Иммунобиологическая оценка состояния облученных животных и способы повышения радиорезистентности организма

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Иммунобиологическая оценка состояния облученных животных и способы повышения радиорезистентности организма

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Введение

Актуальность темы. Источники ионизирующих излучений рассматриваются как существенные факторы загрязнения окружающей среды, что связано с интенсивным развитием атомной промышленности и ядерной энергетики, с широким применением меченых атомов и ионизирующих излучений в биологии, в медицинской и ветеринарной практике. Все это и возможные аварии на предприятиях ядерного топливного цикла и их последствия вызывают необходимость проведения фундаментальных и прикладных исследований по проблеме влияния радиоактивных излучений на организм животных и человека. Данная проблема определяет ряд актуальных научных направлений, связанных с изучением механизма первичного биологического действия радиации в патогенезе острой и хронической лучевой болезни. С установлением величин предельно допустимых и переносимых доз внешнего и внутреннего облучения, с разработкой методов и способов повышения радиорезистентности организма и многие другие вопросы (Шарецкий А.Н., Абрамова М.Р., 2005; Аклеев А.В., Веремеева Г.А., Возилова А.В., 2006; Москалев А.А., 2008; P.W. Phipps et al., 2006).

Воздействие малых доз на организм животных и человека представляется наиболее возможным в современных условиях развития и применения радиационных технологий. О важности проведения исследований в этом направлении отмечается в решении V съезда по радиационным исследованиям (2006), на международных конференциях и работах зарубежных ученых (Алексахин Р.М., 2008; Cuttler J.M., 2007). Лучевые проявления хронического радиационного воздействия низкой интенсивности имеют сложный характер, так как длительное повреждение клеток сочетается одновременно с процессами репарации в них. Скорость протекания этих реакций определяется многими факторами - продолжительностью облучения, его характером, мощностью дозы, чувствительностью клеточных, тканевых систем, видом и возрастом животных и т.д. (Аклеев А.В., Алещенко А.В., Готлиб В.Я. и др., 2004; Ярмоненко С.П., 2006). Имеются противоречивые данные по механизму биологического действия пролонгированного воздействия радиации малой мощности (Жербин Е.А., Чухловин А.Б., 1989; Бурлаков Е.Б. и др., 1996; Насонова Е.А. и др., 2006; Бурлакова Е.Б. и др., 2006; Аклеев А.В. и др., 2006; Москалев А.А., 2008). В связи с этим данный вопрос является актуальным как по причине его важности, так и по причине недостаточной изученности.

Острые лучевые повреждения, вызываемые однократным облучением более предсказуемы, но, тем не менее, внутренний механизм их развития, обусловленный цепочкой последовательно развивающихся физических, физико-химических, химических, биологических преобразований также зависит от многих факторов, включая и условия облучения (Кудряшов Ю.Б., 2004). К таковым можно отнести внешнее и внутреннее облучение. В механизм биологического эффекта радиации вовлекаются все системы организма, и в первую очередь кровеносная и иммунная (Ярилин А.А., 1980; Петров Р.В., 1983; Орадовская И.В., 2006). При этом отдельные реакции, проявляемые со стороны этих систем, в зависимости от условий облучения, до сих пор остаются мало изученными.

Изучение механизма биологического действия радиации определяет следующую, не менее важную проблему, связанную с профилактикой и терапией лучевой патологии. (Решение V съезда по радиационным исследованиям, 2006). Формирование радиорезистентности организма много лет осуществлялось с помощью применения различных фармакохимических соединений (радиопротекторов), которые вводятся за небольшой промежуток времени до облучения, и часто обладают токсическим эффектом. Для преодоления этого недостатка большое развитие получает перспективное направление составления рецептур из комбинации двух или нескольких радиопротекторов, позволяющих снижать токсичность одного препарата с помощью другого (Владимиров В.Г. и др., 1988; Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б., 1996; Грачев С.А. и др., 1999). Для решения этой задачи есть основания обратиться к биологически активным веществам природного происхождения (Кудряшов Ю.Б., 1989; Кудряшов Ю.Б., Гончаренко Е.Н., 1999). Среди них особый интерес вызывают растительные препараты, и препараты, полученные из органов и тканей животных. Для повышения резистентности организма в животноводческой и ветеринарной практике широко применяется эраконд (Байматов В.Н., 1999; 1999; 2000; Таирова А.Р., 2001; Гизатуллина Ф.Г., 2002); тимоген (Жуков А.П., Биктеев Ш.М., 2001) и другие. Природные препараты, как правило, более доступны, не токсичны, а потому разработка способов и методов их применения для повышения радиорезистентности организма является актуальной.

Интерес к возможности формирования адаптации к повторному облучению в больших дозах проявляется в научных задачах вот уже несколько лет. Научные работы, проводимые в этом направлении, являются важными и существенными для настоящего времени, поскольку интерес к возможной адаптации живых организмов к воздействию радиации и к механизму ее формирования не ослабевает, а напротив возрастает (Решение V съезда по радиационным исследованиям, 2006; Аклеев А.В., 2009). Известны факты повышения радиорезистентности организма после предварительного воздействия низких доз радиации (Киршин В.А. и др., 1984). Вместе с тем следует отметить, что используемые для этой цели дозы излучений, вызывают кратковременные изменения в картине крови. Поэтому комплексный подход к разработке способов повышения радиорезистентности, включающий наряду с физическим фактором и применение биологических средств природного происхождения на сегодняшний день является наиболее актуальным.

Пребывание продуктивных животных на территории с повышенным радиационным фоном вызывает следующую не менее важную проблему, связанную с их рациональным использованием. При подобных чрезвычайных ситуациях целесообразен убой на мясо (Сивохин П.А, 1990; Портнов В.С., 1993). При массовом убое животных получение сырья и продукции животноводческого происхождения будет иметь важное социальное значение. В связи с этим изучение биологической ценности и безвредности мяса облученных животных представляется весьма актуальным.

Указанные причины явились побудительным мотивом для проведения данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить иммунобиологическое состояние животных при внешнем воздействии ионизирующего излучения, разработать способы повышения радиорезистентности организма, оценить санитарные и биологические качества мясной продукции облученных домашних животных.

Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние пролонгированного гамма-облучения в малых дозах низкой интенсивности на иммунобиологическое состояние животных.

2. Изучить влияние предварительного однократного гамма-облучения в малых дозах на формирование радиорезистентности у животных к последующему летальному воздействию ионизирующего излучения.

3. Изучить влияние предварительного облучения в сочетании с эракондом на формирование радиорезистентности организма.

4. Изучить радиозащитные свойства флоренты в сочетании с предварительным облучением.

5. Изучить комплексное радиозащитное действие предварительного облучения и тимогена.

6. Оценить по иммунобиологическим параметрам роль природных адаптогенов, в сочетании с предварительным облучением, на формирование радиорезистентности организма.

7. Изучить ветеринарно-санитарные показатели говядины, баранины и свинины, полученной от внешне облученных животных; определить биологическую ценность и безвредность мяса с применением нетрадиционных способов консервирования и хранения.

Научная новизна работы. Впервые изучено воздействие пролонгированного внешнего гамма-излучения в малых дозах низкой мощности на иммунобиологическое состояния крыс и свиней. Впервые изучены радиозащитные свойства биологических препаратов - эраконда, и тимогена в сочетании с предварительным облучением в малых и низких дозах. Впервые изучены радиозащитные свойства экстракта пихты сибирской как в отдельности, так и в сочетании с предварительным облучением. На примере облученных животных показано, что эраконд, флорента и тимоген обладают антиоксидантными, гемато- и иммуномодулирующими свойствами. Показана гистологическая структура внутренних органов крыс при пролонгированном воздействии внешней радиации в малых дозах и при воздействии летальных доз на фоне применения радиозащитных способов. Приводится ветеринарно-санитарная оценка свежего и консервированного мяса однократно и многократно облученных домашних животных с определением его биологической ценности на растущих крысятах и с использованием культуры инфузории Tetrahimena piriformis.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные новые данные расширяют теоретические представления о механизме биологического влияния ионизирующих излучений в условиях внешнего однократного и пролонгированного низкоинтенсивного облучения в широком диапазоне доз на критические системы организма.

Исследования влияния средств физической и биологической природы на антиокислительные процессы, возникающие в клетке в период первичной реакции на облучение, а также пролиферативной активности наиболее радиочувствительных тканей позволили обосновать и разработать способы профилактики острой лучевой болезни. Разработанные способы комплексной профилактики способствовали получению положительных клинических результатов, оцениваемых выживаемостью, средней продолжительностью жизни, а также показателями реакции клеток костного мозга и периферической крови, показателями неспецифической и специфической защиты организма, антиоксидантной системы. По результатам проведенного анализа исследуемых показателей были выделены наиболее информативные из них, которые необходимо учитывать при оценке радиозащитных свойств различных препаратов.

На основании результатов исследований разработаны:

1. Способ физико-биологической профилактики острой лучевой болезни (Патент РФ, №2307898, 2007).

2. Способ профилактики острой лучевой болезни лабораторных животных (Патент РФ, №2342099, 2008).

Разработанные способы относятся к экспериментальной медицине и радиологии и могут быть использованы в ветеринарной и медицинской онкологической практике, а также в неблагоприятных экологических условиях для повышения резистентности организма.

Результаты санитарно-биологических исследований продукции домашних животных позволили установить, что свежее мясо, полученное от многократно облученных животных и подвергнутое консервации, соответствует требованиям установленных ГОСТов, что является важным моментом в практике получения и сохранения животноводческой продукции в условиях, связанных с чрезвычайными ситуациями.

Полученные результаты исследований внедрены: в программу научно-исследовательских работ радиобиологического научного центра и учебный процесс АО «Медицинский университет Астана» республики Казахстан; ГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» и другие. Вошли в учебные пособия для ВУЗов биологического профиля «Элементы ядерной физики и химии в биологии и ветеринарии», «Радиационная экология»; в учебно-методические разработки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммунобиологическое состояние животных при длительном воз-действии низкоинтенсивного ионизирующего излучения в малых дозах.

2. Влияние предварительного однократного облучения в малых дозах на формирование радиорезистентности к последующему летальному воздействию радиации.

3. Радиозащитные свойства препаратов природного происхождения - эраконда, флоренты и тимогена.

4. Эффективность применения предварительного облучения в сочетании с препаратами природного происхождения на формирование радиорезистентности организма.

5. Антиоксидантные, иммуно- и гемомодулирующие свойства эраконда, тимогена и флоренты в условиях облученного организма.

6. Количественные и качественные показатели ветеринарно-санитарной и биологической ценности мяса, полученного от внешне облученных продуктивных животных в условиях длительного хранения с применением консервирующих рецептур.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на: Всероссийской научно-практической конференции «Прикладные аспекты радиобиологии» (Москва, 1994); региональной научно-практической конференции «Резервы увеличения производства и повышения качества сельскохозяйственной продукции» (Оренбург, 1994); региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1997); международном координационном совещании «Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных» (Воронеж, 1997); международной научно-практической конференции «Морфология и хирургия в практической ветеринарии и медицине» (Оренбург, 1999); международной научно-производственной конференции по вопросам ветеринарии и животноводства, посвященной 70-летию зооинжинерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научно-практической конференции «Проблемы регионального управления рисками на объектах агропромышленного комплекса» (Оренбург, 2002); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии» (Оренбург, 2003); международном симпозиуме «Социально-экономические, политические и экологические проблемы в сельском хозяйстве России и стран СНГ (Оренбург, 2004); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); международной конференции по патофизиологии животных (Санкт-Петербург, 2006); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); 3-й международной научно-практической конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий». (Оренбург, 2006); международной научно-практической. конференции ветеринарных терапевтов и диагностов, посвященной 90-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, проф. Кабыша А.А. «Современные проблемы ветеринарной терапии и диагностики болезней животных» (Троицк, 2007); международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации государственной программы развития сельского хозяйства на 2008-2012 гг.» (Оренбург, 2008); международной научно-практической конференции «Достижения современной ветеринарной науки и практики в области охраны здоровья животных» (Краснодар, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 50 научных работ (из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций), в том числе учебное пособие с грифом МСХ РФ (18,1 п.л.), 2 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста компьютерного набора, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа содержит 63 таблицы, иллюстрирована 48 рисунками. Список литературы включает 610 источников, в том числе 115 зарубежных авторов.

Содержание работы

гамма облучение иммунобиологический тимоген

Материал и методы исследований

Работа выполнена на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы и заразных болезней ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» в соответствии с государственным планом научно-исследовательских работ университета (№ государственной регистрации 01200105543).

Исследования проведены в экспериментальных условиях. Для достижения цели и поставленных задач в опытах были использованы белые нелинейные крысы, свиньи белой русской породы, овцы, крупный рогатый скот, культура инфузории Tetrahimena piriformis. Эксперименты проводили с соблюдением всех требований содержания лабораторных и домашних животных в условиях вивария. Лучевую патологию моделировали на гамма-установке ГУБ-20 с источником излучения Cs-137 при мощности дозы 0,08 Гр/мин при однократном и 0,39-1,2 мГр/час при пролонгированном облучении, а также на гамма-установке «Агат-С», с источником излучения Со-60 при мощности дозы 0,6 Гр/мин. Во всех условиях облучения неравномерность гамма-поля не превышала ±10%. Особенности методик отдельных исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.

Выбор для опытов крыс обусловлен общебиологической точкой зрения закономерностей развития радиобиологического эффекта. При одинаковых уровнях доз облучения организм крыс проявляет относительно малую степень различия радиационных эффектов, в частности, в уровнях эффективных доз для различных тканей, продолжительности жизни, изменений показателей иммунологической реактивности. Белые крысы имеют малые сезонные изменения биологических процессов. Выбор свиней в качестве экспериментальных животных обусловлен тем, что из числа сельскохозяйственных животных они отвечают требованиям большинству биологических, медицинских и ветеринарных исследований.

Общая схема исследований

Овцы и крупный рогатый скот и свиньи были необходимы для получения мяса с последующей его санитарной и биологической оценкой.

Используемая в работе культура инфузории Tetrahimena piriformis является альтернативным универсальным тест-объектом для определения биологической ценности сельскохозяйственных продуктов, в частности, для определения биологической ценности и безвредности мяса.

В работе изучали наиболее информативные показатели, характеризующие степень лучевой патологии и эффективность применяемых радиозащитных средств.

Количество эритроцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, содержание гемоглобина, общий белок и его фракции в периферической крови определяли общепринятыми в гематологии методами исследования (Карпуть И.М., 1986). Морфологическое изучение периферической крови осуществляли путем подсчета общего количества лейкоцитов, абсолютного и относительного содержания базофилов, эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов; лимфоцитарный индекс (ЛИ) и лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) - по методу, предложенному Я. Кальф-Калифом (Ронин В.С., Рабинович И.М., 1973). Общее количество клеток в костном мозге бедренной кости и подсчет абсолютного числа клеток различных генераций проводили по методу, предложенному П.Д. Горизонтовым, О.И. Белоусовой, М.И. Федотовой (1983). Количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови подопытных животных определяли, соответственно методами Е-PОK и ЕАС-РОК (Фримель Г., Краузе Х. и др., 1987).

Количественное определение иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Для постановки реакции использовали моноспецифические антисыворотки против IgG, IgМ, IgА, изготовленные научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии (Нижний Новгород).

Титры аутоантител к лизату собственных эритроцитов (ЛСЭ) определяли реакцией Уанье в модификации Н.Н. Клемпарсокй (1981). Количество бляшкообразующих клеток (БОК) в периферической крови, селезенке, печени, почках определяли реакцией Йерне в модификации Н.Н. Клемпарской и др. (1981).

Циркулирующие иммунные комплексы в сыворотке крови определяли по методу M. Digenon и др. (1987).

Содержание гормонов тироксина, трийодтиронина, инсулина определяли радиоиммунологическим методом, используя тест-наборы: РИА-Т₃-ПГ, РИА-Т₄-Г, РИА-ИНС-ПГ-¹²⁵I. Принцип метода заключается во взаимодействии меченного и исследуемого гормона со специфически связывающим реагентом ограниченной емкости. Радиометрию результатов проводили на гамма-спектрометре РИА-ГАММА. Расчет концентрации гормонов осуществлялся автоматически на основании существующих стандартов. Общую активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) определяли с помощью тест наборов «Лахема». Интенсивность перекисного окисления липидов по накоплению малонового диальдегида (МДА) и состояние антиоксидантной системы по активности глутатионредуктазы (ГР) в печени крыс определяли методами, предложенными М.И. Прохоровой (1982), В.Н. Ореховичем (1987). В ткани печени контрольных и облученных животных определяли количество белка, холестерина, общих фосфолипидов. Экстракцию липидов проводили по методу Фолча, разделяли липиды методом ТСХ на силикагеле/50 мк в системе гексан - эфир - уксусная кислота (73: 25: 2 по объему). Липидный фосфор определяли по методу Герлаха - Дойтике, холестерин и эфиры холестерина по реакции Либермана - Бурхарда, количество белка по методу Лоури. Все использованные методики приведены в работе И.К. Коломийцевой (1989).

Для повышения радиорезистентности организма животных использовали предварительное облучение в диапазоне доз 0,75 - 1,5 Гр за 28-30 дней до летального воздействия ионизирующих излучений в сочетании с природными адаптогенами - эракондом, флорентой и тимогеном.

Эраконд представляет собой экстракт люцерны посевной (Medicago sativa), полученный при гидробарометрической обработке наземной части растения с добавлением определенного набора микроэлементов. Препарат разработан в ТОО НВП «АПТ-Экология» (Екатеринбург). Густой экстракт люцерны, приготовленный в соответствии с ТУ 9337-004-12334249-97, представляет собой пластическую стерильную субстанцию темно-коричневого цвета, которая при высушивании твердеет. Вкус горьковатый, хорошо растворим в воде (допускается появление незначительного осадка).

Флорента - это экстракт зелени пихты сибирской выпускается во флаконах темного цвета 200 мл, по ТУ 8501-050-20680882-05. Изготовитель фирма «Биолит» г. Томск. В составе флоренты содержится комплекс растительных полифенолов, фитонцидные фракции, микроэлементы, витамины.

Тимоген субстанция - мононатриевая соль дипептида, состоящего из остатков глутаминовой кислоты и триптофана, выделенный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии из тималина. Препарат представляет собой бесцветный прозрачный раствор без запаха, совместимый со всеми лекарственными средствами.

Послеубойный ветеринарно-санитарный осмотр туш и внутренних органов проводили по общепринятой методике «Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов», 1988.

Органолептические исследования свежего мяса выполняли в соответствии с ГОСТом 72-69-79. Для консервации мяса использовали две рецептуры №1 и №2, разработанные во ВНИИВСГиЭ (Сивохин П.А., Колякова В.Я., Захарова Л.Л., 1992).

Из физико-химических показателей определяли рН в фильтратах мышечной ткани, активность пероксидазы, количество бактерий и степень распада мышечной ткани путем микроскопирования мазков отпечатков по ГОСТу 23392-78. Определяли содержание аминоаммиачного азота, летучих жирных кислот (ЛЖК). Ставили реакцию с сернокислой медью. Содержание азота в исследуемых пробах мяса определяли фотометрическим методом по Къельдалю.

Исследование мяса на инфузории Tetrahimena piriformis проводили согласно «Методическим рекомендациям для использования экспресс-метода биологической оценки продуктов и кормов», 1990. Каждая проба исследовалась трижды в три повторности для получения средних показателей. Оценка результатов велась путем подсчета выросших за четверо суток клеток инфузорий в десяти квадратах счетной камеры Фукса-Розенталя. Основным показателем явился коэффициент относительной биологической эффективности (ОБЦ) (Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов убоя сельскохозяйственных животных, 1977).

Дальнейшие исследования биологической полноценности мяса проводили на взрослых белых крысах и крысятах-отъемышах. Взрослые крысы-самцы содержались в течение 7 суток на рационе, белковая часть которого состояла полностью из исследуемого мяса, контролем служили крысы, содержавшиеся на общепринятом рационе. При определении коэффициента эффективности белка (КЭБ) тест-объектом служили крысята-самцы-отьемыши в возрасте 30 суток. Длительность опыта составлял 28 дней. Количество скармливаемого азота равнялось 180 мг на 1 голову в сутки. Безбелковая часть рациона состояла (%): сахар - 10,0; растительное масло - 8,0; клетчатка - 1,0, крахмал - 74,0; минеральная смесь -4,0; витаминная смесь - 1,0. Динамику раннего постнатального развития анализаторов слуха и зрения оценивали по времени отлипания ушной раковины с 1-х суток после рождения и открытия глаз с 13-х по 16-е сутки постнатальной жизни потомства. Взятие внутренних органов (печень, селезенка, сердце, почки, семенники) для определения веса и весовых коэффициентов проводили согласно «Методам биологической оценки продуктов животного происхождения», 1995. Для дальнейшего морфологического исследования сердце, печень и селезенку фиксировали в 10% формалине и 90% этиловом спирте.

Гистологические препараты готовили по общепринятой методике и окрашивали по Романовскому - Гимза. Для объективного суждения о реальности в степени достоверности результатов исследований цифровые данные подвергали статистической обработке по Стьюденту. Различия считали достоверными при уровне значимости Р<0,05. Набор и корректура текста, графические изображения выполнены с помощью программ Microsoft Word 6.0 и Microsoft Excel 5.0 в операционной оболочке Windows-XP. Распечатка произведена на принтере HP LaserJet1010.

Часть исследований выполнена на базе Всероссийского НИИ ветеринарной санитарии гигиены и экологии РАСХН.

Результаты собственных исследований

Влияние пролонгированного внешнего воздействия малых доз ионизирующей радиации на иммунобиологическое состояние животных

Изучение влияния пролонгированного внешнего гамма-воздействия малых доз ионизирующей радиации низкой интенсивности (0,39-1,2 мГр/час) проведено на белых беспородных крысах и свиньях белой русской породы.

Опыты на крысах. При постановке опыта из крыс-самцов было сформировано пять групп по 20 штук в каждой. Первая группа - нахождение под облучением 30 суток: вторая - 60; третья - 90; четвертая - 120 суток; пятая группа облучению не подвергалась и служила биологическим контролем. Исходная масса тела крыс всех подопытных групп составляла 160-165 г. По истечению указанных сроков пролонгированного облучения крыс выводили из-под облучения и при убое проводили гематологические, морфологические, иммунологические, биохимические исследования. Суммарная доза составила 0,28; 0,56; 0,84 и 1,2 Гр, соответственно

Наблюдение за общим состоянием крыс, находившихся под непрерывным облучением в течение 30 (1 группа), 60 (2 группа), 90 (3 группа) и 120 суток (4 группа) велось в течение всего эксперимента. Животные выглядели клинически здоровыми, адекватно реагировали на внешние раздражители, охотно поедали корм. Гибели крыс в течение эксперимента в подопытных группах и в группе контроля не отмечалось. В течение всего времени крысы не отставали в массе от своих аналогов группы контроля. При этом масса внутренних органов - печени, почек, селезенки находилась также в пределах контроля. Осмотр внутренних органов животных опытных групп, при убое их сразу после прекращения облучения, не выявил видимых патологоанатомических изменений.

В картине периферической крови отмечалась слабая эритропения, анемия и лейкопения в течение первых двух месяцев пребывания крыс под непрерывным облучением низкой интенсивности. Количество эритроцитов на 30 и 60 день составляло соответственно 86,1% и 80,5% к контролю; содержание гемоглобина - 87,8% и 86,7%, соответственно. К завершению хронического облучения, т.е. к 120 суткам, эти показатели приближались к контрольным величинам. Общее количество лейкоцитов через 30 дней уменьшалось на 19,8%, через 60 дней - на 18,6% по отношению к биологическому контролю. На 90-й и 120-й день их количество достигало нижних границ физиологической нормы и составляло, соответственно, 84,7%, 91,4% к биологическому контролю. В лейкоцитарной формуле изменения среди гранулоцитов носили переменный характер. Появлялся невысокий процент юных клеток во всех подопытных группах. Процент палочкоядерных нейтрофилов был выше контрольного в первой и второй подопытных группах, но не достоверно. Увеличивался процент сегментоядерных нейтрофилов. Более заметное снижение лимфоцитов (8,5%) приходилось на 30 сутки после облучения.

Заметных изменений в содержании IgG, IgM, IgA в сыворотке крови подопытных крыс выявлено не было. Подобная особенность была характерна и для циркулирующих иммунных комплексов (табл. 1).

Таблица 1. Содержание иммуноглобулинов G, M, A и ЦИК в сыворотке крови крыс

Изменения наблюдались в соотношении Т- и В-лимфоцитов. На 30 день после облучения количество Т-лимфоцитов снижалось на 28,2%; спустя 60 дней - на 27,8%; 90 дней - на 11, 6% по отношению к контролю. К 120 дню их содержание соответствовало значениям контрольных величин. В отличие от Т-клеток содержание В-лимфоцитов у подопытных крыс имело тенденцию к увеличению спустя 30, 60 и 90 дней. К 120 дню их количество находилось в пределах контроля. Таким образом, Т-лимфоциты периферической крови при низкоинтенсивном пролонгированном облучении крыс имели тенденцию к снижению, а В-лимфоцитов - к увеличению (рис. 1).

Рис. 1. Изменение содержания Т- и В-лимфоцитов у крыс при пролонгированном облучении

Титры аутоантител, со стороны антигенных субстанций собственных эритроцитов, селезенки, печени и почек, оценивались в 0,2-0,5 балла (реакция слабо положительная). Оценка в 0,5 балла, в большинстве случаев, была характерна для почек (табл. 2).

Таблица 2. Титры аутоантител (баллы) к аутологичным органам и тканям

Изучение влияния пролонгированного облучения в малой дозе низкой мощности на количество липидов в печени крыс показало, что количественные параметры общего белка в течение исследуемого периода имели отличия. Так спустя 30 суток содержание белка в печени подопытных крыс составило 196,0±15,5 мг/г при 203,8±12,6 мг/г в контроле. Спустя 60 суток 238,0±26,0 мг/г - при 206,0±9,1 мг/г в контроле; на 90 сутки содержание белка было по-прежнему повышенным (235,0±22,0 мг/г при 212,0+4,2 мк/мг в контроле). Через 4 месяца этот показатель не имел заметных отличий от контроля и составлял 226,0±14,0 мг/г. Содержание эфиров холестерина при облучении имело тенденцию к снижению. Заметные изменения произошли по этому показателю спустя 3 мес после облучения, когда уровень холестерина достоверно уменьшался и составлял 2,7±0,4 мкг/г, что было ниже контрольной величины на 30%. Через 120 дней он поднимался до уровня контроля (3,7±0,3 мкг/г при 3,3+1,5 мкг/г в контроле). Содержание общих фосфолипидов не отличалось от контрольной величины во все сроки исследования. Таким образом, после воздействия пролонгированного гамма-излучения, при мощности излучения 0,39 мГр/мин (1,8•10^-7 Гр/с) в печени облученных крыс через 1 мес (0,28 Гр) наблюдается уменьшение количества холестерина, что сохраняется через 60 (0,56 Гр) и 90 суток (0,84 Гр). Восстановление холестерина до нормальных количественных значений наблюдается через 120 суток непрерывного пролонгированного облучения.

Гистологическое изучение препаратов сердца, селезенки и печени показало, что структура органов сохранена, а выявленные изменения носят однотипный характер и не имеют существенных отличий от таковых контрольных животных.

Опыты на свиньях. Из свиней было сформировано три группы по пять голов в каждой: первая - нахождение под облучением при мощности дозы 0,39 мГр/час в течение 30 и 90 суток; вторая - при мощности дозы 1,2 мГр/час в течение 30 и 90 суток; третья группа облучению не подвергалась и служила биологическим контролем. Исследования крови у свиней проводили прижизненно на 30 и 90 сутки. Суммарная накопленная доза по срокам исследования составила 0,27; 0,81 Гр (первая группа); 0,87 и 2,61 Гр (вторая группа), соответственно. Весь период нахождения под непрерывным облучением состояние животных было удовлетворительным. Случаев падежа не наблюдалось. Масса тела спустя 30 и 90 суток у подопытных животных первой и второй группы не отставала от таковой биологического контроля. Содержание лейкоцитов в крови свиней, находившихся в течение 30 и 90 суток в условиях двух различных уровнях излучения, имело зависимость от мощности дозы. В первой группе подопытных животных при мощности 0,39 мГр/час количество лейкоцитов находилось в пределах физиологической нормы. Во второй группе (1,2 мГр/час) - этот показатель был ниже контрольных значений на 30 сутки. В лейкоцитарной формуле у животных первой и второй группы несколько увеличивался процент молодых форм нейтрофилов при относительном уменьшении сегментоядерных. К 90 суткам количество эритроцитов, содержание гемоглобина и гематокрит у подопытных свиней находился в пределах контроля (4,9±0,3•10¹²/л; 112,3±1,05 г./л; 40,2±0,16%), соответственно. Подобная закономерность наблюдалась в отношении содержания общего белка, альбуминов, г-глобулинов, иммуноглобулинов IgG, IgА, IgМ. Содержание ЦИК носило изменчивый характер, но не выходило за пределы контроля. Бактерицидная активность сыворотки крови находилась в пределах контрольных величин, также как и фагоцитарная активность лейкоцитов. Повышение титров антител к ЛСЭ наблюдалось, но не превышало 0,5 балла. Активность ферментов АСТ и АЛТ у свиней подопытных групп находилась также в пределах контроля.

Таким образом, длительное низкоинтенсивное -облучение крыс в течение 30, 50, 90, 120 дней и свиней в течение 30-90 суток не вызывает видимых клинических нарушений в общем состоянии животных и в микроструктуре внутренних органах, но вызывает определенные изменения в некоторых гематологических, иммунологических, биохимических показателях, чаще при мощности излучения 1,20 мГр/час. Эти изменения в большинстве случаев носят недостоверный характер и приходятся на начальный период нахождения животных под облучением.

Радиозащитные свойства предварительного облучения в малых и низких дозах в сочетании с препаратами природного происхождения

Данный этап работы посвящен разработке способов повышения радиорезистентности организма с использованием предварительного однократного облучения в сочетании с биологическими препаратами - эракондом, тимогеном и флорентой.

Радиозащитное действие предварительного однократного облучения в малых и низких дозах к последующему воздействию в летальной дозе. Для изучения влияния предварительного облучения на выживаемость и клинико-гематологические показатели повторно облученных летальной дозой животных в опыт были взяты белые беспородные крысы-самцы с массой тела 180-200 г. Из крыс было сформировано 5 групп, по 10 голов в каждой. Первая группа была облучена в дозе 0,25 Гр; вторая - 0,5 Гр; третья - 0,75 Гр; четвертая в дозе 1,0 Гр; пятая - предварительно не облучалась и служила контролем. Животных всех групп содержали в одинаковых условиях вивария. Через 28-30 дней после предварительного воздействия в указанных дозах животных подвергали облучению в дозе 9,0 Гр. Одновременно с ними была облучена в летальной дозе и группа крыс, без предварительного облучения, которая служила контролем однократного облучения (группа контроля облучения). Наблюдение за выживаемостью вели в течение 30 дней.

Начало гибели животных, облученных дозой 9 Гр, приходилось на шестые сутки после облучения; к 15 дню погибли 9 из 10 крыс. Внешние клинические признаки и ранняя гибель животных свидетельствовали о крайне тяжелой степени острой лучевой болезни.

В двух группах крыс, которые были предварительно облучены в дозах 0,25 и 0,5 Гр за 28-30 дней до летального воздействия 9,0 Гр, выживаемость составила 30-40%. Сроки гибели животных приходились на 9-18 сутки после облучения.

Выживаемость животных, предварительно облученных в дозе 0,75 - 1,0 Гр за 28-30 суток до облучения в летальной дозе, составила 40-50%, а средняя продолжительность жизни павших крыс - 25 суток. Внешние клинические признаки, отдаленная во времени гибель животных свидетельствовали о проявлении у них средней степени острой лучевой болезни. Таким образом, дозы предварительного облучения 0,75 Гр и 1,0 Гр показали лучшую выживаемость при повторном облучении животных летальной дозой.

Изучение гематологических показателей крыс в дополнительном опыте показало, что в период первичной реакции на облучение (через 24 часа) в крови крыс однократно облученных в дозе 9,0 Гр количество лейкоцитов достоверно уменьшалось и составляло 43,5% по отношению к биологическому контролю. В подопытной группе крыс, предварительно облученных в дозе 0,75 Гр, в этот период общее число лейкоцитов сохранялось на 24,6%; нейтрофилов и лимфоцитов на 28,7% и 23,2%; ядросодержащих клеток в селезенке на 22,9% выше контроля облучения, соответственно. Подобная закономерность отмечалась и в группе крыс предварительно облученных в дозе 1,0 Гр (рис. 2).

На седьмые сутки, которые приходятся на начало разгара острой лучевой болезни у крыс, количество лейкоцитов в группе животных, однократно облученных в дозе 9,0 Гр, составляло лишь 8,9% по отношению к биологическому контролю. Количество эритроцитов и содержание гемоглобина достоверно уменьшалось на 44,7% и 33,1%, соответственно.

Рис. 2. Динамика лейкоцитов и ядросодержащих клеток селезенки (ЯСКС) в период первичной реакции на облучение (первые сутки)

Рис. 3. Динамика клеток периферической крови и ЯСКС крыс в период разгара острой лучевой болезни (7 сутки)

Развивалась тромбоцитопения с достоверным снижением кровяных пластинок на 74,6% по отношению к значениям биологического контроля. Количество ядросодержащих клеток достоверно уменьшалось на 82,4% или в 5,6 раза (рис. 3).

На этом фоне в группе предварительно облученных животных в дозе 0,75 Гр количество лейкоцитов было в 3,6 раза больше по сравнению с однократно облученным контролем. Количество эритроцитов, тромбоцитов и содержание гемоглобина достоверно превосходило значения контроля облучения на 24,7; 31,7% и 21,2%, соответственно. Количество ядросодержащих клеток селезенки в данной группе превосходило таковые группы контроля облучения на 35,2% или в 3 раза. Такая же закономерность прослеживалась и в подопытной группе (1,0+9,0 Гр). Количественные значения лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, ядросодержащих клеток селезенки, содержание гемоглобина у защищенных крыс достоверно превосходили таковые группы контроля облучения в 2,8; 1,6; 2,1; 2,9 и 1,3 раза, соответственно.

Таким образом, предварительное облучение в дозах 0,75 и 1,0 Гр за 28-30 суток до воздействия ЛД_90-100/30 способствует достоверному сохранению количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина в крови и ядросодержащих клеток селезенки у крыс по сравнению с однократным их облучением в дозе 9 Гр. Такая закономерность прослеживается во все периоды острой лучевой болезни (первичная реакция на облучение, латентный период, разгар болезни, восстановление). Указанный временной интервал предварительного облучения, по нашему мнению, соответствует времени формирования основных защитных реакций организма.

Рис. 4. Титры антител к лизату собственных эритроцитов у крыс, облученных малыми и низкими дозами

При изучении влияния малых и низких доз предварительного внешнего воздействия ионизирующих излучений в диапазоне доз от 0,5 до 2,0 Гр на формирование аутоантител к лизату собственных эритроцитов и к гомогенатам различных органов прослеживалась дозовая зависимость. Слабоположительные реакции регистрировались при дозе 0,5 Гр; положительные в один балл - при дозах 0,75 и 1,0 Гр. Доза 2,0 Гр вызывала положительную реакцию, оцениваемую в два балла и более. Суточная динамика увеличения титров аутоантител приходилась на 5-15 сутки (рис. 4).

Динамика образования антителообразующих клеток в крови, селезенке, печени, почках имела прямую связь с динамикой образования титров аутоантител.

Влияние предварительного облучения в сочетании с эракондом на формирование радиорезистентности организма

Изучение влияния предварительного облучения в сочетании с эракондом на выживаемость повторно облученных летальной дозой животных проводилось с использованием г-излучения в диапазоне доз от 0,5-1,0 Гр и 10% раствора эраконда в дозе 5,0-7,5 мл/кг с водой и кормом за 5-10 дней до летального облучения в дозе 9 Гр. Вводимые дозы эраконда обоснованы нами экспериментально по их радиозащитному действию в диапазоне от 2,5-12,5 мл/кг. Наибольший радиозащитный эффект при ЛД_90-100/30 наблюдался при введении эраконда в объеме 5,0-7,5 мл/кг. Эти объемы препарата были взяты для разработки радиозащитного способа.

Таблица 3. Выживаемость белых крыс, облученных летальной дозой на фоне применения предварительного облучения и эраконда

Радиозащитное действие способа испытано в экспериментальных условиях на белых беспородных крысах-самцах при тяжелой степени острой лучевой болезни. В тесте 30-дневного наблюдения за клиническими проявлениями, выживаемостью и средней продолжительностью жизни павших животных в условиях применения различных доз облучения установлено, что наибольшим радиозащитным действием обладают дозы предварительного облучения 0,75-1,0 Гр в сочетании с эракондом в объеме 5,0-7,5 мл/кг (табл. 3).

Таким образом, результаты опытов на крысах в течение 30-дневного наблюдения за выживаемостью показали, что радиозащитный эффект наблюдается через 20-30 дней с начала применения способа, включающего предварительное воздействие г-излучения в диапазоне от 0,75-1,0 Гр и введения эраконда в объеме 5,0-7,5 мл/кг с водой и кормом ежедневно за 7-10 дней до облучения ЛД_90-100/30. При этом выживаемость составляет 70-80%.

Для изучения влияния предварительного облучения в дозе 0,75 Гр в сочетании с эракондом на клинико-гематологические показатели и на клеточность бедренной кости был проведен дополнительный опыт. При этом крысы были разбиты на группы: первая (9,0 Гр - облученный контроль); вторая (0.75 Гр + 9,0 Гр); третья (эраконд + 9,0 Гр); четвертая (0,75 Гр + эраконд + 9,0 Гр); пятая - биологический контроль.

В результате исследований установлено, что у большинства крыс первой группы, которая являлась контролем облучения 9 Гр, на третьи-пятые сутки отмечалась диарея, животные отказывались от корма, не адекватно реагировали на внешние раздражители, были вялыми, взъерошенными, грязными и неподвижными. На седьмые сутки вокруг глаз и носовых отверстий образовывались коричневые корочки, что свидетельствовало о выраженном развитии геморрагического синдрома. Гибель крыс начиналась на 8-е сутки и составила 90% при средней продолжительности жизни 9,6±2,3 сут.

Таблица 4. Показатели картины крови у подопытных крыс

У животных данной группы с первых дней после воздействия г-излучения в дозе 9,0 Гр резко снижалось количество лейкоцитов в крови. На седьмые сутки их количество достигало наименьших значений и насчитывало 0.6±0.07·10⁹/л (табл. 4).

У животных 2 группы на седьмые сутки после повторного воздействия гамма-излучения в дозе 9.0 Гр количество лейкоцитов было достоверно выше облученного контроля в 2 раза. Достоверная разница прослеживалась с эритроцитами и тромбоцитами. В этот период вялость крыс чередовалась с адекватной реакцией на внешние раздражители. Признаки диареи присутствовали, но непродолжительное время, признаки геморрагического синдрома были единичными. Выживаемость в течение 30-дневного наблюдения составила 50%.

У животных 3 группы количество лейкоцитов на пятые сутки было достоверно выше в 4,1 раза, тромбоцитов в 1,83, эритроцитов в 1,24 раза. Клинические признаки были схожи с таковыми животных группы предварительно облученных в дозе 0,75 Гр. Выживаемость составила 40-50%.

У крыс четвертой группы (0,75 Гр + эраконд + 9,0 Гр) клиническое проявление острой лучевой болезни было выражено на уровне средней и легкой степени тяжести. Животные в большинстве оставались чистыми, адекватно реагировали на внешние раздражители, охотно поедали корм. Случаи диареи были единичными и непродолжительными. Количество лейкоцитов было достоверно выше контроля облучения в 5,5, тромбоцитов в 1,96 и эритроцитов в 1,3 раза. Выживаемость при данном способе профилактики составляла 70-80%.

В результате исследований установлено, что общее количество клеток в бедренной кости необлученных крыс (биологический контроль) колебалось в пределах 131,0±2,7·10⁶. В период первичной реакции на облучение у крыс группы облученного контроля их количество достоверно уменьшалось до минимальных значений (рис. 5). Во второй, третьей и четвертой опытных группах общее количество клеток костного мозга было достоверно выше по сравнению с облученным контролем в 2,0; 2,05 и 2,55 раза, соответственно. Обращают на себя внимание процессы, происходящие на 8-е сутки. Более высокий темп восстановления был более выражен во второй, третьей и четвертой группах подопытных животных в 2,5; 2,55 и 2,8 раза, соответственно. Подобная закономерность прослеживалась и с разновидностями клеточных популяций костного мозга: эритроидными, нейтрофильными и лимфоидными клетками. Динамика популяции эритроидных клеток примерно повторяла таковую, характеризующую общее количество клеток бедренной кости, как в период первичной реакции на облучение, так и в период восстановления. Количество нейтрофильных клеток во второй и третьей группах превышало таковые контроля облучения примерно в 2 раза, а в четвертой - в 2,3 раза. На восьмые сутки процесс восстановления нейтрофильных клеток был более выражен у животных защищенных групп (рис. 5).

Рис. 5. Динамика общего числа клеток бедренной кости подопытных крыс: первая - (9,0 Гр - облученный контроль); вторая - (0.75 Гр + 9,0 Гр); третья - (эраконд + 9,0 Гр); четвертая - (0,75 Гр + эраконд + 9,0 Гр); пятая - биологический контроль

Таким образом, предварительное воздействие г-излучения в дозе 0,75 Гр за 30 суток до повторного облучения в дозе ЛД_90-100/30 формирует адаптивный ответ, который характеризуется улучшением общего состояния животных, слабым проявлением клинических признаков геморрагического синдрома, увеличением средней продолжительности жизни и как следствие 40-50% выживаемостью. Применение 10% эраконда за 5-10 дней до воздействия г-излучения в дозе 9,0 Гр также увеличивает выживаемость крыс до 40-50% и переводит тяжелую степень лучевой болезни в среднюю. Последовательное применение предварительного воздействия г-излучения и эраконда в указанных временных и дозовых диапазонах сохраняет 70-80% крыс, подвергнутых повторному воздействию радиации ЛД_90/30, облегчает их общее состояние с проявлением клинических признаков, характерных для легкой степени острой лучевой болезни. У животных предварительно облученных малыми дозами внешней радиации восстановление костномозгового кроветворения происходит более интенсивно по сравнению с однократно облученным контролем. Предварительное облучение и последующее применение эраконда, оказывает более выраженный положительный эффект на сохранение и восстановление кроветворных клеток у крыс, подвергнутых повторному облучению в летальной дозе. Различие в кроветворении выражается в более высоком содержании, как общего количества клеток, так и клеток эритроидного, гранулоцитарного и лимфоидного ряда в костном мозге бедренной кости крыс.

В опытах на облученных в дозах 0,5 Гр - 1,5 Гр крысах установлено корригирующее действие эраконда на функциональную активность щитовидной железы на 1, 7 и 30 сутки после облучения. Что касается временных изменений, то они были явными на 1 и 7 сутки после облучения указанными дозами без применения эраконда. Влияние эраконда прослеживалось при всех радиационных нагрузках и во все сроки исследования. Оно характеризовалось стабилизацией функциональной активности щитовидной железы, определяемой содержанием гормонов Т₃ и Т₄, в пределах контрольных значений.

Радиозащитные свойства предварительного облучения в сочетании с тимогеном

Радиозащитное действие предварительного облучения в малых дозах в сочетании с тимогеном на выживаемость животных, подвергнутых летальной дозе, заключалось в применении ионизирующего г-излучения и пептида тимуса. Активнодействующими началами в данном способе являются энергия г-излучения и тимоген. Профилактика острой лучевой болезни проводилась с использованием г-излучения в диапазоне доз от 0,75-1,5 Гр и введения тимогена с водой или кормом в дозе 10-12 мкг на одну крысу. Вводимые дозы тимогена, повышающие выживаемость, обоснованы нами экспериментально на крысах, облученных в дозе 9 Гр, при этом изучаемый диапазон введения тимогена составлял от 2-14 мкг/крысу.