Клеточные и тканевые реакции развивающегося головного мозга млекопитающих на воздействия неблагоприятных факторов среды

Размещено на http://www.allbest.ru/

КЛЕТОЧНЫЕ И ТКАНЕВЫЕ РЕАКЦИИ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ХОЖАЙ ЛЮДМИЛА ИВАНОВНА

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте экспериментальной медицины РАМН и в Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.А.Отеллин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор И.Н. Боголепова

доктор биологических наук, профессор О.С. Сотников

доктор медицинских наук, профессор Э.И. Валькович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится « » ________________2008 года в____часов_____минут на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ( ) при Институте Физиологии им. И.П.Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.

Автореферат разослан « » ______________2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Н.Э.Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Исследования механизмов внутриутробного развития центральной нервной системы относятся к числу актуальных задач современной биологии и медицины. В период эмбриогенеза формируются основные структурно-функциональные характеристики дефинитивного головного мозга и могут закладываться основы различных патологических состояний и нервно-психических заболеваний, проявляющихся после рождения. Высокий интерес исследователей к проблемам влияния неблагоприятных факторов среды (экологических факторов, гипоксий разного генеза, стрессов, различных фармакологических препаратов, курения, употребления алкоголя, наркотиков и т.д.) на развивающийся организм обусловлен постоянным повышением частоты неврологических нарушений у новорожденных и детей разных возрастных групп. Актуальность изучения этой проблемы обусловлена еще и тем, что при всех усилиях, направленных на лечение и реабилитацию этих детей к пубертатному возрасту среди них регистрируется значительное число инвалидов. По данным статистики различные отклонения нервно-психического развития, обусловленные пренатальной патологией, диагноcцируются в разных областях России примерно у 27-44% детей в возрасте до 15 лет (Володин Н.Н. и др. 2001).

В последние годы особое внимание исследователей привлекает изучение последствий влияния стресса матери на формирование поведенческих реакций, обучения, памяти, выявлению физиологических отклонений у потомства. В специальной литературе имеются свидетельства того, что различные стрессовые воздействия, связанные с эмоциональными нагрузками или воздействиями неблагоприятных факторов среды во время беременности, вызывают отклонения в строении отделов головного мозга, сопровождающиеся функциональными расстройствами ЦНС в постнатальном периоде развития. Как известно, стресс матери повышает ее гормональную активность, нарушает регуляцию функций гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы и значительно усиливает секрецию кортикоидов.

Воздействие на плод высокого уровня материнских эндогенных глюкокортикоидных гормонов при стрессе приводит, как показывают наблюдения у человека и экспериментальные исследования на животных, к снижению внимания и способности к обучению, склонности к депрессии, изменению в мотивационно-эмоциональной сфере, к нарушениям моторной активности, низкому порогу раздражительности, повышению страха и тревожности и т.д. (Weinstock M., 1997; Weinstock M., 2001; Lemaire V., Koehl M., Le Moal., 2000).

Не менее важным является исследование влияния повышенного уровня глюкокортикоидов на развивающийся мозг, возникающий после введения их синтетических аналогов. В настоящее время в акушерской практике синтетические глюкокортикоиды (дексаметазон, бетаметазон, дексазон и др.) имеют достаточно широкое терапевтическое применение. Они используются как иммуносупрессоры, противовоспалительные средства, а также для ускорения развития легких у плода при угрозе преждевременных родов. Иногда дексаметазон применяется на протяжении почти всей беременности при риске врожденной почечной гиперплазии. Результаты недавних исследований показали, что воздействие синтетических глюкокортикоидов в пренатальный период приводит к нарушению развития некоторых отделов мозга, сокращению количества синапсов, а также вызывает задержку созревания нейронов, уменьшение массы всего мозга у потомства крыс (Muneoka K., Mikuni M., Ogava T. et al., 1997; Young N.A., Teskey G.C., Henry L.C., et al., 2006). Эффекты воздействий глюкокортикоидов на плод человека до сих пор недостаточно изучены. Однако известно, что у детей, пренатально подвергавшихся действию дексаметазона, наблюдается изменение познавательной способности, эмоционального и социального поведения, задержка психомоторного развития (Trautman P.D. et al., 1995; Lajic S., Wedell A. et al., 1998). Наблюдения у человека и данные, полученные в экспериментах на грызунах, свидетельствуют о том, что воздействие повышенного уровня глюкокортикоидов (экзогенного происхождения или эндогенного кортизола в ответ на стресс матери во время беременности) приводят к неблагоприятным эффектам, включающим нейроэндокринные и поведенческие расстройства, которые конечно необходимо изучать. Однако одним из актуальных и особо значимых направлений исследований в этой области на современном этапе должны быть исследования механизмов структурных изменений отделов головного мозга плода, новорожденного и индивидуума в постнатальном периоде развития. Данные о клеточных механизмах и структурных основах функциональных нарушений ЦНС в формациях головного мозга в настоящее время отсутствуют.

Механизмы перечисленных выше эффектов стресса в той или иной мере связаны как с глюкокортикоидами, так и с моноаминами. Острый и хронический стресс вызывает в разной мере выраженное в отдельных структурах мозга изменение уровня серотонина, числа пре- и постсинаптических серотониновых рецепторов, особенно в участках мозга связанных с контролем страха и тревожности (Aldridge J.E. et al., 2003; Janusonis et al., 2004). Эти факты свидетельствуют о том, что серотонинергическая система является мишенью воздействия гормонов стресса, особенно кортикоидов. В ответные реакции эмбрионов и плодов на воздействие материнского стресса вовлекается развивающаяся серотонинергическая система. Однако как влияет изменение уровня содержания серотонина и его метаболизма на ключевых стадиях морфогенеза на эмбриональное развитие и, в том числе, формирование структур головного мозга млекопитающих остается не известным.

Одним из значимых повреждающих агентов влияющих на развитие головного мозга является гипоксия различной этиологии (внешняя среда, заболевания матери и т.д.). Развивающийся мозг человека и млекопитающих чувствителен к гипоксии. Ее воздействие в пренатальный период, по мнению клиницистов, вызывает наибольшее число отклонений в развитии нервной системы, составляющих большую гетерогенную группу нейропатологий. Экспериментальные исследования на животных показали, что пренатальная гипоксия, как и материнский стресс, приводит к нарушениям формирования поведенческих реакций, развитию двигательной активности, ослаблению способности к обучению, снижению массы тела (Tashima L. еt al., 2001; Vexler Z., Ferriero D., 2001; Pascual J., Koenigsberger M., 2003). Влияние различных форм гипоксии на строение и функции систем и органов достаточно хорошо изучено у взрослых животных, однако реакции клеток различных отделов развивающегося мозга в период раннего нейрогенеза на повреждающее действие гипоксии, а также структурные изменения формаций мозга у потомства в постнатальный период не исследованы.

Изучение этих проблем требует проведения модельных экспериментов на животных, основное направление которых должно быть связано с исследованием влияния повреждающих факторов: повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов, влекущего за собой изменение уровней содержания и метаболизма моноаминов, а также острой пренатальной гипоксии на развитие структур головного мозга, во время раннего постимплантационного периода, когда формируются закладки формаций головного мозга, и на стадиях их активного роста. Необходимо проследить последствия пренатальных воздействий неблагоприятных факторов в постнатальный период развития, и выявить конкретные клеточные и тканевые механизмы, приводящие к формированию аномалий развития ЦНС. Широкое использование в клинике синтетических аналогов глюкокортикоидных гормонов для терапии беременных, о влиянии которых на развитие потомства известно крайне мало, указывает на острую необходимость фундаментальных исследований побочных эффектов этих препаратов. Получение данных такого рода представляется необходимым для установления механизмов морфогенеза эмбрионального мозга, а также для более глубокого понимания основ формирования врожденных патологий ЦНС.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучение клеточных механизмов эмбрионального развития и реакций таких полифункциональных формаций головного мозга млекопитающих как неокортекс, гиппокамп, стволовые моноаминергические ядра в ответ на различные стрессовые воздействия в пренатальный период и их эффекты в последующем онтогенезе. клеточный реакция головной мозг

Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучить влияние повреждающих факторов (повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов, как эндогенных после хронического материнского стресса, так и экзогенных после введения синтетического кортикоида дексаметазона; сниженного уровня серотонина и острой пренатальной нормобарической гипоксии) на развитие исследуемых отделов эмбрионального мозга лабораторных млекопитающих.

2. Проследить непосредственные реакции нейральных эмбриональных клеток развивающегося головного мозга на воздействия повреждающих факторов.

3. Выявить отдаленные последствия пренатальных воздействий повреждающих факторов, определив динамику изменения структурных характеристик формаций мозга на разных этапах постнатального периода развития (препубертатном, пубертатном и у половозрелых животных).

НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые получены данные о динамике развития клеточных и тканевых реакций в отделах развивающегося головного мозга грызунов в ответ на воздействия повреждающих факторов. В зависимости от глубины и характера изменений выявлены адаптивные и деструктивные реакции, являющиеся структурной основой формирования пренатальной патологии ЦНС.

Впервые установлено, что избыточный уровень глюкокортикоидов (как следствие материнского стресса, так и введения синтетических аналогов) во время беременности, вызывает непосредственные реакции нейральных клеток развивающегося мозга, приводящие к быстрой апоптотической гибели части из них, нарушает базисные гистогенетические процессы развития и оставляет длительный след в виде структурных изменений в формациях головного мозга у потомков в постнатальном периоде и достигших половозрелого возраста. Избыток глюкокортикоидов в ранние периоды формирования мозга и его функций приводит к тяжелым аномалиям развития неокортекса, гиппокампа и стволовых моноаминергических ядер, проявляющихся в недоразвитии и истончении слоев, сокращении количества клеток в структурах, изменении соотношения разных типов клеток, отсроченной гибели нейронов. Показано, что серотонин функционально активен на протяжении всего пренатального периода. Он необходим для нормального развития эмбриона как в доимплантационный, так и постимплантационный периоды развития млекопитающих. Дефицит серотонина на доимплантационных стадиях приводит к гибели дробящихся зародышей, а в постимплантационный период вызывает задержку развития и дифференциации нейральных и глиальных клеток в отделах развивающегося мозга, нарушает формирование ряда структур головного мозга, в том числе, серотонинергического центра мозга - дорсального ядра шва, что приводит к вторичному дефициту эндогенного нейронального серотонина и может инициировать развитие новых патологических процессов. Получены новые сведения о влиянии острой пренатальной гипоксии на развитие неокортекса и структур гиппокампа. Показано, что гипоксия вызывает непосредственную выраженную реакцию эмбриональных нейральных клеток, приводящую значительную их часть к апоптотической гибели, и оставляет след в постнатальном периоде развития, представленный недоразвитем кортикальных структур и формаций гиппокампа. Впервые морфологически показано, что клетки развивающихся различных отделов гиппокампа имеют разную чувствительность к гипоксии. Выявлено, что повреждающее действие гипоксии на эмбриональный мозг имеет стадиоспецифический эффект.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты данной работы являются существенным вкладом в понимание клеточных механизмов формирования структурных основ врожденных патологий ЦНС, проявляющихся после рождения. Установленные непосредственные клеточные реакции и модификации базисных гистогенетических процессов во время формирования отделов головного мозга, в том числе стволовых моноаминергических ядер, в ответ на воздействия стрессовых факторов в пренатальный период, расширяют представления о патогенезе нейродегенеративных заболеваний в постнатальном онтогенезе. Выявлен существенный факт, что во время эмбриогенеза биологически активные вещества (гормоны, моноамины), запускающие и регулирующие клеточные и тканевые процессы генетической программы развития мозга, даже при непродолжительном воздействии эпигенетических факторов, могут искажать эту программу, приводя к формированию отклонений в строении отделов мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза. Материалы данного исследования определяют круг экспериментальных моделей для изучения возникновения разнообразных нарушений поведенческих реакций, памяти, обучения, депрессии, врожденных психопатологий. Представленные данные могут служить основой для создания моделей медикаментозной коррекции врожденных нарушений, а также привлечь широкое внимание к профилактике последствий неблагоприятных воздействий во время беременности, особенно в период основного органогенеза у эмбрионов, наиболее чувствительного и опасного для жизни и здоровья потомства.

Полученные данные могут быть использованы в преподавании морфологических дисциплин в процессе подготовки гистологов, эмбриологов, неонатологов, детских неврологов и усовершенствовании врачей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Воздействия использованных повреждающих факторов среды на развивающийся мозг вызывают модификации базисных гистогенетических процессов - пролиферации, миграции и дифференциации нервных клеток. Это приводит к формированию однотипных структурных отклонений в строении отделов головного мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза.

2. Избыточный уровень глюкокортикоидов и пониженный уровень серотонина в эмбриональный период существенно влияют на развитие фетального мозга, изменяя процессы нейро-, глиогенеза и дифференциации нейронов. Структурные изменения и клеточная гибель в отделах головного мозга формируются в пренатальный период и сохраняются после рождения.

3. Пренатальный период развития млекопитающих высоко чувствителен к низкому уровню серотонина. Серотонин играет важную роль в механизмах морфогенеза, начиная с ранних доимплантационных стадий. Его дефицит приводит к нарушению нейро- и глиогенеза, лежащих в основе аномалий развития структур головного мозга. Серотонин является авторегулятором развития серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis. Снижение уровня серотонина на ранних этапах эмбриогенеза приводит к структурным изменениям в nucleus raphe dorsalis, уменьшению количества серотонинсинтезирую- щих нейронов, что может вызывать его вторичный дефицит.

4. Повреждающее действие острой пренатальной гипоксии имеет стадиоспецифический эффект. Наибольшая степень выраженности структурных изменений в отделах мозга регистрируется при воздействии гипоксии на более ранних постимплантационных стадиях, во время, когда активны процессы пролиферации, миграции и дифференцировки нервных клеток, обеспечивающих формирование структур мозга и их клеточный состав.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. Фрагменты диссертации-онной работы представлены на XXIV Конгрессе “Psychoneuroendocrine aspects of life phases: Psychoactive agent and the foetal/embryonic development, IBPN (Taoraine, Italy, 1993), научной конференции «Гистогенез и регенера- ция тканей» (ВМА, СПб, 1995), на симпозиуме «Современные представления о структурно-функциональной организации мозга» к 100-летию акад. С.А.Саркисова (Москва, 1995), на VI Европейском конгрессе нейропаталогии (Barcelona, 1999), на Всероссийской Конференции «Актуальные проблемы экспериментальной клинической фармакологии» (НИИЭМ РАМН, СПб, 1999), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящ. 150-летию И.П.Павлову, СПб, 1999, научной конференции «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 1999), научной конференции «Механизмы адаптивного поведения» (Институт физиологии им. И.П.Павлова, РАН, СПб,1999), 29 Annual Meeting Society for Neuroscience (Miami Beach, USA, 1999), научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» посвящ. 110-летию НИИЭМ (СПб,2000), 30 Annual Meeting Society for Neuroscience (New Orleans, 2000), 31 Annual Meeting Society for Neuroscience (San Diego,USA, 2001), XII Международном Совещании по эволюционной физиологии, посвященном памяти акад. Л.А.Орбели (НИИ им. И.М.Сеченова РАН, СПб, 2001), XVIII съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001), конференции “Changing views of Cajal's neuron”, CSIC (Madrid, Spain, 2001), IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения» (НИИ Физиологии РАН, СПб, 2002), научной конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002), 33 Annual Meeting Society for Neuroscience (New Orleans, 2003), Российской конференции с международным участием «Организм и окружающая среда - адаптация к экстремальным условиям» (Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, 2003), Всероссийской конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 2003), 8-th Multidisciplinary International conference of Biological Psyhiatry “Stress and behavior” (St.Petersburg, 2004), International Congress “Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health” (Sudak, Crimea, Ukraina,2004), научной конференции «Механизмы синаптической передачи» (Москва, 2004), 19-ом Съезде физиологов (Екатеринбург,2004), 8-th Regional Meeting European Neuropsychopharmacolo- gy (2004), 35 Annual Meeting Society for Neuroscience (2005), 1-ом Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005), кнференции «Фундаментальные науки - медицине» РАН (Москва, 2006), XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии, посвященных памяти акад. Л.А.Орбели и 50-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (СПб, 2006), научной конференции «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности ассметрии и пластичности мозга» (НИИ мозга РАМН, Москва, 2006), V Международной конференции по функциональной нейроморфологии, «Колосовские чтения», РАН (СПб, 2006).

ПУБЛИКАЦИИ

Полученные результаты диссертационного исследования опубликованы в 54 работах. Из них: 1 обзор, 2 монографии и 25 статей в ведущих отечественных и зарубежных журналах, включенных в список ВАК.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материал и методы», четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 300 страницах, иллюстрирована 124 рисунками, включающими 215 микрофотографий, 9 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Работа выполнена на мышах гибридах F1 (C57BL/CBA), мышах линии C57BL и лабораторных крысах линии Wistar. Было исследовано 75 зародышей, находящихся на разных стадиях дробления (от стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты); 126 эмбрионов на ранних постимплантационных стадиях развития (с 6-7 до 16 эмбриональных суток); 238 плодов на поздних постимплантационных стадиях развития (с 17 до 19 эмбриональных суток); 376 животных на разных стадиях постнатального развития (новорожденных, особей раннего постнатального периода, препубертатного, пубертатного периодов и животных, достигших половозрелого возраста).

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Эмбрионы различных стадий пренатального развития и животные разных постнатальных этапов онтогенеза в работе использовались для изучения:

1. Роли серотонина в процессах дробления. Были использованы доимплантационные дробящиеся зародыши со стадии 2-х бластомеров до стадии бластоцисты. Оценивали скорость дробления, сопоставляя количество бластомеров в зародыше в опыте и контроле на определенных стадиях.

2. Воздействий неблагоприятных факторов среды (повышенного уровня глюкокортикоидов, гипоксии) на развитие разных отделов развивающегося головного мозга. Исследование закладок неокортекса, среднего, заднего и продолговатого мозга у постимплантационных эмбрионов и плодов проводили на 13, 14, 16, 17, и 19, 20 эмбриональные сутки, т.е. в периоды активных процессов пролиферации, миграции и начальной дифференциации нейронов. Определяли наличие клеток с признаками пикноза, либо апоптотической гибели, а также целостность ядра и цитоплазмы.

3. Отдаленных последствий пренатальных воздействий повреждающих факторов среды (повышенного уровня глюкокортикоидов, пониженного уровня серотонина, гипоксии). В разные сроки постнатального периода исследовали различные отделы головного мозга, отличающиеся по происхождению, строению и реализации высших нервных функций: neocortex (слои II - VI); структуры, входящие в состав лимбической системы: area cingularis (передняя и задняя подобласти лимбической коры); hippocampus (поля СА1, СА3, СА4 и fascia dentata); моноаминергические ядра - substantia nigra и nucleus raphe dorsalis.

Cравнительный анализ состояния структур головного мозга после различных воздействий и в контроле проводили в стандартизированных условиях на одних уровнях. При этом использовался стереотаксический атлас мозга крысы (Paxinos G., Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 1998); и стереотаксический атлас мозга мыши (Slotnick B. M., Leonard C.M. A Stereotaxic Atlas of the albino mouse forebrain, 1995).

Материал обрабатывали по общепринятой гистологической методике. Готовили серийные фронтальные срезы целого мозга. Морфологическому анализу подвергали каждый 5-й срез разных отделов мозга.

Были исследованы следующие отделы головного мозга: neocortex- фронтальная (area frontalis); теменная (area parietalis); височная (area temporalis); затылочная кора (area occipitalis); лимбическая кора (area сingularis), формации hippocampus (поля СА1, СА2, СА3, СА4 и fascia dentata); substantia nigra и nucleus raphe dorsalis. Оценивали размер нейронов, их форму, целостность ядра и цитоплазмы, наличие клеток с признаками пикноза или цитолизиса, вакуолизации цитоплазмы, а также оценивали плотность расположения нейронов в каждой структуре.

Выбранные для исследования структуры мозга выполняют жизненно важные функции, принимают участие в построении и регуляции многочисленных и разнообразных функций ЦНС, участвуют в ответе на стрессовые ситуации, достаточно обильно иннервируются серотонинергическими волокнами.

Методы исследования.

Проведено несколько серий экспериментов:

1. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов, возникающего после стресса матери на развивающийся мозг крыс.

Изучались как непосредственные реакции развивающейся нервной ткани в ответ на материнский стресс, так и отдаленные его последствия. Самки подвергались процедуре хронического иммобилизационного стресса в течении 30 минут дважды в день на 16, 17, 18, 19, 20 и 21 сутки беременности. Исследование непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани в ответ на стресс матери проводили через 3 часа и 1 сутки после однократного воздействия материнского стресса на эмбрионы 16 суток развития. Для изучения отдаленных последствий хронического материнского стресса мозг потомства фиксировали на 25, 40-45 и 90 сутки постнатального развития. В качестве контроля исследовали мозг потомков аналогичных стадий развития, полученных от интактных матерей.

2. Изучение воздействия повышенного уровня глюкокортикоидов, возникающего у беременных самок крыс после введения синтетического аналога дексаметазона на развивающийся мозг потомства.

Изучали как непосредственные реакции развивающейся нервной ткани на воздействие дексаметазона в пренатальный период развития, так и отдаленные его последствия. В исследовании использовали фармакологический синтетический препарат - дексаметазон-фосфат (КРКА, Словения) в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг. Выбор дозы: 1мг/кг - приближена к средне терапевтической, используемой в акушерской практике; 3 мг/кг - широко используется в известной литературе в экспериментах на животных для более выраженного эффекта воздействия повышенного уровня кортикоидов на функции мозга. Препарат вводили однократно внутрибрюшинно на 13, 16 и 19 сутки внутриутробного развития, когда наиболее активно осуществляются процессы пролиферации нейральных клеток-предшественников и их начальная дифференцировка. Для исследования непосредственных реакций эмбриональной нервной ткани на воздействие дексаметазона мозг плодов крыс линии Wistar фиксировали через 3 часа и 1 сутки после введения препарата. Для изучения отдаленных последствий пренатального воздействия дексаметазона мозг потомков фиксировали на 60 сутки постнатального развития, когда отчетливо выявляются модификации основных гистогенетических процессов. В качестве контроля исследовали мозг потомков аналогичных стадий развития, полученных от интактных матерей, и матерей, получавших однократную внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора.

3. Изучение роли серотонина в развитии и фомировании головного мозга у подопытных животных.

Для исследования участия серотонина в развитии головного мозга и формирования патологий при его дефиците в пренатальном периоде использовался метод ингибирования ключевого фермента его синтеза - триптофангидроксилазы парахлорфенилаланином (пХФА). Работа выполнялась на мышах гибридах F1(C57Bl/CBA), на мышах линии C57Bl и крысах линии Wistar. Беременным самкам мышей (на 8 эмбриональные сутки) и крыс (на 9 эмбриональные сутки) вводили пХФА однократно внутрибрюшинно в дозе 400 мг/кг. Доза была выбрана с учетом литературных данных, свидетельствующих о том, что пХФА в дозе 300-400 мг/кг как у взрослых животных, так и у их плодов вызывает длительное снижение уровня содержания серотонина (до 50-80%). Снижение уровня серотонина происходит постепенно, достигает максимума через 3-е суток и сохраняется пониженным в течение 5-6 суток (Науменко, Е.В., 1971; Попова Н.К. и др., 1975; Keller H.H., 1972; Lauder J.M. et al., 1985)

Метод определения уровня серотонина. Уровень содержания серотонина в тканях мозга эмбрионов определяли методом высокоаффинной жидкостной хроматографии в лаб. Биохимии НИИ Акушерства и гинекологии им. С.Е. Отта. Количество серотонина измеряли в нг/1мг белка эмбриональной нервной ткани. Было установлено, что в пробах, полученных от интактных эмбрионов, количество серотонина составляло 0,137±0,01 нг/мг белка, а через 3 суток после введения пХФА в дозе 400 мг/кг его количество равнялось 0,05±0,006 нг/мг белка эмбриональной нервной ткани, т.е. снижалось на 63,3%.

Для изучения влияния дефицита серотонина на развитие доимплантационных и ранних постимплантационых зародышей препарат вводили на 1 и 2 сутки беременности. Эмбрионы исследовали на 3, 4, 5, 7 и 8 эмбриональные сутки развития.

Для изучения роли серотонина в развитии головного мозга пХФА вводили самкам мышей на 8 сутки, а самкам крыс на 9 сутки беременности. Эта стадия эмбрионального развития была выбрана из расчета, что значительное снижение уровня серотонина происходило через 3 суток (см. выше) после введения (т.е. на 11-12 эмбриональные сутки, в период когда формируются отделы мозга) и остается пониженным до 16-18 эмбриональных суток (т.е. на протяжении всего периода активного морфогенеза: процессов пролиферации, миграции и начальной дифференцировки нейронов). Исследование головного мозга у животных проводили в постнатальный период на 1, 5,10, 25, 40 и 90 (П1, П5, П10, П25, П40 и П90) постнатальные сутки. В качестве контроля использовали мозг потомков соответствующих стадий развития, полученных от интактных матерей, и матерей которым вводили физиологический раствор на соответственных сроках беременности.

Для изучения влияния пренатального материнского стресса на формирование отделов мозга у эмбрионов, развивающихся на фоне дефицита серотонина, использовали одновременное сочетание метода пренатального ингибирования синтеза серотонина и пренатального иммобилизационного стресса. Этот фрагмент работы выполнен на крысах линии Wistar. В качестве контроля служили самки, которым однократно внутрибрюшинно на соответствующей стадии вводили физиологический раствор. Исследование отделов головного мозга у потомства как контрольных самок, так и самок, подвергавшихся воздействиям проводили на 25, 40 и 90 постнатальные сутки.

Морфометрические параметры клеток измерялись в разных слоях neocortex и hippocampus. Определяли количество клеток, их среднюю площадь, процент площади, занимаемой клетками внутри выделенного квадрата, вертикальные и горизонтальные размеры, углы наклона клеток или угол отклонения апикального дендрита от вертикали при нарушении ориентации нейронов. Количественную оценку наблюдаемых изменений проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений Matrox Inspector (Канада). Изображения структур с гистологических срезов мозга животных вводили в компьютер с помощью цветной цифровой видеокамеры Leica DIC-E 300F (Leica, Germany), смонтированной на световой микроскоп Н605Т (увеличение х40; Image size 1300x1030 пикселей; Color depth: 8 bit). Сравнение количественных данных проводили с использованием параметрического критерия t.

Статистическая обработка количественных оценок и измерений проводилась при помощи компъютерной программы PhotoM121.

Для электронномикроскопического исследования участки neocortex фиксировали методом погружения в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере, затем отмывали в буфере и использовали дополнительную фиксацию 1% четырехокисью осмия на 0, 05М какодилатном буфере, обезвоживали в спиртах и заливали в эпон. Изготавливали полутонкие срезы, проводили прицельную заточку блока на уровни различных слоев neocortex. Ультратонкие срезы исследовали под электронным микроскопом Jem-100 B.

4. Влияние острой пренатальной гипоксии на развитие мозга крыс.

Исследование проведено на крысах линии Wistar. Беременных крыс помещали в барокамеру СВК-150 объемом 14 литров. Барокамера оснащена устройствами для автоматического обогрева до заданной температуры, постоянной смены газовой смеси и определения скорости потока газа. Во время экспериментов использовали аппаратуру для определения: содержания ОІ и СОІ - газоанализатор CF-101 (SPHAJA, Франция), скорости газового потока через камеру - волюметр (VEB-MLW, Германия), давления в камере - манометр с ценой деления 1 кг/смІ (Россия), температуры среды в камере - электротермометр и чернильный самописец КСП -6 (Россия). Азотно-кислородную смесь приготавливали с помощью газоаналитической и газосмесительной установки фирмы “Laorg” (Франция). Беременных самок помещали в барокамеру и содержали в ней 1 час, в течение которого ее продували азотно-кислородной смесью со скоростью 2,5 л/мин. Во время экспериментов использовали следующие параметры среды: содержание кислорода - 7,56 - 7,8%; содержание углекислого газа 0,16 - 0,21%; температура - 21,3 - 23,0?С; общее давление - нормальное. Воздействие гипоксии осуществляли на 13, 16 и 19 сутки эмбрионального развития. Гистологическое исследование мозга крысят проводили на 1, 5 и 10 постнатальные сутки. Мозг фиксировали в жидкости Буэна и по общепринятой методике заливали в парафин, готовили фронтальные срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали по Нисслю.

Материал для световой микроскопии обрабатывался общепринятыми гистологическими методами. Гистологические препараты исследовали под световым микроскопом фирмы Leiсa (Германия).

Иммуноцитохимические методы исследования.

Метод выявления GFAP. Изучение дифференцировки астроцитарных элементов в разных кортикальных структурах проводили с использованием иммуноцитохимического метода выявления белка промежуточных филаментов астроцитов - специфического глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), что позволило судить о начале, объеме и темпах их дифференцировки. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 1 часа или смеси 80% этанола и 0,5% параформальдегида в течение 24 часов. GFAP выявляли с помощью поликлональных антител (DАКО, Дания) и вторичных антител, конъюгированных с полимером и пероксидазой (En Vision+, DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания).

Метод выявления серотонина. Для выявления серотонинергических нейронов nucleus raphe dorsalis использовали иммуноцитохимический метод выявления серотонина. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на серотонин осуществлялась с использованием поликлональных кроличьих антител к серотонину фирмы Novocastra (NCL-SERTp, разведение 1: 200) и набора LSAB -2 (DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю.

Метод выявления тирозингидроксилазы. Для изучения локализации тирозингидроксилазы, использовали иммуноцитохимический метод ее выявления. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,01М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 24 часов. Фиксированный материал обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Иммуноцитохимическая реакция на тирозингидроксилазу осуществлялась с использованием моноклональных антител (клон ТОН А1, разведение 1: 500) фирмы BD Pharmingen и набора LSAB -2 (DAKO, Дания). Визуализацию связанных первичных антител производили при помощи хромогена DAB+ (DAKO, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов докрашивали толуидиновым синим по Нисслю (Коржевский Д.Э. и др., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние иммобилизационного стресса матери на развитие отделов головного мозга крыс.

Уровень стероидных гормонов (глюкокортикоидов и половых) в крови матери имеет существенное значение для нормального развития плодов. Изменение гормонального баланса в ту или другую сторону, возникающего при воздействии разного рода стрессов на мать, как правило, приводит к существенным нарушениям различных функциональных систем ее потомков.

В развитии стресса существенная роль принадлежит глюкокортикоидам и серотонину, которые соответственно называют гормоном и медиатором стресса и уровень которых при этом значительно меняется. Результатом пренатального стресса является, в частности, изменение уровня серотонина и снижение его оборота в ряде структур головного мозга (Poland R.E., et al., 1995; Muneoka K. et al, 1997). Серотонин является одним из главных модуляторов гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, как матери, так и плода, участвующей в ответе на стресс. Попытка в настоящей работе изучить влияние дисбаланса кортикоидов и серотонина, возникающего при материнском стрессе, на развитие отделов головного мозга млекопитающих объясняется отсутствием в доступной нам литературе данных о клеточных механизмах, характере и тканевых характеристиках нарушений развития мозга.

Материнский стресс во время формирования отделов головного мозга вызывает каскад структурно-функциональных реакций, при этом выявляются непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани на стресс и отдаленные его последствия, представленные структурными изменениями во всех исследованных формациях головного мозга и сохраняющиеся в постнатальном онтогенезе.

Непосредственные реакции эмбриональной нервной ткани в ответ на стресс матери.

Однократная процедура стрессирования матери на 16 сутки беременности достаточно быстро (через 3 часа и 1 сутки) вызывает реакцию развивающейся нервной ткани на стресс, которая приводит к апоптотической гибели часть клеток. В основном, гибель нейробластов регистрируется в развивающихся неокортексе, среднем и продолговатом мозге. Утрата части нейробластов в популяциях клеток последних, несомненно, будет сказываться на формировании и развитии структур этих отделов мозга и их клеточном составе.

Отдаленные последствия воздействия стресса матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс.

Аномальное развитие neocortex выявлено у животных, пренатально переживших материнский стресс, на 25, 40 и 90 постнатальные сутки, при этом характерными нарушениями цитоархитектоники во всех изученных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) было: истончение и разреженность всех слоев, особенно глубоких (V и VI), снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, недоразвитие нейропиля, нарушение ядерно-цитоплазматического соотношения в нейронах, а также присутствие диффузной единичной гибели клеток во всех слоях neocortex. У животных, достигших половозрелого возраста (90 постнатальные сутки), все структурные изменения в neocortex, отмеченные в препубертатный и пубертатный периоды, сохраняются, более того к этому сроку происходит утрата больших пирамидных нейронов в слое V и появление нейронов с вакуолизированной цитоплазмой. Материнский стресс у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина, приводит к аналогичным изменениям в кортикальных структурах.

Значительные нарушения выявлены в аrea cingularis. У потомков всех возрастов, пренатально перенесших материнский стресс, в передней и задней подобластях лимбической коры присутствуют аналогичные изменения характерные для neocortex (истончение и разреженность как слоев верхнего комплекса (II-III-IV), так глубоких слоев (V и VI), снижение количества клеток в слоях, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). В задней лимбической подобласти эти нарушения более выражены. У крыс, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс, в аrea cingularis наряду со сходными нарушениями, по мере увеличения постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных), в верхних слоях (II-III-IV) задней лимбической подобласти происходит еще большее снижение количества нейронов, уменьшение размеров клеток и изменение их формы, часто приобретающей неправильные очертания.

Хронический стресс матери приводит у потомков к изменению структуры всех формаций hippocampus. В полях СА1, СА3 и СА4 слои пирамидных нейронов истончены. Единичные диффузно рассеянные погибшие пирамидные нейроны и клетки гранулярного слоя fascia dentata встречаются на протяжении всего постнатального периода, а также у животных, достигших половозрелого возраста. Такая отсроченная постепенная гибель клеток в результате приводит к утрате значительной части нейронов в формациях hippocampus у взрослых животных. Достаточно высокую чувствительность клеток hippocampus к кортикоидам, обнаруженную в нашем исследовании, по-видимому, можно объяснить содержанием самой высокой плотности глюкокортикоидных рецепторов нейронами всех формаций hippocampus по сравнению с клетками других структур головного мозга (Wan S.L., Liao M.Y., Sun K., 2002; Weinstock, 2005). Более того, их количество в лимбических областях еще более повышается после иммобилизационного стресса матери (Kanitz E., Otten W., Tuchscherer M., et al., 2003). Результатом этого может быть изменение функционального состояния нейронов в отделах hippocampus. Обнаруженные нами структурные изменения и дегенеративные процессы в формациях hippocampus могут быть одной из основных причин нарушения физиологических и поведенческих реакций у животных. Отмечено, что разного рода психические расстройства и неврологические заболевания: шизофрения, депрессия, эпилепсия, болезнь Альцгеймера и т.д., сопровождаются изменениями в структуре отделов hippocampus (Fujioka A., Fujioka T., Ishida Y., et al., 2006; Fenoglio K.A., Brunson K.L., Baram T.Z., 2006; Dhikav V., Anand K.S., 2007).

Отмеченное нами снижение количества пирамидных нейронов в формациях hippocampus следует расценивать как результат остановки пролиферации клеток во всех полях и fascia dentata hippocampus после пренатального стресса, вызывающей резкое уменьшение его объема (Isgor C., Kabbaj M., Akil H., 2004; Yu I.T., Lee S.H., LeeY.S., Son H., 2004). Наряду с этим выявлен факт присутствия в пубертатный период значительного количества незрелых клеток в hippocampus (Liu H., Kaur J., Dashtipour K., et al., 2003), который дает основание предположить, что после стрессового воздействия основная масса клеток не способна осуществить дифференцировку должным образом и остается в незрелом состоянии. Вероятно, последствием этого может быть отсроченная гибель клеток в этих структурах.

Показано, что у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и переживших пренатальный стресс, структурные изменения в формациях hippocampus более выражены. Во всех полях и, особенно, fascia dentata слои нейронов истончены, присутствуют диффузно рассеянные погибшие, как пирамидные нейроны, так и клетки гранулярного слоя. Взаимные контролирующие влияния серотонина и кортикоидов в нейрогенезе в период пренатального развития крайне мало изучены. Известно лишь то, что у пренатально стрессированных крыс происходит снижение уровня серотонина в hippocampus за счет подавления избыточным кортикостероном серотонинергической трансмиссии путем снижения экспрессии 5-НТА1 рецепторов. С другой стороны, серотонин через 5-НТ7 рецепторы вызывает транскрипцию mRNA глюкокортикоидных рецепторов в hippocampus (Andrews M.H., Kostaki A., Setiawan E., 2004), недостаток кортикостероидов нарушает развитие серотонинергической иннервации в hippocampus и neocortex (Leret M.L., Peinado V., Suarez L.M., et al., 2004). Как видно, существуют достаточно сложные механизмы тесного взаимодействия уровней серотонина и глюкокортикоидных гормонов, необходимых для нормального нейрогенеза и созревания мозга, нарушение корреляции уровней которых при материнском стрессе может приводить к аномалиям развития отделов мозга, что еще раз подтверждается результатами настоящего исследования.

Впервые показано, что материнский стресс сказывается на морфо- функциональном состоянии нейронов моноаминергических ядер substantia nigra и nucleus raphe dorsalis. Структурные изменения и гибель клеток в них регистрируются в пренатальный и постнатальный (препубертатный, пубертатный) периоды, а также сохраняются у животных, достигших половозрелого возраста.

У 25 суточных крысят после пренатального стрессирования в substantia nigra zona compacta обнаружено снижение количества клеток, присутствие нейронов с вакуолизированной цитоплазмой (рис.1). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) происходит усиление дегенеративных процессов при этом возрастает количество нейронов, имеющих тяжелые изменения и погибших клеток, одновременно происходит сокращение общего количества нейронов, составляющих структуру. Оказалось, что у подопытных животных в пубертатный период количество дофаминсинтезирующих нейронов сокращается почти в 2 раза, вероятно, результатом этого будет снижение объема синтеза дофамина и его оборота в организме.

Рис. 1 Мозг крысы, фрагмент substantia nigra zona compacta на 25 постнатальные сутки, (а) контроль, (б) после пренатального стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (стрелка). Окраска по Нисслю. Увел. ок.х 10, об.х 40

Более выраженные структурные изменения в substantia nigra zona compacta были выявлены в пубертатном периоде и у взрослых животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс. Значительное сокращение количества нейронов, соответствующих норме, и увеличение клеток с тяжелыми изменениями ядра и цитоплазмы, а также погибших нейронов (рис.2) могут быть результатом нарушения формирования самой серотонинергической системы и снижения синтеза серотонина, мишенью которого являются дофаминергические нейроны, их развитие и дифференцировка, а, следовательно, и формирование substantia nigra в целом.

Регулирующие влияния дофамина в эмбриогенезе достаточно известны. Дифференцировка дофаминергических нейронов в substantia nigra zona compacta и становление проекций к развивающимся отделам мозга в норме происходит довольно рано (Hu Z., Cooper M., Crockett D.P., et al., 2004; Van Kampen J.M., Robertson H.A., 2005; Deng D.R., Djalali S., Holtje M., et al. 2007). Нарушение развития и интеграции дофаминергических проекций в конечный мозг, изменение становления

Рис. 2 Мозг крысы, substantia nigra zona compacta на 90 постнатальные сутки после пренатальной деплеции серотонина и стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (короткая стрелка), сморщенные гиперхромные нейроны (длинная стрелка). Окраска по Нисслю. Увел. ок.х10; об.х 40

кортикостриатных и кортиколимбических путей, нарушение дофаминергической иннервации hippocampus после пренатального стресса (Berger M.A., Barros V.G., Sarchi M.I., et al, 2004; Scott S.A., Diaz N.M., Ahmad S.O., 2007) может, отчасти, объяснять обнаруженные в данном исследовании нарушения развития кортикальных структур и hippocampus.

В развитии дофаминергической системы принимает участие большое количество активных факторов (различные типы ростовых факторов, нейротрофины, представители семейства TGF-beta, IGFs, стероидные гормоны и т.д.), которые включаются в регуляцию развития и дифференцировки клеток этой нейральной системы. Механизмы, лежащие в основе этих процессов сложны, комплексны и включают взаимодействия с другими факторами, стимулирующими эти процессы, а также требуют активации ненейральных клеток, таких как астроциты. Одной из мишеней глиального нейротрофического фактора (GDNF) являются дофаминергические нейроны. Этот, один из самых мощных трофических факторов, способствует нормальной функции дофаминергических нейронов и их выживанию, однако эта специфическая его функция утрачивается в пубертатный период (Kholodilov N., Yarygina O., Oo T.F., et al., 2004; (.Li L., Su Y., Zhao C., et al., 2006; Kipp M., Karakay S., Pawlak J., et al., 2006). Не исключено, что обнаруженное в нашем исследовании нарушение глиогенеза после пренатального стресса, может вносить свой вклад в изменение структуры substantia nigra zona compacta и недостаточное поддержание жизнеспособности дофаминергических нейронов. Транскрипционные факторы, недавно выделенных генов (HNF3alpha, synaptotagmin 1 и Ebf3), экспрессия которых обнаружена в вентральном среднем мозге, являются необходимыми для постмитотической дифференцировки и выживания дофаминэргических нейронов. При этом их экспрессия продолжается до периода полового созревания (Thuret S., Bhatt L., OґLeary D.D., et al., 2004). Не исключено, что избыточный уровень кортикоидов, являющихся ядернотропными гормонами и воздействующими на плод после пренатального стрессирования, могут влиять на экспрессию этих генов, оказывая непрямое влияние на дифференцировку дофаминергических нейронов и их выживание. Обнаруженное в настоящем исследовании уменьшение размеров нейронов и их отсроченная гибель вполне могут быть результатом нарушения процесса дифференцировки нейронов. Более того, как видно из установленных фактов, экспрессия некоторых генов и функциональная активность нейротрофических факторов в развитии имеют место только до периода полового созревания. Учитывая, с одной стороны, прекращение функциональной активности некоторых нейротрофических факторов, а с другой, изменение гормонального фона, пубертатный период можно считать критическим для проявления и усугубления пренатально сформированных аномалий, что и подтверждают представленные нами данные.