Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Структурно-функциональная организация, механизм действия и иммунобиологические свойства г-D-глутамил-L-триптофана (Бестима)

14.00.36 - аллергология и иммунология

Колобов Александр Александрович

Санкт-Петербург

2008

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич

доктор биологических наук, профессор Самойлова Кира Александровна

доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

В настоящее время гуморальные регуляторные факторы иммунной системы, действующие как местно, так и на системном уровне, находятся в центре внимания клинических иммунологов как потенциальные лекарственные препараты. Они используются для модуляции активности иммунной системы с целью лечения целого ряда патологических состояний и заболеваний (Кетлинский и др., 1992; Кетлинский, Калинина, 1998; Новиков, 1999; Jeffery, 2004). Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают низкомолекулярные медиаторы полипептидной природы. Их особая роль заключается в тесной функциональной взаимосвязи с другими гормонами, особенно с гормонами гипоталамуса, гипофиза, надпочечников и половых желез, обеспечивающей один из механизмов реализации нейроиммуноэндокринных взаимодействий (Blalock, 1989, Jiang et al., 1998, Dantzer, 2004).

Действие низкомолекулярных пептидных биорегуляторов селективно и высокоспецифично, их эффективные концентрации лежат в зоне микро- наномолярных значений. Как правило, они нетоксичны и неиммуногенны, время их действия ограничено, они быстро разлагаются до аминокислот под действием протеолитических ферментов. Совокупность уникальных биологических свойств и возможности промышленного получения низкомолекулярных пептидов с помощью методов химического синтеза делают этот класс соединений одним из наиболее перспективных кандидатов для разработки новых лекарственных препаратов (Шабанов, 2006).

Одной из задач современной иммунофармакологии является изучение структурно-функциональной организации биорегуляторов, т.е. зависимости проявления биологической активности от структуры молекул, которое помогает установить механизмы их действия на молекулярном и клеточном уровнях. Знание структурно-функциональной организации позволяет целенаправленно подходить к конструированию новых аналогов, обладающих селективной активностью и уникальными фармакологическими свойствами, стимулирует разработку лекарственных препаратов на их основе. В тоже время понимание механизмов функционирования лекарственных препаратов позволяют более обоснованно и эффективно применять их в иммунокорригирующей терапии (Козлов и др., 2001; Нестерова и др., 2002). В связи с этим, разработка новых синтетических иммуномодуляторов пептидной природы и изучение механизмов их действия является актуальной теоретической и практической задачей.

Настоящее исследование посвящено изучению иммунотропной активности нового семейства иммуномодулирующих препаратов - г-глутамил содержащих дипептидов, исследованию их структурно-функциональной организации, установлению механизма действия и клинико-иммунологической характеристике наиболее активного по совокупности использованных тестов соединения г-D-глутамил-L-триптофана.

Результаты проведенных исследований положены в основу включения лекарственного препарата Бестим, в котором г-D-глутамил-L-триптофан используется в качестве фармакологически активной субстанции, в терапию заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Тх-1/Тх-2 звеньев иммунитета и снижением функциональной активности макрофагов.

Цели исследования:

Изучение закономерностей структурно-функциональной организации г-глутамил содержащих дипептидов, исследование спектра иммуномодулирующей активности и механизма действия г-D-глутамил-L-триптофана, разработка нового иммунотропного препарата пептидной природы на его основе.

Основные задачи исследования:

1. исследовать взаимосвязь структура-активность в ряду г-глутамил содержащих дипептидов и осуществить дизайн структуры с наиболее высокой иммуномодулирующей активностью;

2. изучить влияние г-D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку, пролиферативную и функциональную активность иммунокомпетентных клеток;

3. провести исследование взаимодействие Бестима с клеточными рецепторами;

4. исследовать фармакокинетические свойства Бестима при различных путях введения препарата;

5. изучить иммуномодулирующее действие Бестима в экспериментальных моделях с преимущественной активацией иммунного ответа по Тх-1 или Тх-2 типу при различных путях введения препарата;

6. провести клинико-иммунологическую характеристику лекарственного препарата Бестим в ходе клинических испытаний.

Научная новизна:

Впервые показано, что дипептиды, содержащие глутаминовую кислоту, соединенную г-связью со следующим аминокислотным остатком, а также их аналоги с в-связью по аспарагиновой кислоте обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Проведенные исследования выявили такие структурные особенности нового семейства иммуномодуляторов как предпочтительность глутаминовой кислоты по отношению к аспарагиновой в первом положении, наличие триптофана с немодифицированным индольным кольцом и глутаминовой кислоты в D-конфигурации, отсутствие модификаций на N- и С-концах молекулы. Доказано, что наибольшей иммуностимулирующей активностью обладает активностью г-D-глутамил-L-триптофан (Бестим, от BE(neficial) ST(imulator) of IM(munity)).

Установлено, что [³H]Бестим с высоким сродством связывается с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши, а также плазматическими мембранами, выделенным из этих клеток. В концентрациях 10^-10-10^-6М Бестим снижает аденилатциклазную активность мембран макрофагов и тимоцитов мыши.

Фармакологическое действие препарата определяется усилением дифференцировки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов. При действии in vitro Бестим усиливает продукцию ИЛ-2 и экспрессию его рецептора лимфоцитами, усиливает их пролиферативную активность. В модельных системах in vivo Бестим стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, активирует макрофаги и естественные киллерные клетки. Установлено, что иммуномодулирующее действие Бестима идентично как при парентеральном, так и пероральном применении.

В модели экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием, усиливая антиген-специфический иммунный ответ с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа. В модели аллергической бронхиальной астмы показано ингибирующее действие препарата на местные и системные проявления патологического процесса.

Иммуномодулирующее действие Бестима изучено при его применении в комплексной терапии пациентов с гнойно-септическими процессами, больных распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза и инфильтративным туберкулезом легких. Динамика клинико-иммунологических показателей после курса препарата свидетельствует о стимуляции антиген-специфического иммунного ответа, функциональной активности Т-клеток, преимущественной активации Т-хелперов 1 типа.

Основные положения, выносимые на защиту:

г-D-гутамил-L-триптофан (Бестим) обладает дозозависимым, невидоспецифичным иммуномодулирующим действием и наиболее активен среди г-глутамил содержащих пептидов.

Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным селективным взаимодействием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

Биодоступность препарата при внутрибрюшинном и пероральном путях введения одинакова и составляет 55-60%.

Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-хелперов 1 типа.

Введение Бестима приводит к усилению антиген-специфического иммунного ответа.

Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием в модели экспериментального генерализованного туберкулеза.

В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических IgE и тканевые проявления аллергического иммунного ответа.

Бестим эффективен при комбинированном лечении больных со вторичными иммунодефицитами различной этиологии, причем положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием препарата.

Практическая значимость:

Практическая ценность работы заключается в установлении закономерностей структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений - г-глутамил содержащих пептидов; дизайне структуры нового иммуномодулирующего соединения и создании на ее основе нового отечественного лекарственного препарата Бестим; демонстрации иммуномодулирующего эффекта Бестима, связанного с преимущественной активацией Т-хелперов первого типа и нормализацией баланса между Тх-1 и Тх-2, при парентеральном и пероральном применении; установлении механизмов его действия; определении оптимальных схем использования препарата; изучении эффективности включения иммуномодулирующей терапии с помощью препарата Бестим в стандартные схемы лечения инфекционных заболеваний.

Результаты, полученные в ходе выполнения исследования, использованы для регистрации и получения разрешения на выпуск в обращение препарата «Бестим, 100 мкг, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» (рег.уд. PN03335/03 от 29.12.2006). В настоящее время препарат выпускается ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России.

Личный вклад автора в проведенные исследования:

Работа выполнена лично автором на базе ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Ряд исследований выполнен совместно с сотрудниками ГосНИИ ОЧБ к.х.н. Смирновой М.П., к.х.н. Колодкиным Н.И., Шпенем В.М., к.х.н. Прусаковым А.Н., Афониной И.В., Трофимовым А.В., Родиным С.В., к.м.н. Пигаревой Н.В., к.м.н. Петровым А.В., Демьяновым А.В., Боковановым В.Е. и другими. Работы по радиорецепторному анализу Бестима проводились на базе Филиала института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино) под руководством д.б.н. Наволоцкой Е.В. Работы по изучению влияния Бестима в модели экспериментального генерализованного туберкулезного процесса проводились на базе Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи под руководством д.м.н. Виноградовой Т.И. Обработка результатов фармакокинетических исследований проведена совместно с сотрудником Института токсикологии ФМБА России (Санкт-Петербург) Трефиловым В.В. Клинические испытания Бестима в терапии хламидиоза проведены на базе клиники кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии им. С.М.Кирова МО России (Санкт-Петербург) под руководством д.м.н. Позняка А.Л., в терапии туберкулеза легких - на базе клиники Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии под руководством д.м.н. Скворцовой Л.А., в терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний - на базе клинической больницы №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ РФ (Москва) под руководством к.м.н. Захарченкова В.А. По всем полученным совместно результатам имеются совместные публикации. Соискатель приносит своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы:

Основные результаты исследований и положения диссертационной работы были представлены и доложены на: 25 Европейском пептидном симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском пептидном симпозиуме (Миннеаполис, США, 1999), 17 Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Сидней, Австралия, 2000), 26 Европейском пептидном симпозиуме (Монпелье, Франция, 2000), 42 Междисциплинарной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Сан-Диего, США, 2002), 27 Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), 12 Международном иммунологическом конгрессе (Монреаль, Канада, 2004), VIII и Х Всероссийском научном форуме им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006), XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта, 2005), 29 Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006), 6-ой ежегодной Конференции Американского Общества Клинических Иммунологов (Сан Франциско, 2006), 13 Международном иммунологическом конгрессе (Рио де Жанейро, Бразилия, 2007).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в их числе 13 российских и международных патентов и 10 работ, изданных в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, включая 86 таблиц и 32 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 355 работ (40 отечественных и 315 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химический синтез пептидов. г-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги с аспарагиновой кислотой синтезированы методами классического пептидного синтеза в растворе или твердофазным способом. Все полученные соединения были индивидуальны по данными тонкослойной хроматографии, их чистота по данным ОФ ВЭЖХ была не менее 95%, аминокислотный состав соответствовал теоретическому (±10%), расчетные молекулярные массы совпали с экспериментально определенными (±0.5%).

Экспериментальные животные и введение препаратов. В работе были использованы лабораторные мыши линий CBA, Balb/c, C57Bl/6 и F1 (CBAЧC57Bl/6) весом 18-20 г и белые беспородные крысы весом 160-180 г (питомник лабораторных животных Рапполово). Кроме того, использовались также SPF мыши линии Balb/c и аутбредные SPF мыши Swiss Webster (питомник лабораторных животных Пущино). Изучаемые соединения разводили в стерильном физиологическом растворе (ФР) и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл. Для перорального (п/о) введения препараты разводили в дистиллированной воде и вводили с помощью желудочного зонда в объеме 200 мкл. Контрольным животным вводили ФР в/б или дистиллированную воду п/о в тех же объемах.

Методы оценки иммуномодулирующей активности препаратов. Уровень экспрессии маркеров дифференцировки на клетках костного мозга (CD90.1, CD117), тимуса (CD4, CD8) и селезенки (CD3, CD4, CD8) мышей и лимфоцитах периферической крови человека (CD16, CD25) определяли с помощью комплемент-зависимого лимфоцитотоксического теста с соответствующими моноклональными антителами (Terasaki et.al., 1972) или с помощью проточной цитофлюориметрии с флюоресцеин- или фикоэритрин-меченными МАТ на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter). Пролиферативную активность тимоцитов и спленоцитов оценивали по включению [³H]-тимидина в реакции бласттрансформации лимфоцитов после стимуляции митогенами или специфическими антигенами. Спонтанную или митоген-(антиген)стимулированную продукцию цитокинов в супернатантах культур клеток или цельной крови оценивали с помощью соответствующих ИФА тест-систем. Активность интерлейкина-2 (ИЛ-2) определяли с помощью ИЛ-2 зависимой линии CTLL-2. Функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов определяли в тесте люминолзависимой хемолюминисценции. Для изучения хемотактической активности использовали метод миграции лейкоцитов под агарозой (Nelson et al., 1975). Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по отношению к предварительно опсонизированным пекарским дрожжам. В качестве мишеней для естественных киллеров использовали клетки мышиной В-клеточной линии Yac-1 (банк клеточных культур Института цитологии РАН), меченные [³Н]-уридином. В качестве моделей иммунного ответа in vivo использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа, иммунизацию растворимым (овальбумином) и корпускулярным (эритроциты барана) антигенами.

Фармакокинетические исследования. Содержание Бестима в системном кровотоке мышей после внутривенного, внутрибрюшинного или перорального введения определяли в динамике, используя разработанный нами набор «ИФА-Бестим» на основе твердофазного конкурентного иммуно-ферментного анализа. В наборе использованы моноспецифические поликлональные антитела кролика к Бестиму, конъюгаты Бестим-биотин и авидин-пероксидаза.

Cвязывание [³H]Бестима с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши. Взаимодействие Бестима с макрофагами и тимоцитами мыши, а также с плазматическими мембранами этих клеток исследовали с помощью радиорецепторного анализа, используя [³Н]-Бестим, полученный методом твердофазного радиоизотопного обмена, в качестве лиганда. Активность аденилатциклазы определяли с помощью [³²P]ATФ по методу (Saltarelli et al., 1985).

Модель экспериментального туберкулезного процесса. Экспериментальный генерализованный туберкулез (ТБ) вызывали инокуляцией в хвостовую латеральную вену второй генерации 3-х недельной культуры M. bovis штамм 8 (0,1 мг влажной культуры на мышь) или M. tuberculosis Erdman (110⁷ микробных тел на мышь). Начиная с седьмого дня после инокуляции инфекта, каждые два дня проводились пробные вскрытия мышей из группы контроля заражения с визуальной оценкой легких с целью выявления фокусов специфического воспаления. Лечение начинали при появлении в легких множественных субмилиарных или единичных милиарных очагов. Мышей всех опытных групп лечили противотуберкулезными препаратами в средних терапевтических дозах, животных, получавших иммунотерапию, - дополнительно Бестимом в течение 5 или 10 дней, начиная с первого дня лечения противотуберкулезными препаратами. Бестим вводили как в/б, так и п/о. Результаты лечения регистрировали на 5, 12, 19 и 33 дни от начала лечения. Сравнение проводили с зараженными нелечеными животными (контроль заражения) и с группой контроля лечения, получавшей только противотуберкулезные препараты (контроль лечения). Тяжесть течения ТБ процесса оценивали по макроскопическому исследованию легких и селезенки, рассчитывая индекс поражения (ИП) легких и коэффициенты массы (КМ) селезенки и легких, по высеваемости микобактерий из селезенки и легких, выражая в колониеобразующих единицах (КОЕ), по гистологическому изучению легких. Параллельно оценивали субпопуляционный состав тимуса и селезенки, митоген- и антиген-специфическую пролиферацию спленоцитов и продукцию цитокинов, уровень цитокинов в сыворотке крови.

Модель иммунного ответа аллергического типа. Использовали модель, описанную в (Kato et al., 1999). В качестве аллергена для двукратной иммунизации и трехкратного аэрозольного бустирования использовали овальбумин (OVA). Бестим вводили после повторной иммунизации перед первой экспозицией аэрозолю в течение 5 дней в дозе 0,1 и 1 мкг/кг. При оценке тяжести экспериментальной аллергической астмы исследовали клеточность и цитологический состав бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), титры анти-OVA IgE в БАЛ и сыворотке и проводили гистологическмй анализ тканей легких.

Клинико-иммунологическая характеристика Бестима. Исследование проводилось на клиническом материале, полученном от больных, которые участвовали в клинических исследованиях эффективности и безопасности применения Бестима в сочетанной терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний, хламидиоза и инфильтративного диссиминированного туберкулеза легких в рамках 2 фазы клинических испытаний. Бестим применяли в виде курса из 5 или 10 ежедневных, или проводимых через один день инъекций по 100 мкг. Во всех случаях иммунотерапия Бестимом проводилась на фоне стандартной этиотропной терапии соответствующих заболеваний. При хламидиозе и туберкулезе химиотерапия назначалась с учетом устойчивости возбудителя бактериостатическим препаратам. Периферическую кровь анализировали до начала терапии, по ее окончании и через 3 месяца после окончания курсов этиотропной терапии. Оценивали общее количество лимфоцитов, процентное и абсолютное число зрелых CD3⁺ Т-лимфоцитов, CD4⁺ и CD8⁺ клеток, В-лимфоцитов, ответ Т-лимфоцитов на ФГА или специфический антиген в РБТЛ, экспрессию «активационных маркеров» на Т-лимфоцитах, уровни спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, уровни неспецифических иммуноглобулинов, циркулирующих в крови иммунных комплексов, бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов.

Статистическая обработка результатов. Выполнялась стандартными методами с помощью t критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни, критерия ч², точного критерия Фишера. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ г-ГЛУТАМИЛ СОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ

г-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги получены методами химического синтеза. Все соединения были гомогенны по данным аналитической ОФ ВЭЖХ, имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствовавшие теоретическим. Биологическую активность аналогов оценивали в тестах in vitro изменению экспрессии Thy-1 (CD90.1) антигена на пре-Т-клетках костного мозга мыши, пролиферации клеток тимуса мыши, стимулированных субоптимальной дозой лектинов, и продукции ИЛ-2 митоген-стимулированными спленоцитами мыши.

Сравнительное изучение биологической активности б-; в- и г-пептидов показало, что замена б- пептидной связи на г-связь приводит к значительному усилению иммуностимулирующей активности соединений. Так, г-L-Glu-L-Trp стимулировал экспрессию Thy-1 антигена в более широком диапазоне концентраций (0,01 - 100 мкг/мл), и его активность была более выражена, чем у соответствующего б-соединения. Принимая во внимание, что г-пептид был значительно более активным, в качестве соединения-лидера был выбран г-L-Glu-L-Trp, и во всех последующих полученных аналогах мы сохранили этот тип соединения двух аминокислотных остатков. Исследование структурно-функциональной организации г-дипептидов проведено методом заместительной модификации. Список синтезированных и исследованных аналогов приведен в таблице 1.

Таблица 1

Структура синтезированных и исследованных соединений

Химическое название	Химическая структура	Химическое название	Химическая структура
б-L-глутамил- L-триптофан		-L-глутамил- L-тирозин
-L-глутамил- L-триптофан		-L-глутамил- L-фенилаланин
-L-аспартил- L-триптофан		-L-глутамил- L-гистидин
б-L-аспартил- L-триптофан		-L-глутамил- L-лейцин
-D-аспартил- L-триптофан		-L-глутамил- L-пролин
б-D-аспартил- L-триптофан		-L-глутамил- Nin-формил- L-триптофан
-L-глутамил- L-триптофан		N-метил--D-глутамил- L-триптофан
-D-глутамил- L-триптофан		N-ацетил--D-глутамил- L-триптофан
-L-глутамил- D-триптофан		г-D-глутамил- L-триптамин
-D-глутамил- D-триптофан		-D-глутамил- L-триптофил-амид

Суммировав результаты проведенных исследований, мы сделали следующее заключение о структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений: аминокислоты должны быть соединены г- или в-амидной связью; в первом положении глутаминовая кислота предпочтительна по сравнению с аспарагиновой кислотой; аминокислота в первом положении должна быть в D-конфигурации; во втором положении должен находиться остаток триптофана с немодифицированным индольным кольцом; N- и С-концы молекулы должны быть немодифицированными.

Структуру нового семейства иммуномодуляторов можно описать общей формулой:

R - NH - CH - (CH₂)_n - C - X,

СООН O

где n=1,2;

R: H, низший ацил или низший алкил;

X: ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное.

Для дальнейшего расширенного изучения был выбран -D-глутамил-L-триптофан, как наиболее активный из исследованных представителей семейства г-глутамил содержащих дипептидов (рис.1). Две структурные особенности этого дипептида - гамма связь между аминокислотными остатками и стереоконфигурация аминокислоты в первом положении - обуславливают его устойчивость к действию протеолитических ферментов, а также предопределяют возможность перорального применения.

Рис.1. Структурная формула -D-глутамил-L-триптофана.

Бестим - это натриевая соль -D-глутамил-L-триптофана, или согласно международной номенклатуре IUPAC натриевая соль 2-амино-4-[[1-кабокси-2-(1Н-индол-3-ил)этил]карбомоил] бутановой кислоты. Брутто формула этого соединения С₁₆Н₁₈N₃O₅Na, молекулярная масса - 355,3. С органолептической точки зрения это бесцветный аморфный порошок без запаха. Разработан метод крупномасштабного классического синтеза Бестима и аналитические методики, совокупность которых позволяет подтвердить структуру полученного соединения и оценить степень его чистоты. На основе этих данных, а также изучения стабильности препарата при хранении, была разработана и утверждена Фармакопейная статья ФСП-42-0303140301 на субстанцию препарата Бестим. Оценка качества препарата производится по следующим показателям: растворимость образцов; прозрачность, цветность, рН, удельное вращение и удельное поглощение их растворов; содержание воды, наличие посторонних примесей и остаточных органических растворителей; микробиологическая чистота и пирогенность.

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕСТИМА

Активность Бестима в модельных системах in vitro. При исследовании структурно-функциональной организации г-глутамил дипептидов было показано, что краткосрочная (2-24 часа) инкубация с Бестимом стимулирует экспрессию Thy-1 антигена пре-Т-клетками костного мозга и продукцию ИЛ-2 спленоцитами мыши (рис.1, А). Усиление КонА-индуцированной пролиферации тимоцитов крысы сопровождалось активацией лектин-стимулированной продукции ИЛ-2 клетками селезенки (рис.1, Б).



Рис.1. Влияние Бестима на экспрессию Thy-1 антигена на клетках костного мозга и продукцию ИЛ-2 спленоцитами мыши (А), пролиферацию тимоцитов и продукцию ИЛ-2 спленоцитами крысы (Б). * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Влияние Бестима на экспрессию клеточных маркеров и функциональную активность зрелых лимфоидных клеток, циркулирующих в периферической крови, было исследовано по изменению экспрессии CD16 и CD25 антигенов на мононуклеарах периферической крови (МПК) человека и продукции цитокинов этими клетками при 24-х часовой инкубации с препаратом. Оказалось, что Бестим усиливал экспрессию CD16 и CD25 только в присутствии ФГА, причем индукция CD16 антигена происходила лишь под влиянием узкого диапазона высоких концентраций препарата (0,1-1 мкг/мл, рис.2А). Усиление экспрессии CD25 антигена происходило в том же диапазоне концентраций, как и активация ФГА-индуцированной продукции ИЛ-2 (0,01-10 мкг/кг). В то же время Бестим в концентрациях 0,1-10 мкг/мл усиливал спонтанную продукцию ИЛ-1в и ФНОб (рис.2Б).



Рис.2. Влияние Бестима на экспрессию CD16, CD25 антигенов на поверхности МПК человека и продукцию цитокинов этими клетками. А. Процент клеток, экспрессирующих CD16 и CD25 антигены, и ФГА-стимулированная продукция ИЛ-2. Б. Спонтанная продукция ИЛ-1в и ФНОб. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Таким образом, иммуностимулирующее действие Бестима в модельных системах in vitro было воспроизводимым, невидоспецифичным и дозозависимым. Характер кривой «доза-эффект» был типичен для полипептидных лигандов, с максимальным эффектом в средних дозах и снижением, вплоть до исчезновения, активности в самых низких и высоких концентрациях.

Изучение фармакокинетики Бестима. Фармакокинетическое исследование проведено при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении Бестима мышам СВА. Количественное определение препарата в сыворотке мышей выполнялось с помощью разработанного нами набора «ИФА-Бестим», в котором реализован один из вариантов твердофазного иммуноферментного конкурентного анализа. На рис.3 представлены сравнительные графики трёх фармакокинетических кривых препарата в одном масштабе.

Значения параметров модельных кривых, полученных при использовании трех относительно независимых способов оценки фармакокинетических показателей (модельно-независимая (прямая) оценка; компартментные модели и метод профиля поступления), практически совпадали и лежали в пределах точности оценки.

Рис.3. Графики экспериментальных фармакокинетических кривых Бестима при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении в дозе 2500 мкг/кг.

Расчет фармакокинетических показателей Бестима при различных путях введения показал, что распределение препарата в организме, по всей видимости, ограничено внеклеточной водной фазой: начальный объем распределения составляет 100-130 мл/кг, кажущийся объем стационарного распределения характеризуется умеренной величиной - 250-350 мл/кг. Препарат быстро выводится из системного кровотока - среднее время его циркуляции составляет 10-11 минут; скорость элиминации характеризуется высоким клиренсом - 25-30 мл/кг/мин. При в/б и п/о путях введения фармакокинетические кривые имеют типичный вид с затянутым нарастанием в начале. Скорость конечного снижения концентрации достоверно отличается от аналогичного показателя для в/в введения, что связано, по-видимому, с постепенным поступлением препарата в кровоток из места введения. Полное время присутствия препарата в организме при в/б и п/о путях введения составляет, соответственно, 20 и 50 минут, а среднее время поступления лежит в пределах 9-10 и 30-35 минут, соответственно. Биодоступность при в/б и п/о введении Бестима практически одинакова и составляет 55-60%.

Связывание [³Н]-Бестима с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши. [³Н]Бестим с высоким сродством связывается с обоими типами клеток и их плазматическими мембранами. Зависимость общего, неспецифического и специфического связывания [³Н]Бестима при 4^оС от времени приведена на рис. 4. Анализ специфического связывания Бестима с макрофагами (рис.5А) и тимоцитами (рис.5Б) показал, что на поверхности этих клеток имеется один класс участков связывания (рецепторов). Величины Kd равные 2,1±0,1 нМ и 3,1+0,2 нМ для макрофагов и тимоцитов, соответственно, свидетельствуют о высокой аффинности связывания. Количество участков специфического связывания в расчете на 1 клетку составляет 43660+3050 (макрофаги) и 39130±2860 (тимоциты).

Показано, что обработка макрофагов трипсином приводит к потере ими способности специфически связывать [³Н]Бестим. Это является свидетельством белковой природы рецептора или, по-крайней мере, той его части, которая участвует в связывании с лигандом.

Рис. 4. Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания [³H]Бестима с перитонеальными макрофагами (А) и тимоцитами (Б) мыши от времени инкубации. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием.



Рис.20. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [³H]Бестима с перитонеальными макрофагами (1) и тимоцитами (2) мыши (А) и плазматическими мембранами, выделенными из перитонеальных макрофагов (1) и тимоцитов (2) мыши (Б). B и F - молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида, соответственно.

Для характеристики специфичности связывания в качестве потенциальных конкурентов [³Н]Бестима были протестированы глутаминовая кислота, триптофан, б-Glu-Trp, АКТГ (1-24), -эндорфин, люлиберин, пептид -сна, нейротензин, вещество P, кассинин, меллитин, соматостатин, вазопрессин, энкефалины. Оказалось, что только б-Glu-Trp ингибировал специфическое связывание [³Н]Бестима с макрофагами и тимоцитами (Ki 0.9±0.1 нМ и 1,1±0,1нМ, соответственно). В концентрациях 10 - 1000 нМ Бестим снижал активность аденилатциклазы плазматических мембран перитонеальных макрофагов и тимоцитов мыши на 30-35%.

Активность Бестима в модельных системах ex vivo. Оценка экспрессии маркеров дифференцировки клетками костного мозга SPF мышей Swiss Webster была проведена с помощью проточной цитофлюориметрии. Исследование показало, что однократное или курсовое введение препарата, как при внутрибрюшинное (в/б), так и пероральное (п/о), приводит к статистически достоверному увеличению количества клеток, несущих Thy-1 (CD90.1) и с-kit (CD117) антигены (рис. 3). CD117 является маркером стволовых гемопоэтических и плюрипотентных клеток, усиление его экспрессии свидетельствует о стимулирующем влиянии Бестима на ранние этапы костномозгового лимфопоэза.

Рис.3. Влияние Бестима на экспрессию Thy-1 (CD90.1) и с-kit (CD117) антигенов на клетках костного мозга мышей. А. Процент Thy-1 позитивных клеток через 72 часа после трехкратного введения препарата. Б. Процент CD117 позитивных клеток через 24 часа после однократного в/б введения препарата. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

При исследовании влияния Бестима на субпопуляционный состав тимоцитов SPF мышей Balb/c было обнаружено снижение процента CD4+CD8+ клеток (на 10-25%), сопровождающееся увеличением относительного содержания CD4-CD8- тимоцитов (на 5-10%) и зрелых CD4+CD8- (на 10-15%) и CD4-CD8+ клеток (на 5-10%, рис. 4). Поскольку данные изменения не сопровождались изменениями клеточности тимуса, то введение Бестима, по-видимому, приводит к увеличению притока ранних предшественников тимоцитов из костного мозга в тимус и ускорению созревания промежуточных форм в зрелые CD4+ и СD8+ лимфоциты.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Изменение субпопуляционного состава клеток тимуса после курсового в/б введения Бестима (средние значения и стандартные отклонения процентов клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры; * - различия с контролем достоверны, p<0,05).

Воспроизводимые изменения субпопуляционного состава тимоцитов получены только при использовании животных без специфических патогенов. В то же время стимулирующее действие Бестима на пролиферацию тимоцитов и продукцию ИЛ-2 в ответ на КонА отмечалось у животных различных линий (рис.5). Препарат не влиял на нестимулированные клетки, но усиливал функциональную активность клеток тимуса при стимуляции суб- и оптимальной дозами КонА как при в/б, так и при п/о применении в дозах 0,1 - 1 мкг/кг.

А Б

Рис.5. Влияние Бестима на функциональную активность тимоцитов мыши при внутрибрюшинном и пероральном введении. А. КонА-индуцированная пролиферация тимоцитов (0,5 и 1 мкг/мл КонА). Б. КонА-индуцированная продукция ИЛ-2 (1 мкг/мл КонА). * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Достоверных изменений спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации спленоцитов выявлено не было. Наблюдалась тенденция к увеличению процента CD3+ лимфоцитов и небольшой сдвиг пропорции CD4+/CD8+ в сторону Т-хелперов. Бестим не влиял на спонтанную продукцию ИЛ-2 и ИФНг, но значительно (в 2-3,5 раза) активировал КонА-стимулированную продукцию этих цитокинов (рис.6А). Как спонтанная, так и митоген-индуцированная продукция ИЛ-4 были снижены в группах животных, получавших препарат в дозах 0,1 и 1 мкг/кг, причем эффект не зависел от способа введения препарата (рис.6Б). Наблюдаемые реципрокные изменения в продукции Тх-1 и Тх-2 зависимых цитокинов свидетельствуют, по-видимому, о преимущественной активации Т-хелперов 1 типа под влиянием Бестима.

Исследование периферической крови не выявило значимых изменений количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы или субпопуляций Т-клеток после введения Бестима. Уровни циркулирующих в крови мышей Т-клеточных цитокинов были ниже чувствительности использованных ИФА тест-систем.

А Б

Рис.6. Влияние Бестима на продукцию цитокинов спленоцитами мыши при внутрибрюшинном и пероральном введении. А. КонА индуцированная продукции ИЛ-2 и ИФНг (1 мкг/мл КонА). Б. Спонтанная и КонА-индуцированная (1 мкг/мл КонА) продукция ИЛ-4. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Для изучения влияния Бестима на активность естественных киллерных (ЕК) клеток препарат вводили мышам СВА трехкратно, в/б и через 72 часа после последнего введения исследовали продукцию ИЛ-2 спленоцитами и цитотоксическую активность ЕК клеток по отношению к клеткам лимфомы мыши Yac-1. Оказалось, что усиление цитотоксической активности, наблюдаемое в диапазоне доз 0,01 - 10 мкг/кг, сопровождается повышением КонА-индуцированной продукции ИЛ-2 клетками селезенки (рис.7А).

А Б

Рис.7. Влияние Бестима на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток и продукцию ИЛ-2 спленоцитами (А) и количество антителообразующих клеток и титры гемагглютинирующих антител при иммунизации эритроцитами барана. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Иммуностимулирующее действие Бестима оценено в модели иммунизации эритроцитами барана. Показано, что трехкратное введение препарата перед иммунизацией приводит на 5 день по завершении курса к достоверному увеличению количества антителообразующих клеток, которое сопровождается увеличением титров геммаглютинирующих антител (диапазон доз 0,01-10 мкг/кг, рис.7Б). Кроме того, трехкратное введение Бестима в дозах 0,1-10 мкг/кг непосредственно перед введением разрешающей дозы эритроцитов барана приводит к достоверному увеличению индекса реакции ГЗТ.

При изучении влияния Бестима на иммунный ответ животных, иммунизированных растворимым антигеном, в качестве которого был использован овальбумин (OVA), основное внимание было уделено развитию антиген-специфического ответа. Иммунизацию OVA проводили в неполном адъюванте Фрейнда в 1 и 15 дни эксперимента, а курсы Бестима - в 1-3 и 15-17 дни. Пролиферацию клеток селезенки, стимулированных OVA, оценивали на 15 и 29 дни.

А Б

Рис.8. Влияние Бестима на иммунный ответ при иммунизации овальбумином. А. Антиген-специфические пролиферация спленоцитов и продукция ИЛ-2 этими клетками на 29 день. Б. Антиген-специфическая продукция ИФНг и ИЛ-4 спленоцитами на 29 день. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Оказалось, что Бестим не вызывал усиления специфического ответа на антиген после первичной иммунизации, но значительно усиливал антиген-специфическую пролиферацию клеток селезенки на 29 день эксперимента. Достоверное усиление антиген-стимулированной продукции ИЛ-2 отмечено только в дозе 0,1 мкг/кг, однако именно в этой дозе наблюдалась и максимальная активация анген-специфической пролиферации спленоцитов (рис.8А). Усиление OVA-стимулированной продукции ИФНг наблюдалось в широком диапазоне доз 0,001 - 1 мкг/кг, при этом снижение антиген-специфической продукции ИЛ-4 отмечено в дозе 0,1 мкг/кг (рис.8Б).

Таким образом, данные, полученные при исследовании активности Бестима на моделях стимуляции иммунного ответа, свидетельствуют о том, что препарат обладает выраженной иммуностимулирующей активностью, усиливает антиген-специфический иммунный ответ, действуя на Т-клеточное звено иммунитета и стимулируя, преимущественно, созревание и функциональную активность Т-хелперов 1 типа.

Активность Бестима в модели экспериментального туберкулезного процесса. В патогенезе туберкулезной инфекции важное значение имеет дисбаланс между Т-хелперами 1 и 2 типа, приводящий к снижению антиген-специфической пролиферации, угнетению продукции Тх-1 зависимых цитокинов, повышению уровня ИЛ-4. Восстановление Tх1/Тх2 баланса и сдвиг его в сторону Тх1 типа необходимы для благоприятного исхода заболевания. Поскольку результаты предшествующих исследований показали, что механизм действия Бестима может быть связан с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа, мы выбрали модель экспериментального генерализованного туберкулеза для оценки возможности терапевтического применения Бестима и подтверждения ранее сделанных выводов.

Бестим назначался на фоне противотуберкулезных препаратов в дозах 0,01; 0,1; 1 и 10 мкг/кг в/б, ежедневно, по 5, 10 или 15 инъекций. В моделях классического, вялотекущего и остро прогрессирующего экспериментального ТБ у мышей, вызванного M.bovis, продемонстрирован выраженный лечебный эффект препарата в дозах 0,1 и 1 мкг/кг при его назначении на фоне сниженной продукции ИЛ-2 спленоцитами.

Максимальный терапевтический эффект выявлен при использовании Бестима при остро прогрессирующем экспериментальном ТБ, где под его влиянием к 30 дню от начала курса отмечалась положительная динамика массы тела, существенное снижение летальности (на 15-25%), уменьшение индекса поражения легких и высеваемости микобактерий из селезенки (рис.9А). При гистологическом исследовании тканей легких наиболее выраженные различия между опытными и контрольными группами также обнаружены при остро прогрессирующей инфекции. У мышей, получавших Бестим, параллельно достоверному снижению распространенности специфического воспаления в легочной ткани, сохранению многорядности бронхиального эпителия и стимуляции признаков напряженности местных иммунных реакций в легочной ткани отмечено отчетливое уменьшение альтеративного компонента воспаления (встречаемости скоплений ядерного детрита и нейтрофильных гранулоцитов).

А Б

Рис. 9. Влияние Бестима на показатели тяжести течения ТБ инфекции (А) и экспрессию маркеров клетками тимуса (Б) у мышей с остро прогрессирующим ТБ, вызванным инокуляцией M.bovis, на 30 день от начала курса иммунотерапии. * - различия с интактной группой достоверны, **- различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

Использование Бестима привело к значительному усилению экспрессии Thy-1, CD4 и CD8 антигенов на тимоцитах к 30 дню от начала курса иммунотерапии (рис. 9Б). Достоверное повышение экспрессии CD4 антигена и восстановление числа клеток с маркером Thy-1 в селезенке мышей, получавших Бестим, до показателей интактных мышей наблюдалось уже к 8 дню от начала курса препарата.

Под влиянием Бестима отмечено повышение пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки мышей как в нестимулированных культурах, так и при индукции пролиферации КонА и ЛПС. При остро прогрессирующем ТБ КонА-индуцированный ответ тимоцитов к 30 дню от начала использования Бестима повысился до 72% от уровня интактной группы при 36% у мышей, леченных только изониазидом (р<0,05), а спленоцитов - до 69% при 35% в контроле лечения (р<0,01).

Стимулирующий эффект Бестима на продукцию ИЛ-2 спленоцитами, проявлявшийся независимо от уровня ингибиции продукции цитокина, отмечен при всех вариантах течения инфекции. При остро прогрессирующем ТБ Бестим на 9 день от начала его курса стимулировал выработку цитокина до 73% от уровня интактных мышей против 22% в группе контроля лечения, на 15 - до 49% против 24%.

Действие Бестима на продукцию ИФНг и ИЛ-4 спленоцитами, а также на их содержание в сыворотке крови оценивалось только при вялотекущем варианте течения инфекции. При этом в КонА-стимулированных культурах клеток у мышей, леченных 0,1 и 1 мкг/кг Бестима, обнаружены разнонаправленные изменения цитокинов: повышение продукции ИФНг и снижение секреции ИЛ-4 (рис.10А). Такие изменения зафиксированы практически на всех сроках обследования при использовании Бестима в разных режимах. Содержание ИФНг и ИЛ-4 в сыворотке крови животных под влиянием Бестима менялось в тех же направлениях: уровень ИФНг повышался, а содержание ИЛ-4 - снижалось (рис.10Б).

А Б

Рис.10. Влияние Бестима на продукцию ИФНг и ИЛ-4 спленоцитами (А) и уровень этих цитокинов в сыворотке крови у мышей с вялотекущим ТБ, вызванным инокуляцией M.bovis, на 22 день от начала иммунотерапии. * - различия с интактной группой достоверны, **- различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

Стимулирующий эффект Бестима на Мф отмечен по снижению уровня внеклеточной 5-нуклеотидазы, стимуляции адгезивной способности Мф, нормализации продукции супероксидных радикалов Мф. Наблюдался восстанавливающий эффект Бестима на активность фагоцитоза Мф при ее ингибиции в ходе развития инфекции и под влиянием длительной (более месяца) терапии туберкулостатиками.

При терапии классического генерализованного ТБ процесса, вызванного M.tuberculosis, также обнаружено отчетливое позитивное влияние Бестима на течение заболевания. Отмечено снижение индекса поражения легких и коэффициента массы селезенки, снижение высеваемости микобактерий из легких животных, прошедших курс иммунотерапии (рис.11А). Гистологическое исследование срезов легких у инфицированных мышей подтвердило высокую терапевтическую эффективность Бестима как при парентеральном, так и пероральном введении в дозе 1 мкг/кг.

А Б

Рис.10. Влияние Бестима на показатели тяжести течения инфекции (А) и митоген- и антиген-индуцированную пролиферацию спленоцитов (Б) на 33 день после начала иммунотерапии у мышей с классическим ТБ, вызванным инокуляцией M.tuberculosis. * - различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

Лечебный эффект Бестима сопровождался стойким иммуномодулирующим действием препарата, наиболее выраженным в дозе 1 мкг/мг в/б или п/о. Интенсивность антиген-специфической пролиферации спленоцитов значимо увеличилась к 33 дню наблюдения (рис.11А), уровень митоген-индуцированной пролиферации практически не менялся на всех сроках наблюдения.

А Б

Рис.11. Влияние Бестима на экспрессию клеточных маркеров спленоцитами (А) и продукцию ИЛ-10 и ИЛ-12 BCG-стимулированными культурами спленоцитов (Б) на 12 день от начала иммунотерапии у мышей с классическим ТБ, вызванным инокуляцией M.tuberculosis. * -различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

иммуномодулирующий бестим дипептид

На ранних сроках после иммунотерапии отмечены стимуляция спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации тимоцитов и изменение субпопуляционного состава тимуса, наблюдавшиеся ранее у интактных животных. На 12 день наблюдалось достоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих CD25 и СD69 антигены (рис.10Б). Существенного усиления ИЛ-2 или ИЛ-4 продукции в ответ на BCG обнаружено не было. Продукция ИФНг спленоцитами имела даже тенденцию к снижению по сравнению с контролем терапии, однако было выявлено статистически достоверное снижение BCG-стимулированной продукции ИЛ-10 на фоне некоторого повышения продукции ИЛ-12 (рис.11Б).

Таким образом, в данной модели лечебный эффект Бестима сопровождался стойким иммуномодулирующим действием препарата. При классическом течении инфекции Бестим способствовал увеличению содержания зрелых Т-клеток в селезенке и экспрессии на спленоцитах маркеров активации, при остро прогрессирующем ТБ - усилению созревания Т-клеток в тимусе и их поляризации в сторону Тх-1. Использование Бестима привело также к повышению функциональной активности Тх-1 клеток (усиление пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки, продукции спленоцитами ИЛ-2, антиген-специфической продукции ИЛ-12, нормализации спонтанной и КонА-индуцированной продукции ИФНг). Под влиянием Бестима отмечалась нормализация уровня продукции спленоцитами Тх-2 зависимых цитокинов - ИЛ-4 и ИЛ-10. При этом наиболее значимые изменения активации спленоцитов и продукции ими цитокинов, указывающие на интенсивное развитие антиген-специфического ответа под действием Бестима, наблюдались через 14-21 день от начала его курса, а нормализация уровня большинства цитокинов - через месяц после назначения.

Активность Бестима в модели экспериментальной аллергической астмы.

В качестве модели патологического состояния, ведущую роль в патогенезе которого играют Т-хелперы 2-го типа, была выбрана модель аллергической астмы, вызванной ингаляционным введением OVA.

А Б

Рис. 12. Влияние Бестима на клеточный состав бронхо-альвеолярного лаважа (А) и уровни анти-OVA IgE в сыворотке и БАЛ (Б). * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

В экспериментах на животных в возрасте 6-8 недель было показано, что общая клеточность бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) под влиянием Бестима не изменяется (2,00±0,34 млн. клеток в контрольной группе; 1,96±0,99 млн. в группе, получавшей 0,1 мкг/кг препарата; и 2,21±1,16 млн. в группе, получавшей 1 мкг/кг). Однако при сравнении относительных долей отдельных популяций лейкоцитов в БАЛ отмечено достоверное снижение содержания эозинофилов и увеличение содержания макрофагов в группе, получавшей 1 мкг/кг Бестима (рис.12А). При анализе уровня антиген-специфических IgE в БАЛ выявлено достоверное дозозависимое снижение этих показателей в группах, получавших Бестим, по сравнению с контрольной группой. Уровни анти-ОVА IgE в сыворотках животных были достоверно ниже, чем в контроле, только в группе, получавшей 1 мкг/кг препарата (рис.12Б).

Морфометрический анализ препаратов от животных, получавших Бестим в дозе 0,1 мкг/кг, показал более чем двукратное снижение относительного содержания бокаловидных клеток в эпителии бронхов по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Также отмечено достоверное уменьшение инфильтрации вокруг бронхов и отчетливая тенденция к снижению интенсивности периваскулярной инфильтрации в обеих опытных группах, получавших Бестим.

Таким образом, в данной модели использование Бестима приводит к снижению интенсивности аллергического иммунного ответа как на местном, так и системном уровне. Поскольку в основе патогенеза аллергических процессов лежит активность Тх-2 клеток и секретируемых ими цитокинов, то можно предположить, что механизм действия Бестима при экспериментальной астме связан с подавлением поляризации Т-клеток в направлении Тх-2.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕСТИМА НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИМИ И ИНФЕКЦИОННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Основанием для проведения исследования клинической эффективности применения Бестима послужило разрешение №118 Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ от 04.07.02. Клиническими базами были утверждены клиника Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии (инфильтративный туберкулез легких, руководитель д.м.н. Скворцова Л.А.), клиническая больница №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ и СР РФ, Москва (гнойно-воспалительные заболевания в хирургии, руководитель к.м.н. Захарченков В.А.), клиника кафедры инфекционных болезней Военно-Медицинской Академии, Санкт-Петербург (урогенитальный и генерализованный хламидиоз, руководитель д.м.н. Позняк А.Л.). Во всех случаях иммунотерапия Бестимом проводилась на фоне стандартной этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

...