Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами

Известно, что этап синтеза вирусных белков происходит подобно закономерностям синтеза белков клетки. В этом случае синтез запускается после того, как вирусная РНК соединяется с рибосомами, и начинается трансляция закодированной в ней информации. Результатом этого процесса является образование полисом, которые могут быть неодинаковыми по величине. При заражении макрофагов энтеровирусами 71, Коксаки В1 и EСHO 11 наиболее интенсивное образование полирибонуклеиновых нитей и скоплений рибосом около виропластов отмечалось через 9 ч инкубации, и в этих зонах обнаруживалось формирование вирионов.

Защитная реакция макрофагов, инфицированных использованными РНК-содержащими вирусами, выражалась в виде формирования в их цитоплазме фагосомоподобных везикул, которые можно отнести к аутофагирующим структурам, образующимся в результате синтеза мембран de novo вокруг поврежденного участка цитоплазмы клетки. С течением времени в макрофагах выявлялись огромные фагосомальные вакуоли, включающие вирусные частицы, и обнаруживалось слияние мембраносодержащих органелл клетки.

Выход РНК-содержащих вирусов, в отношении которых была установлена внутриклеточная репродукция и образование вирионов (хантавирус и ВКЭ), осуществлялся подобно входу - путем локального лизиса их плазмалеммы. Подобный способ выхода их макрофагов был описан для вирусов гриппа и Марбург (Скрипченко, 1997). Свойство группы вирусов, содержащих суперкапсид, осуществлять вход и выход из клетки-мишени, не разрушая ее плазмалеммы, определяет их способность к длительной репродукции в макрофагах без цитопатического эффекта. Относительно энтеровируса ECHO11, принадлежащего к вирусам без липопротеиновой оболочки, нами было установлено, что он покидал клетку с помощью 2-х механизмов, а именно, с помощью локального лизиса плазмалеммы или путем клазматоза, что разрушало целостность плазмалеммы клетки. Для этой группы вирусов характерно высвобождение популяции при массивном повреждении клеточной мембраны с последующим лизисом клетки (Suhy, 2000), что и наблюдалось нами в поздние сроки наблюдения (2-е сут) в макрофагах, инфицированных энтеровирусом ECHO 11.

Таким образом, в случаях заражения макрофагов группой вирусов, содержащих суперкапсид, и энтеровирусом ECHO 11 выявлена продуктивная инфекция, поскольку при этом образуется морфологически выявляемый полноценный вирус. При инфицировании макрофагов энтеровирусами 71 и Коксаки В1 установлена абортивная инфекция, для которой характерно изменение метаболизма клетки в результате появления в ее цитоплазме вирусспецифических и вирусиндуцированных образований, а также различных патологических внутриклеточных изменений, но не наблюдается формирование полных вирионов.

Итак, на наш взгляд, ультраструктурное исследование этапов процесса внутриклеточного размножения вирусов необходимо проводить с позиций анализа механизмов, лежащих в основе изменения структуры и функции клетки. Несмотря на то, что подобное исследование макрофагальных клеток, зараженных различными вирусами, позволило бы более полно оценить степень участия этих клеток в патологическом процессе, на настоящий момент этому вопросу уделяется незаслуженно мало внимания. Известно небольшое количество работ по исследованию ультраструктурных изменений макрофагов при вирусных инфекциях. Тем не менее, раскрытие механизмов проникновения и репродукции РНК-содержащих вирусов на модели их взаимоотношений с макрофагами, которые филогенетически относятся к наиболее древней фагоцитарной системе иммунитета, позволит раскрыть некоторые свойства вирусов как паразитов, приобретенные ими в ходе эволюционного развития. Причем, способы входа вирусов в клетку не зависят от наличия в их структуре липопротеиновой оболочки, тогда как в зависимости от вида эти вирусы в различной степени способны активировать или ингибировать синтетические процессы в клетках-хозяевах.

Сравнительная оценка морфофункциональной активности резидентных макрофагов, инфицированных вирусами семейств Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae

Установлено, что не все вирусы в одинаковой степени чувствительны к действию ферментных систем моноцитов / макрофагов (Соловьев, 1986). Одни легко инактивируются фагоцитами (группа I), а другие резистентны к их действию и способны к активной и нередко длительной репродукции (группа II). По основным биохимическим параметрам макрофаги не имеют принципиальных отличий от других клеток человека и животных. Пути метаболизма и механизмы его регуляции общие. Вместе с тем можно выделить важные особенности обмена данных клеток, связанные, с одной стороны, с особенностями их ультраструктуры, а с другой, - со специализацией их функций как фагоцитов. Поэтому определенное значение приобретают исследования, связанные с изучением ферментативного состояния клеток моноцитарно-макрофагальной системы в ответ на заражение различными вирусами.

В зараженных хантавирусом, ВКЭ, полиовирусом и энтеровирусами ECHO 1, Коксаки В1 и 71 макрофагах, была исследована активность ферментов плазмалеммы, как показателей стимуляции клеток (5'-нуклеотидаза, АТФаза), ферментов кислородзависимой системы NADPНоксидазного комплекса первого порядка, связанных с мембраносодержащими структурами (НСТ-тест), ферментов третьего порядка, принимающих участие в общем окислительном метаболизме клеток - ЛДГ, СДГ и ЦХО. Кроме того, была исследована активность фермента супероксиддисмутазы - высокоспецифичного антиоксиданта, служащего для регуляции уровня кислородных радикалов, а также лизосомальных ферментов, катализирующих процессы расщепления макромолекул (кислая фосфатаза и неспецифическая эстераза). Параллельно изучалась нитроксидобразующая активность фагоцитов. Для сравнительного анализа данных по исследованию активности ферментных систем макрофагов, зараженных указанными вирусами, мы использовали регрессионный анализ. В таблице приведены данные сравнительного анализа коэффициентов регрессии методом простой модификации t-критерия (табл.).

При исследовании активности эктофермента плазмалеммы - 5'-нуклеотидазы определена достоверная стимуляция макрофагов в первые минуты контакта с энтеровирусом Коксаки В1 и полиовирусом (рис. 2). В ответ на введение группы «одетых» вирусов, имеющих суперкапсид, стимуляция клеток наступала в более поздние сроки (после 3 ч инкубации). Подобные результаты были получены нами при определении активности АТФазы. Так, в ответ на заражение хантавирусом, реакция клеток по показателям активности этого фермента была более выраженной, затем следовала активность АТФазы фагоцитов, инфицированных вирусом Коксаки В1, полиовирусом, вирусом клещевого энцефалита и хантавирусом. Значения коэффициентов регрессии для этих клеток составили -4,9168; -2,9298; 4,7427 и -11,852 соответственно. Отрицательное значение константы -0,2265 для данных по содержанию АТФазы в фагоцитах, зараженных ВКЭ, подтверждало позднюю активацию этого фермента, через 18 ч после заражения.

Интерес представляют данные, полученные при изучении активности 5'-нуклеотидазы и АТФазы в макрофагах, зараженных энтеровирусом ECHO11. Значения активности указанных ферментов в клетках, зараженных эти вирусом, находились на более высоком уровне и составили 12,178 и 15,93, что достоверно (p<0.01) отличалось от коэффициентов регрессии указанных ферментов в макрофагах, инфицированных остальными вирусами (табл.). Вместо снижения внутриклеточного содержания 5'-нуклеотидазы и АТФазы - ферментов, которые обычно расходуются при различных пространственных преобразованиях плазмалеммы, в клетках, в случае контакта с энтеровирусом ECHO11, мы наблюдали противоположный процесс - их синтез. На это указывает линия с положительными значениями индекса стимуляции (рис. 1). Известно, что синтез пуриновых нуклеотидов осуществляется из инозинмонофосфата и образующиеся нуклеозидмонофосфаты АМФ и ГМФ переходят в дифосфаты АДФ и ГДФ под действием различных ферментов с участием 5'-нуклеотидаза. В свою очередь цитоплазматическая область АТФаз участвует в реакционном цикле фосфорилирования / дефосфорилирования, приобретая попеременно два конформационных состояния, ответственных за транспорт ионов, и принимает активное участие в переносе синтезированных нуклеотидов (Кольман, 200). Если сравнить данные количественной ОТ-ПЦР, то именно при заражении макрофагов энтеровирусом ECHO 11 было установлено значимое различие между показателями количества специфической вирусной РНК через 4 и 24 ч инкубации зараженных клеток, что указывало на ее внутриклеточный синтез. Таким образом, этот вирус, являясь «неодетым», т.е. без суперкапсида, спосо бен очень быстро инициировать синтез собственной РНК, и полученные нами данные об увеличении внутриклеточного содержания эктоферментов в зараженных энтеровирусом ECHO11 макрофагах косвенно подтверждают наличие в них активного синтеза нуклеотидов.

При анализе метаболической активности макрофагов, зараженных всеми использованными РНК-содержащими вирусами, установлена стимуляция фер-

Достоверность различий коэффициентов регрессии, определенная методом модифицированного t - критерия для двух малых выборок

При этом степень активации ферментов этой системы зависела от вида вируса, которыми заражались клетки. Наибольшая их активность отмечалась в случае инфицирования макрофагов вирусами, способными к внутриклеточному размножению, а именно: ВКЭ и энтеровирусом ECHO 11. Наиболее ярко отражали активацию метаболизма клеток показатели внутриклеточного содержания СДГ и ЛДГ (рис. 3а, б). При инфицировании клеток ВКЭ и энтеровирусом ECHO 11 с увеличением времени инкубации происходило нарастание активности указанных ферментов, тогда как в макрофагах, зараженными остальными вирусами, активация не происходила.

Необходимо отметить, что данные по активности СДГ можно расценивать двояко (рис. 3б). Известно, что при определении цитотоксического действия инфектов на клетки используется метод, основанный на уменьшении количества метилтиазолилтетразолия бромида (МТТ), преобразование которого в формазан происходит с помощью СДГ митохондрий (Cotter, 2001). Чем меньше формазана в клетках, тем меньше активность СДГ, структура которой нарушается при неблагоприятных воздействиях. Таким образом, при заражении макрофагов вирусами, обладающими более выраженным цитопатогенным воздействием на клетки (полиовирусом и энтеровирусом Коксаки В1), по сравнению с энтеровирусом ECHO 11, наблюдалось снижение активности СДГ.

При исследовании активности ЦХО и СОД достоверно от клеток, инфицированных другими вирусами, отличались макрофаги, зараженные ВКЭ (рис. 3в, г; табл.). Так, коэффициент регрессии активности ЦХО для клеток, инфицированных ВКЭ, составил 1,7531, тогда как для фагоцитов, зараженных остальными вирусами, он был меньше единицы, а для СОД - 0,004.

Изучение роли нитроксидобразующей активности макрофагов при вирусных инфекциях начато относительно недавно. Определено, что NO может оказывать прямое противовирусное действие, и поэтому исследование нитроксидобразующей активности моноцитов / макрофагов, которые относятся к одним из главных поставщиков метаболитов NO, при вирусных инфекциях приобретает особенное значение (Kreil, 1996). Нами с помощью различных методов была определена роль нитроксидобразующей системы в функциональной активности макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами. С помощью непрямого метода флюоресцирующих антител изучалась активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS), с помощью цитохимического метода определяли внутриклеточную активность НАДФ диафоразы, а также проводили ультра структурное выявление этого фермента. Параллельно исследовалось внутри клеточное содержание метаболитов оксида азота (NO) - нитритов и активности цитохромоксидазы (ЦХО), фермента четвертого комплекса дыхательной цепи митохондрий, принимающего участие в аэробном окислении клеток. В качестве простетической группы этот фермент содержит ци-тогемин, с которым связывается молекула NO. Определение внутриклеточного содержания ЦХО позволяет косвенно оценить способность клеток к продукции NO по нитритредуктазному пути (Меньшикова, 2000).

Результаты цитохимического исследования активности NO-синтазы выражали в виде среднего цитохимического коэффициента, распределяя клетки по степени включения специфического для НАДФ-диафоразы субстратного компонента. Установлено, что достоверное (р<0,05) повышение активности NO-синтазы отмечается в период проникновения (от 5 до 60 мин) в фагоциты вирусов, имеющих суперкапсид (хантавирус и ВКЭ).

При инфицировании макрофагов энтеровирусами, не содержащими липопротеиновой оболочки, достоверное повышение внутриклеточного содержания NO-синтазы выявляется после 2-х ч инкубации. Необходимо отметить, что повышенное содержание этого фермента после контакта фагоцитов с вирусами, содержащими суперкапсид, отмечалось на протяжении всего срока наблюдения. По-нашему мнению, совпадение пика активности NO синтазы с периодом наличия внутриклеточной репродукции «одетых» вирусов указывает на реализацию защитных функций макрофага в ответ на его заражение.

При изучении активности iNOS в макрофагах, зараженных РНК-содержащими вирусами, наибольшее количество клеток со специфическим свечением отмечалось после 1 ч инкубирования с ВКЭ и составило 75±6,5%. Затем к 5 ч оно снижалось до уровня интактных клеток - 5±0,6%, к 7 ч возрастало до 25±1,6%, понижаясь к концу срока наблюдения. Подобная активность iNOS, но на более низких показателях наблюдалась нами в случае инфицирования клеток хантавирусом, тогда как при заражении макрофагов группой «неодетых» вирусов эта активность была незначительной, и специфическое свечение отмечалось в единичных клетках. С помощью ультраструктурного исследования нами установлено, что локализация НАДФ-диафоразы в макрофагах, зараженных ВКЭ, наблюдается во внутрицитоплаз матических везикулах.

При заражении резидентных макрофагов РНК-содержащими вирусами также отмечалось повышение внутриклеточного содержания метаболитов NO - нитритов (рис. 4б). Уровень нитритов в интактных клетках был принят за 0%. Наибольшее внутриклеточное содержание метаболитов NO отмечалось в клетках, инфицированных вирусами, содержащими суперкапсид - ВКЭ и хантавирусом. Постепенное достоверное (р<0,05) повышение уровня нитритов наблюдалось с первых минут после заражения макрофагов ВКЭ, и максимальное значение показателей для этих клеток определялось через 48 ч инкубации - 38,5±2,2% (р<0,05). При инфицировании макрофагов хантавирусом максимальное содержание метаболитов NO отмечалось после 6 ч инкубации и составило 38,6±2,5%, после чего отмечалось его постепенное снижение до 3,4±0,5%. Наибольшее внутриклеточное содержание нитритов в макрофагах, зараженных пикорнавирусами, обнаруживалось при их контакте с энтеровирусом ECHO 11. При постепенном повышении от момента введения в культуру клеток вируса (1 ч; 11,2±1,3%), показатели содержания метаболитов NO достигали максимального значения через 24 ч инкубации - 18,7±1,7%, после чего следовало их резкое снижение.

Нами установлено, что наибольшая активность ЦХО обнаруживалась в макрофагах, зараженных ВКЭ. Так, ее повышение выявлялась через 1 ч контакта клеток с вирусом, показатель составил 14,7±0,7% относительно контроля. Через 48 ч в фагоцитах обнаруживалась максимальная активность фермента, и показатель составил 76,3±6,7%. Необходимо отметить разнонаправленность изменения активности NO-синтазы и ЦХО в макрофагах, инфицированных ВКЭ. Это проявлялось в повышении СЦК при гистохимическом определении активности NO-синтазы на фоне понижения в этих клетках активности ЦХО, причем показатели внутриклеточного содержания метаболитов NO оставались на высоком уровне. По сравнению со значениями для макрофагов, зараженных ВКЭ, при инфицировании клеток пикорнавирусами внутриклеточное содержание ЦХО находилось на низком уровне.

Таким образом, нами установлено, что резидентные макрофаги под воздействием РНК-содержащих вирусов в различной степени способны к наработке активных форм NO. Степень наработки NO этими клетками зависит от вида вируса. Так, в случае инфицирования макрофагов группой вирусов, имеющих суперкапсид (хантавирус, ВКЭ), отмечается генерация NO как по нитроксидсинтазному пути при участии в качестве катализатора фермента нитроксидсинтазы, так и по нитритредуктазному пути, на что указывало повышение активности ЦХО. При заражении клеток группой вирусов, не содержащих липопротеиновой оболочки (полиовирус, энтеровирусы Коксаки В1 и ECHO 11), преимущественно имеет место нитритредуктазный путь образования NO.

В целом, нами установлено, что в момент проникновения РНК-содержащих вирусов (до 1 ч после заражения) в клетках выявляется стимуляция кислородзависимой и нитроксидобразующей ферментных систем (рис. 1). Причем в случае инфицирования макрофагов вирусами, способными в них размножаться, нарастание ферментативной активности этих систем носило более выраженный характер. На это указывало повышение активности как НАДФ-оксидазного комплекса первого порядка, локализованного в плазматической мембране, так и активности митохондриальных ферментов третьего порядка - лактатдегидгеназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Волнообразное изменение активности этих ферментов в макрофагах в первом периоде (до 3 ч) отражало реакцию клеток на проникновение вирусов, а во втором (с 5 до 48 ч) - наличие синтеза и выхода вирусных частиц во внеклеточное пространство. Помимо этого, в макрофагах, зараженных «одетыми» вирусами, ВКЭ и хантавирусом, отмечалась активная наработка метаболитов NO, которая в начальном периоде инфекции (15 мин - 4 ч) коррелировала с изменением активности ферментов кислородзависимого метаболизма клеток. В поздние сроки наблюдения (от 1 до 4-х сут) в этих клетках было выявлено повышение активности фермента супероксиддисмутазы, принимающей участие в ликвидации избыточного количества активных метаболитов кислорода. На наш взгляд, первоначальное повышение активности клеточных ферментов указывало на период активации макрофагов в ответ на введение инфекта, а последующее их повышение - на период увеличения их синтетической активности макрофагов, что совпадало с наибольшим количеством антигенсодержащих клеток в этот период. Особенно наглядно это было выявлено при изучении динамики активности ферментов кислородзависимой системы макрофагов, которая отражала изменение метаболизма клетки в процессе репродукции в них вирусных компонентов.

Отличие использованных нами видов вирусов с наличием суперкапсида - хантавируса и ВКЭ, помимо геномной последовательности, обусловлено различной структурой нуклеокапсида - спиральной и икосаэдрической, различной полярностью РНК - отрицательной или положительной, а также структурой поверхности их суперкапсида. По нашим данным, несмотря на все перечисленные отличия указанных вирусов, они оказывали равное по степени выраженности воздействие на метаболизм макрофагов как клеток-мишеней. Тем не менее, необходимо отметить, что в зависимости от наличия липопротеиновой оболочки определялось воздействие вирусов на различные ферментативные системы макрофагов. Так, установлено, что активность цитоплазматических ферментов, участвующих в процессах расщепления макромолекул - кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы - зависела от вида вируса, которыми были инфицированы макрофаги (рис. 5). В макрофагах, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), увеличивалась активность кислой фосфатазы, тогда как при инфицировании клеток группой вирусов без липопротеиновой оболочки (полиовирус и энтеровирусы 71, ECHO11 и Коксаки В1) - неспецифической эстеразы. Причем, активность КФ в случае заражения макрофагов хантавирусом повышалась в первые часы после заражения, а в случае инфицирования ВКЭ - после 4-х ч (рис. 5а). В обоих случаях повышенное внутриклеточное содержание КФ отмечалось до конца срока наблюдения. На наш взгляд, высокая активность КФ связана с участием этого фермента в этапе депротеини зации вирусов, а именно в их освобождении от суперкапсида, что подтверждается данными других исследователей о низком значении рН в эндосомах или в окружающем вирус участке цитоплазмы (Stiasny, 2002). При таком значении рН и активизируется КФ, последующее накопление которой, на фоне активного синтеза вирусных компонентов, мы связываем с реализацией макрофагами защитных функций.

Иная динамика показателей была получена нами при изучении активности неспецифической эстеразы в макрофагах, зараженных РНК-содержащими вирусами (рис. 5б). Наибольшая активность этого фермента определялась в клетках, инфицированных группой «неодетых» вирусов, причем повышенное внутриклеточное содержание неспецифической эстеразы в макрофагах отмечалось с первых минут инфицирования до конца срока наблюдения.

Известно, что изменения активности неспецифической эстеразы в макрофагах отражают их физиологическую или иммунологическую стимуляцию (Хейхоу, 1983). На наш взгляд, в случае заражения макрофагов вирусами, относящимся к группе «неодетых», у которых отсутствует суперкапсид, высокое содержание этого фермента отражает активную стимуляцию клеток в ответ на внедрение инфекта. Это предположение усиливает факт, что наибольшую эстеразную активность макрофагов мы наблюдали после их контакта с полиовирусом, который обладал, по нашим данным, наибольшим цитопатогенным действием на культуру клеток. Таким образом, несмотря на активную наработку макрофагами неспецифической эстеразы, что можно отнести к защитной реакции клетки, фагоциты не способны уничтожить внедренный в них вирус.

Итак, анализ результатов комплексного исследования метаболизма макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами, позволяет сделать вывод, что информация о ферментативной активности клеток дает возможность охарактеризовать реакцию фагоцитов на усиление синтетических процессов, связанных с репродукцией в них вирусов. Этот вывод основан на том, что биосинтез компонентов вирусных частиц осуществляется при участии ферментов клетки-хозяина и статистически достоверный сдвиг этой активности может рассматриваться как показатель воздействия вирусов на клетки. Таким образом, применение высокочувствительных методов определения активности ферментов и регрессионного анализа данных можно отнести к важным способам индикации защитных реакций макрофагов и репродуктивной активности вирусов, а также для дифференцировки типа их воздействия на клетки.

В целом, анализ полученных нами данных показал, что комплексное исследование взаимодействия макрофагов с РНК-содержащими вирусами, особенно с позиций их структурных отличий, позволит подойти к пониманию контролируемой коррекции молекулярных и метаболических процессов, происходящих в клетках-хозяевах. Этот вывод усиливается известным фактом, что успешный исход вирусного заболевания происходит при достижении баланса между индукцией антивирусных эффекторных механизмов, реализация которых связана с клеточными элементами моноцитарно / макрофагальной системы. На наш взгляд, для понимания механизмов иммунологических реакций организма в патогенезе вирусных инфекций необходима oбъективная оценка роли местных факторов иммунитета, где ключевыми являются вышеуказанные клетки. Значение этих клеток многогранно, и наряду с тем, что фагоциты могут осуществлять положительный противовирусный эффект путем поглощения, обезвреживания, элиминации вирусов, а также фагоцитоза инфицированных вирусами клеток, в результате чего они начинают продуцировать в месте заражения цитокины, макрофаги могут выполнять и отрицательную функцию. При первичном иммунном ответе оно выражается в том, что проникшие в фагоциты вирусы могут в них репродуцироваться. В результате этого возникает депрессия функциональной активности клеток, причем такие фагоциты могут уничтожать здоровые клетки в месте воспаления, когда продуцируемые ими активные радикалы кислорода и NO, помимо противо-вирусного действия, инициируют процесс апоптоза клеток и увеличивают проницаемость капилляров. В этом случае, моноциты / макрофаги при вирусном инфицировании организма не всегда проявляют себя в качестве защитного барьера. Тем не менее, активация этих клеток при репродукции в них вируса позволяет им осуществить антигенпредставляющую функцию для стимуляции В- и Т-лимфоцитов и активации цитотоксических Т - лимфоцитов для уничтожения инфицированных клеток при развитии специфического иммунного ответа.

Выводы

1. С помощью молекулярно-генетических (ПЦР, ИФА), вирусологических (титрование на клеточных культурах) и морфологических методов исследования (нМФА) установлено, что РНК-содержащие вирусы (вирус клещевого энцефалита, хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae - полиовирус, энтеровирусы 71, ECHO11 и Коксаки В1) способны из вируссодержащей жидкости адгезировать к поверхности макрофагов и проникать в них. Вирусы, имеющие суперкапсид (ВКЭ и хантавирус), и энтеровирус ECHO11 способны к репродукции в макрофагах.

2. Установлено, что РНК-содержащие вирусы способны проникать в макрофаги, используя различные механизмы. Вирусы, содержащие суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), проникают в макрофаги путем локального лизиса плазмалеммы. Вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки (полиовирус, энтеровирусы 71, ECHO11 и Коксаки В1), используют различные способы проникновения в фагоциты (локальный лизис плазмалеммы, кавеолы, эндосомы). Выход хантавируса и ВКЭ, в отношении которых была установлена репродукция в макрофагах, осуществлялся подобно входу, тогда как для энтеровируса ECHO 11 выявлено два способа выхода из клетки путем локального лизиса плазматической мембраны и клазматоза.

3. Определена гипертрофия мембраносодержащих органелл и формирование разнобразных псевдоподий в макрофагах, зараженных РНК-содержащими вирусами. Наибольшим мембранотропным действием обладали вирусы, не содержащие суперкапсид.

4. Выявлено, что наряду с неспецифическими признаками поражения клеток (вакуольная и зернистая дистрофия, гелизация цитоплазмы и другие), в макрофагах, инфицированных РНК-содержащими вирусами, определялись изменения, характерные для вирусных инфекций, а именно: образование вирусспецифических и вирусиндуцированных структур - виропластов, трубчатых и пластинчатых образований, полинуклеопротеидных нитей и микрофиламентов, где определялись новообразованные вирусные частицы.

5. Установлено, что для макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами, кроме полиовируса, характерен автономный тип инфицирования, на что указывали ультраструктурные признаки активации вирусного генома в цитоплазме при неизмененной морфологии клеточного ядра.

6. Определена продуктивная инфекция при заражении макрофагов вирусами, содержащими суперкапсид, и энтеровирусом ECHO 11, поскольку в этих случаях образуется морфологически выявляемый полноценный вирус. Абортивная форма инфекции обнаружена при взаимодействии фагоцитов с энтеровирусами 71 и Коксаки В1, на что указывает отсутствие формирования полноценных вирионов.

7. Комплексное исследование метаболизма клеток выявило, что этап проникновения РНК-содержащих вирусов в макрофаги сопровождается выраженной стимуляцией кислородзависимой и нитроксидобразующей ферментных систем. Нарастание активности данных систем носило более выраженный характер в случае инфицирования макрофагов вирусами, способными в них размножаться - ВКЭ, хантавирус и энтеровирус ECHO11. На это указывало повышение активности как НАДФ-оксидазного комплекса первого порядка (плазматические мембраны), так и активности митохондриальных ферментов третьего порядка - лактатдегидгеназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы.

8. Установлено, что активность цитоплазматических ферментов, участвующих в процессах расщепления макромолекул, - кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы - зависела от вида вируса, которыми были инфицированы макрофаги. В макрофагах, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), увеличивалась активность кислой фосфатазы, тогда как при инфицировании клеток группой вирусов без липопротеиновой оболочки (полиовирус и энтеровирусы 71, ECHO11 и Коксаки В1) - неспецифической эстеразы.

9. Выявлена активная наработка метаболитов NO макрофагами, зараженными вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хантавирус). При этом в начальном периоде инфекции (15 мин - 4 ч) проукция метаболитов NO клетками коррелировала с изменением активности ферментов кислородзависимого их метаболизма. В поздние сроки наблюдения (от 1 до 4-х сут), у этих макрофагов отмечалась активность супероксиддисмутазы - фермента, принимающего участие в ликвидации избыточного количества активных метаболитов кислорода.

10. Для макрофагов, зараженными указанными видами вирусов, характерна острая, литическая инфекция, так как при синтезе вирусных компонентов в клетках отмечается изменение ее метаболизма, обнаруживаются патологические внутриклеточные изменения и формирование вирусиндуцированных образований, которые вызывают токсическое и механическое повреждение клеток. Это приводит к подавлению клеточного метаболизма и несостоятельности защитных реакций макрофагов.

11. Установлено, что вирусы, имеющие суперкапсид, осуществляют вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней. Это определяет способность этих вирусов к длительной репродукции в макрофагах без выраженного цитопатического эффекта. При отсутствии выраженных деструктивных изменений эти клетки могут выступать в роли источника указанных вирусов и принимать определенное участие в процессе их диссеминации в организме.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Взаимодействие первичной культуры макрофагов с хантавирусами / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова, Г.Г. Компанец, Р.А. Слонова, Н.В. Перевощикова // Инфекционная патология в Приморском крае: тез. докл. III науч.-практ. конф. - Новосибирск, 1999. - С. 93-94.

2. Динамика продукции TNFальфа и NO перитонеальными макрофагами при воздействии разных штаммов вируса клещевого энцефалита / Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, Н.Г. Плехова // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, №2/3. - С. 146-147.

3. Изменение метаболической активности макрофагов под влиянием вируса клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Е.И. Дробот, Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова // Биохимия - 2007. - Т. 72, вып. 2. - С. 236-246.

4. Инфицирование макрофагов вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова, Е.В. Пустовалов // Вопр. вирусол. - 2008. - №2. - С. 32-37.

5. Исачкова, Л.М. Динамика ферментативной активности и количествен-

ных показателей моно- и полинуклеарных фагоцитов при воспалительных процессах различной этиологии / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Инфекционная патология в Приморском крае: тез. докл. науч.-практ. конф. - Владивосток, 1994 - С. 136-137.

6. Исачкова, Л.М. Новые данные о патологии инфекционного процесса / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и крайнем Севере: тез. докл. научно-практ. конф. - Новосибирск, 1996. - С. 71-72.

7. Исачкова, Л.М. Новые данные к современной концепции антиинфекционной резистентности / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1997. - №5. - С. 67-70.

8. Исачкова, Л.М. Новые аспекты антиинфекционной резистентности организма / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Актуальные вопросы инфекционной патологии: тез. докл. науч.-практ. конф. - Ростов-на-Дону, 1999. - С. 80-81.

9. Исачкова, Л.М. К развитию представлений об антиинфекционной резистентности / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2002, №1, С. 11-15.

10. Метаболическая активность макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Н.В. Крылова, Г.Г. Компанец // Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: тез. докл. 3 науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2007. - мед.-фармацевт. журн. Сиб. Консилиум - 2007. - №7. - С. 67-68.

11. Механизм инфицирования макрофагов возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом: ультраструктурные аспекты / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова-Исачкова, Р.А. Слонова, Г.Г. Компанец, Е.В. Пустовалов, Е.И. Дробот // Цитология. - 2003. - Т. 45, №8. - С. 770-779.

12. Механизм инфицирования макрофагов возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом: ультраструктурные аспекты / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Р.А. Слонова, Г.Г. Компанец, Е.И. Дробот // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы: тез. докл. междунар. конгр. - Санкт-Петербург, 2003. - C. 140.

13. Морфофункциональная характеристика макрофагов, зараженных вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова Г.Н. Леонова, Н.В. Крылова, Е.И. Дробот // Тихоокеанск. мед. журн. - 2001. - №2. - С. 56-58.

14. Морфофункциональная активность фагоцитарных клеток при инфекционных процессах различной этиологии / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова, Р.А. Слонова, В.В. Лукьянова // Тихоокенск. мед. журн. - 2001. - №2. - С. 92-95.

15. NO продуцирующая активность макрофагов, зараженных вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова // Бюл. экс. биол. и мед. - 2008. - №3. - С. 316-320.

16. Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма / Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Кондрашова Н.М., Запорожец Т.С. - Методические рекомендации, Владивосток, 2005. - 24 с.

16. Плехова, Н.Г. Динамика показателей моно- и полинуклеарных фагоцитов при воспалительных процессах различной этиологии // Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова // Юбилейная конференция НИИЭМ им. Пастера: тез. докл. - Санкт-Петербург, 1993. - С. 27.

17. Плехова, Н.Г. К вопросу о взаимодействии нейтрофилов и макрофагов в системе антиинфекционной защиты / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1997. - №5. - С. 70-73.

18. Плехова, Н.Г. Морфологическая характеристика макрофагов, зараженных вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова, Г.Н. Леонова, Н.В. Крылова // Актуальные вопросы инфекционной патологии: тез. докл. науч.-практ. конф. - Ростов-на-Дону, 1999. - С. 58.

19. Плехова, Н.Г. Морфологическая характеристика макрофагов, зараженных хантавирусом / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова, Г.Г. Компанец // Инфекционная патология в Приморском крае: тез. докл. III науч.-практ. конф. - Новосибирск, 1999. - С. 98-99.

20. Плехова, Н.Г. Ультраструктурная локализация хантавируса в резидентных макрофагах / Н.Г. Плехова, Л.М. Исачкова, Е.В. Пустовалов, Г.Г. Компанец, Р.А. Слонова // ХVIII Российск. конф. по электр. микроскопии: тез. докл. - Черноголовка, 2000. - С. 286.

21. Плехова, Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов / Н.Г. Плехова // Журн. эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. - 2006. - №6. - С. 89-96.

22. Плехова, Н.Г. Способ определения биологической активности вещества (варианты) / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова - Пат. на изобр. №2270251 C2 заявка №2003109097; опубл. Бюл. - 2006. - №5.

23. Плехова, Н.Г. Значение клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе флавивирусных инфекций / Н.Г. Плехова // Бюлл. Сиб. отделения РАМН. - 2007. - №4. - С. 71-77.

24. Плехова, Н.Г. Клетки моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе энтеровирусных инфекций / Н.Г. Плехова // Дальневост. мед. журн. - 2008. - №2. - С 8-14.

25. Плехова, Н.Г. Роль клеток моноцитарного происхождения в патогенезе хантавирусных инфекций / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // Тихоок. мед. журн. - 2008. - №2. - С. 32-37.

26. Плехова, Н.Г. Изменение активности ферментов плазмалеммы макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // Тез. докл. 4 съезда Рос. общ. биохим. и молекул. биол. - Новосибирск, 2008. - С. 439.

27. Плехова, Н.Г. Современные представления о механизмах входа вирусов в клетки / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // Успехи совр. Биологии. - 2009, Т. 129, №1, С. 39-50.

29. Плехова, Н.Г. Ультраструктурная характеристика резидентных макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова // XXII Российская конф. по электронной микроскопии, тез докл. - Черноголовка, 2008. - С. 72.

30. Пути входа вирусов семейства Picornaviridae в резидентные макрофаги / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, В.И. Злобин, С.В. Должиков, Т.В. Фролова, Л.С. Карань // Цитология. - 2008. - Т. 50, №2. - С. 171-181.

31. Сомова-Исачкова, Л.М. Патоморфогенез геморрагической лихорадки с почечным синдромом: от прошлого к будущему / Л.М. Сомова-Исачкова, Н.Г. Плехова - В кн.: «Хантавирусы и хантавирусные инфекции (к 70-летию изучения ГЛПС на Дальнем Востоке России) - Владивосток, 2003. - С. 182-200.

32. Сомова, Л.М. Оксид азота как медиатор воспаления / Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова // Вестник ДВО РАН. - 2006. - №2. - С. 77-80.

33. Способ оценки состояния иммунитета / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Заворуева Д.В., Кондрашова Н.М. - пат. на изобр., рег. №2007111666

34. Способ оценки фармакологических препаратов на местные факторы защиты организма на примере бронхолегочных заболеваний / Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.Г. Плехова, Н.М. Кондрашова, Б.И. Гельцер - Пат. на изобр. №23376620 С1, заявка №2007100308/14; опубл. Бюл. - 2008. - №31.

35. Ультраструктурное изучение морфогенеза хантавируса в резидентных макрофагах / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова-Исачкова, Г.Г. Компанец, Е.В. Пустовалов, Р.А. Слонова - В кн.: «Хантавирусы и хантавирусные инфекции (к 70-летию изучения ГЛПС на Дальнем Востоке России) - Владивосток, 2003. - С. 200-212.

36. Ультраструктурное исследование макрофагов, инфицированных вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Г.Н. Леонова, Н.В. Крылова, Е.В. Пустовалов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита): тез. докл. Всерос. науч. конф. - Москва, 2007. - С. 91.

37. Plekhova, N.G. Defensive function of phagocytes in Pseudotuberculosis / N.G. Plekhova, L.M. Somova-Isachkova, Shubin F.N. - In: Advances in experiment. med. and biol. «The genus Yersinia. Entering the Functional Genomic Era» (Eds. M Skurnic, J.A. Bengoechea, K. Glanfors), 2003. - Vol. 529. - P. 161-164.

38. Metabolic activity of macrophages infected with Hantavirus, an agent of hemorrhagic fever with renal syndrome / N.G. Plekhova, L.M. Somova, R.A. Slonova, G.G. Companets, V.V. Luk'yanova, N.V. Yakubovich // Biochemistry (Moscow). - 2005. - Vol. 70, №9. - P. 990 997.

39. The localization of Hantavirus in resident macrophages / N.G. Plekhova, L.M. Somova, E.V. Pustovalov, G.G. Kompanets, R.A. Slonova - In proceed. Vol. III, Life Sciences. 13th European Microscopy Congress, Belgium, 2004. - Life Sciences, Vol. III. - P. 389-390.

40. The Enter of viruses family Picornaviridae in residents macrophages / N. Plekhova, L. Somova, E. Pustovalov, G. Koroljova, V. Zlobin - In proceed. The 16th International Microscopy Congress, Sapporo, Japan, 2006. - Vol. I. - P. 428.

41. The entry of the Picornaviridae virus family in resident macrophages / N.G. Plekhova, L.M. Somova, S. Dolzhikov, T.V. Frolova, L.S. Karan, V.I. Zlobin // Cell and Tis. Biol. - 2008. - Vol. 2, №3. - P. 311-321.

42. Ultrastructural study of resident macrophages in hemorrhagic fever with renal syndrome / N.G. Plekhova, L.M. Somova, E.V. Pustovalov, G.G. Kompanets, R.A. Slonova // 8th Asia-Pacific Conferen. on Electron. Microscopy (8 APEN), Kanazawa, Japan, 2004. - P. 71.

43. Viral particles influence on life systems as nanocontainer design prototype for cellular metabolism regulation/ N.G. Plekhova, E.V. Pustovalov, L.M. Somova, V.S. Plotnikov // In proccecing: Nanostructures: Physics and Technology, 16th Int. Symp. - Vladivostok, 2008. - P.10.

44. Plekhova, N.G. The virus-inducted structures in RNA virus infected macrophages / N.G. Plekhova, L.M. Somova, E.V. Pustovalov - In proc. Vol. III Life Sciences 14th Europ. Microsc. Congr., Germany, 2008. - P. 135-136.

Размещено на Allbest.ru