная часть, в свою очередь, делится на 2 фрагмента длиной примерно по 350 пн, причем каждый из них гомологичен исходной последовательности.

Для подробного изучения и определения закономерностей хромосмного распределения En/Spm элементов, кроме Ae. speltoides были использованы другие виды семейства Poacecae, а именно: Z. biebersteiniana, T. monoccoccum, T. urartu и H. spontaneum. Сравнительный анализ хромосомного распределения En/Spm транспозонов у пяти изученных видов злаков показал, что кластеры этих элементов чаще всего находятся внутри или в непосредственной близости к районам локализации 5S рибосомальных генов (5S рДНК). С другой стороны, в районах 45S рибосомальных генов (45S рДНК) наблюдалась отчётливое затухание сигнала. В эухроматиновых районах хромосом наблюдался в основном дисперсный сигнал, но также были отмечены отдельные кластеры. В гетерохроматиновых и перицентромерных районах у всех исследованных видов была отмечена значительная редукция сигнала En/Spm элементов.

Анализ хромосомного распределения фрагментов TPase En/Spm транспозонов показал, что наиболее стабильные кластеры образуются в районах кластеризации 5S рДНК. У Ae. speltoides такой кластер расположен на хромосоме 5 в коротком плече. In situ гибридизация на хромосомах нескольких диплоидных видов семейства Poaceae: Z. biebersteiniana, T. monococcum и H. spontaneum подтвердила обнаруженную закономерность. Но наиболее интересным, на наш взгляд, были данные о 100% совпадении кластеров En/Spm элементов и непостоянных кластеров 5S рДНК. Наличие непостоянных рДНК кластеров описано у многих видов растений, и их количество может варьировать даже в пределах вида (Heslop-Harrison 2000). В 1985 Schubert и Wobus, исследуя мобильность ядрышкого организатора (NOR) в геноме лука (Allium), где, как известно, находятся крупные кластеры рДНК, впервые на уровне гипотезы предположили вовлечённость мобильных элементов в этот процесс.

Поскольку предполагалось, что активность En/Spm транспозонов повышается во время мейоза, был проведён ряд экспериментов по исследованию мейотических хромосом растений из популяции 2.22 Ae. speltoides. Полученные результаты впервые подтвердили гипотезу об активной роли мобильных элементов, и, в частности, En/Spm транспозонов во внутригеномном переносе хромосомных кластеров рибосомальных генов. Гибридизация En/Spm TPase и 5S рДНК вывила во всех клетках пыльника совпадение положения на хромосомах регулярных кластеров En/Spm элементов и 5S рДНК блоков. Более того, было выявлено полное совпадение кластеров En/Spm с возникающими в мейозе непостоянными кластерами 5S рДНК. Существование подобных комплексов было подтверждено ПЦР-скринингом на сайт-специфичное внедрение транспозонов, когда один из олигонуклеотидных праймеров специфичен для транспозона, а другой - для гена. Подобный подход позволил выявить наличие в ДНК, полученной из колосков растений на стадии микроспорогенеза, комбинированных фрагментов длиной примерно 1600 пн, состоящих из фрагмента En/Spm транспозона и фрагмента 5S рДНК. В ДНК, полученной из листьев, такого фрагмента выявлено не было. Данные in situ гибридизации и ПЦР-скрининга позволяют заключить, что возникновение большей части нерегулярных кластеров рДНК напрямую связано с активизацией En/Spm транспозонов в мейозе.

В качестве механизма движения, можно предположить перенос фрагмента рДНК заключенного между двумя активными мобильными элементами, но нельзя исключить и прямой «захват» части рДНК мобильным элементом, поскольку недавно были опубликованы данные о том, что транспозоны могут захватывать, переносить и амплифицировать отдельные фрагменты ядерных генов (Jiang и др. 2004).

En/Spm-обусловленный перенос рДНК может быть условно разделён на два типа: (1) геном-специфичный, наблюдаемый во всех клетках организма, и возникающий, вероятнее всего, на стадии зиготы; и (2) клеточно-специфичный, наблюдаемый в отдельных материнских клетках пыльцы. Оба типа переноса могут одновременно присутствовать в одном пыльнике. Клеточно-специфичный En/Spm-обусловленный внутри- и межхромосомный перенос рДНК а так же выявление крупных комплексных кластеров En/Spm + 5S рДНК в районах хромосомных перестроек свидетельствуют о важной роли En/Spm транспозонов в постоянно действующих внутрипопуляционных процессах хромосомного репаттренинга. Несмотря на то, что клеточно-специфичные мутации в мужском спорогенезе затрагивают лишь отдельные гаметы и в большинстве элиминируется, нельзя исключить возможность того, что небольшая их часть может закрепиться в следующих поколениях в результате инбридинга или самоопыления, и перейти в разряд геном-специфичных. Согласно классическим эволюционным представлениям, изменение структуры хромосом является одним из важнейших составляющих внутривидовой вариабельности, ведущей к изменению генотипического состава популяции, что, в свою очередь, при определённых условиях, приводит к видообразованию, особенно в небольших краевых популяциях (Четвериков 1926, Lewis и Raven 1958, Тимофеев-Ресовский и др. 1979, Grant 1981). В дальнейшем будет показано, как происходит перераспределение рДНК блоков при симпатрическом видообразовании у двух родственных видов группы Sitopsis.

Элементы семейства hAT, к которым относятся Ас элементы, (Класс II) широко распространены в растительном царстве, особенно у видов злаков с большими геномами (Kunze и др. 1997, Staginnus и др. 2001, Langdon и др. 2003). Высокая копийность этих элементов была недавно документирована для нескольких видов Poaceae (Mao и др. 2000, Koprek и др. 2000, Wicker и др. 2003, Langdon и др. 2003). Одним из наиболее эффективных способов определить динамику мобильных элементов и их роль в процессах микроэволюции является сравнительное исследование их хромосомного распределения в естественных популяциях близкородственных видов. Можно утверждать a priori, что кластеры мобильных элементов могут быть древними, и, следовательно, общими у нескольких видов. Тем не менее, в последнее время были опубликованы данные о том, что текущая внутрипопуляционная активность hAT элементов может вести к дивергентной трансформации геномов в популяциях с контрастной экологией (Wright и др. 2001, Raskina и др. 2004). Исходя из этого, была поставлена задача изучить меж- и внутривидовое сходство/различия в хромосомном паттерне Ас элементов (семейство hAT). Положение кластеров Ас элементов определялось относительно известных и стабильных хромосомных маркеров, таких как рДНК сайты, центромеры, теломеры и блоки гетерохроматина на митотических и мейотических хромосомах диплоидных пшениц и ячменя (Triticeae, Poaceae).

Для сравнительного анализа кроме Ae. speltoides были использованы два других вида Triticeae - Triticum urartu (2n=2x=14) и H. spontaneum (2n=2x=14). Были подобраны пары популяций с контрастными условиями внешней среды - одна из аридной Ирано-Туранской флористической области, другая - из Средиземноморской с высокой влажностью. Для измерения положения кластеров Ас элементов на хромосомах применялась оригинальная компьютерная программа VideoTesT-Karyo 1.0. Наложение выравненных (чтобы свести к минимуму различную степень конденсации хромосом) денситограмм позволило с высокой точностью картировать блоки Ас элементов, привязав их к положению известных цитогенетических маркеров, и выявить внутривидовую вариабельность их распределения по хромосомам. Для каждой популяции было получено 7-10 денситограмм по каждой хромосоме у 3-7 растений (324 измерения в целом).

Для независимой оценки полученных данных хромосомного распределении Ас элементов были использованы несколько статистических методов. В в каждой из экологически контрастных популяциях популяций TS-84, TS-24 (Ae. speltoides), SB и Ma (H. spontaneum) анализировались по четыре растения. Оценивалось присутствие/отсутствие отдельного кластера у каждого из растений. Целью было оценить роль экологических факторов в вариабельности хромосомного распределении Ас элементов. Из классических параметрических тестов был применён тест «Расстояния Айалы» (Ayala distance), когда присутствие/отсутствие отдельного кластера Ас элементов рассматривается как аллель (Ayala и др. 1970). Расстояния Айалы были вычислены для каждого генотипа и в среднем для популяции. Был также использован метод «ресамплинга» или статистической симуляции (Li и др. 2002). Этот метод является разновидностью симуляции «Монте Карло» когда обработка данных и выводы делаются на основе множества возможных сценариев. Данный метод делает возможным оценку уровня стабильности (или, если угодно, детерминированности) хромосомного паттерна мобильных элементов в популяции, находящегося под воздействием определённых условий внешней среды.

FISH эксперименты выявили неоднородное, хромосом-специфичное распределение Ас элементов по длине хромосом у трёх исследованных видов Triticeae. Кластеры Ас элементов на гомологичных хромосомах могут быть выявлены в гомо- и в гетерозиготе, а также полностью отсутствовать у отдельных генотипов. Хромосомы Ae. speltoides несут массивные АТ-обогащённые гетерохроматиновые блоки в дистальных/терминальных и перицентромерных районах, и мы обращали особое внимание на эти кластеры при оценке роли элементов Класса II в формировании гетерохроматина. Гетерохроматин - высокогетерогенная, сложная фракция генома, в которой преобладают мобильные элементы Класса I (Pearce и др. 1996, Brandes и др. 1997, Saunders и Houben 2001, Belyayev и др. 2001, Lippman и др. 2004). В противоположность интенсивному FISH-сигналу мобильных элементов Класса I, в гетерохроматине наблюдалась значительная редукция сигнала Ас элементов. Большинство кластеров Ас элементов было выявлено на границе гетеро- и эухроматина. Анализ хромосомных денситограмм не выявил концентрации Ас элементов вокруг или внутри 45S рДНК и 5S рДНК сайтов. В данных районах концентрация Ас элементов была сопоставима со средней плотностью элементов по хромосоме.

Для первичной оценки распределения Ас элементов по хромосомам были вычислены несколько простейших параметров. Для каждой популяции были определены среднее число кластеров на хромосому и процент кластеров в дистальных и терминальных районах. Общее число кластеров практически одинаково у двух экологически контрастных популяций перекрёстноопыляемого Ae. speltoides, в то время как у самоопыляемых H. spontaneum и T. urartu число кластеров значительно различается. Анализ распределения кластеров Ас элементов по длине хромосом выявил их большую концентрацию в проксимальных районах, включая внедрения в центромеры. Тест «дистанция Айалы» позволяет создать уникальный профиль популяции, что, в свою очередь, позволяет выявить популяции со сходным типом профиля. Для каждой популяции была вычислена попарная дистанция между генотипами по хромосомному паттерну Ас элементов, а также среднее значение этих дистанций. Значения незначительно различались и колебались между 0,39 и 0,43. Затем был сделан следующий шаг: реальные значения дистанций Айалы были сопоставлены со случайно-генерированными методом «Монте-Карло» с целью определения тех популяций, где паттерн Ас элементов отличался от случайного распределения. Были получены следующие результаты: популяции проанализированных видов, произрастающие в Средиземноморской флористической области (TS-84 и Ma), имеют значения близкие к 1.00, и это означает, что хромосомные паттерны Ас элементов в этих популяциях неслучайны, т.е. упорядочены. В противоположность, популяции из Ирано-Туранской флористической области имеют значения внутри симулированного распределения и колеблются от 0.62 для популяции SB H. spontaneum до 0.85 для популяции TS-24 Ae. speltoides. Таким образом, хромосомные паттерны Ас элементов в этих популяциях нарушены.

Анализ полученных данных показывает, что внутри вида существуют отчётливые межпопуляционные различия как в хромосомной локализации Ас элементов, так и в общем количестве кластеров на геном. Можно отметить наиболее характерные особенности паттерна Ас транспозонов, а именно:

· Преимущественная концентрация кластеров Ас элементов (54-76%) в проксимальных районах хромосом. В теломерных районах транспозоны этой группы локализуются крайне редко.

· Высокий процент кластеров на границе эу- и гетерохроматина.

· Комплементарное положение кластеров Ас по отношению к En/Spm элементам (САСТА).

· Отмечены хромосомо- и популяционноспецифичные внедрения в районы центромерного центрального домена. . Похожие внедрения, но Ty3-gypsy ретротранспозонов, были обнаружены нами (Belyayev и др. 2005) в тех же популяциях Ae. speltoides и H. spontaneum.

· Значительная разница в общем числе кластеров между популяциями самоопылителей по сравнению с перекрёстниками. Теоретически предполагалось, что система размножения должна быть важным фактором, влияющим на динамику мобильных элементов в естественных популяциях (Charlesworth и др. 1993, Wright и др. 2001). Уменьшение эффективного размера популяции у самоопылителей через обычное явление «бутылочного горлышка» и/или жёсткий отбор в сцепленных локусах может вызывать как увеличение числа мобильных элементов, так и их стохастическую элиминацию в отдельных самоопыляемых линиях. Как следствие, разница между популяциями самоопылителей в количестве/распределении мобильных элементов может быть выше, чем у перекрёстноопыляемых растений.

Раздел 4.4 Активность мобильных элементов в ряду поколений при переходе растений к самоопылению

Данные приведенные в этой главе были получены в результате совместной работы с сотрудниками университета Хельсинки. Автор выражает благодарность доценту Руслану Календару и профессору Алану Шульману.

С XIX века было известно, что очень часто при неблагоприятных внешних условиях перекрёстно опыляемые растения переходят к самоопылению (Darwin 1859, Henslow 1879, Коржинский 1898, Lewis 1953, Baker 1955, Stebbins 1970, Moeller и Geber 2005). Теоретически, в определённых условиях, самоопылители могут иметь преимущества перед перекрёстно опыляемыми растениями, когда гарантии репродукции перевешивают ущерб от имбредной депрессии (Fisher 1941, Lloyd 1992). Наши длительные полевые наблюдения над несколькими дикими видами Triticeae (Ae. speltoides, Ae. sharonensis, H. spontaneum) также выявили переход значительной части растений в Израильских популяциях к самоопылению и обратно в зависимости от ежегодных колебаний климатических параметров (сезонное количество осадков, колебания температуры и т.д.) (данные не опубликованы).

Основываясь на вышесказанном, мы попытались смоделировать реальные процессы, протекающие в небольшой краевой популяции Ae. speltoides. Мы проследили динамику мобильных элементов, относящихся к разным классам, в геномах модельных растенияй втечение трёх циклаов самоопыления. На основе данных предыдущего цитогенетического анализа из трёх различных колосков были отобраны три растения, характеризующиеся хромосомными аберрациями и несущие дополнительные В-хромосомы (Raskina и др. 2004 a, b). Для определения копийности мобильных элементов использовалось два типа ДНК - из листьев и из колосков на стадии микроспорогенеза. ДНК растений Ae. speltoides ssp. aucheri Ts-84 (Латакия, Сирия) из центра ареала была выбрана как контроль. Мы полагали выявить определённые колебания копийности мобильных элементов в ряду поколений, но результаты превзошли все ожидания. Первым бросается в глаза то, что копийность мобильных элементов гораздо выше в генеративных тканях по сравнению с вегетативными. Это правило соблюдается для большинства элементов за исключением относящихся к семейству Athila (Sabrina, WHAM). Например, копийность WIS ретротранспозонов в колосках G13 S1 (генотип 13, первое поколение от самоопыления - S1) превышает копийность в листьях на 59% или на 17825 копий. Копийность трибо-специфичных тандемных повторов Spelt 52 и 5S rRNA генов (также служащих определенным контролем по отношению к мобильным элементам) также оказалась выше в генеративных тканях.

Ещё одной важной особенностью является то, что копийность мобильных элементов варьирует в ряду поколений, и каждый генотип имеет свою динамику этих изменений. Число мобильных элементов может как возрастать, так и снижаться, причём часто уменьшение копийности сменяется возрастанием в следующем поколении, то есть изменяется волнообразно. В генеративных тканях амплитуда колебаний копийности мобильных элементов значительно выше. Максимальный подъём числа копий одного элемента в абсолютных значениях был зарегистрирован для того же ретротранспозона Daniela у G13, где копийность поднялась с 18204 во втором поколении (S2) до 51491 в третьем (S3). Максимальный рост копийности одного элемента в относительных значениях был зарегистрирован для элемента Sabrina в генеративных тканях G14 S2-S3 где он составлял 672% за одно поколение. Элементы WIS, Wilma, и WHAM также увеличиваются в количестве в данном генотипе в S2-S3 поколениях.