Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики

Рис. 8. Электронная микроскопия олигомеров белка GroEL туляремийного микроба. А - мелкие дискообразные частицы звездчатой формы и крупные цилиндрические структуры (увеличение х 163 000); Б - блоки, составляющие крупную цилиндрическую структуру (увеличение х 173 600); В, Г - неассоциированные в цилиндр крупные дискообразные частицы (увеличение х 240 000).

Осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии

Найдено, что клетки возбудителя туляремии выдерживают значительную концентрацию хлористого натрия (до 4M NaCl) в течение 20 дней, что согласуется с данными литературы (Nano F., 1988), при этом солевой стресс сопровождается изменением содержания общих сахаров. Увеличение содержания сахаров в 3-4 раза наблюдали у стрессированных клеток штаммов Schu, 543 и в 2-3 раза - у штамма 503 по сравнению с контрольными клетками, причем увеличение содержания сахаров наблюдали как в результате выращивания клеток в среде с различным содержанием хлористого натрия в течение длительного времени, так и через 3 часа после приложения стрессовых условий (собственно солевой стресс).

При помещении клеток в условия высокого содержания соли отмечали также увеличение накопления глицинбетаина (таблица 2.) В первые 4 часа инкубации в условиях стресса наблюдали увеличение содержания бетаина в пробах в 5,5 раз для штамма Schu и в 4,8 раз - для штамма 503 (концентрация соли 2,0-4,0 M). Через 8 часов инкубирования содержание бетаина было примерно одинаковым для штаммов обоих подвидов, а затем начинало снижаться. Экзогенное внесение коммерческого препарата глицинбетаина несколько замедляло (до одной недели) сроки перехода клеток возбудителя туляремии в некультивируемое состояние.

Таблица 2.

Накопление глицинбетаина (mM) клетками возбудителя туляремии при солевом стрессе

При электронномикроскопическом изучении стрессированных клеток туляремийного микроба штаммов Schu и 503 по сравнению с контрольными были выявлены определенные различия в характере аутолитических изменений, которые выражались в той или иной степени нарушениях цитоплазматических структур. При этом характер этих изменений лучше прослеживался у штамма Schu. На поверхности стрессированных клеток туляремийного микроба штамма Schu обнаружен электронно - плотный слой, состоящий из хлопьевидного материала, включавшего мелкие плотные глыбки. Значительное количество подобного материала наблюдали и между клетками. В контрольных препаратах такого препарата на поверхности клеток было значительно меньше, а в межклеточном пространстве его не было вообще. На поверхности стрессированных клеток штамма 503 слой глобулярного контрастного материала был выражен слабо, хотя количество хлопьевидного плотного материала между клетками было почти таким же, как у штамма Schu. Таким образом, с помощью электронно-гистохимического метода показано, что в условиях солевого стресса туляремийный микроб штамма Schu активно продуцирует «вещество», которое локализуется на наружней мембране и которое выявляется с помощью красителя, имеющего выраженные катионные свойства. В отличие от Schu штамм 503 в таких условиях это «вещество» активно не продуцирует.

Фагоцитоз туляремийного микроба, который проводили на перитониальных макрофагах белых мышей, показал, что при воздействии осмотического (солевого) шока на клетки F. tularensis штаммов Schu и 503 (0,15М-1М -2М NaCl) происходит повышение антифагоцитарной активности микробов. Одновременно наблюдали снижение значения ИЗФ (клетки Schu - с 0,002 до 0,2; клетки 503- с 0,03 до 0,3) и повышение % ПМ (Schu - с 92 до 95%; 503- с 90 до 95%). На захват микроорганизмов осмотический шок заметного влияния не оказывал, но стимулировал размножение стрессированных микробов внутри фагоцитов, что, как минимум, свидетельствует в пользу усиления патогенных свойств возбудителя.

При генотипическом изучении ДНК клеток туляремийного микроба в ОП-ПЦР с праймером №15 отмечены отличия в геноме стрессированных клеток (клетки подвергали стрессу в течение 4 часов) по сравнению с интактными, что выражалось в изменении характера распределения полос ДНК-ампликонов, причем штамм американской разновидности отличался от штамма европейской разновидности явными перестройками хромосомы (рис. 9).

1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10

Рис. 9. ПЦР-профиль ДНК стрессированных клеток различных штаммов туляремийного микроба с праймером №15 (контакт клеток с солью в течение 3 часов при температуре 37⁰С).

1-F.tularensis Schu-0,15M NaCl; 2-Schu-0,5 M NaCl; 3-Schu-1,0 M NaCl; 4-Schu-2,0 M NaCl; 5-Schu-4,0 M NaCl; 6-F.tularensis 503-0,15 M NaCl; 7-503-0,5 M NaCl; 8-503-1,0 M NaCl; 9-503-2,0 M NaCl; 10-503-4,0 M NaCl; M-маркер молекулярных весов.

ДНК стрессированных клеток штамма Schu изменила картину распределения амликонов: исчезли минорные полосы в районе 1500, 700 и 450 п.н. и появилась полоса в районе 300 п.н. Для штамма 503 таких наблюдений не отмечено. Картина распределения ДНК-ампликонов при солевом стрессе была фактически одинаковой.

Таким образом, возбудитель туляремии обладает устойчивостью (солетолерантностью) к повышенным содержаниям в среде хлористого натрия. В ответ на солевой стресс туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать в почвенных и водных экосистемах в межэпидемические (межэпизоотические) периоды.

5. ПЦР в практике эпизоотологического обследования и эпидемиологического надзора за туляремией (на примере Ростовской области)

В системе комплексного изучения природных очагов туляремии лабораторная диагностика имеет особое значение. Информация о состоянии компонентов паразитарной системы в совокупности с информацией о показателях заболеваемости служит основой рационального планирования и осуществления мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями, а в межэпизоотийный период позволяет оценить эффективность этих мероприятий.

Лабораторными методами, позволяющими судить об инфицированности популяций носителей и переносчиков, а также контаминации абиотических объектов окружающей среды (экосистемный уровень), в настоящее время являются бактериологический, серологический (направленный на поиск антигена и антител), биологический (постановка биопробы на высокочувствительных животных) и молекулярно - биологический.

Выбор объекта для лабораторного исследования материала из природных очагов туляремии определяется типологией очага, сезоном обследования, конечными целями исследования (контроль за динамикой эпизоотологического процесса или территориального распределения эпизоотических участков). В природных очагах исследуют биотические и абиотические объекты различных уровней. Информативность молекулярно-биологического, бактериологического и биологического методов, используемых при изучении биотических объектов полевого материала, во многом определяется сроками доставки проб из природного очага в лабораторию. Хранение проб при неблагоприятных температурных условиях в летне-весенний период может сделать невозможным выделение инфекционных агентов. Рекомендуемые существующими инструктивно - методическими документами консерванты позволяют увеличить время сохранения биологических объектов, но не всегда способны обеспечить должное качество. Поэтому нами при обследовании природных очагов в Ростовской области был применен метод криоконсервирования (Терентьев А.Н., и др., 1993).

Для получения объективной, эпидемиологически значимой информации и оценки использованных приемов полевой материал, добытый в природных очагах туляремии, исследовали бактериологическим и молекулярно-биологическим методами в комплексе с серологическими реакциями. Серологические реакции включали поиск антигена (РКОА, РАО, РНАт) и антител к туляремийному микробу (РНГА). Молекулярно-биологический метод (метод ПЦР) с использованием видоспецифических праймеров - для детекции туляремийного микроба. Анализ результатов проводили по двум типам природных очагов туляремии, учитывая все структурные уровни и компоненты.

Метод ПЦР со специфическими праймерами был использован для обнаружения возбудителя туляремии в пробах полевого материала, собранного при плановом эпизоотологическом обследовании степного и пойменно-болотного очагов туляремии в Ростовской области в весенне - летний и осенне - зимний периоды 1996 - 1999 г.г. (более 4000 проб).

При анализе результатов, независимо от типа очага установлено преимущество ПЦР в сравнении с РНАт, РКОА и РАО при исследовании проб мышевидных грызунов (p<0,001, p<0,05, p<0,05, соответственно). При исследовании в степном очаге биотических и абиотических объектов подземного (гнездонорового) уровней позитивные результаты получены только в ПЦР. В пробах воды из очага этого типа частота позитивных результатов в ПЦР была ниже, чем в серологических реакциях(p<0,05). При исследовании воды поверхностных водоемов в очаге пойменно-болотного типа, где она играет несомненно большую роль в персистенции туляремийного микроба, чем в очаге степного типа, частота позитивных результатов была выше в ПЦР. Как отмечалось ранее, этот факт необходимо учитывать при проведении эпидемиологического надзора за туляремией (таблица 3).

Как уже отмечалось, методологической базой исследования полевого материала на туляремию явились положения, сформулированные на момент исследования в «Методических указаниях по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии» (1983). В своих исследованиях мы внесли в них некоторые дополнения. Начальным этапом является разбор и сортировка проб полевого материала. Затем следуют серологические и молекулярно - биологические исследования, важнейшая задача которых состоит в получении информации для дальнейших лабораторных исследований: обнаружение ДНК, антигенов и антител к туляремийному микробу. Наличие такой информации на этапе, предшествующем постановке биологических проб, исключительно важно, так как она позволяет определить приоритетность проб и сконцентрировать внимание на наиболее значимых объектах. Подобный подход целесообразен, рационален и позволяет повысить производительность труда, в особенности при одномоментном поступлении в диагностическую лабораторию большого количества полевого материала. Следующим является этап постановки биологических проб с высокочувствительными лабораторными животными. Информационное обеспечение этого этапа (положительные результаты в ПЦР и серологических реакциях) является показанием для обязательной постановки биологической пробы с последующими пассажами и прямого посева полевого материала на плотные питательные среды. Если на этом этапе исследования падежа биопробных животных не наблюдается, то положительные результаты в ПЦР и нарастание титров серологический реакций, полученных при изучении материала от биологических проб, является показанием для проведения последующих пассажей. В нашем исследовании применение такого методического подхода как многопассажной методики, не предусмотренной действовавшими инструктивно-методическими документами, было выделено 16% культур туляремийного микроба. Заключительный этап исследования предполагает выделение туляремийного микроба на питательных средах и его идентификацию.

Таблица 3

Информативность реакций коагглютинации, аггломерации, нейтрализации антител и полимеразной цепной реакции

Таким образом, при отработке тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом надзоре за туляремией установлено, что информационными параметрами, характеризующими состояние паразитарной системы являются:

1. Выделение и идентификация туляремийного микроба из биотических и абиотических объектов всех трех уровней системы;

2. Детекция ДНК туляремийного микроба в ПЦР в биотических и абиотических объектах всех трех уровней системы;

3. Обнаружение антигена туляремийного микроба в биотических и абиотических объектах всех трех уровнях системы;

4. Обнаружение антител к туляремийному микробу в биотических объектах (позвоночные животные первого и второго уровней системы.

При сравнении информативности использованных методов показано преимущество использования ПЦР при эпизоотологическом обследовании территорий природных очагов туляремии.

Нами установлено, что применение ПЦР в комплексе с бактериологическими и иммуно - серологическими методами при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов может быть использовано для характеристики эпизоотической активности очага: высокая - детекция специфической ДНК подтверждается выделением культур туляремийного микроба; повышенная - детекция специфической ДНК регистрируется на фоне обнаружения антигена; низкая - отрицательные результаты при использовании всех методов исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С использованием комплекса молекулярно-биологических приемов нам впервые удалось описать феномен некультивируемого состояния у возбудителя туляремии. Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Это может иметь значение в природных условиях в межэпизоотический период и явиться механизмом запуска начала эпизоотии среди чувствительных животных. Существование некультивируемых форм имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен адаптивной пластичностью, важной для персистенции, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Изучение механизма адаптационной изменчивости туляремийного микроба, роли в этом процессе стрессовых условий, возможность перехода возбудителя в некультивируемое состояние значительно расширило наши представления об экологии возбудителя туляремии. Проведенные исследования легли в основу совершенствования принципов лабораторной диагностики и специфической индикации возбудителя туляремии. Использованный нами впервые метод ПЦР-диагностики при обследовании природных очагов туляремии включен в приказ №125 Минздрава РФ, посвященный усилению мероприятий по профилактике туляремии (1999), что явилось основой для последующего обоснования введения молекулярно-биологических методов в методические указания по эпидемиологическому надзору за туляремией (1999, 2005). Разработанный новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, усовершенствование тактики лабораторной диагностики при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии позволили лучше понять паразитарную систему возбудителя, его экологию вообще и в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы окружающей среды, вызывающие индукцию некультивируемого состояния у туляремийного микроба, что позволяет по-новому и объективно подходить в прогнозированию состояния природных очагов туляремии и планировать объем профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений.

Выводы

1. Впервые показано, что в результате голодания и низкотемпературного стресса туляремийный микроб может обратимо переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде экосистемы в межэпизоотийный период. Существование «некультивируемых» форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.

2. Ревертанты «некультивируемых» форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства в том числе и вирулентность. Реверсия в природных условиях в межэпизоотийный период и может явиться механизмом запуска начала эпизоотии туляремии среди чувствительных животных.

3. Туляремийный микроб наделен генетически закрепленной адаптивной изменчивостью, важной для сохранения возбудителя в изменяющихся условиях окружающей среды и проявляющейся в адекватной реакции на стрессовые факторы.

4. В силу своей природной пластичности возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, сопровождаемого заметной перестройкой его метаболизма. В ответ на стрессовые условия туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему приспособиться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать (иногда в виде «некультивируемых форм») в почвенных и водных экосистемах в межэпизоотийные периоды.

5. Для изучения различных аспектов экологии F. tularensis, его взаимоотношений с факторами окружающей среды, а также обнаружения и идентификации предложен комплекс молекулярно-биологических приемов, прошедший испытания в лабораторных и полевых условиях. Сконструирована рекомбинантная плазмида pRD6 с комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба фрагментом, служащим ДНК-зондом для эффективного выявления только штаммов F. tularensis и не взаимодействующим с представителями других близкородственных и отдаленных микроорганизмов. На базе ДНК-зонда сконструированы видоспецифические праймеры F1 и F2 для идентификации в ПЦР клеток возбудителя туляремии в чистой культуре, смеси культур с другими микроорганизмами, в суспензиях из органов зараженных биопробных животных и пробах клещей.

6. Осуществлен генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба на межвидовом и внутривидовом уровне, а также продемонстрирована их генотипическая гетерогенность с помощью ОП-ПЦР и набора универсальных (случайных) праймеров. ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет не только выявлять генетическую гетерогенность штаммов F. tularensis, но и четко делить их на неарктический, среднеазиатский, голарктический подвиды и F.novicida.

7. Впервые определено место ПЦР как важного элемента совершенствования тактики лабораторной диагностики за туляремией в природных очагах. Внедрение ПЦР в практику эпидемиологического надзора за туляремией позволяет получать оперативную информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага.

8. ПЦР-анализ обладает рядом важных моментов (скорость получения ответа, чувствительность, а также специфичность), позволяющих использовать его в качестве надежного инструмента эпидемиологического надзора. Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуносерологическими методами при исследовании различных биотических и абиотических компонентов экосистемы может быть использовано для углубленной характеристики эпизоотической активности очага, так как этот метод учитывает, как типичные формы возбудителя туляремии, так и атипичные с измененной антигенной структурой, и микроорганизмы, находящиеся в «некультивируемом» состоянии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 1669981 Рекомбинантная плазмидная ДНК-источник зонда для тестирования представителей рода Francisella. Штамм E.coli JM 103 pRD 6RM7-продуцент рекомбинантной плазмиды / Романова Л.В., Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. - Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 15.04.1991.

Павлович, Н.В. Сравнительная характеристика биологических свойств штаммов F.tularensis, выделенных на территории СССР / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Н.К. Тынкевич, И.В. Рыжко, Л.В. Романова, Г.И. Данилевская // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - № 10. - С. 23-25.

Романова, Л.В. Использование полимеразной цепной реакции для генотипического скрининга штаммов F.tularensis / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Симферополь, 1991. - С. 160-161.

Романова, Л.В. ДНК-зонд для обнаружения возбудителя туляремии / Л.В.Романова, Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Симферополь, 1991. - С. 162-163.

Романова, Л.В. ДНК-зонд для идентификации представителей рода Francisella / Л.В.Романова, Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. -1992. -№ 4. - С. 52-55.

Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Francisella tularensis с использованием универсальных праймеров / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1993. - № 6. - С. 8-9.

Романова, Л.В. Анализ ДНК штаммов Brucella sp. в полимеразной цепной реакции с использованием универсальных праймеров / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1994. - № 4. - С. 8-10.

Романова, Л.В. ПЦР-детекция представителей рода Francisella / Л.В. Романова, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин // Актуальные проблемы разработки мед.средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил: Тез. докл. - Санкт-Петербург, 1994. - С. 127.

Романова, Л.В. Использование полимеразной цепной реакции для генотипического скрининга Y.pestis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, В.К. Валенцев // Актуальные проблемы особо опасных природно-очаговых инфекционных болезней: Тез. докл. - Иркутск, 1994. - С. 133.

Романова, Л.В. Стрессовый ответ у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, И.Л. Олейников, Б.Н. Мишанькин // Актуал. опр.профилакт. чумы и других инф. заболеваний: Матер. межгос. нучно-ракт. конф. - Ставрополь, 1994. - С. 203-204.

Романова, Л.В. Праймеры для специфического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной цепной реакции / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1995. - №. -С. 77-80.

Romanova, L.V. Polymerase chain reaction species-specific primer set for rapid detection of Francisella tularensis / L.V. Romanova, B.N. Mischankin // Abstract 7^th European congress of Clinical Microbiolog and Infectious Diseases-ECCMID-95.- Vienna - Austria. - March 26-30, 1995. - P. 97.

Романова, Л.В. ПЦР-генотипувания холерных вiбрiонiв видiленных в Дагестане в 1993-1994 рр. / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Ю.М. Ломов, И.Ю. Сучков // XII зьезд Украiнского наук. товариства миiроб. епiдем. параз. - Кiiв - Винниця, 1996. - С. 55.

Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция: детекция и генотипирование представителей рода Francisella / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, И.Ю. Сучков // Биотехнология. - 1996. - № 3. - С. 27-32.

Романова, Л.В. ПЦР-генотипирование ДНК-содержащих бактериофагов / Л.В. Романова, В.И. Марченков, Т.Н. Бородина, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 1997. - № 1. - С. 21-25.

Москвитина, Э.А. Эпидемиологический надзор за туляремией с позиций социально-экологической концепции / Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, Н.В. Павлович, Л.В. Романова и др. // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т.1. - С. 110-111.

Романова, Л.В. Продукция основных белков теплового стрессового ответа клетками Francisella tularensis в подкожно имплантированных диффузионных камерах / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 113-114.

Романова, Л.В. Стрессовый белок GroEL Francisella tularensis / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 114.

Романова, Л.В. Выявление некультивируемых форм Francisella tularensis с помощью полимеразной цепной реакции / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 115.

Романова, Л.В. ПЦР - в практике эпизоотологического обследования природных очагов туляремии в Ростовской области / Л.В. Романова, Н.Л. Пичурина, Б.Н. Мишанькин // Матер. научно-практ. конф. посвящ. 100-лет. образов. противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 213.

Romanova, L.V. Francisella tularensis stress protein / L.V. Romanova, S.O. Vodopyanov, S.R. Sajamov, B.N. Mischankin // Vojenske Zdravotniske Listy, Rocnik LXVI, 1997. - N. 1. - P. 18. - Second International Conferens on Tularemia.

Mischankin, B.N. Nonculturable forms of Francisella tularensis and their possible epideviological significance / B.N. Mischankin, L.V. Romanova, N.L. Pichurina // Vojenske Zdravotniske Listy, Rocnik LXVI, 1997. - N. 1. - P. 25. - Second International Conferens on Tularemia.

Мишанькин, Б.Н. База данных о нуклеотидных последовательностях, используемых в качестве базы данных «Праймеры микроорганизмов» / Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Волохонская, Э.А. Москвитина, Л.В. Романова и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1998. - № 5. - С. 39-43.

Романова, Л.В. Использование метода ПЦР для детекции Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Методические документы и отчеты по сан. - эпид. охране территории РФ. - Саратов, 1998. - С. 24-25.

Романова, Л.В. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в диагностике Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний: Матер. II Всерос. конф. 20-22 января 1998 г. -Москва, 1998. - С. 112-113.

Мишанькин, Б.Н. Туляремия / Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, Л.В. Романова, И.Я. Черепахина и др. // Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней. - Саратов. - 1998. - Т. 1. - С. 111-143.

Орехов, И.В. Фауна переносчиков, как составная часть паразитарной системы природных очагов туляремии в Ростовской области / И.В. Орехов, А.В. Родионов, В.Г. Налетов, Б.Н. Мишанькин, Э.А. Москвитина, Н.Л. Пичурина, Л.В. Романова // Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения: Матер. Всесоюзн. научно-практ. конф. - Омск, 1998. - С. 150-151.

Кадетов, В.В. ПЦР - диагностика криоконсервированного полевого материала / В.В. Кадетов, Н.Л. Пичурина, Л.В. Романова, В.Г. Налетов и др. // Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения: Матер. Всесоюзн. научно-практ. конф. - Омск, 1998. - С. 156-157.

Романова, Л.В. Применение ПЦР в генотипической характеристике холерных бактериофагов / Л.В. Романова, Т.А. Кудрякова, Л.Д. Македонова, Г.В. Качкина и др. // Генная диагностика особо опасн. инф.: Матер. I-ой Всерос. научно-практ. конф. - Саратов, 2000. -С. 31-33.

Романова, Л.В. Некультивируемые формы Francisella tularensis: условия получения и реверсии в исходное состояние / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, С.О. Водопьянов и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 2000. - № 2. - С. 11-15.

Романова, Л.В ПЦР и проблема некультивируемых форм Francisella tularensis / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина // Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальянской науч. конф. - Санкт Петербург, 2000. - С. 215.

Пичурина, Н.Л. Совершенствование тактики лабораторных исследований при эпизоотологическом мониторинге природных очагов туляремии / Н.Л. Пичурина, Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Л.В. Романова, С.А. Гавринев, В.В. Баташов и др. // Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальянской науч. конф. -Санкт Петербург, 2000. - С. 197.

Romanova, L.V., Kudryakova T.A., Makedonova L.D., Kachkina G.V., Mischankin B.N. Genotyping of Vibrio cholerae bacteriophages using arbitrary primer polymerase chain reaction (AP-PCR) / L.V. Romanova, T.A. Kudryakova, L.D. Makedonova, G.V. Kachkina, B.N. Mischankin // The 9^th International Congress for Culture Collection (ICCCI). - Brisbane.-Australia, 2000. - P. 105.

Мишанькин, Б.Н. Туляремия: перспективы использования полимеразной цепной реакции при эпидемиологическом надзоре / Б.Н. Мишанькин, Э.А. Москвитина, Н.Л. Пичурина. Л.В. Романова и др. // Актуальные вопросы особо опасных инфекций. - Нальчик, 2000. - С. 49-51.

Romanova, L.V. Transfer of Francisella tularensis to the nonculturable state: indaction and condition favourable for reversion / L.V. Romanova, B.N. Mischankin, N.L. Pichurina // The 3-rd International Conference on Tularemia. - Umea. - Sweden, 2000. - P. 25.

Романова, Л.В. Осмотический стресс у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, Н.Я. Шиманюк, Т.Г. Мордвинцева, Б.Н. Мишанькин // Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг: Матер. Российской научно-практ. конф. - Москва, 2002. - С. 83.

Москвитина, Э.А. Компьтерные базы данных для эпизоотического и эпидемического процессов при туляремии / Э.А. Москвитина, Г.Б. Анисимова, Н.Л. Пичурина, Б.Н. Мишанькин, И.В. Орехов, С.Ю. Водяницкая, Д.А. Феронов, Л.В. Романова // Эпидемиологический надзор и социально - гигиенический мониторинг: Матер. Российской научно - практ. конф. - Москва, 2002. - С. 67-68.

Орехов, И.В. Особенности фаунистической структуры паразитарных систем некоторых природно-очаговых инфекций в условиях крупного города / И.В. Орехов, Э.А. Москвитина, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, А.Д. Линкович, В.И. Адаменко, С.Ю. Водяницкая, Л.В. Романова и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - Вып. 1/83. - С. 64-72.

Romanova, L.V. Influence of osmotic stress on Francisella tularensis / L.V. Romanova, N.Ya. Shimanyek, T.G. Mordvintseva, B.N. Mishankin // Fourth International Conference on Tularemia. The Assembly Room, City of Bath, Romsey. - UK, 2003. - P. 10.

Романова, Л.В. Место ПЦР в эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии Ростовской области / Л.В. Романова, Н.Л. Пичурина, Э.А. Москвитина, С.Ю. Водяницкая и др. // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Матер. 4-й Межгосударст. научно-практ. конф. государств - участников СНГ. - Саратов, 2003. - С. 157-160.

Романова, Л.В. Тепловой стресс и белок теплового стресса GroEL у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов, И.П. Олейников и др. // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 33-39.

Романова, Л.В. Солетолерантность и осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии / Л.В. Романова, Н.Я. Шиманюк, С.Р. Саямов, А.К. Киселева и др. // Биотехнология. - 2004. - № 6. - С. 27-33.

Романова, Л.В. Изучение солевого стресса туляремийного микроба с помощью ОП-ПЦР / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всеросс. научно-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 192.

Романова, Л.В. Возбудитель туляремии: современные аспекты экологии и диагностики / Л.В. Романова, Б.Н. Мишанькин // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств: Матер.VII Межгосударств. научно-практ. конф. Оболенск, 2006. - С. 119-120.

Размещено на Allbest.ru