Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Характерной чертой современной вирусологии является развитие молекулярно-генетических исследований структуры и патогенности вирусов. Вместе с тем, что теоретическое и практическое значение таких исследований не вызывает сомнений, изучение сложного процесса взаимодействия вируса и клетки с позиций морфологии остается не менее актуальным. Так, если в 50-80-х гг. прошлого столетия имелись многочисленные публикации российских и зарубежных ученых, посвященные исследованиям морфологической структуры как вирусов, так и зараженных ими клеток, то на данный момент последняя российская монография, посвященная вопросам вирусной цитопатологии, была опубликована в 1986 г. (Букринская, 1986). Начиная с 2000 годов, в зарубежной литературе появились сообщения о необходимости возобновления ультраструктурных исследований в клеточной биологии, интерес к которым был снижен в конце прошлого столетия по разным причинам, в частности: ограниченности методологических подходов, перенаправленности исследований в сторону молекулярно-генетических методов, а также малочисленности специалистов-морфологов, способных дать точную интерпретацию данных (Kopecky, 1991; Afzelius, 2004; Griffiths, 2004). Последняя причина особенно характерна для России, так как на настоящий момент в области медицинской вирусологии практически не существует школы морфологов.

Известно, что в результате взаимодействия клетки и вируса возникает сложный комплекс морфологических и цитофизиологических изменений, которые специфичны только для данного типа взаимоотношений и не встречаются при других патологических состояниях клеток (Альштейн, 1982). Детальное ультраструктурное исследование взаимоотношений «вирус-клетка» позволяет решать как общебиологические проблемы (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эндо- и экзоцитоза и другие), так и медицинские, связанные с пониманием механизмов развития патологического процесса в макроорганизме. Не менее важно, параллельно ультраструктурному, проводить исследование функциональной и ферментативной активности инфицированных вирусом клеток, так как при синтезе нуклеиновых кислот и белковых компонентов вирусов могут использоваться ферментные системы самой клетки без их модификации, либо индуцируется синтез новых, не свойственных ей ферментов. Одномоментно, активность собственных клеточных энзимов резко угнетается. Таким образом, применение высокочувствительных методов определения ферментативной активности зараженных вирусом клеток является важным способом индикации вирусной репродукции, дифференцировки цитопатогенного действия вирусов, а также характера и формы инфекционного процесса в клетках (Greenberg, 2002). Несмотря на важность подобной информации, в литературе последних лет такие работы встречаются редко.

При защите организма от инфекционного агента клетки моноцитарной линии функционируют в качестве одного из основных компонентов его резистентности к возбудителю. Данные клетки в силу доступности методов их выделения, фракционирования и культивирования из периферической крови и перитонеального экссудата служат прекрасной моделью для изучения ряда общих цитофизиологических закономерностей. Клетки моноцитарной линии филогенетически относятся к самой древней системе защиты организма и являются эффекторами и модуляторами различных инфекционных процессов. На поверхности плазматической мембраны макрофагов выявлены многочисленные рецепторы, принимающие участие в процессах адгезии, эндо- и фагоцитоза, межклеточных взаимодействий, восприятия регуляторных воздействий, причем часть из них относится к рецепторам, присутствующим на всех стадиях созревания этих клеток от моноцитов до макрофагов (Купер, 1980; Cooper, 2002; Helmy, 2006). Несмотря на то, что с помощью специфических сывороток, включая моноклональные антитела, на мембране этих клеток выявлены различные категории антигенов, фагоциты различных видов млекопитающих связаны единством происхождения, общностью основных функций и сходством структур и метаболических процессов, обеспечивающих реализацию их функций. Используя в качестве модельной системы макрофаги перитонеального экссудата мышей без применения каких-либо индукторов воспаления и достигнув функциональной однородности клеточной популяции путем их культивирования, результаты исследований взаимодействия этих клеток с инфектами можно экстраполировать в целом на клетки моноцитарного происхождения класса млекопитающих. Данная популяция клеток соответствует резидентным макрофагов, а при воздействии инфекта они определяются как активированные.

Известно, что в процессе адгезии различных типов вирусов участвуют интегрины (гликопротеины, состоящие из различных комбинаций - и -цепей), которые также присутствуют на мембране макрофагов (Hynes, 1992, Roivainen, 1994, Гавриловская, 1999). На настоящий момент различными исследователями доказано участие клеток моноцитарного происхождения в развитии защитного ответа организма при вирусном инфицировании. В основном, в подобных исследованиях очерчивается функциональная характеристика этих клеток, связанная с их способностью к синтезу различных цитокинов (Morahan et al., 1985; Mogensen, 1988; Wu and Morahan, 1992, Marcotic, 1996). Так, противовирусная активность моноцитов / макрофагов подразделяется на прямую и опосредованную (Baskin et al., 1997). Первая определяется внутриклеточной способностью макрофагов нарушать вирусную репликацию либо ей способствовать, а вторая обусловливается внеклеточной активностью макрофага влиять на вирус. Что же касается непосредственного взаимодействия вирусов с макрофагами, то существует мнение, что их участие в развитии вирусных болезней ограничено свойствами «профессионального» фагоцита, способного только к фагоцитозу зараженных вирусом клеток-мишеней и их фрагментов (Семенов, 1982; Смородинцев, 1975, 1983). Известны единичные работы, в которых с позиции вирусной цитопатологии частично описаны морфологические внутриклеточные изменения макрофагов после их заражения вирусами: гриппа (Скрипченко и др., 1997), Денге (Mosquera, 2005) и вируса иммунодефицита человека (Pelchen-Matthews, 2003). Однако оценка цитохимического состояния макрофагов не приводилась. Тем не менее, немаловажны сообщения, что при размножении, в частности, вируса иммунодефицита человека в макрофагах, при невыявляемом цитопатическом действии определяется снижение бактерицидного потенциала и синтезирующей активности клеток. Это, в последующем, может выражаться в реализации потенциала макрофагов как инициаторов иммунного ответа организма (Schrier, 1993).

На настоящий момент, при исследовании патогенеза вирусных инфекций, к важному и нерешенному вопросу относится определение в начальный период заболевания места кодирования главных детерминант вирусов. Это включает: 1) выявление типа клеток, поддерживающих первый этап размножения вируса при естественной инфекции; 2) обнаружение локализации рецепторов, используемых вирусами при адгезии на поверхность клеток; 3) выявление механизма тропизма вирусов к тканям, где они также могут размножаться. В этой связи весьма актуальными являются исследования, связанные со значением клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Для комплексной оценки процесса взаимодействия вируса и макрофага в качестве инфекционных агентов мы использовали вирусы, принадлежащие к трем семействам: Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae. Несмотря на то, что все эти вирусы являются РНК-содержащими, мы руководствовались их структурными различиями. Так, Picornaviridae относятся к вирусам без наличия суперкапсида, тогда как вирусы остальных двух семейств имеют липопротеиновый суперкапсид. Нами также взято во внимание, что Hantavirus, сем. Bunyaviridae, отличается структурой нуклеокапсида - спиральной и отрицательной нитью РНК, тогда как вирусы семейств Picornaviridae и Flaviviridae - икосаэдральной и положительными нитями РНК. Эти признаки могут определять специфичность взаимодействия данных вирусов с макрофагами.

Цель работы: дать комплексную ультраструктурную и цитохимическую характеристику резидентных макрофагов в процессе взаимодействия с РНК-содержащими вирусами, патогенными для человека. Установить механизмы развития цитофизиологических изменений, специфичных для макрофагов, инфицированных различными видами РНК-содержащих вирусов.

Задачи исследования:

1. С помощью вирусологических методов (ПЦР, нМФА, ИФА и метод титрования на клеточных культурах) определить адсорбцию и возможную репликацию РНК-содержащих вирусов (вирус клещевого энцефалита, хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae) в первичной культуре макрофагов.

2. С помощью электронной микроскопии исследовать механизмы проникновения и выхода РНК-содержащих вирусов в резидентных макрофагах.

3. Выявить локализацию центров репродукции РНК-содержащих вирусов в макрофагах.

4. Изучить ультраструктурные изменения инфицированных РНК-содержащими вирусами макрофагов и выявить вирусспецифические структуры в этих клетках.

5. Исследовать активность эктоферментов плазмалеммы и цитоплазматических ферментов резидентных макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами.

6. Изучить нитроксидобразующую активность макрофагов, зараженных указанными вирусами. Провести сравнительный анализ ультраструктурных и цитохимических изменений макрофагов, зараженных различными видами вирусов.

Научная новизна:

Ш С помощью морфологических и вирусологических методов установлена способность РНК-содержащих вирусов (энтеровирусов, вируса клещевого энцефалита и вируса Хантаан) к адсорбции и репродукции в макрофагах.

Ш Раскрыты этапы входа и выхода РНК-содержащих вирусов в макрофагах в связи со структурными особенностями их видов. Вирусы с наличием суперкапсида (ВКЭ, хантавирус) входят в макрофаги путем локального лизиса плазмалеммы, тогда как вирусы без липопротеиновой оболочки (полиовирус, энтеровирусы ECHO11, Коксаки В1, 71) используют различные способы (локальный лизис плазмалеммы, кавеолы, эндосомы) проникновения в фагоциты. Выход хантавируса и ВКЭ, в отношении которых была установлена репродукция в макрофагах, осуществлялся подобно входу, тогда как для энтеровируса ECHO 11 выявлено два способа - путем локального лизиса мембраны и клазматоза.

Ш Дана ультраструктурная характеристика центров репродукции РНК-содержащих вирусов и их компонентов в инфицированных макрофагах.

Ш На основании электронномикроскопического исследования классифицирована морфология вирусспецифических и вирусиндуцированных структур в макрофагах при репродукции в них РНК-содержащих вирусов.

Ш На основании комплексного исследования ферментативной активности зараженных макрофагов выявлены метаболические изменения в процессе репродукции в них вирусов. Определены типы цитопатогенного действия указанных вирусов на макрофаги, а также формы вирусной инфекции этих клеток.

Ш Определены цитофизиологические критерии специфичности противовирусной защиты макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами.

Теоретическое значение

В работе раскрыты клеточные и молекулярные основы взаимодействия макрофагов с вирусными агентами, охарактеризована роль этих клеток в качестве как эффекторов фагоцитоза, так и триггера вирусной инфекции.

Полученные сравнительные данные о способах входа в макрофаги РНК-содержащих вирусов с наличием суперкапсида и без него расширяет общетеоретические представления о механизмах проникновения вирусов в клетки.

Установленные закономерности изменений структуры и функций макрофагов в процессе их взаимодействия с РНК-содержащими вирусами позволили выявить особенности защитной реакции этих клеток при вирусной инфекции. Эти новые данные имеют значение для понимания общебиологических процессов (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эндо- и эктоцитоза и других), а также для выявления патологических изменений эукариотических клеток, что позволит подойти к обоснованию подходов к контролируемой коррекции клеточных процессов.

В целом, полученные в работе комплексные данные о морфофункциональном состоянии макрофагов, зараженных вирусами семейств Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae, вносят вклад в проблему вирусной цитопатологии, а также способствуют углублению знаний о патогенезе вирусных инфекций.

Практическое значение

Решение актуальной проблемы взаимоотношений макрофагов с РНК-содержащими вирусами с помощью современных методов иммуноэлектронной микроскопии позволяет выявить критерии для ультраструктурной идентификации вызываемых ими вирусных заболеваний. Подобные исследования смогут обеспечить понимание не только процесса инфицирования и стратегии вирусного заражения клетки, но и дать возможность воздействия на этот процесс с целью определения терапевтических подходов для лечения вызываемых ими заболеваний.

Тестирование ферментативной активности макрофагов может быть использовано для исследования эффективности биологически-активных веществ при вирусной патологии, направленной как в отношении вирусов (влияя на их репродукцию), так и в отношении макрофагов (стимулируя их противовирусную защиту).

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

· методических рекомендаций «Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Авторы: Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова, Н.М. Кон драшева, Т.С. Запорожец). Утверждены Департаментом здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток. - 2005.

патента РФ «Способ определения биологической активности вещества (варианты)» (Патент 2270251 РФ от 10.09.2003) Авторы: Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. - 2003109097/12; Заявл. 10.07.03. Опубл. 10.07.03., Бюлл. №5. - 7 с.).

патента РФ «Способ оценки состояния иммунитета» (Патент РФ от 02.04.2007) Авторы: Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.М. Кондрашова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. рег. №2007111666/15 (012676).

патента РФ «Способ оценки влияния фармакологических препаратов на местные факторы защиты организма на примере бронхолегочных заболеваний» (Патент РФ 2337620 от 09.01.2007). Авторы: Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.Г. Плехова, Н.М. Кондрашова, Б.И. Гельцер. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. - 2007100308/14. Заявл. 09.01.07. Опубл. 10.11.08, Бюлл. №31.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Резидентные макрофаги являются клетками-мишенями при инфицировании РНК-содержащими вирусами, имеющими липопротеиновый суперкапсид (вирус клещевого энцефалита и хантавирус), а также энтеровирусами ECHO11, неимеющими его.

2. Характерным свойством группы вирусов, имеющих липопротеиновый суперкапсид, является их способность осуществлять вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней, тем самым не оказывая выраженного цитопатогенного эффекта на макрофаги, тогда как вирусы без липопротеновой оболочки обладают подобным воздействием на эти клетки.

3. Тип инфицирования макрофагов РНК-содержащими вирусами является автономным, так как активация их генома происходит в цитоплазме, независимо от клеточного. При репродукции указанных вирусов в резидентных макрофагах выявляется острая, литическая инфекция, причем при заражении фагоцитов вирусами с наличием суперкапсида и энтеровирусом ECHO 11 установлена продуктивная инфекция, а в случае заражения энтеровирусами Коксаки В1 и 71 - абортивная.

4. В цитоплазме макрофагов, инфицированных Хантавирусом, имеющим в составе своего генома РНК отрицательной полярности, формируются вирусиндуцированные структуры, морфологически отличающихся от структур, образующихся в результате репродукции вирусов с РНК положительной полярности (вирус клещевого энцефалита, энтеровирусы).

5. Одним из механизмов воздействия РНК-содержащих вирусов на макрофаги является стимуляция кислородзависимой и нитроксидобразующей активности клеток. К специфическим механизмам воздействия на фагоциты группы вирусов с наличием суперкапсида (ВКЭ, хантавирус) относится их способность активировать фермент - кислую фосфатазу, участвующую в процессе расщепления макромолекул их оболочки, тогда как группа вирусов без суперкапсида (полиовирус и энтеровирусы ECHO11, Коксаки В1 и 71) стимулирует неспецифическую эстеразу - фермент отвечающий за иммунологическую стимуляцию макрофагов.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены на: научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 1994); научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере» (Новосибирск, 1996); региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 1999); III научно-практической конференции «Инфекционная патология на Дальнем Востоке» (Новосибирск, 1999); XIX и XXII Российских конференциях по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000, 2008); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург 2003); научно-практической конференции «Хантавирусы и хантавирусные инфекции (к 70-летию изучения ГЛПС на Дальнем Востоке России)» (Владивосток, 2003); 13-м, 14-м конгрессах европейских микроскопистов (Бельгия, 2004; Германия, 2008); 8-м Азиатско-Тихоокеанской конференции по электронной микроскопии (Япония, Каназава, 2004); 16-м международном конгрессе по микроскопии (Япония, Саппоро, 2006); юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Владивосток, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007); III научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); 16-м международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология» (Владивосток, 2008); IV съезде Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 44 научных работах, в том числе: 8 - в международной печати, 16 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 1 методических рекомендациях и 3 патентах на изобретение.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 330 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 514 источников, - из них 63 отечественных, 451-зарубежных. Работа иллюстрирована 1 схемой, 69 рисунками и 2 таблицами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГУ Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Содержание работы

плазмалемма макрофаг вирус эктофермент

Материалы и методы

Эксперименты на модели in vitro проводились на первичной культуре макрофагов, полученной от 350 беспородных половозрелых белых мышей-самцов массой 18-25 гр. по методу Simonet (1992) в нашей модификации (Plekhova et al., 2003). Животные были получены из питомника РАМН «Столбовая» и находились на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции.

В качестве инфекционных агентов использовались следующие виды вирусов: семейства Bunyaviridae, Hantavirus (хантавирус); семейства Flaviviridae, Tick-Borne Encephalitis Virus (вирус клещевого энцефалита, ВКЭ); семейства Picornaviridae, вирус полиомиелита, энтеровирусы 71, ECHO 11 и Коксаки В1. В экспериментах использовали супернатантную культуральную жидкость перевиваемых линий клеток, содержащую вирус в количестве 2 единицы титра цитопатогенного действия на 50% клеточных культур в 0,2 мл, что составляло около 0,5 инфекционных единиц на 1 макрофаг, исходя из посадочной концентрации клеток и количества титра вируса, используемого для заражения.

Условия эксперимента. Время контакта первичной культуры макрофагов с вируссодержащей жидкостью составило от 15 (с хантавирусом) до 60 мин, после чего монослой клеток дважды промывали средой 199 для удаления внеклеточных вирусных частиц, и продолжали инкубацию в течение 90 мин, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 18, 24, 48 и 72 ч. Эксперименты повторяли трижды.

Оценку динамики накопления вирусного антигена в клетках проводили с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА). Для выявления специфических антигенов в макрофагах применяли гомологичную иммуно-асцитическую жидкость к вирусам (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва; ГУ НИИЭМ СО РАМН, г. Владивосток) и диагностическую флюоресцирующую сыворотку против иммуноглобулинов G мыши (ICN, USA), по стандартной методике (Кармышева, 1979). Детекцию вирусной РНК в макрофагах осуществляли с помощью ПЦР метода с использованием тест-системы «Амплисенс Энтеровирусы» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ, г. Москва). Измерение концентрации РНК энтеровирусов проводили с применением метода ли митирующих разведений с вышеуказанной тест-системой. Для количественной идентификации антигенов вирусов в макрофагах использовали иммуноферментную тест-систему (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ, г. Минск). Выявление комплекса антиген-антитело в клеточных образцах проводилось с помощью иммуноферментного антивидового коньюгата, который окрашивается при добавлении субстрат-индикаторного раствора в коричневый цвет различной интенсивности. Учет реакции осуществляли на спектрофотометре «Multiscan Titertek Plus» («Flow lab.», Финляндия) при длине волны 492 нм.

Определение инфекционного титра вирусов проводили по цитопатогенному действию ВКЭ и вируса Коксаки В1 на перевиваемую культуру клеток эпителия почек эмбриона свиньи (СПЭВ), хантавируса - на Vero, полиовируса, энтеровируса 71 и ECHO 11 - на культуру клеток RD. Бактерицидную активность макрофагов, предварительно зараженных вирусами, определяли по методу P. Garlinski et al. (1987). Данные выражали в виде индекса переваривания тест-бактерий.

Оценка ферментативной активности макрофагов проводилась в динамике.

а) Спектрофотометрические исследования

· НСТ-тест (тест с нитросиним тетразолием) по методу, модифицированному А.А. Бутаковым (1991).

· Содержание метаболитов NO - нитритов (NO^-₂) проводили с использованием Griess реактива (Schulz et al., 1999).

· Активность аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) и 5' - нуклеотидазы определяли по методу Г.Б Кириличевой и соавт. (1988) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали adenosine-5' - triphosphate и adenosine-5' - mono phosphate (производства ICN) соответственно.

· Активность цитохромоксидазы (ЦХО) определяли по методу A.B. Novikoff и соавт. (1969) в собственной модификации, используя в качестве субстрата 3,3 ^* - diaminobenzidine.

· Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли по методу З. Лойда (1965) в собственной модификации. В качестве субстратов взяты 3 - (4,5 - dimethylthiazolyl-2) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromide и iodonitrotetrazolium violet (ICN) соответственно.

· Активность кислой фосфатазы (КФ) проводили по методике, модифицированной А.А. Бутаковым (1991), с добавлением паранитрофенилфосфата (ICN).

· Активность неспецифической эстеразы (НЭ) проводили по методу Хейхоу и Кваглино (Хейхоу, 1983) в собственной модификации. В качестве субстратов использован нафтил AS ацетат и синий прочного ВВ.

В качестве контроля использовали образцы с добавлением ингибитора реакции - NaF (ICN, 1,5 мг/мл).

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No - N_k)/ N_k х 100; где N_k - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных макрофагах; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных макрофагах.

Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) в фагоцитах использовали субстрат на основе 0,05 М кальций фосфатного буфера (рН 7,8), включавшего 0,05 М Na2CO3, 0,25 мМ ксантина, 0,2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,025 мМ нитросинего тетразолия и 0,025 ед. ксантиноксидазы («ICN», Бельгия). Оптическую плотность раствора в отсутствии суспензии разрушенных клеток принимали за 100%, активность СОД выражали в единице, равной количеству фермента, подавляющего активность ксантиноксидазы на 50%.

б) Цитохимические исследования

· Активность кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы выявляли по методу Хейхоу и Кваглино (1983).

· Активность НАДФН-диафоразы (аналога NO-синтазы) выявляли по методу Hope, Vincent (1989).

· активность индуцибельной NO - синтазы (iNOS) в макрофагах проводили методом иммуномечения (Webb et al., 2001). В качестве первичных антител использовали кроличью поликлональную сыворотку к iNOS (SIGMA; 1:400), в качестве вторичных - диагностическую флюоресцирующую сыворотку против иммуноглобулинов G мыши (ICN).

Цитологические исследования проводили с помощью световой микроскопии монослоя макрофагов, окрашенных по Нохт-Максимову.

Электронномикроскопические исследования

Для выявления морфологических изменений структуры плазматической мембраны макрофагов в процессе проникновения в них вирусов использовали комплексный фиксатор, предложенный Ито с соавт. (1975). Помимо этого, для определения зоны гликокаликса наружной мембраны макрофагов мы применили цитохимический метод, в основе которого лежат анионные свойства кислых остатков полисахаридов гликокаликса, при взаимодействии с которыми способен избирательно присоединяться краситель - рутениевый красный (Marechal et al., 2001). Для дофиксации использовали 1% раствор OsO₄ (Serva), дегидратацию проводили в этаноле с возрастающей концентрацией, и образцы заключали в эпон-аралдит (Serva) с использованием метода плоскопараллельной заливки. Образцы контрастировали цитратом свинца по стандартной методике (Уикли, 1975) и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония). Параллельно просматрива лись препараты, приготовленные с помощью классических электронномикроскопических методов обработки.

Ультраструктурное исследование активности NO-диафоразы (аналога NO синтазы) клеток проводили с помощью цитохимического метода, путем инкубации образцов в фиксаторе по Ито при 37 ⁰С в течение 90 мин, включающем тетразолиевую соль - 2 - [2'-бензотилазолил] - 5-стирил-3 - [4'-фталгидрозидил] тетразолия хлорид (Sigma, БСПТ), являющуюся субстратом для НАДФ диафоразы (Faber-Zuschratter, 1994). В результате этой реакции образуется осмиофильный формазан. Помимо БСПТ субстратный раствор включал 10 мг НАДФ (Sigma). Контрольные образцы инкубировали без НАДФ. После дофиксации образцов в 1% растворе OsO₄ и заключения в эпон-аралдит с использованием плоскопараллельной заливки, ультратонкие срезы, полученные в плоскости, параллельной монослою клеток, контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония).

Полученные результаты обрабатывали с помощью приложения Microsoft Excel с определением средней арифметической (М), ее ошибки (±m), достоверности различий (р), а также были использованы методы корреляционного и регрессионного анализов и применены известные графические приемы выражения статистических данных (Мисюк, 1975).

Результаты исследования и их обсуждение

Ультраструктурная характеристика резидентных макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами

Первой стадией при вирусном инфицировании является адгезия вирусных частиц к специфическим рецепторам на клеточной поверхности и для проникновения в клетки-мишени хантавирус (Gavrilovskaya, 1999) и вирусы семейства Picornaviridae - ECHO 1 и Коксаки A21 и В3 используют гликопротеины - интегрины, состоящие из различных комбинаций и -цепей (Bergelson, 1994), наличие которых также отмечается на поверхности моноцитов / макрофагов (Hynes, 1992; Helmy, 2006). Тогда как флавивирусы могут связываться с гепарансульфатным протеогликаном - рецептором, обнаруженном на поверхности моноцитов / макрофагов (Goldsmith, 2002). Причем, чем в более поздней стадии дифференцировки находятся моноциты, тем большее количество вирусов связывается с их поверхностью (Markotiж, 2007). В своем исследовании мы использовали популяцию перитонеальных клеток, которая включала в себя макрофаги в одинаковой степени зрелости. По данным литературы (Waldo, 2008), предварительная инкубация в течение 3 сут соответствует окончанию периода созревания моноцитов в резидентные макрофаги, которая происходит в результате адгезии этих клеток к поверхности. Таким образом, мы получали равноценную по функциональным свойствам популяцию резидентных макрофагов, которую впоследствии заражали вирусами.

С помощью нМФА определено, что количество макрофагов с адгезированным на них вирусами сем. Picornaviridae через 1 ч контакта в среднем составило 48,6%. Адгезия энтеровирусов на макрофаги была подтверждена методом титрования надосадочных вируссодержащих жидкостей на клеточных культурах, с помощью ОТ-ПЦР и с использованием иммуноферментной тест-системы для определения специфических антигенных белков энтеровирусов. При исследовании адгезии к макрофагам «одетых» вирусов, содержащих суперкапсид (хантавируса и ВКЭ), также определена способность этих вирусов активно адсорбировать к поверхности клеток. Эти результаты, полученные с помощью вирусологических методов, указывают на то, что при невосприимчивости к вирусным инфекциям в целом организма (известно, что взрослые мыши невосприимчивы к возбудителям энтеро- и флавивирусных инфекций, а также геморрагической лихорадки с почечным синдромом; Смородинцев, 1983; Фадеев, 2008), к указанным вирусам могут быть чувствительны его отдельные клеточные элементы, а именно - макрофаги. Это доказано нами при инфицировании этих клеток ВКЭ, хантавирусом, и энтеровирусом ECHO11.

По данным литературы известно, что хантавирус входит в клетки перевиваемых культур путем клатрин-зависимого эндоцитоза, используя в ранней стадии проникновения эндосомы, а в поздней стадии - внутриклеточные органеллы с низким значением рН - лизосомы (Jin, 1982). Для флавивирусов Денге и Западного Нила также установлено проникновение в клетки путем клатрин-зависимого эндоцитоза без формирования ранних и поздних эндосом, при условии использования клеточных органелл с низким значением рН (Chu, 2004). При ультраструктурном исследовании входа вирусов, имеющих суперкапсид - хантавируса и ВКЭ, в резидентные макрофаги нами было установлено, что для них характерен механизм проникновения путем локального лизиса плазмалеммы. В процессе проникновения указанных вирусов мы не наблюдали инвагинации плазмалеммы фагоцитов и образования морфологических структур, подобных кавеолам и эндосомам, как, например, в случае инфицирования макрофагов энтеровирусами. Вероятно, механизм входа указанных вирусов путем локального лизиса плазмалеммы обусловлен морфофункциональными особенностями макрофагов как фагоцитов. Так, отмечается, что этот механизм используется флавивирусом Денге при выходе из макропиноцитозной вакуоли моноцитов (Mosquera, 2005).

Принято, что вирусы без суперкапсида, к которым относятся энтеровирусы, преимущественно проникают в клетки путем клатрин-опосредованного эндоцитоза либо с помощью локального лизиса плазмалеммы (DeTulleo, 1998). При этом необходимо отметить, что в основном процесс входа и репродукции эпителиального происхождения. При инфицировании первичной культуры макрофагов энтеровирусами 71 и Коксаки В1 нами было обнаружено, что эти вирусы входят в клетки только путем формирования кавеол, тогда как вход полиовируса в макрофаги осуществлялся тремя путями: путем формирования кавеол, локального лизиса плазмалеммы и, после продолжительной инкубации до 45 мин, путем макропиноцитоза. В литературе указывается на проникновение полиовируса в клетки путем клатрин-либо динамин-опосредованного эндоцитоза, при этом обязательно формирование везикул крупного размера (Zeichhardt, 1985). По-видимому, наблюдаемые нами способы проникновения полиовируса в макрофаги определяются специфичностью данной клетки как фагоцита, для которого характерно активное поглощение чужеродного материала. Это свойство макрофагов обнаруживались после 45-минутной инкубации с полиовирусом, когда наблюдался макропиноцитоз вирусных частиц, что связано с ответной фагоцитарной реакцией клеток. Активация макрофагов в этот период была подтверждена нами результатами биохимического исследования активности ферментов клеток, зараженных полиовирусом.

Недавно исследователями сообщалось (Marjomaki, 2002), что энтеровирусы ECHO11, как и Коксаки способны проникать в эпителиальные клетки перевиваемых культур путем образования кавеол. Нами обнаружено, что в течение первых 15 мин энтеровирус ECHO 11 проникает в цитоплазму макрофагов путем локального лизиса их плазмалеммы. В дальнейшем, наблюдалась инвагинация и формирование в цитоплазме зараженных макрофагов эндоцитарных вакуолей с включенными в них вирусными частицами. Выход вируса из эндоцитарных вакуолей осуществлялся путем локального лизиса мембраны клеток. Несмотря на наличие специфической стимуляции макрофагов, на что указывало появление на поверхности фагоцитов клапановидных псевдоподий с электронноплотными зернистыми включениями, не было обнаружено макропиноцитоза этого вируса.

Таким образом, нами установлено, что пути проникновения вирусов сем. Picornavridae в макрофаги разнообразны. По нашему мнению, это связано как с видовой принадлежностью этих вирусов, так и с типом клеток, с которыми они взаимодействуют, в данном случае с однородной популяцией клеток - резидентными макрофагами.

До проникновения вируса в клетку вирион биологически инертен. Эта инертность сохраняется до тех пор, пока вирусный геном не начинает функционировать внутриклеточно как самостоятельная единица, индуцируя синтез вирусспецифических белков, способных в той или иной степени подавлять клеточный метаболизм. Нами установлено, что вирусы, имеющие суперкапсид - хантавирус и ВКЭ, проникают в макрофаг, на первом этапе не повреждая его. Затем в процессе активации своего генома в цитоплазме макрофага, они способны изменять метаболизм клетки - хозяина. При этом тип инфицирования макрофага относится к автономному, потому что вирусный геном реплицируется независимо от клеточного генома. Также необходимо отметить некоторые особенности морфогенеза вирусов этой группы. Снаружи нуклеокапсиды хантавируса и ВКЭ покрыты двухслойным липидным суперкапсидом, на котором располагаются белковые структуры с гемагглютинирующей активностью. Поверхностные специальные F-белки обеспечивают слияние вирусного суперкапсида и клеточных мембран. Обнаруженное нами проникновение вирусов, имеющих суперкапсид, путем слияния и последующее их освобождение таким же способом подтверждает их особенные свойства, присущие этой группе вирусов. Так, при ультраструктурном исследовании начального этапа адгезии вирусных частиц к поверхности макрофагов была обнаружена активация поверхностных белков суперкапсида. Морфологически это выражалось в утолщении оболочек вирусов и наличии на его поверхности blebs-структур. Подобные структуры были описаны как показатели активации поверхностного белка суперкапсида - гемагглютинина у вируса гриппа (Scheiffele, 1997). Таким образом, свойство группы вирусов, содержащих суперкапсид, осуществлять вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней, определяет их способность к длительной репродукции в этих клетках без цитопатического эффекта.

Нами также были выявлены различия в патологических изменениях макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами (рис. 1). Так, в зараженных хантавирусом макрофагах было обнаружено изменение плазмалеммы, которое проявлялось в появлении неглубоких многочисленных выемок, тогда как при инфицировании ВКЭ установлено иное изменение плазмалеммы, характерное для специфической стимуляции макрофагов в ответ на внедрение инфекта. Это выражалось в появлении многочисленных псевдоподий округлой формы с электронноплотным содержимым. Отличия были обнаружены и в изменениях цитоплазмы клеток, зараженных этими вирусами. Так, в случае заражения макрофагов хантавирусом отмечалось разряжение периферической части цитоплазмы вследствие дислокации органелл в околоядерное пространство, что приводило к ее вакуольной дистрофии. Сайты внутриклеточной локализации частиц хантавируса и их последующей репродукции были выявлены в участках цитоплазмы клеток с повышенным содержанием рибосом и наличием цистерн эндоплазматического ретикулума. Помимо этого, были обнаружены специфические морфологические признаки вирусной инфекции клетки. Это выражалось в одновременном присутствии в цитоплазме зараженных макрофагов трех типов вирусспецифических образо ваний: 1) плотные виропласты; 2) сформированные из первых, морфологически четко обозначенные специфические структуры с ограничивающей их двухслойной мембраной; 3) пластинчатые и трубчатые структуры, которые в основном располагались в околоядерной зоне цитоплазмы инфи цированных клеток. В случае инфицирования макрофагов остальными вирусами мы не наблюдали подобного разнообразия вирусспецифических образований. По мнению А.П. Авцына (1979), наличие подобного типа структур можно объяснить нарушением внутриклеточного синтеза белка в инфицированных клетках. Белки вируса, являясь чужеродными для клетки, не подвергаются ее катаболизму. Мы предполагаем, что как и трубчатые, так и пластинчатые структуры являются местом синтеза белков хантавируса. В свою очередь, плотные виропласты и рибонуклеопротеидные нити, по-видимому, определяют место синтеза рибонуклеиновых кислот. Таким образом, полученные нами ультраструктурные данные свидетельствуют о различном внутриклеточном местоположении центров синтеза белковой оболочки и нуклеопротеинов хантавируса. Этот вывод согласуется с исследованиями на перевиваемых культурах клеток, зараженных вирусами сем. Bunyaviridae (Matsuoka, 1994). Морфологически образование рибонуклеопротеина, в результате инициации процесса транскрипции вирусной РНК, проявляется в формировании различного типа виропластов, как было установлено нами при исследовании макрофагов, зараженных хантавирусом. Затем рибонуклеопротеин перемещается к цистернам аппарата Гольджи, где происходит специфическое опознавание цитоплазматического вирусспецифического компонента для его соединения с гликопротеинами суперкапсида, после чего формируются вирионы.

Необходимо отметить, что заражение макрофагов хантавирусом вызывало чрезмерное расширение цистерн агранулярной эндоплазматической сети, и в этих клетках в результате слияния различных мембраносодержащих органелл отмечалось образование миелиноподобных структур, занимающих всю цитоплазму. Формирование подобных структур на последних этапах развития инфекций характерно для клеток, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид. Этот процесс связан с образованием липо- и мукопротеидов, необходимых для формирования вирусной липопротеиновой оболочки, когда в клетках обнаруживаются неспецифические расстройства обмена липидов (Egger, 2005).

Из всех флавивирусов, наиболее полноценно исследованы взаимоотношения вируса Денге с клетками моноцитарно-макрофагальной системы, причем скорость его размножения в макрофагах выше, чем в периферических B-лимфоцитах (Cologna, 2003). По данным А.А. Смородинцева (1983), известно, что ответная реакция макрофагов на заражение вирусом Лангат, относящимся к комплексу КЭ проявляется в их способности фагоцитировать клетки с адсорбированными на них вирусными частицами. Нами установлено, что ВКЭ без участия каких-либо других факторов способен адгезировать из вируссодержащей жидкости к поверхности резидентных макрофагов, проникать и размножаться в них. При морфологическом исследовании клеточной культуры, зараженной ВКЭ, нами были обнаружены признаки цитопатического действия этого вируса на макрофаги. Это выражалось в наличии зернистости в цитоплазме клеток, усилении ее эозинофилии, что характеризовало увеличение реакции на РНК и белок, а также в кариопикнозе у некоторых клеток. Наряду с указанными клетками определялись макрофаги с признаками апоптоза.

В наших исследованиях использовалась первичная культура макрофагов, которая предварительно инкубировалась в течение 3-х суток, что позволило получить однородную популяцию клеток, прошедших все этапы дифференцировки. Подготовленные таким образом макрофаги были способны поддерживать репродукцию ВКЭ при сохранении клеточных структур в течение 4-х суток, что позволило исследовать все этапы мрфогенеза этого вируса. При ультраструктурном исследовании нами было обнаружено, что в макрофагах, инфицированных ВКЭ, выявляется зернистая дистрофия, которая выражается в уплотнении цитозоля в результате появления в нем различных электронноплотных образований. Зернистая дистрофия клетки возникает при усиленном синтезе новых структур, таких как рибосомы, полирисомальные нити, микрофиламенты и другие органеллы. Известно, что подобного типа дистрофия является выражением напряжения функциональных процессов и приспособительно-компенсаторных реакций клеток (Авцын, 1979). При этих нарушениях накапливается необычное количество (или необычные типы) макромолекул или продуктов их распада. При развитии дистрофий наиболее уязвимы аэробное дыхание (окисление, связанное с фосфолирированием), синтез ферментов и структурных белков, а также интегрированность клеточных мембран и генетического аппарата клетки. Подобные изменения цитоплазмы клеток были выявлены при заражении культуры лимфобластов флавивирусом Денге (Sriurairatna, 1978), а также в макрофагах мышей, зараженных Бразильскими флавивирусами (Barros, 2004).

Флавивирусы являются типичными цитозольными вирусами, поскольку их РНК-зависимый полимеразный комплекс ассоциирован с внутриклеточными мембранами, что определяет механизм биосинтеза вирусного РНК-генома в цитоплазме инфицированных клеток. Проведенный нами ультраструктурный анализ макрофагов, зараженных ВКЭ, выявил морфологические особенности, связанные с синтезом вирусных компонентов в цитоплазме. Несмотря на отмеченное присутствие вирусных частиц в цистернах эндоплазматической сети, ни в одном случае нами не было обнаружено признаков синтеза вирусных компонентов в этих структурах. Преимущественно вирионы локализовались в цитоплазме клеток, со временем перемещаясь в околоядерную зону, где и обнаруживались вирусные частицы с морфологическими признаками активации в них синтетических процессов. На это указывало по явление на поверхности вирионов нитевидных образований, а в результате разрежения нуклеоида отмечалось увеличение вирусных частиц и повреждение их оболочки. Затем обнаруживалось формирование вирусспецифических и вирусиндуцированных структур в цитоплазме, где осуществлялся синтез нуклеиновых и белковых компонентов ВКЭ. На поверхности виропластов выявлялось формирование новобразованных вирусных частиц. Помимо этого после инкубации в течение 24 ч в околоядерной зоне цитоплазмы обнаруживалось интенсивное формирование нуклеокапсидов ВКЭ, которые морфологически были связаны с полипротеиновыми нитями. Вероятно, последние являются белковыми компонентами суперкапсида ВКЭ. Мы не наблюдали гексагональных упаковок и цепочек новообразованных вирусных частиц, формирующихся при размножении флавивирусов в нейронах (Исачкова, 1986). По-видимому, это связано со специфической принадлежностью макрофагов к фагоцитарной системе и обусловлено их морфологическим отличием от нейронов, а именно, меньшей площадью ядра и цитоплазмы, наличием менее развитой и четко структурированной эндоплазматической сети, а также меньшим количеством митохондрий.

На данный момент определено, что при инфицировании клеток крови пикорнавирусы дифференцируются по их способности использовать различные системы рецепторов и их скорость репродукции зависит от степени дифференцировки моноцитов / макрофагов. Нами установлена способность всех использованных видов пикорнавирусов - полиовируса, энтеровирусов 71, ECHO11 и Коксаки В1 проникать в макрофагальные клетки. При этом к одному из характерных признаков внедрения этой группы вирусов, не имеющих суперкапсид, относилось появление на поверхности макрофагов многочисленных разнообразных псевдоподий (рис. 1). Так, при заражении полиовирусом и энтеровирусом ECHO 11 в течение первого часа после внесения инфектов наблюдалось формирование нитевидных псевдоподий, при участии которых впоследствии образовывались эндоцитарные вакуоли, содержащие вирусные частицы.

Наряду с нитевидными псевдоподиями у фагоцитов, зараженных энтеровирусом ECHO11, наблюдались также клапановидные. Формирование такого типа псевдоподий на поздних сроках инфекции связано с экскрецией макрофагами во внеклеточное пространство биологически активных веществ. В случае заражения энтеровирусами 71 и Коксаки В1 возникновение на поверхности макрофагов псевдоподий, преимущественно округленной формы, обнаруживалось несколько позже - после 7 ч инкубации. В последующем, количества псевдоподий у макрофагов, зараженных пикорнавирусами увеличивалось и выявлялась гипертрофия мембраносодержащих органелл.

Установлено, что в случае инфицирования пикорнавирусами - полиолирусом, энтеровирусами 71, Коксаки В1 и EСHO 11 - наблюдаются патологические изменения цитоплазмы макрофагов, которые связаны с характерными для вирусной инфекции признаками. Под воздействием пикорнавирусов, как и при инфицировании ВКЭ в макрофагах обнаруживалось уплотнение цитозоля вследствие появления в нем различных электронноплотных образований, свойственных для зернистой дистрофии. Подобная дистрофия цитоплазмы возникает в результате усиленного синтеза клеткой новых структур, таких как рибосомы, полирисомальныe нити, микрофиламентов и другие органеллы. Наибольшим воздействием, как активатор клеточного метаболизма, обладал вирус EСHO 11 и в этом случае, обнаруживались новообразованные вирусные частицы. Образование полноценных вирусных частиц в случае заражения клеток энтеровирусами Коксаки В1 и вирусом 71 не отмечалось. Возникновение зернистой дистрофии данных макрофагов, вероятно, происходило после освобождения в цитоплазме вирусной РНК от нуклеокапсида, в ответ на ее распознавание и трансляцию рибосомами клетки. В результате этого процесса образуется полипротеиновая молекула, которая может выявляться в цитоплазме клеток как отдельная структура, и она морфологически одинакова для всех вирусов этого семейства (Egger, 2005). Микрофибриллы в макрофагах, зараженных пикорнавирусами, мы наблюдали после 5 ч инкубации. Исключение составил полиовирус, обладающий выраженным цитопатогенным действием на фагоциты. В этом случае нами была установлена острая литическая инфекция макрофагов, приводящая к резкой деградации культуры. В клетках, инфицированных полиовирусом, не наблюдалось морфологических признаков усиления синтетических процессов. Уже через 9 ч после заражения этим вирусом в результате деструктуризации органелл в клетках выявлялось просветление цитоплазмы. На денатурацию белковых компонентов цитоплазмы указывала ее глыбчатая ультраструктура, которая характеризовалась чередованием просветленных участков с электронноплотными. Подобного типа изменения наблюдались в большинстве фагоцитов, причем после 24 ч инкубации процесс деградации клеток усиливался, и наблюдалась секвестрация измененных участков цитоплазмы макрофагов. Все эти признаки характеризует дегенеративный процесс.

Электронно-микроскопические исследования макрофагов, зараженных энтеровирусами 71, Коксаки В1 и EСHO 11, показали, что с течением времени наиболее выраженные деструктивные изменения наблюдаются в мембранных структурах. Помимо этого, в макрофагах отмечалось увеличение количества везикул разнообразной формы и величины, которые локализовались как внутри цитоплазмы, так и у плазмалеммы. Сохранившиеся канальцы и цистерны эндоплазматической сети с течением времени расширялись. Наблюдались гипертрофированные митохондрии с просветленным матриксом, при этом в них отмечалось нарушение двухконтурности мембран и деформация крист. Основное скопление этих вирусов отмечалось в цитоплазматическом матриксе макрофагов. Подобные патологические изменения были описаны в макрофагах, инфицированных вирусом гриппа (Скрипченко, 1997).

При инфицирования макрофагов энтеровирусами 71, ECHO11 и Коксаки В1 в цитоплазме этих клеток также отмечалось формирование разнообразных вирусспецифических структур - виропластов, полирибосомальных нитей и микрофиламентов. На наш взгляд, образование виропластов, которое отмечалось несколько позже, чем формирование полирисомальных нитей и микрофиламентов, указывало на цитозольную локализацию двухспиральных репликативных форм РНК пикорнавирусов. При этом необходимо отметить, что, несмотря на отмеченное присутствие РНК-содержащих вирусов в цистернах эндоплазматической сети, ни в одном случае нами не было обнаружено вирионов с измененной морфологией. Преимущественно вирусные частицы локализовались в цитоплазме клеток, со временем перемещаясь в околоядерную зону, где и обнаруживались формирование вирусиндуцированных структур. Причем, во всех случаях заражения макрофагов РНК-содержащими вирусами нами не было выявлено морфологических признаков активации клеточных ядер. Усиление синтетических процессов отмечалось только в цитоплазме клеток вне их ядер, что указывало на автономный тип вирусной инфекции макрофагов. Необходимо отметить, что при заражении макрофагов группой вирусов, содержащих суперкапсид (хантавирус и ВКЭ), отмечалось нарушение ядерной мембраны и формирование около ядра различных фибриллярных компонентов.