Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

16.00.03. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ездакова Ирина Юрьевна

Москва 2009

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Верховский Олег Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поляков Виктор Филиппович

доктор медицинских наук, профессор Булычева Татьяна Ивановна

доктор биологических наук, профессор Емельяненко Петр Алексеевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита диссертации состоится _____ __________2009 г. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

Автореферат разослан _____ ______________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Грязнева Т.Н.

иммуноглобулин рецепторный иммунитет

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Иммунная система создавалась в процессе эволюции для распознавания биологических структур, опасных для жизни организма. В основе иммунных реакций лежит межклеточная кооперация трех основных популяций клеток: Т-, В-лимфоцитов и макрофагов. Эти клетки в различных комбинациях, на разных этапах иммунного ответа включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р.,2008). Принцип их действия основан на существовании рецепторов, которые могут быть связаны с клеткой или секретироваться в виде антител. Изучение рецепторных свойств и функций этих клеток предоставляет отличную возможность для оценки молекулярных факторов онто- и иммуногенеза.

В практическом аспекте оценка состояния иммунной системы основывается на количественной характеристике иммунокомпетентных клеток и антител, и является основой контроля эффективности и безопасности вакцин, иммунокорригирующих препаратов, использующихся в ветеринарии (Дамбаева С.В. и соавт.,2000, Обухова О.О. и соавт., 2004, Крапивина Е.В. и соавт.,2005, Донник И.М. и соавт.,2005, Крапивина Е.В. и соавт.,2006, Шахов А.Г и соавт,2006, Дегтярев В.П, 2006).

Следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных изучены недостаточно. В частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации. Ответы на эти вопросы будут способствовать разработке эффективных и безопасных вакцинных препаратов - основу специфической профилактики болезней животных.

В-, Т-клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами, были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation - символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы и характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Рабсон А.,2006, Ройт А.,2000, Бурместер Г.-Р,2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы обеспечивают иммунную защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток, способствуя многочисленным клеточно-функциональным связям с нервной, эндокринной и другими системами.

Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:

- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;

- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.

Среди мембраносвязывающих белков IgSF большой интерес представляют рецепторы находящиеся на поверхности Т- и НК-клеток (CD2), макрофагов (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR - антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы, определения эффективности применения вакцин и препаратов, используемых для химиотерапии и иммунопрофилактики (Ющук Н.Д., и соавт.,1994, Макарков А.И. и соавт., 1997, Иллек Я.Ю. и соавт.,2003, Кирюхин А.В. и соавт., 2003, Добротина Н.А. и соавт.,2005, Артюхов В.Г и соавт., 2006)

В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения в организме на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Дергачева Т.И. и соавт.,2000, Булычева Т.И. и соавт.,2000, Щеголева Л.С. и Добродеева Л.К.,2003, Haines D.M. и West K.H ,2005, Саидов М.З. и соавт.,2006, Высочин И.В. и соавт.,2006). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.

Цель настоящей работы - функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза животных с использованием разноплановых методов оценки Т- и В- систем иммунитета.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

- разработать способы получения препаратов для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и мышей;

- оптимизировать методы идентификации и количественного определения субпопуляций Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов с помощью реакции розеткообразования (Е-РО), определения фагоцитарной активности и иммуноцитохимического анализа с использованием моноклональных антител (РИФ и ИПО);

с помощью усовершенствованных методов:

- изучить функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза;

- дать функциональную и рецепторную характеристику IgM крупного рогатого скота, находящегося в растворимой и связанной (sIgМ) формах, в различные периоды онтогенеза;

- провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.

Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ 01.01.05 М (МП), 01.02.01 М ГНТП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественно определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», «Разработать методы иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител для оценки иммунного статуса животных и иммунологической эффективности различных биологических препаратов», 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».

Научная новизна.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.

Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.

На основании результатов проведенных исследований:

- Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.90 г.);

- Разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение №2277421 от 5 апреля 2005 г.).

- Разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение №2288008 от 27 ноября 2006 г.)

- Разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).

Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.

Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.

Определены количественные показатели Т- лимфоцитов и макрофагов, а также уровень экспрессии рецепторных белков IgSF на Т- лимфоцитах мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

Практическая значимость.

Практическая значимость исследования определяется тем, что систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные научно-методические рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии

На основании результатов проведенных исследований разработаны:

- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ№9388-0039-00008064-96, 1996 г;

- Временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии №13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;

- Методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.

Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:

- Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол№1);

- Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2);

- Методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2).

Получена серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.) и золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.)

Автор удостоен медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 и в 2008 гг. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000 г.; Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2001 г.; Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина, 2004; научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии», Москва, ВИЭВ, 2005 г.; секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2005 г.,2008 г.; Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов», Москва, 2006 г.;Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко, Москва, 2006 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института,2006 г.; 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS), Гдыня-2006 г., Сан-Себастьян - 2007 г., Эгмонд -2008 г.; Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», Москва, 2008 г.; Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ, 1995-2008 г.; межлабораторном заседании научных сотрудников ВИЭВ, 2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов;

- оценка содержания растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;

- функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных ILT - клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ в периодических изданиях, материалах научных конференций и международных форумах (12 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, в том числе монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных»).

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор, член-корр. РАСХН Ю.Н. Федоров, к.б.н. Т.А. Чеботарева, к.в.н. А.И. Жаданов, к.б.н. И.В. Третьякова , к.в.н. М.Н. Борисова. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.б.н., профессору О.А. Верховскому, д.б.н., профессору Л.П. Дьяконову, за организацию научных исследований д.в.н., профессору В.В. Субботину, научным сотрудникам ВИЭВ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 310 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 55 рисунками, включающими 43 микрофотографии. Список литературы включает 379 источника, из них 206 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко в период 1985-2008 гг.

В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии BALB/c, гибриды F1 (BALB/c х DBA/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, куры, серебряные караси, карпы.

Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы и периферическая кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о. Лисий. Образцы крови норок и SPF-кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.

Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.

При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО Ветзвероцентр).

IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученых препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Изофокусирование белков проводили в системе «Phast System» (Pharmacia, Швеция) по методике, предложенной фирмой. Иммуноблоттинг осуществляли в буферной системе H.Towbin et al (1979).

Рис. 1 Общая схема исследований

Гипериммунизацию кроликов породы Шиншилла с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А. Мисниковой и А.Ю. Самострельским.

Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).

Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии - РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Кондрахин И.П. и соавт., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (Лебедев К.А. и соавт.,1981).

Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (Горбачева Л.Д. и соавт., 1981).

Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест - ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток - ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию непрямой иммунофлуоресценции - РИФ (Новикова М.С.,1990).

Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с ILT- рецепторами

Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные - связанные с мембраной, ILT- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и клеток с ILT-рецепторами.

Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота

Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации г-глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IgG с примесями. В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G использован другой способ разделения белков - ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка.

При сравнении двух методов выделения IgG, нами установлено, что использование ионообменной хроматографии является более эффективным для получения данного изотипа иммуноглобулинов крупного рогатого скота.

Разработка способа получения IgА из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота

Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной.

Как видно на иммуноэлектрофореграмме (рис.2) в сыворотке крови и в молозиве доминирующим иммуноглобулином является IgG, при этом в крови концентрация IgA очень низкая (~ 1,0 мг/мл), а в молозиве - наиболее высокая из всех биологических жидкостей. В носовом секрете количество S-IgA значительно преобладает над иммуноглобулинами других изотипов и на иммуноэлектрофореграмме не видно других линий, кроме полос преципитации соответствующих IgA. В бронхоальвеолярных смывах также преобладают S-IgА, концетрация которых не превышает 0,24 мг/мл.

Рис.2 Иммуноэлектрофореграмма различных биологических жидкостей КРС. (В лунках - 1- сыворотка крови, 2- сыворотка молозива, 3 - носовой секрет, 4 - слезный секрет, 5 - бронхо-альвеолярные смывы, 6 - иммунохимически чистый sIgA; в траншеях - антисыворотка против г-глобулинов КРС)



Содержание IgA в слезах достаточно высокое, достигает 2,72 мг/мл, но как видно на иммуноэлектофореграмме в слезной жидкости присутствуют и другие белковые примеси. Таким образом, наиболее оптимальной биологической жидкостью для выделения S-IgA служат носовые секреты и сыворотка молозива.

Для выделения S-IgA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота носовой секрет в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR.

Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.

Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).

Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM рогатого скота

В 1990 г. нами была получена коллекция гибридом, секретирующих МкА к IgМ рогатого скота, открывшая перспективу разработки различных тест-систем на их основе (табл.1).



Таблица 1 Иммунохимическая характеристика моноклональных антител

Клоны	Изотип	Изоэлектрическая точка	IgG	IgA	IgM	Тип эпитопа
					Пентамер	Цепи
						м	L
С2	IgG1	6,85	-	-	+	-	-	конформационный
С4	IgG1	7,35	-	-	+	-	-	конформационный
G9	IgG1	7,35	-	-	+	-	-	конформационный
С11	IgG1	7,35	-	-	+	+	-	линейный
В3	IgM	8,45-8,5	-	-	+	+	-	линейный

Как видно из таблицы 1, полученные МкА взаимодействали только с IgM, не реагируя IgG и IgА. По результатам иммуноболоттинга, МкА клонов С₂, С₄ и G₉ взаимодействали только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере эпитопов на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. МкА клонов С₁₁ и В₃ взаимодействовали не только с нативной молекулой, но и с тяжелой полипептидной цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА. В результате проведенных исследований были отобраны МкА С₂ и G₉, взаимодействующие с нативной молекулой IgM и сохранившие титр в РДП 1:32 после лиофилизации.

На основе полученных МкА С₂ и G₉ приготовлены реагенты для количественного определения уровня IgМ рогатого скота в биологических жидкостях организма животных в РДП и мембранных IgM (sIgM) В-клеток методами РИФ и ИПО.

Выделение иммуноглобулинов G₁ из сыворотки крови мышей (Mus. Musculus)

Для проведения иммунологических реакций, таких как иммунодиффузия, иммуноферментное окрашивание клеток или иммунофлуоресценция, необходимо было получить моноспецифические антисыворотки к Ig мышей.

Исходным материалом для выделения иммуноглобулинов мышей служила сыворотка крови беспородных мышей, которую двукратно осаждали сульфатом аммония 50% насыщения при 4⁰С в течение 18-20 час. Осадок отделяли центрифугированием при 1000g (45 мин.) и растворяли в физиологическом растворе, после чего проводили диализ в фосфатном буфере. Осажденные г-глобулины концентрировали в ПЭГ-40000. Образцы при концентрации белка 10-20 мг/мл наносили на колонку с Sephacryl S-300.

Для дополнительной очистки полученных элюатов использовали ионообменную хроматографию на DEAE Sepharose 6B в градиенте NaCl. Иммунохимически чистый IgG₁ получали при 0,1 М NaCl. В результате были получены иммунохимически чистые препараты IgG₁ с концентрацией белка 1,6 мг/мл.

С использованием иммунохимически чистых препаратов IgG и IgA крупного рогатого скота и IgG₁ мышей были изготовлены моноспецифические антисыворотки, которые использовались в дальнейших исследованиях по определению уровня иммуноглобулинов и количества иммунокомпетентных клеток, несущих на своей поверхности иммуноглобулины (sIg-клеток) при различных формах иммунного ответа.

Применение различных вариантов реакции розеткообразования для определения функциональной активности иммуноцитов

Ведущая роль в реакциях приобретенного иммунитета принадлежит лимфоцитам, ответственным за специфическое распознавание патогенных организмов. Взаимоотношения лимфоцитов с антигенами и между собой осуществляется посредством рецепторов клеточной мембраны, которые с помощью соответствующих внутриклеточных молекул трансформируют антигенный сигнал в клеточные реакции.

Спонтанное розеткообразование (РО) основано на присутствии на мембранах лимфоцитов рецепторов к эритроцитам. У человека это адгезивная молекула CD2, для которой на эритроцитах барана существует соответствующий лиганд CD58 (LFA-3).

Параллельно с РО изучено наличие CD2- и CD19- (аналог розеткообразующих клеток с рецептором к третьему компоненту комплемента) молекул на мембране лимфоцитов мышей методом РИФ с использованием МкА к рецепторам CD2 и CD19 мыши (табл.2).

Таблица 2 Сравнительная оценка уровня Т- и В-клеток методами розеткообразования и иммунофлуоресценции (M±m)

№ п/п	Источники клеток	Е-РОК	CD2-клетки	Коэф. корр.(r)	ЗС-РОК	CD19-клетки	Коэф. корр.(r)
		Т-клетки		В-клетки
		Е-РО	РИФ	Е-РО/РИФ	Е-РО	РИФ	Е-РО/РИФ
1	Кровь	21,0±1,7	11,3±0,8	0,5*	11,6±1,2	13,2 ±0,9	0,9
2	Лимфатические узлы	54,5±2,2	33,3±1,6	0,97	34,0±1,5	13,5±1,0	0,99
	Тимус	26,5±0,8	20,7±1,0	0,67	9,1±0,3	4,5±0,6	0,83
4	Костный мозг	41,1±2,5	44,8±2,1	0,98	14,2±1,4	22,9±1,3	0,97
5	Селезенка	25,2±0,3	10,7±0,9	0,86	22,3±0,4	25,2±1,5	0,87

Примечание. Р<0,01, * - р<0,05, n=100

Как видно из таблицы 2 , содержание иммунокомпетентных клеток с Е-розеткообразующим рецептором выше в крови (21,0%), лимфатических узлах (54,5%) и селезенке (25,2%), чем уровень CD2-клеток (11,3%, 33,3%, 10,7% соответственно). Степень сопряженности между иммунологическими параметрами Т- и В-клеток, определяемых в РО и РИФ, установлена при высоких значениях коэффициента корреляции.

Оптимизированы методы антигенного розеткообразования (А-РО), теофиллиновый тест, реакция контактного взаимодействия тимоцитов и макрофагов (РКВ) на лабораторных животных, позволяющие изучать механизмы формирования иммунного ответа на антигены различной природы.



Разработка способа идентификации В-лимфоцитов

К важнейшим рецепторам В-клеток относятся sIg, специфичные к одному определенному эпитопу антигена. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации и плотности распределения sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. Возможно, что белки IgSF, функционирующие на поверхности мононуклеарных клеток (МНК) и в циркулирующей крови, образуют своеобразную систему иммунного контроля поверхности не только иммуноцитов, но и клеток нервной и эндокринной систем.

Для изучения локализации sIg клетки и определения количества В-лимфоцитов был оптимизирован метод иммунопероксидазного окрашивания (ИПО) клеток с использованием моно- и поликлональных антител к Ig крупного рогатого скота и мышей. Было показано, что высокочувствительный метод ИПО является оптимальным для детального исследования модуляции Ig-рецепторов, функционирующих как в мембранной (sIg) так и в цитоплазматической (cIg) формах. SIg, cIg и секретируемые (Ig) белки IgSF, являются также показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.

При постановке метода ИПО для раcщепления пероксидазы и визуализации реакции применяли 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК). При учете результатов к sIg-МНК относили лимфоциты с окрашенной мембраной, а к cIg-МНК - клетки с окрашенной цитоплазмой.

При апробации разработанного метода на мышах и анализе полученных результатов было установлено, что относительное содержание окрашенных клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - сIgМ, 27,5% - cIgG и 20,5% - сIgА, 10,3% лимфоцитов содержали sIgM-рецепторы. Эти данные подтвердили известный тезис о том, что костный мозг не только поставляет клетки-предшественники различных популяций лимфоцитов, но и одновременно является местом синтеза антител.

В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% МНК с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано 7,5% МНК с sIgM, 7,1% - sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IgG-рецепторы, являются В-клетками памяти.

В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Показано, что IgG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - «ринг» - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3%- «петч» - неравномерное распределение окраски, 5,2% - «кэп» - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - «петч +эндоцитоз» - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм иммуноглобулиновых рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. До 70% фолликулов лимфатического узла содержат зародышевые центры, состоящие, в основном, из пролиферирующих В-лимфоцитов, а на МНК преобладают IgG-рецепторы.

В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% МНК с sIgМ; 2,6% - sIgG; 3,8% - сIgА. Следует отметить, что IgA тимоцитов, спленоцитов, лимфоцитов костного мозга и лимфоидной ткани кишечника обнаружены только в цитоплазматической форме. Таким образом, согласно полученным результатам, уровень IgA-В-лимфоцитов превышает (3,8%) количество IgG-клеток (2,6%), что согласуется с данными о том, что основными клетками, синтезирующими IgA, являются В-лимфоциты кишечника (Conley M.E., 1987, Першин Б.Б. и соавт., 2001).

Больше всего В-лимфоцитов находится в костном мозге и лимфатических узлах. При этом, у мышей в клетках костного мозга преобладают cIg, что подтверждает его важную роль в синтезе антител.

В иммунных реакциях большое значение имеет функциональное состояние фагоцитов, в частности макрофагов. В крово- и лимфотоке постоянно циркулируют антитела, проникающие через стенку сосудов проходят в различные полости организма и взаимодействующие с клетками. Нами установлено, что на перитонеальных макрофагах мыши, полученных методом адгезии на пластике и тщательно отмытых от экзогенных иммуноглобулинов, присутствуют Fc-рецепторы как к IgG - 25,0%, так и к IgM - 23,0% и к IgA - 21,0%.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод, который впоследствии был использован для определения поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.

Динамика ILT - рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза

В ходе превращения стволовых клеток в лимфоциты, последние приобретают поверхностные антигены CD, которые отличают их от других клеток. Клетки-предшественники лимфоцитов проходят несколько стадий деления и созревания, взаимодействуя со своим микроокружением с помощью поверхностных гликопротеинов, участвующими в передаче сигнала. Активация Т-клеток возможна как по классическому (CD3-зависимому), так и альтернативному (CD2-зависимому) пути. Блокада CD-2-зависимого способа активации приводит к нарушению иммунных процессов (Талаев В.Ю., 1999). Поэтому уровень экспрессии данных ILT- рецепторов является функционально значимым в механизме формирования иммунного ответа.



Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза (in vivo и in vitro)

Иммунный ответ при вакцинации имеет ряд особенностей, определяемых спектром воздействия вакцины - стимулирующим или супрессирующим. Учитывая, что иммуногенез начинается с активации клеток, а именно со структурных изменений их мембран, представляет интерес определение модуляции адгезивных молекул иммунокомпетентных клеток в процессах первичного и вторичного иммунного ответа.

Известно, что при кратковременной инкубации лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты, происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных рецепторов лимфоцитов. В нашей работе метод стимуляции лимфоцитов in vitro (антигенное розеткообразование) был использован для оценки динамики уровня розеткообразующих рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза и определения индекса сдвига, показывающего активность иммунокомпетентных клеток.

Опытной группе белых мышей вводили подкожно по 0,2 см³ производственной вакцины против рожи свиней (Erysipelothrix rhusiopathiae) из штамма ВР (VR)-2 , контрольной - 0,2 мл физиологического раствора. Одну часть мононуклеарных клеток, полученных от этих групп мышей, инкубировали с вакциной, вторую - с физиологическим раствором в течение 30 мин. при t 37^оС. На 2, 7, 14 и 20 сутки после иммунизации проводили количественное определение розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов, индекса стимуляции (ИС), характеризующих влияние вакцины на активность МНК тимуса и селезенки мышей.

Результаты опыта показали, что введение вакцины обуславливает повышение количества Т- и В-клеток в тимусе и селезенке на протяжении всего срока исследования (табл.3).



Таблица 3 Процентное содержание Т- и В- лимфоцитов у мышей в процессе поствакцинального иммунного ответа (n=100)

Показатели	Сутки иммунного ответа
	0	2	7	14	20
Тимоциты, %: опыт.группа контроль	7,00,2 15,00,32	66,51,2 30,00,9	49,51,0 19,50,2	59,01,4 37,01,0	20,00,8 55,01,3
В-спленоциты, %: опыт.группа контроль	8,70,1 8,00,2	60,02,0 32,01,2	30,01,8 9,00,5	16,01,0 12,00,35	10,00,3 31,00,8

Примечание. p 0,05: - по сравнению с контролем, - между показателями с антигеном и без антигена.

Как видно из представленных в табл.3 данных, на 2, 7 и 14 сутки после иммунизации розеткообразующая активность лимфоцитов возрастает с 30,0% до 66,6% после инкубации с вакциной. На 20 сутки - инкубация лимфоцитов с вакциной не стимулирует розеткообразование, а наоборот, приводит к его угнетению (с антигеном 20,0%, без антигена - 55,0%).

Лимфоциты мышей контрольной группы не были активированы и короткая инкубация с антигеном in vitro не привела к изменению уровня Т- и В-лимфоцитов (ИС=1,0). Как видно из табл. 4, функциональная активность иммуноцитов наиболее выражена на 7 сутки иммунного ответа (ИС=3,3-1,9), а наименее - на 20-е (ИС 1,0).

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том, что иммуномодулирующее влияние вакцины in vitro на активированные лимфоциты выражается в изменении количества рецепторов на поверхности Т- и В-клеток. При этом показано, что 30-минутного воздействия вакцины на интактные лимфоциты недостаточно для изменения количества CD2-молекул и рецепторов к С₃-компоненту системы комплемента на поверхности клеток (ИС=1,0). Аналогичная обработка лимфоцитов, иммунизированных животных, существенно увеличивало количество розеткообразующих лимфоцитов (ИС1,0). Полученные показатели индекса стимуляции, позволяют характеризовать влияние вакцины на лимфоциты, так величина ИС1,0 свидетельствует о иммуностимуляции, а значение ИС 1,0 - о снижении показателей иммунного ответа.

Таблица 4 Динамика показателей индекса стимуляции (ИС) в нагрузочном тесте с вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

Показатели	Сутки иммунного ответа
	0	2	7	14	20
Тимоциты	0,40,02	2,20,2	2,50,2	1,60,3	0,40,02
Т-клетки селезенки	1,00,03	1,20,2	1,90,3	1,50,1	0,70,03
В-клетки селезенки	1,00,03	1,90,3	3,30,5	1,30,1	0,30,01

Примечание. - p 0,05, n=100.

Таким образом, вакцина, используемая в данном эксперименте, способна модулировать экспрессию CD2-молекул и рецепторов к С₃-компоненту системы комплемента. Этим подтверждается важная роль CD2-рецепторов Т-лимфоцитов в клеточном иммуногенезе, как в качестве адгезивных молекул, так и молекул альтернативной активации Т-клеток.

По результатам эксперимента установлена положительная корреляция между количеством розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов (r=0,84), а также количеством В- и Т-клеток селезенки (r=0,89). Высокие значения коэффициентов корреляции характеризуют сильную степень сопряженности между иммунологическими параметрами, что подтверждает существование межклеточной кооперации основных популяций лимфоцитов в процессе иммуногенеза. Параллельно показано, что наличие сильных корреляционных взаимосвязей свидетельствует об активации иммунной системы на фоне вакцинации.

Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации

В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК).

С целью изучения взаимосвязи между розеткообразующей активностью Т-лимфоцитов и функциональной способностью АПК взаимодействовать с тимоцитами, использованы два варианта реакции розеткообразования - лимфоцитов с эритроцитами барана и тимоцитов с макрофагами (реакция контактного взаимодействия макрофагов (РКВ). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериального и вирусной этиологии. В процессе иммунного ответа проводили исследования изменений адгезивных свойств перитонеальных макрофагов и рецепторной активности Т-клеток лимфоидных органов у беспородных и линии BALB/c мышей. Определяя количество эритроцитов барана (ЭБ) на поверхности клетки, лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные -многорецепторные и неполные, малорецепторные. Клетку считали малорецепторной (мРОК), если она присоединила от 1 до 3 ЭБ, а если 6 - 9 ЭБ - многорецепторной (МРОК). Также определяли количество высокоаффинных Т-клеток и их корреляцию с показателями функциональной активности антигенпрезентирующих клеток (макрофаги) в процессе поствакцинального иммунного ответа.

Результаты исследований показали, что адгезивная активность перитонеальных макрофагов зарегистрирована на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-е сутки после введения вирусных антигенов (табл.5).



Таблица 5 Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе поствакцинального иммунного ответа

Группы животных	Сутки иммунного ответа
	0	1	2	3	7	10	14	21
1 (Т/ПМ)	26,0± 0,5	52,0± 0,7	70,3± 1,0	200,7± 12,0	21,0± 0,3	40,1± 0,4	21,0± 0,8	20,0± 0,7
2 (Т/ПМ)	30,5± 0,9	34,8± 0,32	212,3± 30,4	70,7± 0,91	56,1± 0,3	260,3± 35,9	125,5± 15,8	26,2± 0,4

Примечание. p 0,05, n=100, Т/ПМ - число адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа - животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа - животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2

По-видимому, этот процесс обусловлен различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов в макрофагах.

Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2 сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдается резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, сопровождающейся морфологическими и биохимическими изменениями клеток (рис.3).

Рис. 3 Реакция контактного взаимодействия перитонеальных макрофагов с тимоцитами (х600)

В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10-14 сутки) обусловлен выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.

В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75% , контроль - 15%), число которых на 2 сутки снижается вдвое. На 7 сутки поствакцинального иммунного ответа их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль - 11%) и тимусе (60,0%, контроль - 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14 суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).

Таким образом, на изменения клеточной поверхности макрофагов лабораторных мышей вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала внутрь Т-лимфоцита. Возрастание CD2-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.

В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирусную вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках только в костном мозге на 14 сутки после иммунизации. Это подтверждает различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены.

Рис. 4 Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи свиней

Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов в этот период была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-е - вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами в функционировании иммунной системы.

В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что начальная фаза иммунного ответа характеризуется умеренной экспрессией CD2-рецептора во всех лимфоидных органах, кроме костного мозга, тогда как завершившие стадию дифференцировки иммунные лимфоциты отличались наличием на поверхности значительного количества CD2-молекул, что, по-видимому, связано с процессом стабилизации межклеточных взаимодействий (рис.4).

В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62). Сопряженность между данными параметрами объясняется поступлением части активированных тимоцитов в циркуляцию и перемещением их во вторичные лимфоидные органы.

Значительное повышение уровня высокоаффинных Т-клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Прямая корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о межклеточной кооперации Т-лимфоцитов этих органов в иммуногенезе. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифических лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию.

Можно предположить, что отрицательная корреляция показателей адгезивной активности спленоцитов и макрофагов (r= -0,64), объясняется различными функциями регуляторных и эффекторных пулов иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа.

Таким образом, адгезивные свойства мембран иммуноцитов играет важную роль в формировании адекватного иммунного ответа. Известно, что именно система контроля над рецепторной активностью клеток в процессе эволюции, преобразовалась в систему иммунологического надзора, а именно в иммунную систему млекопитающих.

Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа

Развитие и созревание В-лимфоцитов зависит от экспрессии пре-BCR (рецептор В-клеток для антигена), сформированного из молекул IgSF - sIgM и CD79, а также IL-7Rб при отсутствии которых снижается количество периферических В-клеток. Для выбора наиболее адекватного метода определения sIg-клеток животных были изучены различные реакции идентификации. Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест.

Рис. 5 Динамика содержания В-лимфоцитов селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1, 3, 7, 14 сут. - первичный иммунный ответ; 1, 7, 14, 20 - вторичный. I- опыт; II-контроль

Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней в дозе 0,2 см³ двукратно с интервалом 30 суток. Контрольным животным вводили 0,2 см³ физиологического раствора. Процентное содержание В-лимфоцитов определяли в селезенке в различные сроки первичного и вторичного иммунного ответа (рис.5).

Как видно из данных на рис. 5, при первичном иммунном ответе увеличение процентного содержания В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль - 12,0%) , и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии sIg на клетках. Помимо количественного определения В- лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию IgG₁ - основного изотипа иммуноглобулинов (рис.6).

Рис. 6 Уровень IgG1 в надосадочной жидкости МНК селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1, 3, 7, 14 сут. - первичный иммунный ответ; 1, 7, 14, 20 - вторичный

В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток (рис.5) и уровень IgG₁ (рис.6), тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.

В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются Ig-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Этим подтверждается изменения количества В-клеток с sIg в процессе вакцинации. Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные результаты динамики sIg-клеток методом ЦТТ подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки в иммуногенезе.

Корреляционный анализ показателей ILT-рецепторных клеток при введении иммунотропных препаратов

Известно, что иммунотропные препараты широко используются для профилактики вторичных иммунодефицитных состояний животных. В соответствии с задачами нашей работы, дальнейшим этапом исследований был анализ модификации мембранных структур иммуноцитов и определение корреляционной взаимосвязи показателей ILT-рецепторных клеток под воздействием препаратов, наиболее широко используемых в ветеринарии в качестве иммуномодуляторов.

...