Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных

В экспериментах использованы мыши линии BALB/c, F1 (BALB/c x DBA/2) и б\п белые мыши массой 16-18 г. Животным вводили однократно, подкожно следующие препараты: 1 группе - селенопиран (0,1 см³), 2 - риботан (0,2 см³), 3 - нуклеинат натрия (0,2 см³), 4 - физиологический раствор (0,2 см³). Определение иммунологических показателей проводили на 1-е и 7-е сутки после инъекции препаратов (табл.6).



Таблица 6 Влияние иммунотропных препаратов на показатели клеточного иммунитета

Показатели	Срок исследования (сутки)
	1	7	1	7	1	7	Контроль
	Селенопиран	Риботан	Нуклеинат Na
Т-клетки крови %	19,81,2	23,70,7	34,00,7	59,01,2	71,62,0	63,01,6	10,00,7
Т-клетки лимф. узлов, %	15,30,9	25,50,7	18,00,9	40,52,0	53,51,6	50,01,7	10,50,2
Т-клетки тимуса %	21,80,7	17,31,2	22,00,9	43,51,5	42,71,2	67,01,9	26,50,8
Фаг.активностьПМ %	10,41,0	12,80,9	24,40,8*	36,91,0*	20,00,6*	10,50,07	9,20,3
Фаг. индекс	2,50,04	3,70,04	7,30,2*	6,60,05*	4,00,07	4,20,1	3,20,06
Лейкоциты тыс./мкл	3,20,02	3,90,3	4,50,4	5,20,07	5,70,1	5,60,03	4,20,05
Лимфоциты %	60,61,6	44,91,5	34,11,2	71,71,9	41,01,6	58,61,9	49,00,7
Нейтрофилы %	21,60,9	50,71,8	54,80,9	23,60,7	40,61,4	34,21,4	41,20,4
Моноциты %	7,00,8	4,10,7	10,10,5	4,50,3	18,00,7	10,00,2	9,60,1

Примечание: p 0,05: - по сравнению с контролем

С целью характеристики межклеточной кооперации лимфоцитов и определения корреляционной взаимосвязи между иммунологическими показателями на фоне введения иммунотропных препаратов, были установлены коэффициенты корреляции между иммунологическими показателями. Так при введении селенопирана и нуклеината натрия корреляционная взаимосвязь между числом Т-клеток крови и тимуса, тимуса и селезенки отсутствует, а между количеством Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов - имеет положительное значение (r=1,0). На высоком уровне значимости (р<0,01) наблюдалась корреляционная зависимость между розеткообразующей активностью клеток крови, тимуса и лимфатических узлов на фоне введения риботана (r=0,98).

Из результатов эксперимента следует, что степень сопряженности между исследуемыми иммунологическими показателями при введении иммунокорректоров различна. Однако во всех группах постоянно сохранялась прямая корреляция показателей Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов (r=0,89), абсолютного числа розеткообразующих лимфоцитов крови и лейкоцитов (r=0,95), содержания лимфоцитов и Т-клеток тимуса (r=0,9). Одновременно наблюдалась сильная обратная корреляционная взаимосвязь между содержанием лимфоцитов и нейтрофилов (r=-0,9), абсолютным числом лейкоцитов и моноцитов (r=-0,88), уровнем розеткообразующих тимоцитов и количеством нейтрофилов (r=-0,9), между содержанием моноцитов и уровнем Т-клеток периферической крови.

Таким образом, можно считать, что применение иммунотропных препаратов сопровождается образованием функциональных связей между степенью розеткообразующей активности ILT-рецепторных клеток крови и лимфатических узлов и количественным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов.

Наши данные согласуются с результатами, полученными Михайленко А.А. и соавт.(2002), по корреляционному анализу и установлению корреляционных констант иммунной системы. На основании проведенных исследований, мы предлагаем диагностический алгоритм при оценке эффективности иммунотропных препаратов, включающий следующие показатели:

1. Положительная корреляция между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов ( 0,7);

2. Положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов;

3. Отрицательная корреляция между показателями количества нейтрофилов и Т-клеток тимуса ( -0,7)

Разработанная схема позволяет определить уровень корреляционной связи по трем соотношениям, которые показывают адекватную реакцию иммунной системы на вводимые препараты.

Параллельно с определением показателей клеточного иммунитета, методами РДП и РИД, определяли содержание иммуноглобулинов в крови и надосадочной жидкости суспензий клеток тимуса, селезенки и лимфатических узлов. Результаты исследований показали, что иммунотропные препараты риботан и селенопиран стимулировали синтез IgG₁ и IgG2a. При этом концентрация IgG₁ в надосадочной жидкости суспензии клеток селезенки на 7 сутки после их применения составила 2,0 и 2,3 мг/мл (в контроле - 1,6 мг/мл).

Таким образом, в результате проведенных исследований, установлено, что при введении иммуномодуляторов изменяется розеткообразующая активность Т-клеток; сопровождающаяся антителогенезом, что подтверждает активацию всех звеньев иммунной системы.

Характеристика растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза

В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия cIgM на поверхности клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе. Модуляция количества sIg или блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно sIg связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.

Нами были изучены формы локализации sIg на поверхности В-клеток в периферической крови у телят и взрослых животных в рамках исследования механизмов клеточной активации и анергии в процессе онто- и иммуногенеза. Количество sIgM-лимфоцитов определяли методами ИПО и РИФ; уровень IgM, IgG, IgA - в РИД. В исследованиях использованы МкА и поликлональные антитела к Ig крупного рогатого скота, полученные на первом этапе исследований.

Формы локализации рецепторов sIgM- лимфоцитов в периферической крови коров

В опытах использовали периферическую кровь крупного рогатого скота черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет. Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволило определить количество sIgM-клеток, изучить модуляцию рецепторного аппарата в процессе дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку. Различные формы распределения sIg на поверхности В-клетки продемонстрированы на рис.7.

Известно, что sIgM присутствует на мембране практически всех субпопуляций В-клеток, но с различной плотностью, играющей важную роль в дифференциации клеток (Сидорова Е.В.,2006). Так негативная и позитивная селекция В-лимфоцитов зависят от плотности антигенных рецепторов на клеточной поверхности. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации рецептора, но и его движением в мембране клетки. На поверхности клетки в результате этого рецепторы могут собираться в форме «петч» (неравномерное распределение sIg по периметру клетки) и «кэп» (скопление sIg на одном из полюсов клетки) с последующим погружением их в цитоплазму - эндоцитоз (рис.7б).

Подобно другим поверхностным белкам, sIg свободно перемещаются в билипидном слое плазматической мембраны клетки и при образовании комплекса с антигеном концентрируются на одном из полюсов клетки («кэппинг»- эффект рис.7-а,б). Виноградова Т.В. и др.(1995) отмечали, что основной формой расположения sIg на поверхности В-лимфоцита человека является «петч»/эндоцитоз (65%).

В результате проведенных исследований нами установлено, что В-клетки в периферической крови коров с окрашенной мембраной в форме «петч»/эндоцитоз составляют 68,9±3,9%, «петч» - 15,0±3,3% (рис.7-в), «ринг» (равномерное распределение sIg по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%.

Исследование форм локализации sIg представляет теоретический и практический интерес, поскольку под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов, изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита (Артюхов В.Г.и др.,2006; Новиков В.В., 2007).

а б

в г

Рис. 7 Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов. а,б - «кэп», эндоцитоз, в - «петч», г - «шеддинг»

Образование «кэпов» на мембране лимфоцита способствует оптимальному концентрированию иммунных комплексов на одном из полюсов клетки для образования кластеров, подвергающихся эндоцитозу.

Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. sIg взаимодействуя с антигеном, посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации.

Помимо механизма поглощения лигандосвязанных рецепторов показан феномен сбрасывания рецепторов (шеддинг) (рис.7-г). Кластеры, состоящие из агрегированных комплексов антиген/sIg на одном из полюсов клетки, отделяются от поверхности клетки в окружающую среду. Процессы эндоцитоза и «шеддинга» являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о присутствии в периферической крови крупного рогатого скота В-клеток с различной локализацией поверхностных иммуноглобулинов. Основной формой распределения sIg на мембране В-лимфоцита является «петч»/эндоцитоз.

SIgM-клетки и IgM-антитела в развитии иммунной системы у телят

Важной задачей наших исследований является разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми Ig, появляющимися в цитоплазме В-клетки, являются тяжелые цепи IgM (м-цепи).

В эксперименте использовали периферическую кровь телят (n=15). Для постановки метода ИПО к взвеси лимфоцитов (1-2х10⁶ кл/мл) добавляли 1-3% раствор лимонной кислоты, отмывали пять раз в 0,2 М фосфатно-cолевом буфере (PBS) рН 7,2 и инкубировали с 10-15% сывороткой крови лошади в RPMI-1640 в течение 60 мин. при 22⁰С. Повторно отмывали в РВS. Затем 20 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали, фиксировали (ацетон : этанол) и добавляли раствор МкА к IgМ рогатого скота в рабочем разведении.

Далее клетки отмывали 3 раза в РВS, высушивали и наносили антитела к Ig мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НПЦ «МедБиоСпектр). После отмывки и инкубации клетки на предметных стеклах обрабатывали AEC, промывали и высушивали. Клетки, специфически окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами (рис.8).



Рис. 8 sIgM-клетки периферической крови телят, окрашенные иммунопероксидазным методом (х900)

При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что клетки периферической крови телят, экспрессирующие sIgM, составляют 19,2%. Кроме того, в результате иммуноцитохимического анализа в крови обнаружены сIgM- клетки, которые не окрашиваются по периметру из-за отсутствия sIg (рис.9). Такие клетки могут быть пре-В-клетками с цитоплазматическими м-цепями или плазматическими клетками, секретирующими IgМ.

Рис. 9 cIgM-клетки (цитоплазматическая форма) периферической крови крупного рогатого скота (х900)

Таким образом, установлено, что в периферической крови телят присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки. Основные показатели, характеризующие sIgM-клетки и IgM-антитела (секретируемая форма IgM) В-системы иммунитета телят приведены в табл.7.

Таблица 7 Показатели В-системы иммунитета у телят

	В-лимфоциты (%)*	sIgM-клетки (%)**	Концентрация IgM (мг/мл) ***	Индекс IgM/В-клетки
Mm, n=15	12,00,5	19,20,8	0,920,03	0,0650,01

Примечание: p0,05, * - ЗС-РОК - CD19; **- ИПО; *** - РИД

Для повышения информативности иммунологических исследований в таб.5 приведен индексный показатель гуморальной системы телят по соотношению уровня IgM к количеству В-клеток. Согласно концепции Петрова Р.В. и соавт. (1995), постулирующей о взаимосвязи всех компонентов иммунной системы и изменение сбалансированности отдельных ее звеньев в условиях патологии, индексные показатели более адекватно отражают нарушения в иммунитете и повышают диагностическую значимость иммунологического мониторинга.

Динамика Ig и ILT-рецепторных клеток у стельных коров

Одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики является проблема профилактики бесплодия и получение жизнеспособного молодняка. Успешное ее решение основано на знании механизмов регуляции репродуктивной функции материнского организма в период плодоношения. Известно, что иммунная система организма во время беременности вместе с нервной и эндокринной системами определяет нормальное развитие плода и рождение здоровых телят. Поэтому оценка показателей иммунного статуса и изучение количественной динамики параметров иммунной системы стельных коров представляет значительный интерес как для характеристики взаимодействия между плацентой и иммунной системой, так и для разработки практических приемов коррекции воспроизводительной функции животных.

Опыт проводили на двух группах коров, изначально подобранных по принципу аналогов (n=20). Первая группа включала коров со сроком стельности 3-4 месяца, вторая - нестельных коров. Началом беременности у коров считали день последнего осеменения. Иммунологические исследования проводили двукратно с интервалом 2 месяца.

Поскольку в наших исследованиях на лабораторных животных установлено, что количество розеткообразующих клеток коррелирует с количеством CD2-лимфоцитов, определенных методом РИФ, на высоком уровне значимости (р<0,01), то на этом основании для количественного определения Т-клеток был использован метод розеткообразования (рис.10).

Рис. 10 Т-клетки периферической крови крупного рогатого скот, реакция розеткообразования (х900)

Количество В-клеток определяли в РИФ. При постанове реакции 100 мкл взвеси МНК (0,5х10⁶кл/см³) периферической крови обрабатывали 1,0%-3,0% раствором лимонной кислоты, затем центрифугировали в РВS и инкубировали в блокирующем растворе. После отмывки клетки помещали на предметное стекло, высушивали и фиксировали в растворе ацетона с метиловым спиртом.

Рис.11 IgM-клетки периферической крови крупного рогатого скота, реакция иммунофлуоресценции (х600)

Далее к фиксированным клеткам добавляли МкА к IgM рогатого скота (1:100). В качестве контроля на предметные стекла вместо МкА вносили 1%-ный раствор БСА. Клетки инкубировали, отмывали в PBS и добавляли FITC-конъюгат (НПЦ «МедБиоСпектр»). После инкубации и отмывки препараты просматривали под микроскопом (х600), используя 50% раствор глицерина в качестве иммерсионной среды. Учитывали светящиеся клетки в течение 24 часов после постановки реакции (рис.11).

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом РИД. Результаты комплексных исследований приведены в табл.8.

Таблица 8 Динамика иммунологических показателей у стельных коров

Показатели	Группы животных
	1	2	Контроль - 1	Контроль - 2
Т-клетки,% абс.(х109/л)	32,6±1,1 1,7±0,1	42,8±2,5 2,8±0,3	28,6±2,1 1,8±0,09	31,0±3,2 1,6±0,05
В-лимфоциты,% абс.(х109/л)	26,8±4,5 1,0±0,2	29,2±1,9 1,5±0,3	25,3±2,6 0,97±0,5	26,2±2,0 1,0±0,7
IgM мг/мл	2,3±0,4	3,5±0,5	2,3±0,1	3,1±0,4
IgGмг/мл	21,6±1,0	26,0±1,6	19,7±2,2	20,7±3,3
IgAмг/мл	0,75±0,3	0,8±0,2	1,0±0,5	1,3±0,6

Примечание. p 0,05. 1 - группа коров со сроком стельности 3-4 мес., 2 - группа коров со сроком стельности 5-6 мес. Контроль 1 и 2 - средние показатели нестельных коров с интервалом 2 мес.

Системные изменения иммунитета при стельности, в первую очередь, зависят от продукции гормонов и от иммунорегуляторного влияния плаценты. При десмохориальном типе плаценты, с увеличением срока стельности у коров, эпителий ворсин и крипт слущивается, кровеносная система плода отделена от сосудов матери только соединительной тканью, что сказывается на функционировании плацентарного барьера. Благодаря такому строению, плацента коров не пропускает через клеточные слои из крови матери молекулы Ig, которые передаются теленку постнатально с молозивом.

Анализ данных, приведенных в табл.6, свидетельствует о том, что в крови коров в период с 3-4 мес. до 5-6 мес. стельности увеличивается уровень IgG, которые путем транссудации поступают в молочную железу и постнатально с молозивом передаются теленку. В передаче IgG из крови в молочную железу особая роль принадлежит Fc-рецепторам на поверхности эпителиальных клеток, а трансэпителиальный переход IgG в молочную железу достигает максимального значения за 2-3 недели до отела. В эти же сроки у стельных коров повысилось как относительное, так и абсолютное количество Е-РОК в периферической крови. Данная тенденция наблюдалась также в контрольной группе, но была менее выражена. Одновременно зарегистрировано незначительное повышение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов, по-видимому, связанное с увеличением содержания иммуноглобулинов в периферической крови стельных коров.

Иммунная толерантность при беременности обусловлена продукцией блокирующих антител, вызывающих модуляцию иммунного ответа. Клеточные рецепторы для IgG - FcгR, экспрессируют макрофаги, НК-клетки, некоторые Т-клетки и нейтрофилы. Мономерный IgG связываясь с Fc-рецепторами иммунокомпетентных клеток может изменять их биологическую активность. Возможно, что увеличение в крови стельных коров концентрации IgG обусловлено выполнением им функции антител, участвующих в супрессии иммунного ответа на антигены плода.

Необходимо отметить, что в оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи. Положительная корреляция уровня ранних (IgM) и поздних (IgG) иммуноглобулинов, является критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей, как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при беременности (табл.9).

Таблица 9 Корреляция иммунологических показателей у коров

Показатели	Стельность 3-4 мес.	Стельность 5-6 мес.	Контроль
Т-клетки/В-клетки	0,64	0,84	0,5
IgG/IgM	0,27	0,73	0,3
IgM/IgA	0,25	0,56	0,4
IgG/IgA	0,3	0,71	0,47

Примечание. р<0,01 при сравнении показателей стельных коров

Из представленных в табл.9 данных видно, что корреляционные взаимосвязи между различными изотипами Ig в сыворотке крови контрольных животных являются слабо положительными. Низкая степень сопряженности между показателями IgG и IgA косвенно подтверждает относительную независимость системного и местного иммунитета. Дальнейшее повышение степени сопряженности между показателями иммунной системы в 5-6 мес. стельности подтверждает усиление рецепторной активности Т- и В-клеток у стельных коров по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, смена слабой корреляционной взаимосвязи на сильную свидетельствует о возрастании функциональной активности иммунокомпетентных клеток и, соответственно, активизации клеточных и гуморальных звеньев иммунной системы в период плодоношения.

Функциональные свойства иммунокомпетентных ILT-рецепторных клеток у различных видов животных

Эволюционное развитие IgSF-рецепторов началось с возникновения шаперонов бактериальных клеток, имеющих Ig-fold (складчатое) строение, Thy-1 и Р₀ - молекул прокариот и одноклеточных эукариот. Многие из этих белков представляют собой различные полимеры, в которых гомологичные Ig-структуры разных цепей взаимодействуют между собой. Каждая такая структура кодируется отдельным экзоном. По-видимому, данное семейство генов ведет свое происхождение от гена, кодирующего одну гомологичную структуру, похожую на Thy-1 или в₂-микроглобулин. Новые члены семейства возникали путем дупликаций экзонов, генов и генных сегментов, кодирующих иммуноглобулиновые молекулы.

В состав IgSF также входят однодоменные белки тимоцитов и Т-клеток (Thy-1), белок миелина Р₀, в₂-микроглобулин, адгезивный белок губок, тирозин-киназный рецептор дрозофилы (DTRK), рецептор кортикальных тимоцитов лягушки и человека и др. Эти молекулы обеспечивали межклеточную адгезию посредством гомофильного взаимодействия (Галактионов В.Г.,2004).В процессе эволюции многоклеточных произошел переход от гомофильного межклеточного взаимодействия к более совершенному гетерофильному взаимодействию для распознавания чужеродных агентов. Контактное взаимодействие иммунокомпетентных клеток посредством рецепторов является первым этапом в осуществлении антигенспецифических реакций. Кооперация клеток друг с другом определяется «адгезивным кодом», то есть определенным для каждой клетки набором мембранных белков. Определение этих белков для каждого клона лейкоцитов позволит понять механизмы ранней дифференцировки, филогенетической связи макрофагов, Т- и В-клеток в процессе становления иммунной системы. sIg-молекулы клеток являются чувствительной системой, реагирующей на изменения в макро- и микроокружении организма. В результате изучения и осмысления механизмов их многообразия и модуляции, возможно создание эффективных и безопасных препаратов против постоянно изменяющих свои поверхностные антигены патогенных микроорганизмов.

Определение ILT-рецепторных клеток у различных видов животных

Заключительным этапом исследований было определение ILT-рецепторных клеток у различных видов животных с помощью метода спонтанного розеткообразования и нагрузочного теста с теофиллином. Теофиллиновый тест использован для оценки состояния цитоплазматических мембран иммунокомпетентных В- и Т- клеток, характеризующихся колебанием уровня внутриклеточного цитоплазматического АМФ, связанного с экспрессией CD2-рецептора. Для определения специфичности эритроцитов барана к мононуклеарным клеткам нами использованы клетки периферической крови млекопитающих, птиц и рыб (табл.10).

Изучая феномен розеткообразования у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы - костистые рыбы, птицы, млекопитающие, было показано, что их лимфоциты обладают рецепторами к эритроцитам барана. Несмотря на то, что у этих видов животных структура иммунной системы различна, основные клеточные и молекулярные компоненты врожденного иммунитета достаточно консервативны.

Таблица 10 Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов в крови здоровых животных (M±m)

Вид животных	В-лимфоциты (%)	Т-лимфоциты
		Общее количество (%)	CD4-Хелперы (%)	CD8-Цитотоксические (%)
Норки, n=80	10,5±0,8	52,0±2,1	33,0±1,5	19,0±1,0
Куры, n=50	23,3±1,5	38,0±2,1	12,2±0,6	10,4±0,8
Рыбы, n=100	14,0±1,5	35,10,6	18,0±0,2	14,5±0,8

Примечание: p0,05



Как видно из таблицы 10, количественные соотношения клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами, такими как CD2 (Т-клетки), CD19 (В-клетки), CD4, CD8, у данных видов животных одинаковы CD2: Т-клеток > В-клеток; Т-хелперов больше, чем цитотоксических лимфоцитов. Это доказывает функционально-рецепторный консерватизм Ig-подобных рецепторов лимфоцитов у различных видов животных. Анализ способности к розеткообразованию у исследуемых видов животных показывает различие рецепторной активности В-клеток. Это обусловлено тем, что В-система иммунитета в процессе эволюции развивалась позже Т-системы. У млекопитающих, птиц и рыб есть тимус - центральный орган иммунной системы, место дифференцировки Т-клеток до зрелых форм. Увеличение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4 Т-хелперов к цитотоксическим CD8 Т-клеткам) от 1,3 у рыб и 1,2 у птиц до 1,7 у норок показывает различие в процессах дифференцировки Т-лимфоцитов, основанное на структурных особенностях тимуса.

Возможно, что CD2-рецепторы, как адгезивные молекулы, появляются одними из первых в процессе филогенеза иммунокомпетентных клеток позвоночных животных. Еще П.Эрлих впервые указал на отсутствие видовой специфичности рецепторов у животных различных видов. А по мнению Галактионова В.Г. (2004) филогенез клеток иммунной системы строится на рецепторной и функциональной общности клеток, участвующих в эволюционном процессе, в котором на пути от НК-клеток к Т-лимфоцитам сохранилось несколько общих рецепторов, указывающих на филогенетическую связь между этими клетками, в частности CD2.

В настоящее время не вызывает сомнений определяющее значение белков суперсемейства иммуноглобулинов в развитии адаптивного иммунитета, основанного на врожденных механизмах защиты от инфекций. Иммунная система, как система специфического распознавания чужеродных структур, на ранних этапах эволюции начала свое становление с появлением иммуноглобулиноподобных доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Именно из этой молекулярной, конформационной структуры, свойственной только членам суперсемейства иммуноглобулинов, построены клеточные рецепторы, ответственные за распознавание антигена, а межклеточная кооперация с участием IgSF является ведущим фактором в развитии иммунных реакций, обуславливающих функционирование иммунной системы, распознавание и деструкцию структур, зондирующих защитные возможности организма. Проведенные исследования показали, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и свободными формами молекул иммуноглобулинов. Определив модуляцию IgSF в онто- и иммуногенезе и консерватизм в филогенезе нами была показана возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы. В результате проведенных исследований было установлено, что ILT-рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность и роль в фило-, онто- и иммуногенезе.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы получения иммуноглобулинов A (S-IgA) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных. Показано, что оптимальной биологической жидкостью для выделения S-IgA служат носовые секреты крупного рогатого скота, а в связи с полиморфизмом иммуноглобулинов данного изотипа для его количественного определения следует использовать стандарт из гомологичного субстрата.

2. Разработана технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам мышей и крупного рогатого скота, предназначенных для определения уровня иммуноглобулинов у животных. Экспериментально установлена возможность использования полученных антисывороток и моноклональных антител в иммуноцитохимических реакциях для количественной оценки IgSF-содержащих клеток.

3. Приведены количественные показатели уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови коров в период 3-6 мес. стельности, которые составляют: IgG - 29,2± 5,9 мг/мл, IgM - 2,6 ±0,6 мг/мл, IgA - 1,0± 0,3 мг/мл. Показано, что иммунологический статус этих животных характеризуется значительным повышением концентрации IgG, который затем переходит в молозиво, где является основным изотипом иммуноглобулинов и доминирующим фактором колострального иммунитета.

4. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно- и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток периферической крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.

5. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число sIgM-клеток в периферической крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х10⁹/л до 1,0±0,7 х10⁹/л. При этом количество sIgM-клеток у стельных коров значительно выше и достигает значения 1,5±0,3 х10⁹/л .

6. Цитохимическим методом определено количество sIgM-клеток в периферической крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5% - 19,2±0,8%.

7. Показана практическая эффективность применения реакции антигенного розеткообразования и контактного взаимодействия с макрофагами для определения рецепторной активности иммунокомпетентных клеток в поствакцинальном иммунном ответе у лабораторных животных.

8. Установлено, что воздействие in vitro вакцины против рожи свиней на интактные лимфоциты мышей не оказывает значительного влияния на число CD2-молекул и рецепторов к С₃-компоненту комплемента на поверхности клеток. Аналогичное воздействие на лимфоциты вакцинированных животных, приводит к повышению уровня экспрессии рецепторов иммуноцитов, при этом индекс стимуляции равен 2,5-3,3 (в контроле 1,0). Двойной антигенный сигнал (in vivo и in vitro) усиливает экспрессию рецепторов в первые 14 суток иммунного ответа, когда в организме сохраняется достаточное количество активированных лимфоцитов.

9. Определено различное воздействие антигенов бактериальной и вирусной этиологии на экспрессию ILT-рецепторов лимфоцитов, отражающую степень их активации. Так иммунизация мышей вакциной против рожи свиней приводит к образованию высокоаффинных Т-клеток в первые сутки в костном мозге, а в последующие - в тимусе; при использовании вирус-вакцины высокоаффинные Т-лимфоциты обнаружены в костном мозге на 14 сутки. Показана ведущая роль костного мозга в индукции рецепторной активности Т-клеток в поствакцинальном иммунном ответе.

10. Установлено различное влияние антигенов бактериальной и вирусной этиологии на процесс активации макрофагов, который является более продолжительным при иммунизации животных бактериальным антигеном. Так количество тимоцитов, взаимодействующих с перитонеальными макрофагами мышей на 2-10-14 сутки после введения вакцины против рожи свиней составило 212,3±30,4, 260,3±35,9 и 125,5 ±15,8 клеток/100 макрофагов соответственно (в контроле - 26,0±0,5). Более продолжительное повышение рецепторной активности поверхностных структур макрофагов и Т-клеток определяется различной МНС-рестрикцией иммунного ответа на бактерии и вирусы.

11. Показано, что вторичный иммунный ответ на введение Т-независимого антигена 2 типа (ТН-2) характеризуется увеличением количества В-клеток костного мозга и селезенки. Установлено увеличение количества IgG1 в селезенке, что подтверждает участие Т-клеточных факторов в ТН-2-иммуногенезе.

12. Предложен диагностический алгоритм для изучения эффективности иммунотропных препаратов на модели лабораторных мышей, включающий следующие показатели: положительная корреляция ( 0,7) между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов; положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов; отрицательная корреляция ( -0,7) между нейтрофилами и Т-клетками тимуса. Разработанная схема позволяет определять уровень корреляционной связи по трем соотношениям, характеризующим сбалансированность иммунной системы.

13. Впервые установлена филогенетически детерминированная рецепторная и функциональная общность CD2-рецепторных клеток у животных, находящихся на различных ступенях эволюционной лестницы (костистые рыбы, птицы, млекопитающие) и отличающихся строением иммунной системы.

14. Показано, что функциональная активность иммунокомпетентных клеток находится в тесной взаимосвязи с мембранными и свободными формами молекул иммуноглобулинов, а межклеточная кооперация ILT- клеток обуславливает их количественные изменения и является ведущим фактором в развитии иммунного ответа у различных видов животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложен комплексный подход к оценке Т- и В-клеточных звеньев иммунной системы крупного рогатого скота и мышей, который может быть использован для определения эффективности иммунотропных препаратов, используемых в ветеринарной практике РФ.

Разработанные методы могут быть использованы для изучения модуляции клеток с иммуноглобулиноподобными рецепторами в онто-, иммуно- и филогенезе, что дает возможность оценки физиологических и молекулярных аспектов функционирования иммунной системы различных видов животных.

Для проведения иммунологического мониторинга животных рекомендованы индексные показатели, которые более адекватно отражают нарушения иммунитета, чем отдельные его параметры. Использование индексных показателей в значительной мере повысит диагностическую эффективность оценки состояния иммунной системы животных.

Разработанные методы использованы для оценки иммунного статуса морских млекопитающих, хомячков Кэмпбэлла (Phodopus campbelli) в рамках программы по оценке здоровья популяций животных, обитающих в естественных условиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Монографии, патенты РФ, методические рекомендации

1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных. - М.: Компания Спутник+.- 2008.- 88 с.

2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота / Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. // Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.1990 г.

3. Федоров Ю.Н. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.// Патент на изобретение № 2277421 от 5.04.2006 г.

4. Федоров Ю.Н. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных/ Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А. //Патент на изобретение № 2288008 от 5.04. 2006 г.

5. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. //Сборник « Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины».-2008.-4.- С. 144-158

6. Ездакова И.Ю. Способ определения антител/ Ездакова И.Ю. //Патент на изобретение № 2293330 от 4.07.2005 г.

Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

7. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. // Сельскохозяйственная биология. - 1993.- № 6.- С. 135-141.

8. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. Феоктистова Т.А. , Федорова И.П., Ездакова И.Ю. // Сельскохозяйственная биология.- 1995.-№ 4.-С. 94-99

9. Жаданов А.И. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. / А.И.Жаданов, И.Ю.Ездакова, О.А.Верховский, Ю.Н.Федоров // Ветеринария.-2000.- №11.- С.22-26.

10. Федоров Ю.Н. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Федоров Ю.Н., Верховский О.А., Жаданов А.И., Ездакова И.Ю.// Доклады РАСХН.- 2000.-№ 5.-С. 42-44.

11. Ездакова И.Ю. Динамика количества Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Жаданов А.И. // Цитология.- 2001.- Т. 43.- № 9-. С. 858.

12. Ездакова И.Ю. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / Ездакова И.Ю., Борзенко Е.В., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н. // Сельскохозяйственная биология.- 2002.-№ 2.-С. 118-122.

13. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /Ездакова И.Ю., Борисова М.Н., Дьяконов Л.П. //Ветеринария.-2005.-№ 12.-С. 28-31

14. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ Ездакова И.Ю., Борисова М.Н. // Ветеринарная патология.-2007.-№ 2.- С. 205-207

15. Ездакова И.Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров/ Ездакова И.Ю. //Ветеринарная патология.- 2007.-№ 2.-С. 148-151.

16. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих - новое направление экологической иммунологии / Ездакова И.Ю., Соколова О.В. // Веткорм.-2008.-№ 4.- С. 14-15

17. Ездакова И.Ю. Динамика розеткообразующих клеток кур в онтогенезе / Ездакова И.Ю., Чуйко О. М., Чадина Е.О. //Ветеринарная патология.-2008.-№ 2.-С. 62-64

18. Ездакова И.Ю. Локализация IgМ в В-клетках периферической крови крупного рогатого скота/ Ездакова И.Ю. // Аллергология и иммунология.- 2008.- Т. 9.- № 3.-С. 274

Статьи в других периодических изданиях, в материалах конференций и сборниках научных трудов

19. Феоктистова Т.А. Иммуноферментный метод количественного определения IgA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Борзенко Е.В. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИиТИБП.- 2000. - C. 279-281.

20. Разработка и совершенствование методов оценки В-системы иммунитета у животных / Верховский О.А., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н, Ездакова И.Ю. и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч.тр. - Щелково:ВНИиТИБП.- 2000. - C. 273-275

21. Yu.N. Fedorov. Quantitation of total IgG-, IgM-, and IgA-secreting cells in mice immunized with live erysipelas vaccine and challenged with the virulent strain of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Yu.N. Fedorov, A.I.Zhadanov, O.A.Verkhovsky, I.Yu.Ezdakova. //Sixth International Veterinary Immunology Symposium. -2001.- 206.- Р.174 (PS8:22).

22. Борзенко Е.В. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Борзенко Е.В., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А. // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т. 73.- С. 217-221

23. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / Ездакова И.Ю., Федоров И.Ю., Третьякова И.В. // Труды ВИЭВ.- 2003.- Т.73.- С. 200-204

24. Феоктистова Т.А. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Сологуб В.К. // Труды ВИЭВ.-2003.- Т. 73.- С. 197-200

25. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / Ездакова И.Ю., Третьякова И.В.// Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина.- М: МГАВМиБ.-2004.-С. 190-194

26. Ездакова И.Ю. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Ханис А.Ю., Боряев Г.И. // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч.тр.- Щелково:ВНИиТИБП .-2004.- С. 47-52.

27. Sokolova O.V.Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncates)/ Sokolova O.V., Denisenko T.E., Ezdakova I.Yu. // Marine Mammals and man in coastal ecosystem: Can they co-exist? : Abstracts book.-Gdynia:ECS.- 2006.- P.180.

28. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /Ездакова И.Ю.// «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 472-474.

29. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.-2006.- С. 475-477.

30. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар.- 2006.- С. 400-403.

31. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» : Сб. науч.тр. - Щелково:ВНИиТИБП.-2006.- С. 157-160.

32. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / Ездакова И.Ю., Субботин В.В. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» : Сб. науч.тр. - Щелково:ВНИиТИБП.-2006.- С. 182-187.

33. Данилевская Н.В. Фармакологические эффекты пробиотика Лактобифадол при его назначении глубокостельным коровам / Данилевская Н.В., Ездакова И.Ю., Кудинов В.В.// Веткорм.- 2006.-№ 6.- С. 24-25.

34. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 1.-С. 11-12.

35. Ездакова И.Ю. Определение показателей В-системы иммунитета телят/ Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 10-11.

36. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина.- 2007.-№ 4.-С. 11-13.

37. Ezdakova I.Yu. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (EUMETOPIAS JUBATUS) / Ezdakova I.Yu., Sokolova O. V., Denisenko T. E., Burkanov V. N. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS- 2008.- P. 191-192.

38. Sokolova O.V .The Ladoga ringed seal (Pusa hispida ladogensis) as a species - indicator of the influence of global warming on the wild population of the marine mammals/ Sokolova O.V ., Lisitsina T. Yu., Ezdakova I.Yu., Denisenko T. E. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.- Egmond aan Zee:ECS.- 2008.- P. 151-152.

39. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / Ездакова И.Ю. //«Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ.- 2008.- С. 329-332.

Размещено на Allbest.ru

...