Клеточные и тканевые реакции развивающегося головного мозга млекопитающих на воздействия неблагоприятных факторов среды

Ранимость дофаминергической системы достаточно известна. Атрофию дофаминергических нейронов у взрослых могут вызвать воздействия таких повреждающих факторов как гипоксия, применение лекарственных препаратов (нейролептиков), воздействие химических веществ и т.д., а также возрастные изменения. Несмотря на большое число исследований, изучающих механизмы, лежащие в основе этих явлений, и использование различных моделей на животных, фундаментальный вопрос: когда происходят первичные нарушения, приводящие к атрофии дофаминергические нейроны, в раннем периоде развития, последующем онтогенезе или они связанны с возрастными изменениями, остается открытым. Однако существует мнение, что дегенеративные процессы в substantia nigra zona compacta у взрослых индивидуумов и в пожилом возрасте являются следствием патологических процессов, происходивших в более раннем онтогенезе (Lang A.E., 2007). Последствия материнского стресса в пренатальный период развития потомства могут являться первоначальной причиной, вызывающей нарушения белкового обмена, оксидативный стресс, увеличение содержания железа, измененние гомеостаза Са+І, т.е. выявленные факторы, приводящие к ускоренной утрате нейронов в substantia nigra zona compacta и нигростриатной дегенерации (Lang A.E., 2007). Причиной дофаминергической нейродегенерации в substantia nigra zona compactа может быть также окислительное повреждение нуклеиновых кислот (цитоплазматической RNA и митохондриальной DNA). Не исключено, что частичное распыление или полная утрата вещества Ниссля, а также вакуолизация цитоплазмы у части нейронов substantia nigra zona compacta, выявленные в настоящем исследовании после пренатального стрессирования, являются результатом окислительного повреждения нуклеиновых кислот, следствием которого, в свою очередь, является нарушение синтетических процессов. Важно отметить, что значительное количество общего продукта окисления нуклеиновых кислот (8-hydroxyguanosine) присутствует в цитоплазме нейронов substantia nigra zona compacta и соответствует распределению нейродегенерации у пациентов с болезнью Паркинсона (Zhang J., Perry G., Smith M.A., et al., 1999).

Рис. 3 Мозг крысы, nucleus raphe dorsalis на 25 постнатальные сутки, (а) контроль, (б) после пренатального стрессирования; вакуолизация цитоплазмы нейронов (короткая стрелка), сморщенные гиперхромные клетки (длинная стрелка), Окраска по Нисслю

Хронический пренатальный стресс является причиной значительного повреждения структуры nucleus raphe dorsalis. Обнаружены характерные нарушения: уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis, снижение общего количества клеток, изменение соотношения разных типов нейронов. У животных в препубертатный период присутствуют клетки с вакуолизированной цитоплазмой, а также диффузная единичная гибель нейронов (рис.3). С увеличением постнатального возраста (в пубертатный период и у половозрелых животных) сокращается количество нейронов соответствующих норме, снижается число серотонинсинтезирующих нейронов и увеличивается число клеток, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы, а также погибших. У животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина и пренатально перенесших материнский стресс, подобные нарушения более выражены, при этом в nucleus raphe dorsalis резко снижается число клеток синтезирующих серотонин. По мере увеличения постнатального возраста (90 суток) наблюдается усиление дегенеративных процессов, следствием которых является резкое уменьшение размеров nucleus raphe dorsalis ядра, количества в нем нейронов и, часто, его полное разрушение (рис.4). По-видимому, широко участвуя в механизмах стресса, сама серотонинергическая система является объектом воздействия гормонов стресса.

Рис. 4 Мозг крысы, nucleus raphe dorsalis, на 90 постнатальные сутки после пренатальной деплеции серотонина и стрессирования; снижение количества нейронов, (а) вакуолизация цитоплазмы, деформация ядер (короткая стрелка), погибшие нейро- ны (длинная стрелка); (б) опустошение структуры. Окраска по Нисслю. Увел. ок.х10; об.х40

Влияние синтетического глюкокортикоида дексаметазона на развитие отделов головного мозга крыс.

Широкий спектр морфофункциональных нарушений в отделах головного мозга крыс обнаружен после пренатального введения синтетичес-кого глюкокортикоида дексаметазона. Очевидным был как дозозависимый, так и стадиоспецифический эффект воздействия дексаметазона.

Наибольшие структурные нарушения в neocortex, а именно, истончение и разряжение слоев, снижение в них количества клеток, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы, гибель нейронов, выявлены при введении дексаметазона в обеих используемых дозах (1мг/кг и 3мг/кг) на более ранних и поздних постимплантационных стадиях (13 и 19 эмбриональные сутки), при этом чувствительность развивающегося neocortex к глюкокортикоидам на поздних сроках пренатального развития оказалась более высокой.

Значительные изменения в аrea cingularis обнаружены при введении дексаметазона в обеих дозах и на всех исследованных стадиях (13, 16 и 19 эмбриональные сутки). Полученные данные выявили отличия в степени повреждения подобластей лимбической коры, из которых задняя подобласть имеет более выраженные нарушения (истончение и разряжение всех слоев II-VI, резкое снижение в них количества клеток, уменьшение

размеров клеточных тел и объема цитоплазмы). Наши данные интересно сопоставить в результатами, полученными другими авторами и показавшими, что пренатальное введение синтетических глюкокортикоидов (дексаметазона и бетаметазона) в дозах более низких, чем используются в клинике или эквивалентных им, имеет отдаленные эффекты и также приводит у крыс к уменьшению числа и размеров нейронов в неокортексе, нарушению пролиферации в субвентрикулярной зоне и гиппокампе ( Kreider M.L., Tate C.A., Cousins M.M., et al., 2006; Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2006). Вероятно, нарушение или задержка процессов пролиферации клеток-предшественников после пренатального введения дексаметазона является причиной обнаруженных нами изменений в развитии формаций hippocampus. Об этом свидетельствует и значительное истончение слоев пирамидных нейронов в полях СА1, СА2, СА3, СА4 и fascia dentatа (рис.5,6). Известно, что эндогенные и синтетические глюкокортикоиды и серотонин влияют на экспрессию глюкокортикоидных рецепторов во время развития формаций hippocampus. Значительное снижение экспрессии mRNA глюкокортикоидных рецепторов в нейронах hippocampus при введении дексаметазона влечет за собой подъем уровней экспрессии 5-НТ1а и 5-НТ2 рецепторов к серотонину в neocortex и hippocampus (Slotkin T.A., Kreider M.L., Tate C.A., 2006; Erdeljan P., Andrews M.H., McDonald J.F., et al., 2005). При этом в гиппокампе существенно снижаются концентрации глиального белка S100-beta (Bruschettini M., van den Hove D.L., Gazzolo D., et al., 2005), через который осуществляется непрямое действие серотонина на пролиферацию и дифференцировку нейронов этих структур. Можно предположить, что обнаруженные нами нарушения развития формаций hippocampus могут быть связаны с дисбалансом глюкокортикоидных гормонов и серотонина, которые оказывают существенное влияние на развитие neocortex и формации hippocampus, что еще раз подтверждают представленные данные.

Исследование характера изменений в substantia nigra после пренатального введения дексаметазона выявило существование в развитии этой структуры различных периодов чувствительности нейронов к дексаметазону. Как оказалось, введение дексаметазона на более ранних и более поздних стадиях пренатального развития (13 и 19 эмбриональные сутки) вызывает глубокие повреждения, включающие изменение соотношения разных типов клеток, уменьшение размеров клеточных тел, появление нейронов, имеющих тяжелые изменения ядра и цитоплазмы. Воздействие дексаметазона в середине пренатального периода (16 эмбриональные сутки) не оказывает значительных изменений в структуре substantia nigra zona compacta.

Рис. 5 Гиппокамп крысы на 60 постнатальные сутки, поле СА1: А - контроль; Б- после пренатального введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 16 эмбриональный день. Окраска по Нисслю.Увел.ок.х 10; об. х 40

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6 Гиппокамп крысы на 60 постнатальные сутки, поле СА3: А-контроль; Б- после пренатального введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 16 эмбриональный день.Окраска по Нисслю.Увел.:ок.х 10; об. х 40

Особого внимания заслуживают изменения в nucleus raphe dorsalis, выявленные после пренатального введения дексаметазона. Значительные структурные нарушения (снижение количества нейронов, уменьшение размеров клеток, вакуолизация цитоплазмы и гибель части нейронов) имеют место при воздействии препарата в обеих используемых дозах на всех исследованных сроках развития, при этом поздние сроки пренатального развития (19 эмбриональные сутки) оказываются гораздо чувствительнее к глюкокортикоидам. Введение препарата в это время приводит к значительной отсроченной гибели нейронов и клеточному опустошению nucleus raphe dorsalis, и, часто, к его разрушению. Это может быть связано с определенными особенностями и темпами развития структуры, хотя в целом причина остается неизвестной.

Таким образом, показано, что развивающийся мозг млекопитающих является высоко чувствительным к повышенному уровню глюкокортикоидных гормонов как эндогенных, высвобождающихся при стрессе матери во время беременности, так и экзогенных, при введении их синтетических аналогов. Повреждающий эффект избыточного уровня глюкокортикоидов значительно выражен в исследованных структурах головного мозга. При этом, вероятно, нарушается синтез и взаимодействие нейротрансмиттеров таких как серотонин и дофамин, вследствие чего, возможно возникновение их вторичного дефицита, который будет сказываться непосредственно на развитии и созревании мозга. К тому же гибель клеток в neocortex, лимбических структурах и моноаминергических ядрах в постнатальный период может свидетельствовать о том, что повышенный уровень глюкокортикоидных гормонов и дефицит нейротрансмиттеров изменяют процессы дифференцировки нейронов. В результате значительная часть нейронов разных отделов мозга к концу пренатального периода развития не способна осуществить полноценную, соответствующую данной стадии развития, дифференциацию, что, в последующем, может приводить их к отсроченной гибели. Вероятно, этим объясняется то, что аномалии развития, выявленные в препубертатный период, сохраняются в течение дальнейшего постнатального онтогенеза, а также у животных, достигших половозрелого возраста. Нарушения морфогенетических процессов в сочетании с гибелью клеток в центральных отделах головного мозга, усиливающейся с увеличением постнатального возраста, приводит к значительному сокращению количества нейронов в структурах мозга у взрослых индивидуумов. Повышенный уровень глюкокортикоидных гормонов во время эмбрионального периода может изменять программу развития мозга плода, повышая возможность возникновения нейропатологий после рождения.

Влияние дефицита серотонина на пренатальное развитие млекопитающих.

На основании экспериментальных данных, полученных в настоящей работе при исследовании участия серотонина в эмбриогенезе млекопитающих, можно предположить, что ему принадлежит важная роль в морфогенетических процессах. Его дефицит на самых начальных этапах развития приводит либо к отсутствию цитокинеза на стадии зиготы, либо к резкому снижению темпа дробления у зародышей мышей, вплоть до полной его остановки. Это согласуется с существующим мнением о том, что моноамины могут участвовать в запуске и регуляции первых делений дробления (Бузников Г.А., 1987; Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997). Подтверждением морфогенетических свойств серотонина является нарушение процесса формирования бластоцист при его дефиците. Несмотря на то, что кавитация осуществляется в то же время, что и в норме, бластоцисты состоят из небольшого числа достаточно крупных бластомеров. Для таких бластоцист характерно нечеткое разделение на трофобласт и внутреннюю клеточную массу. Такие зародыши способны индуцировать децидуальную реакцию и завершать процесс имплантации, однако они погибают либо сразу после имплантации, либо пройдя стадию «яйцевого цилиндра». Более того, пренатальная деплеция серотонина в период активной пролиферации и органогенеза у мышей (12-17 эмбриональные сутки) приводит к различным врожденным аномалиям развития, спектр которых достаточно обширен: образование мозговых и пупочных грыж, укорочение нижней челюсти и конечностей, микрофтальмия, расщелина твердого неба. К анатомическим аномалиям присоединяются нарушения развития кровеносной системы, которые могут быть связаны с нарушениями серотонинергической иннервации сосудов, их проницаемости, тонуса и кровотока. Об этом свидетельствуют обширные подкожные гематомы на голове, спине, конечностях и брюшной стороне тела плодов. Кровоизлияния обнаруживались в различных структурах мозга, желудочках, сосудистом сплетении. Характерным было расширение и стаз кровеносных сосудов в головном и спинном мозге, внутренних органах и конечностях. Представленные результаты косвенно подтверждают данные других авторов о существовании у эмбрионов мест захвата, аккумуляции или синтеза серотонина (Kirby M.L., Gilmore S.A., 1972; Allan I.J., Newgreen D.F., 1977; Wallace J.A., 1982), поскольку выявленные нами аномалии развития различных эмбриональных структур при снижении уровня серотонина в пренатальный период соответствуют структурам, в которых во время развития обнаружен его синтез и аккумуляция.

Изменение развития структур головного мозга (neocortex, hippocampus, nucleus raphe dorsalis) после пренатальной деплеции серотонина было выявлено у крыс в ранний постнатальный период. Оказалось, что имеет место задержка дифференцировки нейронов и, как следствие, задержка формирования neocortex, которая отчетливо выявляется на 5 постнатальные сутки. Нарушение цитоархитектоники neocortex выражалось в истончении слоев, снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, недоразвитии нейропиля, задержке дифференцировки нейронов, изменении их формы и размеров, сокращении количества вещества Ниссля, частом нарушении ориентации дендритных отростков нейронов. По мере увеличения постнатального возраста (10 постнатальные сутки) все обнаруженные ранее нарушения развития не только сохраняются, но усугубляются. В верхних слоях появляюся клетки с признаками хроматолиза, в глубоких, наряду с их истончением, происходит изменение клеточного состава (в слое V): уменьшается количество больших пирамидных нейронов, в основном, присутствуют клетки среднего и малого размера. Появляется единичная диффузная гибель клеток во всех исследованных структурах (neocortex, hippocampus, nucleus raphe dorsalis).

Наличие внутриклеточной деструкции подтвердило электронномикроско- пическое исследование, которое выявило ряд ультраструктурных изменений в нейронах и глиальных клетках neocortex. Следует отметить, что в разных кортикальных слоях эти нарушения выражены не одинаково, в частности, в глубоких слоях (V и VI) коры повреждения нейронов выражены значительнее. Кариоплазма ядер нейронов содержит вакуоли и миелиноподобные телеца, образованные концентрическими мембранами, при чем по мере увеличения постнатального возраста животных размер и количество миелиноподобных телец в ядрах увеличивается. Степень вакуолизации может быть значительной, в этих случаях вакуоли могут занимать до 1/3 объема ядра. Наряду с этим появляются инвагинации ядерной оболочки, как в цитоплазму, так и кариоплазму. Ультраструктурные изменения органоидов цитоплазмы такие как расширение цистерн эндоплаз- матического ретикулума, увеличение везикулярного компонента комплекса Гольджи и повреждение митохондрий (появление в них мембранных включений, образование многокамерных вакуолей, трансформация частей митохондрий в мембранные структуры) свидетельствуют о деструктивных внутриклеточных процессах, имеющих место у части нейронов на 30 постнатальные сутки. Вероятно, это может объяснять отсроченную постепенную гибель нейронов в исследованных областях головного мозга. Ультраструктурные изменения в астроцитах, а именно вакуолизация цитоплазмы клеток и их отростков, отек отростков, могут лежать в основе нарушений структурно-функциональных характеристик периваскулярной глии. С увеличением количества погибающих нейронов, увеличивается число клеток микроглии, их трансформация в макрофаги, а также повышается фагоцитарная активность глиальных макрофагов.

Особенности нейроногенеза в различных слоях коры выявило морфометрическое исследование, проведенное на крысах после пренатальной деплеции серотонина. По мере увеличения постнатального возраста (с 3 по 10 сутки) площадь клеток в neocortex в верхних слоях (II-IV) в контроле увеличивается в 2, а в глубоких (V-VI) в 1,5 раза. После пренатальной деплеции серотонина в верхних слоях (II-III) и слое V происходит незначительное увеличение площади клеток, а в IV и VI слоях площадь клеток практически не увеличивается. Эти данные косвенно подтверждают задержку процессов развития и дифференцировки нейронов neocortex при снижении уровня серотонина во время эмбрионального развития.

Серотонин участвует не только в нейрогенезе, но и глиогенезе, в частности, развитии элементов астроцитарного ряда. Известно, что астроциты имеют различное происхождение. Клетки радиальной глии трансформируются в астроциты белого вещества и глубоких слоев V и VI neocortex, а астроциты верхних кортикальных слоев происходят из астроглиальных предшественников, которые мигрируют из поздней герминативной зоны после окончания миграции нейронов. Существует большое число факторов способных препятствовать процессам трансформации клеток радиальной глии в астроциты или прерывать коридоры миграции поздней астроглии, что может приводить к нарушению глиогенеза и, как следствие, приводить к изменению цитоархитектоники neocortex и иметь долгосрочные последствия (Evrard P., Marret S., Gressens F., 1997).

В связи с этим особого внимания заслуживают полученные в настоящей работе данные о том, что у животных, развивающихся на фоне дефицита серотонина, имеет место задержка формирования и дифференцировки астроцитарной глии, которая отчетливо выявляется на 10 постнатальные сутки. Показано, что в neocortex выявляется значительно меньшее число GFAP-положительных клеток и их отростков, чем у контрольных животных, а особенно в белом веществе на всех изученных сроках постнатального развития. В связи с этим есть основание высказать несколько предположений относительно причин наблюдаемого явления: либо пренатальная блокада синтеза серотонина приводит к нарушению процессов трансформации и путей миграции клеток радиальной глии, что в дальнейшем может отражаться на дифференцировке нейронов и цитоархитектонике neocortex в целом; либо нарушает пролиферацию глиальных предшественников, вследствие чего не возникает определенной серотонин-зависимой популяции глиоцитов и их формируется меньше. Возможно, снижение уровня серотонина изменяет темпы дифференцировки астроцитов, в результате чего нарушается экспрессия GFAP; не исключено что имеет место изменение уровня функциональной активности формирующейся глии. Обнаруженное, после пренатальной деплеции серотонина, снижение количества глиальных клеток и изменение их активности, может влиять на развитие neocortex. Доказательством этого предположения служат данные, показавшие, что нейрогенетическое действие серотонина на нейроны-мишени может быть как прямым, так и опосредованным через рецепторы астроцитов (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997).

Участие серотонина в формировании серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis выявленное нами служит еще одним подтверждением предположения, что серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов как у беспозвоночных животных, так и у млекопитающих (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997; Lauder J.M., 1990; Whitaker-Azmitia P.M., Shemer A.V., Caruso J. et al., 1990; Whitaker-Azmitia P.M., Druse M., Walker P., Lauder J.M., 1995). При этом снижение уровня эндогенного серотонина в пренатальный период приводит к структурным нарушениям в nucleus raphe dorsalis, которые касались прежде всего изменения соотношения типов клеток, уменьшения размеров клеточных тел, объема цитоплазмы и вещества Ниссля, уменьшения общего количества серотонинсинтезирующих нейронов. Результатом этих изменений будет, вероятно, уменьшение объема синтеза серотонина и возникновение вторичного дефицита эндогенного нейронального серотонина, следствием которого может быть задержка пролиферации и дифференцировки нервных клеток в отделах головного мозга - серотонинергических мишениях иннервации. Все это может создавать новые субстраты для формирования структурно-функциональных основ пренатальной патологии, проявляющейся после рождения.

Суммируя данные раздела по исследованию отдаленных последствий пренатальной деплеции серотонина следует отметить, что аномалии развития, выявленные на более ранних этапах, а именно, нарушение формирования кортикальных слоев, развития и дифференцировки нейронов, изменения их формы, размеров и ориентации, соотношения разных типов клеток в структурах, недоразвитие нейропиля, а также структурные изменения формаций, входящих в лимбическую систему и моноаминергических ядер, сохраняются на протяжении всего последующего онтогенеза.

Аномальное развитие neocortex после пренатальной деплеции серотонина обнаруженное нами согласуется с существующими представлениями о влиянии классических нейротрансмиттеров на процессы нейрогенеза (Бузников Г.А., 1987; Lauder J.M., 1988, 1990; Lauder J.M., Tamir H., Sadler T.W., 1988; Aldridge J., Seidler F.J., Meyer A. et al., 2003). Важно отметить, что к структурным нарушениям в коре, по мере увеличения постнатального возраста, присоединяются нейродегенеративные процессы, о чем свидетельствует диффузная гибель клеток во всех слоях neocortex уже в пубертатный период, в дальнейшем выявляется тенденция к ее увеличению.

К числу заслуживающих внимания относится факт обнаружения структурных изменений в лимбических формациях, hippocampus и area cingularis. Пренатальное снижение уровня серотонина, вероятно, нарушает серотонинергическую иннервацию развивающихся формаций hippocampus, что является драматическим событием, так как серотонин это один из важных факторов, контролирующий пролиферацию клеток-предшественников в формациях hippocampus, влияющий на их миграцию, дифференцировку, синаптогенез и выживаемость (Brezun J.M., Daszula A., 20007), осуществляющий свои влияния через экспрессирующиеся различные подтипы рецепторов к серотонину (5-НТ1А, 5-НТ7, 5-НТ4 и т.д.) (Compan V., Daszula A., Salin P et al., 1996; Daszula A., Ban M.S., Soumier A., 2005). Нарушение всех этих процессов, вызванное пренатальным дефицитом серотонина, приводит к сокращению численности нейронов в структурах hippocampus, задержке, а может быть, и снижению степени дифференцировки нейронов. Не исключено, что отсроченная гибель клеток в формациях hippocampus в постнатальный период вызвана функциональной нагрузкой непомерной для нейронов, не осуществивших достаточную дифференцировку, соответствующую данному этапу развития. Это предположение является наиболее вероятным, так как известно, что hippocampus осуществляет функции, которые еще незрелы у новорожденного животного, для их функционального развития необходимо активное взаимодействие организма с окружающей средой. Период завершения структурного и биохимического становления hippocampus совпадает у млекопитающих с критическим периодом постнатального онтогенеза - временем перехода к активным контактам организма и среды и включения всех анализаторов (Никитина Г., Юсова О.Б., 1965; Виноградова О.С., 1975; Altman J., Das G.D., 1965).

Структурные нарушения в моноаминергических ядрах после пренатальной деплеции серотонина относятся к одному из новых фактов выявленных нами.

Все обнаруженные изменения в substantia nigra zona compacta усугубляются у крысят в пубертатный период, при этом наблюдается увеличение гибели нейронов. У животных, более старшего возраста, результатом отсроченной гибели клеток является снижение общего количества нейронов в структуре, в том числе, дофаминсинтезирующих. При этом сохраняется измененное соотношение разных типов клеток, меньшие размеры нейронов и объема цитоплазмы, косвенно свидетельствующих о нарушении процессов дифференцировки. Представленные данные подтверждают гипотезу о том, что серотонин участвует в регуляции процессов развития substantia nigra.

Оказалось, что пренатальное снижение уровня серотонина приводит к долгосрочным изменениям в структуре серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis. Важно отметить, что обнаруженные нарушения на ранних постнатальных сроках, касающиеся изменения соотношения разных типов нейронов, уменьшения размеров нейронов, сокращения общего количества клеток, в том числе серотонинсинтезирующих нейронов, регистрируются на протяжении всего постнатального онтогенеза. Однако с увеличением возраста характерно появление нейронов с тяжелыми изменениями ядра и цитоплазмы сокращение количества серотонинсинтезирующих нейронов, следствием чего может являться снижение объема синтеза серотонина, приводящее к его вторичному дефициту. Особенности развития nucleus raphe dorsalis в эмбриогенезе свидетельствуют о том, что клетки-предшественники сначала развиваются как билатеральные структуры и после завершения деления нейрональных клеток молодые серотонинергические нейроны проходят два этапа миграции: первичную миграцию, передвигаясь из вентрикулярной зоны вдоль срединной линии, и вторичную миграцию, результатом которой является слияние в рострально-каудальном направлении билатеральных групп нейронов в единую структуру по срединной линии(Levitt P., Moore R.Y., 1978; Diaz-Cintra S., Cintra L., Kemper T. et al., 1981).

В связи с этим, полученные нами данные не только подтверждают гипотезу о том, что серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов у млекопитающих (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Д.М., 1997), но и могут свидетельствовать в пользу того, что серотонин может контролировать как деление серотониновых клеток-предшественников, так и оба этапа их миграции. В наших эскпериментах эти процессы осуществляются в период, когда был зарегистрирован самый низкий уровень содержания серотонина. Можно предположить, что нарушение темпов деления клеток-предшественников и миграционных процессов, вызванных дефицитом серотонина, лежит в основе уменьшения как количества клеток, так и уменьшения размера самого nucleus raphe dorsalis.

Использование поведенческих моделей тревожности и тестирования тонической боли в наших совместных с физиологами экспериментах показало, что выявленные нами аномалии развития мозга у животных после пренатальной деплеции серотонина сопровождаются нарушением формирования исследовательской реакции, резким изменением уровня двигательной активности, которая является одним из независимых компонентов поведения животных, изменением формирования механизмов торможения, при этом с увеличением возраста проявляется тенденция к усилению торможения, а также нарушением развития систем болевой чувствительности (Буткевич И.П., Хожай Л.И., Михайленко В.А., Отеллин В.А., 2003; Butkevich I.P., Khozhai L.I.,et al, 2003; Буткевич И.П., Михайленко В.А., Хожай Л.И., Отеллин В.А., 2005; Butkevich I.P., Mikhailenko V.A. et al, 2005; Butkevich I.P., Khozhai L.I. et all, 2005; Ватаева Л.А., Хожай Л.И. и др., 2007).

Таким образом, пренатальный период развития млекопитающих является высоко чувствительным к низкому уровню серотонина. Серотонин играет важную роль в механизмах морфогенеза, начиная с ранних стадий дробления. Дефицит серотонина на постимплантационных стадиях приводит к нарушению нейро- и глиогенеза, аномалиям развития центральных структур мозга - неокортекса, лимбических структур, моноаминергических ядер (nucleus raphe dorsalis и substancia nigra). Серотонин является авторегулятором дифференцировки серотонинергических нейронов. Его дефицит во время пренатального развития приводит к структурным нарушениям в центральном звене серотонинергической системы - nucleus raphe dorsalis и, тем самым, вызывает вторичный дефицит серотонина в развивающемся мозге, что, в свою очередь, также способствует формированию новых структурных основ пренатальной патологии. Обнаруженные нарушения развития исследованных структур головного мозга на ранних постнатальных стадиях выявляются в последующем онтогенезе, с усилением деструктивных процессов в период полового созревания, и сохраняются вплоть до достижения животными половозрелого возраста.

Влияние острой пренатальной гипоксии на развитие отделов головного мозга млекопитающих.

Чрезвычайную чувствительность развивающего мозга млекопитающих к гипоксии еще раз подтвердили и полученные нами данные. Повреждающий эффект острой гипоксии зависит от стадии развития эмбриона на момент ее воздействия, что свидетельствует о разной чувствительности нейральных клеток развивающегося мозга к дефициту кислорода, находящихся на различных стадиях развития. Впервые выявлено, что гипоксия вызывает непосредственную реакцию эмбриональных нейральных клеток, которая развивается достаточно быстро и приводит к значительному увеличению числа нейробластов с признаками апоптотической гибели. Следует подчеркнуть, что непосредственная реакция клеток в ответ на гипоксию выявляется только на ранних постимплантационных стадиях (13 и 16 эмбриональные сутки). В развивающемся неокортексе и среднем мозге, как правило, в зоне миграции нейробластов, уже через 1 час после воздействия гипоксии обнаруживается значительная гибель клеток. В последующие 3 суток гибель клеток продолжается, о чем свидетельствуют диффузно рассеянные небольшие группы апоптотических телец. На более поздних сроках пренатального развития (19 эмбриональные сутки) воздействие гипоксии не вызывает заметной реакции клеток.

Острая гипоксия, перенесенная в пренатальный период развития, имеет отдаленные последствия, оставляя след в структурной организации отделов головного мозга в постнатальном онтогенезе. Обращает на себя внимание тот факт, что аномалии развития отделов головного мозга наиболее выражены у животных, подвергавшихся острой гипоксии на более ранних сроках эмбриогенеза (13 и 16 эмбриональные сутки). Структурные изменения в коре, обнаруженные на ранних стадиях, с увеличением постнатального возраста сохраняются.

Воздействие гипоксии на более поздней стадии пренатального развития (19 эмбриональные сутки) приводит к менее выраженным повреждениям в neocortex. У животных к 1 постнатальным суткам формируются все слои коры, однако они имеют заметное отставание в развитии. Истонченность верхних слоев, замедление темпов нейроногенеза, задержка дифференцировки клеток, недоразвитие нейропиля являются характерными для ранних сроков постнатального периода. С увеличением постнатального возраста отставание в развитии слоев коры уменьшается. Однако достаточно продолжительное время может сохраняться меньшая степень дифференцировки нейронов, о чем свидетельствует их веретеновидная форма, меньший размер и меньший объем цитоплазмы. Недостаточная зрелость части нейронов и глии, вероятно, может являться причиной отсроченной гибели клеток в постнатальный период.

Нами проведен цикл работ по определению морфометрических параметров нейронов в слоях neocortex у крыс, подвергавшихся острой пренатальной гипоксии и контрольных животных, результаты которых полностью подтвердили наши морфологические наблюдения. По мере увеличения постнатального возраста (с 5 до 10 суток) у животных в контроле число клеток в слоях коры на единицу площади уменьшается в 2 раза, а площадь клеток значительно увеличивается (также в 2 раза). После острой пренатальной гипоксии, независимо от сроков воздействия, на начальных этапах постнатального периода развития (1 и 5 постнатальные сутки), во всех слоях коры число клеток на единицу площади значительно превосходит их число в контроле, а площадь клеток значительно ниже таковой в контроле. Однако с увеличением постнатального возраста (10 постнатальные сутки) при воздействии гипоксии на более ранних сроках эмбрионального развития число клеток во всех слоях коры незначительно превышает контрольные значения, при этом площадь клеток остается в 2 раза меньше, чем в контроле. После действия гипоксии на более поздних сроках развития выявляются отличительные послойные особенности развития. Так, численность клеток в верхних слоях и глубоком слое VI остается более высокой, а в слое V соответствует их числу в контроле. При этом во всех слоях коры к 10 постнатальным суткам площадь клеток приближается к контрольным значениям.

Используя тесты «открытого поля», в совместном исследовании с физиологами, проведенном на аналогичном материале, было показано, что выявленные аномалии развития исследованных структур головного мозга сочетались с нарушением поведенческих реакций, при этом обнаружена корреляция изменения поведения и стадии эмбрионального развития в момент воздействия гипоксии. Обнаружены половые особенности нарушения поведенческих реакций. Так, у самок крыс, подвергавшихся воздействию гипоксии на 16 сутки эмбрионального развития, снижается активность в тестах «открытого поля», а у самцов имеет место противоположная тенденция: горизонтальная активность у них повышается. Более того, имеет место половая инверсия: в тестах «открытого поля» самки демонстрируют паттерны поведения, типичные для интактных самцов. В свою очередь, поведение самцов больше похоже на поведение самок. После действия гипоксии на 19 сутки эмбрионального развития у крыс обоего пола возникают однонаправленные изменения поведения - уровень горизонтальной активности и у самок и у самцов снижается (Ватаева Л.А., Косткин В.Б., Хожай Л.И. и др., 2001).

В работе получен неизвестный ранее факт повреждающего действия острой гипоксии на развитие и становление формаций hippocampus, при этом выявлена зависимость степени повреждения разных его отделов от стадии развития эмбриона в момент воздействия гипоксии.

Нарушение развития поля СА1 выявляется после действия гипоксии как на ранних, так и поздних постимплантационных сроках, при этом значительное отставание в развитии этой структуры от таковой в контроле сохраняется на последующих изученных этапах постнатального онтогенеза.

Изменение развития поля СА2 после воздействия пренатальной гипоксии менее выражены, чем СА1. Гипоксия на ранних сроках эмбриогенеза (13 и 16 эмбриональные сутки) и более поздних (19 эмбриональные сутки) вызывает незначительные отклонения, которые нивелируются с увеличением постнатального возраста.

Существенные отличия выявлены в развитии поля СА3. Воздействие пренатальной гипоксии на ранней и более поздней стадии пренатального развития (13 и 19 эмбриональные сутки соответственно) вызывает значительную задержку развития этой формации hippocampus, которая сохраняется в постнатальном онтогенезе. В середине пренатального периода развития (16 эмбриональные сутки) гипоксия практически не вызывает структурных изменений в поле СА3.

Выраженные нарушения развития поля СА4 имеют место при действии гипоксии на более ранних сроках эмбриогенеза, при этом они сохраняются с увеличением постнатального возраста. Воздействие гипоксии на более поздних сроках эмбрионального развития приводит к значительной задержке развития нейронов выявляемой в первые постнатальные дни, однако с увеличением постнатального возраста отличия пропадают.

Изменения в слое гранулярных клеток в fascia dentatа значительно выражены при воздействии гипоксии на более ранних сроках эмбрионального развития. Уменьшение размеров гранулярных клеток и более плотное их расположение, выявленные в первые дни после рождения, сохраняются с увеличением постнатального возраста. Воздействие гипоксии на поздних сроках пренатального развития приводит к задержке развития этой структуры, которая обнаруживается в первые постнатальные сутки и сохраняется с увеличением возраста. Наше исследование с очевидностью показало, что формации hippocampus имеют отличительные особенности развития и разную чувствительность к гипоксии. Это может объясняться разным временем генерации разных популяций клеток, формирующих отделы hippocampus и осуществляющих в разное время процессы дифференцировки, и выполняющих, впоследствии, различные функции.

Таким образом, острая пренатальная гипоксия оказывает повреждающее действие на развитие мозга млекопитающих. Чувствительность развивающихся структур мозга зависит от стадии развития эмбриона в момент воздействия гипокии. Установлены непосредственные реакции эмбриональных нервных клеток в ответ на гипоксию и ее отдаленные последствия. Непродолжительная эмбриональная гипоксия приводит к нарушению развития слоев неокортекса, при этом тяжесть повреждения кортикальных структур имеет стадиозависимый характер. Повреждения проявляются разными эффектами - избирательной гибелью клеточных элементов эмбриональной ткани, нарушением миграции, изменением темпов развития и дифференцировки, значительной задержкой развития нейропиля, что в свою очередь сказывается на строении формирующегося неокортекса и приводит к необратимым последствиям. Пренатальная гипоксия вызывает нарушение развития и становления формаций гиппокампа, которые имеют разную чувствительность к действию гипоксии. Нейральные клетки, формирующихся полей СА1, СА4 и гранулярные клетки fascia dentatа проявляют высокую чувствительность к гипоксии на ранних постимплантационных стадиях развития, которая снижается к концу эмбриогенеза. В поле СА2 эмбриональные клетки оказываются менее чувствительными к гипоксии на протяжении всех исследованных стадий пренатального развития. В формирующемся поле СА3 существует два срока высокой чувствительности клеток к гипоксии - самые ранние постимплантационные стадии и поздние стадии пренатального развития. Пренатальная гипоксия приводит к долгосрочным последствиям в постнатальном периоде жизни, так как, вероятно, достаточно долго сохраняется незрелость нейронов во всех исследованных областях головного мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, настоящая работа открывает новое направление исследований клеточных механизмов формирования структурных нарушений в эмбриональном мозге после воздействия стрессовых факторов, определяющих основы врожденных патологий ЦНС, и изучения морфофункциональных проявлений этих нарушений в разные периоды постнатального онтогенеза. Получены новые приоритетные данные, касающиеся процессов развития нервной ткани, динамики формирования отделов головного мозга на фоне воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды организма. Прослежены и подробно описаны тканевые и клеточные реакции разных отделов развивающегося головного мозга на воздействие различных повреждающих факторов, при этом выявлено, что немаловажное значение имеет стадия развития эмбриона на момент воздействия стрессового фактора, от которой зависит интенсивность реакции эмбриональных клеток. Показано, что даже непродолжительное воздействие повреждающих факторов в определенные периоды пренатального развития вызывает быстрые модификации гистогенетических процессов и оставляет длительный след в структурной и функциональной организации мозга на протяжении последующего онтогенеза. Выявлены непосредственные реакции и отдаленные последствия повреждающих воздействий в разные сроки эмбрионального периода на структурно-функциональные характеристики развивающегося и дефинитивного головного мозга. Независимо от природы стрессового фактора (иммобилизационного стресса, изменения уровня серотонина, введения синтетических кортикоидов, острой гипоксии) выявлена общая направленность деструктивных процессов, приводящая к формированию абнормальных структур. Более того, показано, что такие разные по своей природе повреждающие факторы вызывают однотипные структурные нарушения в мозге, связанные с модификацией основных процессов гистогенеза (пролиферации, миграции и дифференцировки), и в результате формируют сходные аномалии развития.

Существенным является обнаруженный факт, что в течение эмбриогенеза существуют периоды, когда развивающийся мозг особенно чувствителен к действию как биологически активных веществ, запускающих и регулирующих клеточные и тканевые процессы генетической программы развития, так и неблагоприятных факторов среды, изменяющих эту программу. Все приведенные в настоящем исследовании данные, в целом, открывают новые пути для исследования механизмов патогенеза внутриутробно формирующейся нейропатологии.

ВЫВОДЫ

1. Развивающийся мозг млекопитающих является высокочувствительным к стрессу матери. Его воздействие в пренатальный период вызывает непосредственную ответную реакцию эмбриональных нейральных клеток, приводящую часть из них к быстрой апоптотической гибели, а также модифицирует основные гистогенетические процессы и оставляет долгосрочные последствия в структурных характеристиках мозга, сохраняющихся после рождения.

2. Материнский стресс во время беременности вызывает структурные изменения в neocortex, характерными из которых являются истончение и разреженность слоев, снижение в них количества клеток, в том числе, больших пирамидных нейронов, уменьшение размеров клеточных тел и объема цитоплазмы, нарушение глиогенеза, задержка развития нейропиля и диффузная гибель клеток. Нарушения развития кортикальных структур сохраняются в препубертатном, пубертатном периодах, и у животных, достигших половозрелого возраста.

3. Хронический стресс матери во время беременности приводит к значительным структурным нарушениям в отделах мозга, входящих в лимбическую систему. В лимбической коре и всех формациях гиппокампа стресс вызывает истончение и разреженность слоев, уменьшение количества и размеров нейронов и объема цитоплазмы. Аномалии развития, сформированные на ранних этапах развития, сохраняются на протяжении препубертатного, пубертатного периодов и у взрослых животных.

4. Хронический стресс матери в период беременности сказывается на морфофункциональном состоянии моноаминергических ядер: substantia nigra и nucleus raphe dorsalis. Стресс приводит к сокращению размеров этих структур, снижению в них количества клеток, изменению соотношения разных типов клеток, сокращению объема цитоплазмы в нейронах. По мере увеличения постнатального возраста увеличивается количество нейронов, имеющих тяжелые необратимые изменения и погибших клеток. Снижается число дофамин- и серотонинсинтезирующих нейронов, что может приводить в дальнейшем к сокращению объема синтеза этих нейротрансмиттеров.

5. Взаимодействию кортикоидов и серотонина в пренатальный период принадлежит существенная роль в эмбриональном развитии головного мозга. Сочетанное воздействие повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов и пониженного уровня серотонина во время беременности, возникающих при стрессовых воздействиях, приводит к более выраженным нарушениям развития всех исследованных структур головного мозга.

6. Воздействие синтетического глюкокортикоида (дексаметазона) в пренатальный период развития млекопитающих приводит к широкому спектру морфологических нарушений в исследованных отделах головного мозга, которые сохраняются на протяжении всего последующего онтогенеза. Действие дексаметазона имеет дозозависимый и стадиоспецифический характер, который определяет тяжесть повреждения. Аномалии развития кортикальных отделов представлены недоразвитием слоев, нарушением нейро- и глиогенеза. Имеет место выраженное изменение структуры моноаминергических ядер: substantia nigra и nucleus raphe dorsalis - нарушение соотношения разных типов клеток, уменьшение количества и размеров нейронов, отсроченная гибель клеток. Эти данные являются основанием для пересмотра показаний к клиническому использованию глюкокортикоидов в акушерской практике.

7. Cеротонин функционально активен на протяжении всего пренатального периода развития млекопитающих. Серотонин необходим для осуществления делений дробления, формирования бластоцисты и имплантации. Снижение уровня серотонина на ранних этапах развития приводит к нарушениям нейро- и глиогенеза, аномалиям развития центральных структур мозга (неокортекса, лимбических структур, моноаминергических ядер). Серотонин является авторегулятором развития и дифференцировки серотонинергических нейронов nucleus raphe dorsalis. Снижение его уровня в эмбриогенезе приводит к структурным нарушениям в nucleus raphe dorsalis, уменьшению числа серотонинсинтезирующих клеток, что в свою очередь, может вторично способствовать развитию врожденных патологий развития ЦНС. Аномалии развития структур головного мозга, связанные с дефицитом серотонина в эмбриональном периоде, формируются на ранних этапах развития, сохраняются в препубертатном, пубертатном периодах и у взрослых животных. В пубертатный период усиливаются нейродегенеративные процессы в гиппокампе и моноаминергических ядрах.

8. Воздействие острой гипоксии в пренатальный период имеет выраженный стадиоспецифический эффект. Развивающийся головной мозг млекопитающих наиболее чувствителен к гипоксии на ранних постимплантационных стадиях развития. В эти сроки значительно выражена непосредственная реакция эмбриональных нейральных клеток в ответ на гипоксию, приводящая значительную их часть к апоптотической гибели. Нарушения гистогенетических процессов, вызваные пренатальной гипоксией, имеют отдаленные последствия. Аномалии развития неокортекса, формаций гиппокампа, сформированные на ранних этапах развития, сохраняются в постнатальном онтогенезе.

9. Выявленные аномалии развития отделов головного мозга после пренатальных стрессовых воздействий сопровождаются изменением поведенческих реакций. Комплексные физиологические исследования на идентичном материале установили, что имеют место нарушения формирования исследовательской реакции, резкое изменение уровня двигательной активности, изменение формирования механизмов торможения, усиливающегося по мере увеличения возраста, а также нарушение развития систем болевой чувствительности, при этом обнаружена корреляция изменения поведения и стадии эмбрионального развития в момент воздействия повреждающего фактора.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хожай Л.И. Роль серотонина в процессах формирования сосудистых сплетений головного мозга у млекопитающих // Науч. Конф. «Гистогенез и регенерация тканей», ВМА, СПб, 1995, c. 67.

2. Khozhai L.I., Otellin V.A., Puchkov V.F. Role of serotonin in early mammalian embryogenesis // Psychoneuroendocrine aspects of life phases: Psychoactive agent and the fetal/embryonic development. IBPN; XXIV Congres, Taoraine (Italy), 1995, p. 118.

3. Хожай Л.И., Отеллин В.А. Изучение роли серотонина в процессах формирования сосудистых сплетений головного мозга у млекопитающих // 3-и научные чтения им. Акад. АМН С.А.Саркисова и симпозиум «Современные представления о структурно-функциональной организации мозга. Москва, 1995, c. 14.

4. Хожай Л.И., Пучков В.Ф., Отеллин В.А. Влияние дефицита серотонина на эмбриональное развитие млекопитающих //Онтогенез, 1995, т.26, № 5, с. 350-356.

5. Ватаева Л.А., Хожай Л.И., Отеллин В.А., Кассиль В.Г., Косткин В.Б., Коржевский Д.Э. Гипоксия в раннем постнатальном онтогенезе крысы: развитие мозга и формирование поведения // Доклады Академии Наук, т. 363, № 3, 1998, c. 409-411.

6. Otellin V.A., Khozhai L.I Development of mammalian neocortex during serotonin deficiency. // VI European Congress of Neuropathology, Barcelona, 1999, p. 68.

7. Vataeva L.A., Khozhai L.I, Otellin V.A, Kassil V.G., Kostkin V.B., Korzhevskii D.E. Effect of hypoxia on early postnatal ontogenesis of rats: brain development and formation of behavioral // Dokl. Arad. Nauk., v.363, N 3, 1998, p. 409-411.

8. Хожай Л.И. Серотонин как регулятор дифференцировки пирамидных нейронов глубоких слоев коры мозга эмбрионов мыши // Всерос. Конф. с междунар. участием, посв. 150-летию И.П.Павлова, СПб, 1999, С. 314-315.

10. Otellin V.A., Vataeva L.A., Khozhai L.I, Kostkin V.B. The cerebral and behavioral vulnerability to hypoxia in neonatal and adult rats. // Conf. “Mechanisms of adaptive behavior”, St.Petersburg, 1999, p. 134.

11. Otellin V.A., Khozhai L.I. Serotonin deficiency affects development of mammalian neocortex // 29 Annual Meeting Society for Neuroscience, Miami Beach, USA, 1999, v. 15, p. 1035.

12. Otellin V.A., Khozhai L.I. Role of serotonin in formation of astroglial elements in the brain of development // 30 Annual Meeting Society for Neuroscience, New Orleans, 2000, v. 30, part 2, p. 1601.

13. Кассиль В.Г., Отеллин В.А., Хожай Л.И., Косткин В.Б. Критические периоды развития неокортекса млекопитающих (обзор). Рос. Физиол. Журнал им. И.М.Сеченова, т. 86, № 11, 2000, c. 1418-1425.

14. Хожай Л.И., Отеллин В.А. Начальные стадии дифференцировки пирамидных нейронов глубоких слоев неокортекса у мыши в пренатальном периоде развития. Морфология, №5, 2000, c. 7-11.

15. Otellin V.A., Khozhai L.I Effect of hypoxia on brain structures formation during “critical periods” of prenatal and postnatal ontogenesis // 31 Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, USA, 2001, v.30, part 1, p. 1346.

16. Хожай Л.И., Отеллин В.А., Леонтьев В.Г., Белостоцкая Г.Б. Роль серотонина в формировании неокортекса у млекопитающих // 12 Междунар. Совещание по эволюционной физиологии, посвящ. Памяти Л.А.Орбели, СПб, 2001, c. 46.

17. Ватаева Л.А., Хожай Л.И., Косткин И.Б., Макухина Г.В., Отеллин В.А. Поведение в «открытом поле» у самцов и самок крыс, подвергшихся действию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития // Доклады Акад. Наук, 2001, т.380, №1, c. 125-127.

18. Otellin V.A., Khozhai L.I, Gilerovich E.G. All cellular types differentiation in neocortical layer I precedes formation of cortical plate // Abstr. Conf. “Changing views of Cajal's neuron”, CSIC Madrid, Spain. 2001, p. 37.

19. Vataeva L.A., Khozhai L.I, Kostkin V.B, Makukhina G.V., Otellin V.A. Effect of the time of prenatal hypoxia in the openfild behavior in the male and female rats // Dokl. Biol. Sci., 2001, v. 380, p. 410-411.