Биохимические механизмы клеточной регуляции в плаценте и околоплодной среде при физиологической и осложненной беременности

19

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биохимические механизмы клеточной регуляции в плаценте и околоплодной среде при физиологической и осложненной беременности

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Крукиер Ирина Ивановна

Ростов-на-Дону 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Федерального агентства по здравоохранению высокотехнологичной медицинской помощи»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Погорелова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Конторщикова Клавдия Николаевна

доктор биологических наук, профессор Микашинович Зоя Ивановна

доктор медицинских наук, профессор Серебренникова Клара Георгиевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава.

Защита диссертации состоится «____»_____________ 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 по биологическим наукам в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского (603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 1)

Автореферат разослан «_____»______________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук А.С. Корягин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Плацента, являющаяся взаимосвязывающим звеном между организмами матери и плода представляет собой одну из наиболее сложных тканей высших млекопитающих и человека. Этот - самый молодой в эволюционном ряду - орган отличается от других, прежде всего тем, что за небольшой период времени претерпевает быстрое развитие, достигает полной зрелости и частично «стареет». Такой темп развития, растущие потребности плода предъявляют особые требования к метаболическим процессам, лежащим в основе функциональной деятельности плаценты: они должны обладать высокой пластичностью, а регулирующие их механизмы располагать все возрастающими возможностями дифференциального контроля. Недостаточность плаценты, нередко приводящая к прерыванию беременности и сопровождающаяся хронической гипоксией и/или гипотрофией плода, является одной из основных причин перинатальной заболеваемости и смертности. Частота этой патологии при привычном невынашивании колеблется от 50 до 77%, при гестозах она составляет 30-35%, при экстрагенитальной патологии 24-45% (Г.М. Савельева и соавт., 1991; В.Е. Радзинский, И.М. Ордиянц, 1999; Cтрижаков А.Н., 2003).

Известно, что плацентарная недостаточность, представляющая собой срыв адаптационно-гомеостатических реакций органа, его неспособность поддерживать адекватный обмен между организмами матери и плода, характеризуется различными нарушениями в метаболизме плаценты и механизмах регуляции последнего (Т.Н. Погорелова и соавт., 1997; В.Е. Радзинский, П.Я. Смалько, 2001).

Однако, несмотря на увеличивающееся в последнее десятилетие количество работ, посвященных различным проблемам плацентологии, многие вопросы биохимических и особенно молекулярных механизмов, лежащих в основе становления функций плаценты в течение физиологической беременности, а также формирования плацентарной недостаточности еще весьма далеки от разрешения. В многокомпонентной системе метаболического обеспечения клеточной регуляции важная роль принадлежит ростовым факторам, обладающим ауто-, пара-, интра- и эндокринными эффектами. С развитием учения о факторах роста возрос интерес к роли этих клеточных регуляторов в период гестации, их участию в процессах эмбриогенеза, плацентации (Г.Е. Чернуха, и соавт., 1996; R.H. Li et al., 1997; D. Y. Hill et al., 1998). Появились данные о динамике факторов роста в крови женщин при различных осложнениях беременности (P. Evans et al., 1997; P. K. Lala, 1998; А.В. Орлов и соавт., 2003). В то же время сведения о продукции различных факторов роста в тканях плаценты немногочисленны и противоречивы (F. Luall et.al., 1997; M. Faxen et al., 1998), поэтому выяснение аутокринных механизмов регулирующего действия факторов роста в цито- и синцитиотрофобласте требует дальнейших исследований.

Участие факторов роста в стимулировании процессов ангиогенеза может определять их роль в развитии сосудистой системы плаценты и формировании маточно- и фетоплацентарного кровотоков. Для оптимального обеспечения последних необходим также определенный баланс между компонентами, регулирующими тонус сосудов. Неадекватная продукция вазоконстрикторов и вазодилятаторов (эндотелинов, тромбоксанов, простациклинов и др.) плацентой может привести к нарушению фетоплацентарной гемодинамики, сопровождающемуся развитием внутриутробной гипоксии плода. Среди вазоактивных веществ особое место занимает оксид азота (NO), обладающий выраженными вазодилататорными свойствами. Определенное значение для метаболических последствий изменения генерации NO имеет его свободнорадикальная природа. Снижение антиоксидантных реакций и усиление свободнорадикальных процессов в плаценте при осложненной беременности подтверждено в исследованиях липидного компонента мембран ворсинчатого хориона (И.И. Крукиер, 1992). Однако, не менее важным субстратом воздействия кислородных радикалов являются белковые молекулы, окислительное повреждение которых приводит к их фрагментации, агрегации, подверженности протеолизу. Оценка окислительной деструкции белков при осложненной беременности позволяет выявить повреждение ряда пусковых механизмов в общей цепи реакций клеточной регуляции плацентарного метаболизма.

К числу биологически активных полипептидов, продуцируемых плацентой и осуществляющих эндогенную регуляцию многих межклеточных процессов, относятся различные представители класса цитокинов, в частности интерлейкины. Изменение уровня интерлейкинов во время гестации является важным звеном адаптационной реакции организма матери, направленной на вынашивание генетически чужеродного плода. Дисбаланс интерлейкинового профиля наряду с прямым воздействием на материнско-плодовые взаимоотношения и течение беременности, может оказывать и опосредованное влияние на биологические эффекты других клеточных компонентов, в частности путем экспрессии индуцибельной NO-синтазы, ряда ферментов синтеза простагландинов, активации свободнорадикальных реакций (В.А. Барабой 1991; T. Bai et.al., 1993).

Модификация всех этих процессов, очевидно, может инициировать развитие дисфункции плаценты. Поэтому их изучение будет способствовать выяснению молекулярных основ становления основных функций плаценты в процессе ее физиологического развития и формирования плацентарной недостаточности при осложненной гестации, что, в свою очередь, позволит разработать научно обоснованные подходы ее профилактики и терапии. Дальнейшего развития требуют также вопросы параплацентарного обмена, вносящего определенный вклад в метаболические взаимосвязи между организмами матери и плода.

Цель исследования состояла в выявлении особенностей становления процессов клеточной регуляции метаболизма плаценты в разные периоды физиологической и осложненной беременности и уточнении биохимических механизмов формирования плацентарной недостаточности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить в сравнительном аспекте динамику уровней: факторов роста, их рецепторов и интерлейкинов в плаценте в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

2. Оценить в том же плане продукцию вазоактивных соединений: эндотелина-1, оксида азота, простациклина и тромбоксана В₂ в плаценте в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

3. Изучить в разные сроки физиологической и осложненной беременности динамику активности радикалообразующих ферментов - NO-синтазы, НАДН₂-синтазы и ксантиноксидазы в плаценте.

4. Определить механизмы и степень окислительной модификации и посттрансляционного фосфорилирования белков различных субклеточных фракций плаценты в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

5. Проанализировать динамику содержания факторов роста, вазоактивных компонентов и интерлейкинов в околоплодных водах, пуповине, плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности для уточнения роли параплацентарного обмена между организмами матери и плода.

6. Исследовать характер влияния уровня цитокинов плодных оболочек на механизмы регуляции родовой деятельности.

7. Выработать объективные критерии для экспертной оценки метаболической полноценности плаценты и прогнозирования состояния здоровья новорожденных при различных клинических вариантах течения беременности.

Научная новизна

Впервые, на базе репрезентативного комплекса лабораторных исследований, проведенных в аспекте сравнительного изучения динамики факторов роста, вазоактивных соединений и интерлейкинов, участвующих в регуляции клеточных процессов в плаценте, в разные сроки физиологической и осложненной гестации, установлены принципиально новые закономерности в системообразующих особенностях становления биохимических механизмов клеточной регуляции обеспечения адекватных условий формирования фетоплацентарной системы в нормально и патологически развивающейся плаценте. При этом также впервые выявлены специфические изменения продукции факторов роста, вазоактивных соединений и интерлейкинов, характерные для плаценты в условиях формирования различных клинических вариантов осложнений беременности, и общие закономерности, свойственные развитию любого ее осложнения. Научно обоснована принципиально новая позиция о том, что плацентарная недостаточность, лежащая в основе многих осложнений беременности, развивается на фоне усиления прооксидантных процессов, а также наличия впервые обнаруженной модификации нуклеотидзависимого фосфорилирования и карбонилирования белков плаценты при ее функциональной недостаточности. Установлены ранее неизвестные различия степени и направленности изменений активности цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ, коррелирующие с характером субклеточной локализации плацентарных белков-субстратов. Впервые выявлены и проанализированы в сравнительном аспекте особенности изменений содержания в околоплодных водах, пуповине и плодных оболочках факторов роста, интерлейкинов и вазоактивных соединений эндотелина-1 и оксида азота в зависимости от характера течения беременности и ее исхода. Объективно доказано активное участие элементов околоплодной среды в обеспечении дополнительного параплацентарного обмена между организмами матери и плода. Установлено, что продукция цитокинов плодными оболочками модулируется интенсивностью синтеза в них оксида азота и вносит существенный вклад в регуляцию процессов родовозбуждения. Научно обоснованы способы прогнозирования нарушения гестации: плацентарной недостаточности (патент N 2238567, 2004), гестоза и степени его тяжести (патенты N 2249212, 2004; N 2309412, 2006), выбора тактики родоразрешения (патент N 2193198,2000), синдрома задержки развития плода (патент N 2246733,2005), неразвивающейся беременности (патент N 2313793, 2006), энцефалопатии новорожденного (патент N 2254573, 2004). цитокин интерлейкин плацента беременность

Основные положения, выносимые на защиту

· В процессе физиологического развития плаценты происходят значительные изменения продукции биохимических компонентов внутри- и межклеточной регуляции: факторов роста и интерлейкинов, а также вазоактивных соединений, участвующих в становлении маточного и фетоплацентарного кровотока. Степень метаболических изменений, направленных на создание оптимальных условий для развития плаценты и плода, различна в разные периоды гестации.

· Осложненная беременность развивается на фоне дисбаланса в хорионе и плаценте важнейших клеточных регуляторов - факторов роста и интерлейкинов, а также сдвига в соотношении вазодилататоров и вазоконстрикторов, нарушающих процессы метаболического обеспечения плацентации, ангиогенеза и дальнейшего развития плаценты. Наиболее выраженные биохимические изменения в плаценте имеют место в первой половине беременности.

· Активация прооксидантных процессов, окислительная деструкция белков и модификация их посттрансляционного фосфорилирования усиливает метаболические нарушения в плаценте при осложненной гестации.

· Высокий уровень факторов роста и других цитокинов в плодных оболочках и пуповине свидетельствует об участии этих тканей в процессах метаболических взаимодействий в фетоплацентарном комплексе. Плодные оболочки являются важным источником цитокинов для околоплодных вод, а их содержание в этой биологической жидкости служит объективным критерием прогноза развития родовой деятельности и оценки состояния новорожденного. Продукция эндотелина и оксида азота в пуповине - дополнительный механизм паракринного воздействия на фетоплацентарное кровообращение.

Теоретическое и практическое значение работы

Проведенные исследования углубляют наши представления о становлении метаболических функций плаценты в процессе ее нормального развития и о молекулярно-биохимических механизмах формирования плацентарной недостаточности одного из наиболее распространенных осложнений гестации. Установлены определенные закономерности, лежащие в основе повреждения процессов внутри- и межклеточной регуляции в плаценте и как следствие формирования основных видов акушерской патологии. Полученные в работе данные обосновывают научные предпосылки для коррекции метаболических дефектов в фетоплацентарном комплексе, особенно в те периоды гестации, в которые установлены наиболее значительные биохимические нарушения в плаценте. Корреляционные связи между содержанием отдельных факторов роста в плаценте и сыворотке крови, установленные при различных осложнениях беременности, позволили научно обосновать и разработать принципиально новые способы прогнозирования нарушений гестации.

По результатам исследования внедрены информативные критерии для оценки функциональной полноценности плаценты (по уровню трансформирующего и эпидермального фактора роста в сыворотке крови, патент N 2238576, 2004), прогнозирования состояние новорожденного (по величине активности НАДФН-оксидазы в плаценте, патент N 2254573, 2005) и выбора тактики родоразрешения (по уровню метаболитов оксида азота в околоплодных водах (патент 2193198, 2002).

Разработанные способы прогнозирования и диагностики акушерской патологии внедрены в работу отделения патологии беременных и родильного отделения ФГУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Росздрава», ГУЗ «Областная больница N2», МЛПУЗ «Городская больница N20, МЛПУЗ «Родильный дом N5» г. Ростова-на-Дону, МУЗ « ЦГБ г. Батайска».

Материалы диссертации используются в лекциях на семинарах по повышению квалификации врачей Учебного центра РНИИАП.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на следующих научных форумах:

· Втором съезде Биохимического Общества Росс. академии наук (Москва. Пущино), 1997.

· II съезде РАСПМ «Перинатальная неврология» (Москва), 1997.

· II съезде акушеров-гинекологов Сев. Кавказа. (г.Ростов-на-Дону), 1998.

· Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты, (г.Смоленск), 2001, 2003, 2005.

· Российском Форуме «Мать и дитя» (г.Москва), 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, (г. Казань), 2007.

· IV съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины (г.Москва), 2002.

· Международной конференции «Биоантиоксидант» (г. Москва), 2002, 2004, 2006.

· Всероссийской конференции «Гипоксия. Механизмы, адаптация, коррекция. (г. Москва), 2002, 2004, 2006.

· Пленуме Российской ассоциации акушеров-гинекологов, проблемной комиссии РАМН МЗ РФ «Перинатальная диагностика и беременность высокого риска», (г. Ростов н/Д), 2003.

· VI Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 300-летию С.Петербурга и 205-летию Военно-медицинской академии «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. (г. Санкт-Петербург), 2003.

· International ecologic forum «Environment and human health», (St. Petersburg), 2003.

· Междисциплинарной III Конференции (г.Петрозаводск), 2004.

· Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г.Тюмень), 2005.

· VIII World Congress International Society for adaptive medicine, (г.Москва), 2006.

· Международном симпозиуме «Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии» (г.Гродно, Беларусь), 2006.

· Всероссийском конгрессе эндокринологов. «Высокие медицинские технологии в эндокринологии», (г. Москва), 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 20 статей в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, получено 5 патентов. Личный вклад автора в публикациях составляет 73%.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 274 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 153 отечественных и 271 иностранных источников. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 46 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на базе клинических и научных подразделений Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. В проспективное исследование были включены 353 беременных в возрасте 20-32 лет, давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования.

Контрольную группу составили 125 здоровых женщин с неосложненной беременностью, у 83 из них она закончилась своевременными родами (39-40 нед.), у 30 была прервана в период с 6 до 12 недель в результате искусственного аборта по желанию женщины и у 12 пациенток - в более поздние сроки (19-20 недель) по показаниям не связанным с осложнением беременности (социальные показания, травматические повреждения). Основные группы составили 228 женщин с осложненной беременностью. У 62 из этого числа пациенток беременность была доношена, но протекала на фоне плацентарной недостаточности. 28 женщин с плацентарной недостаточностью (ПН) беременность недоносили и она закончилась преждевременными родами в 36-37 недель. У 76 пациенток беременность самопроизвольно прервалась в 6-10 и 19-20 недель.

Диагноз ПН был поставлен на основании комплексного динамического обследования. Критериями при постановке диагноза ПН служили: выявление анамнестических факторов риска, снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, обнаружение признаков гипоксии внутриутробного плода при проведении кардиотокографии; отставание роста плода по данным ультразвуковой биометрии; снижение в крови активности специфического плацентарного изофермента глутаматдегидрогеназы. У 30 беременных был диагностирован синдром задержки внутриутробного роста плода (СЗРП), обусловленный, прежде всего, плацентарной недостаточностью. Еще одну группу составили 32 пациентки, беременность которых осложнилась гестозом легкой и средней степени тяжести. Диагноз гестоза верифицирован по данным клинического и лабораторного обследования. При проведении функциональных исследований использованы ультразвуковой аппарат Toshiba SSA-340A с цветным допплеровским картированием (Япония), фетальный кардиомонитор с компьютерной обработкой Oxford Sonicaid Team Duo (США), анализатор Humalyzer 2000 human (Германия).

Материалом исследования служили гомогенаты и экстракты хорионов (на ранних сроках развития органа) и плаценты пациенток указанных выше групп. В ряде исследований в 36-40 недель использованы также экстракты плодных оболочек, пуповины и околоплодные воды. В качестве контроля использованы хорионы и плаценты соматически здоровых женщин в разные сроки неосложненной беременности.

В гомогенатах хориона и плаценты, взятых при соблюдении холодового режима определяли уровень факторов роста с помощью иммуноферментного анализа. Для фактора роста плаценты (ФРП), эпидермального фактора роста (ЭФР), сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР), фактора роста фибробластов (ФРФ), фактора некроза опухоли- (ФНО-) использовали иммуноферментные наборы (Cytimmune systems, USA). Исследования проводили в соответствии с протоколом фирмы - разработчика. Аналитическая чувствительность методов - 10,5 пг/мл, 8,3 пг/мл, 18,6 пг/мл, 0,48 пг/мл и 8,8 пг/мл соответственно. Содержание инсулиноподобного фактора роста (ИПФР-1), трансформирующего фактора роста и (ТФР- и ТФР-) определяли иммуноферментными наборами «RD systems» (USA). Чувствительность методов - 10,1 пг/мл и 4,8 пг/мл соответственно. Определение растворимых рецепторов СЭФР и ЭФР (СЭФР-R1, ЭФР-R) в тканях также проводили иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы «Bender MedSystems» (Austria). Чувствительность методов составила 2,72 пг/мл и 1,4 пг/мл соответственно.

Измерение уровня эндотелина (ЭТ-1), тромбоксана В₂ (ТхВ₂) и простациклина (ПГI₂) осуществляли тест-наборами «RD systems» (USA) для иммуноферментного анализа. Аналитическая чувствительность методов - 0,3 пг/мл и 0,9 пг/мл соответственно.

Содержание интерлейкинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и ИЛ-10 определяли, используя тест-системы фирмы «Cytimmune» (USA). Чувствительность методов 9,2 пг/мл, 8,4 пг/мл, 5,6 пг/мл. Все анализы проведены на многофункциональном счетчике для иммуноферментных исследований с программным обеспечением Victor (Finnland).

Эндогенный уровень оксида азота в форме нитрит-аниона (NO₂) после энзиматического восстановления нитратов в нитриты определяли с помощью классической реакции Грисса и обозначали как NO_х. Активность NO-синтазы (КФ 1.14.13.39) измеряли по увеличению продукции NO из l-аргинина в присутствии НАДФН. Количественную оценку образованного NO проводили с помощью ЭПР-спектроскопии мононитрозильных комплексов с двухвалентным железом и диэтилдитиокарбоматом (ДЭТК), обладающих характерными парамагнитными свойствами (А.И. Цапин и соавт., 1994).

Окислительную деструкцию белков оценивали по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков (карбонильных производных) с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенил-гидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически (Е.Е. Дубинина и соавт., 1995). Оптическую плотность образованых динитрофенилгидразонов регистрировали при длине волны 363 нм. Интенсивность окислительной деструкции белков рассчитывали по уровню карбонильных производных, используя коэффициент молярной экстинции, равный 2210³ М^-1см^-1.

Об активности циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ судили по включению радиоактивного фосфора в экзогенный и эндогенные белки из [ ^-32 Р] АТФ. В качестве эндогенных белков-субстратов использовали белки субклеточных фракций плаценты. Стандартным методом дифференциального центрифугирования в градиенте сахарозы выделяли ядра, митохондрии и цитоплазму (супернатант после центрифугирования при 105000g). Из ядерной фракции после изоосмотического лизиса и соответствующей экстракции и выделяли негистоновые белки хроматина (P. Platz et.al., 1983), которые служили эндогенными субстратами плацентарных протеинкиназ. Кроме того, в качестве последних использовали суммарные белки цитоплазмы и митохондрий. Экзогенным белковым субстратом являлся протамин («Sigma», USA). Источником фермента были 10% экстракты плаценты. По окончании реакции с использованием инкубационной среды,содержащей фосфатный буфер, хлористый магний, дитиотрентол, ³²Р-АТФ, цАМФ(или цГМФ), пробы пропускали через соответствующие фильтры «Synpor», промывали стоп-раствором, высушивали и считали в сцинтилляционном счетчике.

Активность НАДФН-оксидазы (КФ 1.11.1.2) определяли по восстановлению 2,6-дихлорфенилиндофенола (ДХФДФ) в присутствии НАДФН при 600 нм. Коэффициент молярной экстинции для НАДФН - 6,22 х 10⁶ см х М^-1 и для 2,6-ДХФДФ - 21 х 10⁶ см х М^-1. Об активности ксантиноксидазы (КФ 1.2.3.2) судили по усилению степени окисления ксантина в ультрафиолетовой области при 293 нм, используя коэффициент молярной экстинции 9,6 см² х М^-1. Активность ферментов выражали в нм/мин/мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури (O.N.Lowry et.al, 1951).

Активность фосфолипазы А₂ (КФ 3.1.1.4) определяли методом Левиса (G.P. Lewis et.al., 1979), используя в качестве субстрата фосфатидилхолин (Sigma, USA). Активность фермента выражали в мкмолях свободных жирных кислот (СЖК) на 1 мг белка за 1 час. Количество СЖК оценивали по Кушмановой и Ивченко (1983).

Определение арахидоновой кислоты проводили с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографах «Цвет-4», «Цвет-5», «Хром-3» и «Хром-4» с плазменно-ионизационным детектором. Газ-носитель - водород, разделение проводили при температуре испарителя и детектора - 275^оС и давления газа-носителя - 0,3-0,6 атм. В качестве регистрирующего прибора использовали электронный автоматический потенциометр ЭПП- 0,9 МЗ.

Статистическая обработка данных.

Cтатистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1. фирмы StatSoft. Inc,) и Excel -2002. Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали критерий Стьюдента (t-критерий) и непараметрический критерий Манна-Уитни (U- критерий). Однородность диcсперcий оценивали с использованием теста Фишера. Достоверными считались различия при р < 0,05. Контроль статистической значимости полученных результатов осуществлялся комплексом современных статистических методов, включая методы рандомизированного тестирования. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена c расчетом коэффициента ранговой корреляции (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Факторы роста плаценты в разные сроки физиологической и осложненной беременности

Результаты наших исследований показали, что в течение физиологической беременности (таблица 1) динамика уровня различных факторов роста в плаценте имеет определенные особенности. Так, содержание ФРП - главного маркера процессов плацентации и ТФР- - важного регулятора клеточной пролиферации и дифференцировки достигает максимальных значений к 20 неделям гестации. Концентрация ФРП к этому периоду развития плаценты в 2, 7, а ТФР- - в 4,2 раза превышает соответствующие показатели в 6-10 недель. Далее в течение гестации содержание указанных факторов роста в «зрелой» плаценте (39-40 нед.) уменьшается, оставаясь однако выше аналогичных величин в раннем хорионе (6-10 недель). Что касается СЭФР, являющегося мощным индуктором ангиогенеза, то отмечалось прогрессивное увеличение его концентрации на протяжении всей беременности. К концу гестации уровень СЭФР был в 2,3 раза выше, чем в начальные сроки. Менее выраженная динамика наблюдалась для другой группы факторов роста, а именно, ФРФ, ИПФР, ТФР- и ЭФР.

Таблица 1

Содержание факторов роста (нг/г ткани) в плаценте женщин в разные сроки физиологической беременности (Мm)

достоверность отличий между показателями: * - в 6-10 и 19-20 нед., ** - в 19-20 и 39-40 нед., - в 6-10 и 39-40 нед. (здесь и в других табл. жирным шрифтом выделены достоверные отличия (p<0,05)).

Содержание этих факторов роста было достаточно высоким в 39-40 недель беременности и превышало исходные величины (6-10 нед.) на 88%, 56%, 42% и 35% соответственно.

Выявленная динамика продукции ростовых факторов развивающейся плаценты, образующих сложную систему регуляторов клеточного роста и дифференцировки, позволяет заключить, что этот орган обеспечивает достаточно высокий уровень изученных компонентов на протяжении всей беременности. Максимальный темп увеличения содержания ФРП и ТФР- приходится на второй триместр, а наибольшая интенсивность накопления СЭФР, ЭФР, ИПФР, ФРФ и ТФР- имела место к концу беременности. Это согласуется с данными литературы, указывающими на участие широкого спектра ростовых факторов в репродуктивных процессах на протяжении всей беременности (K.Kawagoe et.al., 1990; T. Regnault et.al.2003).

Различные степень и в ряде случаев направленность изменений плацентарной продукции факторов роста, сопряженные с их основными эффекторными воздействиями при физиологической гестации объясняются необходимостью внутри- и межклеточного контроля процессов метаболического обеспечения меняющихся функций развивающейся плаценты в соответствии с возрастающими потребностями плода. Если рассматривать действие факторов роста на молекулярном уровне, то прежде всего, это индукция биосинтеза ДНК, которой предшествует экспрессия целого ряда генов. Причем реализация указанных эффектов, как известно, обеспечивается не самим фактором роста, а опосредуется его рецептором.

Как показали наши исследования, наряду с изменением содержания факторов роста в процессе физиологической беременности изменяется и плацентарная продукция их рецепторов. Содержание рецепторов ЭФР (R-ЭФР) повышается в плаценте к концу гестации в 3 раза, для СЭФР-R1 увеличение менее выражено и составляет 42%.

Выявленная динамика продукции факторов роста и их рецепторов в течение физиологического развития плаценты, очевидно, направлена прежде всего на оптимальную регуляцию ангио- и васкулогенеза, формирование и развитие фетоплацентарного кровообращения, от которых во многом зависит трофическое и кислородное снабжение плода.

Формирование плаценты в условиях осложненной беременности сопровождается значительными сдвигами в уровне факторов роста (рис. 1). Содержание ФРП, ИПФР, ЭФР и ТФР- уменьшалось в раннем хорионе (6-10 нед.) как при плацентарной недостаточности, так и у женщин с гестозом. Значительные изменения происходили и в содержании других факторов роста, в частности - ТФР- и СЭФР. Концентрация указанных биологически активных полипептидов была напротив резко повышена в хорионе женщин с самопроизвольно прервавшейся беременностью: в 6 и 2,7 раза - при ПН, и в 4,6 и 2,6 раза - при гестозе относительно этих показателей при физиологической беременности.

Рис. 1 Изменение содержания факторов роста (в % к контролю) в хорионе женщин (6-10 недель) при осложненной беременности

В связи с таким значительным изменением уровня ТФР- при осложненной гестации, следует подчеркнуть, что наряду с участием этого фактора роста в регуляции, имплантации и дифференцировки цитотрофобласта, одним из его метаболических эффектов, влияющих на процессы гемодинамики, является изменение обмена l-аргинина в результате модификации активности NO-синтазы и аргиназы (J.D.Shearer, et.al., 1997). Влияние ТФР- на активность NO-синтазы приводит к нарушению генерации NO, а активация им аргиназы сопровождается модификацией продукции пролина - важного компонента сосудистой стенки.

Анализируя собственные данные и накопленные сведения о процессах плацентации с начальных этапов гестации, можно полагать, что такое раннее прерывание беременности может быть связано с реологическими нарушениями, недостаточностью инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии плацентарного ложа, вследствие чего развивается внутриутробная гипоксия, стимулирующая, как известно, продукцию СЭФР и его рецепторов ( F.Lyall, et. al., 1997). Последнее, по-видимому, и является одной из причин установленного нами повышения уровня плацентарного СЭФР при самоабортах. Содержание таких важных индикаторов роста и развития плода, каковыми являются ИПФР и оФРФ, было, напротив, снижено при обоих осложнениях беременности. Поскольку ФРП, ЭФР, ФРФ и ИПФР оказывают прямое влияние на пролиферативную активность трофобласта, кроме того первым трем факторам роста принадлежит одна из основных ролей в становлении плацентарно-эмбрионального кровообращения, уменьшение уровня указанных ростовых факторов может способствовать нарушению процессов плацентации (включая изменение пролиферации, миграции, инвазии трофобласта). Последнее, по-видимому, и приводит в данном случае к прерыванию беременности.

Полученные данные свидетельствуют о том, что основы будущей патологии закладываются уже в ранние сроки беременности, что подтвердилось исследованиями, проведенными в сыворотке крови женщин указанных выше групп. По данным А.В. Орлова (2003, 2006) и результатам собственных исследований (И.И. Крукиер и соавт., 2005), изменение содержания большинства факторов роста в крови пациенток с различными осложнениями беременности наблюдается уже в первом ее триместре. Причем направленность изменений в сыворотке крови и плаценте для ряда факторов роста имеет одинаковый характер: повышение уровня СЭФР при ПН и гестозе, ТФРв - при ПН, снижение уровня ФРП и ИПФР при обеих патологих и снижение содержания ФРФ при ПН, что, очевидно, свидетельствует об общности механизмов повреждения на системном и локальном уровнях. Одинаковый характер изменения содержания СЭФР и ТФРв в раннем хорионе и сыворотке крови при плацентарной недостаточности и прямая корреляционная связь между этими показателями (r=0,69 и 0,73 соответственно) позволили нам совместно с клиницистами разработать «Способ прогнозирования фетоплацентарной недостаточности» (Патент на изобретение N 2238567, 2004) по соотношению концентраций этих факторов роста, определяемых в сыворотке крови с 5-6 недель беременности.

Аналогичная по направленности, но в некоторых случаях более выраженная динамика наблюдалась и в группах женщин с беременностью, самопроизвольно прервавшейся в 19-20 недель. Такое существенное нарушение баланса (сохраняющееся и в середине гестации) факторов роста, регулирующих молекулярно-биохимические механизмы развития плаценты и в целом функционирование фетоплацентарного комплекса несомненно влияет на течение беременности и вносит определенный вклад в развитие процессов, приводящих к ее прерыванию уже в 1 или во II триместрах.

В обследованных группах женщин, доносивших беременность (с ФПН, гестозом и СЗРП), динамика уровня ростовых факторов выглядела следующим образом (рис.2). Содержание ФРП и СЭФР в плаценте, полученной после родов в срок, снижено при всех перечисленных осложнениях в среднем на 40-48%%. При осложнившейся, но доношенной беременности, существенно был снижен и уровень ИПФР. В группах пациенток с ФПН это снижение составило 61%, с СЗРП - 51% и с гестозом - 38%.

Рис. 2 Изменение содержания факторов роста ( в % к контролю) в плаценте женщин (39-40 недель) при осложненной беременности

Аналогичная направленность изменений установлена также для плацентарной продукции ЭФР и ФРФ. Уровень таких ростовых факторов, как ТФР- и ТФР-, напротив, значительно возрастал в 39-40-недельной плаценте женщин, беременность которых развивалась на фоне различных осложнений. По результатам изучения факторов роста в плаценте, сопоставления их с аналогичными данными в сыворотке крови этих беременных и состоянием новорожденных был разработан «Способ прогнозирования задержки внутриутробного развития плода» (Патент N 2246733, 2005), в основу которого легло определение коэффициента отношения между содержанием ИПФР и СЭФР.

Одним из основных активаторов ангиогенеза в органах репродуктивной системы является СЭФР, который наряду с индукцией ангиогенеза повышает и сосудистую проницаемость ( Т. Mayhew et al., 2003), являясь таким образом, фактором роста эндотелия сосудов, а также фактором проницаемости сосудов. Поскольку усиление продукции СЭФР (в раннем хорионе ) и при прерывании беременности в 19-20 недель), стимулируется гипоксией (и, по-видимому, гипоксемией в результате снижения уровня О₂ в межворсинчатом пространстве), можно полагать, что именно последняя является одной из причин установленной нами динамики содержания СЭФР.

Очевидно, такое повышение уровня СЭФР, учитывая его аутокринное воздействие на сосуды плаценты, изменяет плацентарную гемодинамику и является одной из причин прерывания беременности в указанные сроки. Только к концу осложненной беременности содержание СЭФР снижено относительно нормальных показателей, причем у женщин с гестозом уровень этого фактора роста ниже, чем при ПН на 40%. Данная направленность изменений, по-видимому, имеет компенсаторный характер и способствует улучшению фето-плацентарного кровотока, что позволяет создать условия для донашивания беременности, протекающей с угрозой прерывания.

Наряду с изменением содержания факторов роста в плаценте при осложненном течении гестации имеет место и нарушение экспрессии их рецепторов.

При беременности, прервавшейся в 6-10 недель (ПН и гестоз), количество растворимых форм ЭФР-R и СЭФР-R1 в хорионе ниже, чем в аналогичные сроки физиологической гестации. Среди причин нарушения продукции ЭФР- R и СЭФР- R1 при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью, можно отметить модификацию гормонального (эстроген-гестагенного) фона при данной патологии, под контролем которого находится индукция как рецепторов, так и самих факторов роста (A. Ahmed et.al., 2000). Уменьшение содержания ЭФР-R, наблюдающее и в более поздние сроки, очевидно, усугубляет отрицательные последствия сниженной продукции ЭФР на процессы пролиферации, ангио- и васкулогенеза в плаценте, способствующие развитию и прогрессированию ее функциональной недостаточности. Что касается рецептора СЭФР, то при преждевременных родах в 36-37 недель беременности на фоне плацентарной недостаточности его уровень в плаценте был повышен, в отличие от показателей при прерывании беременности в 6-10 недель. Повышение уровня СЭФР-R1 в плаценте пациенток с ПН, с одной стороны, можно рассматривать как компенсаторную реакцию, позволившую отсрочить прерывание беременности. С другой стороны - увеличение индукции его растворимой изоформы способно ингибировать связывание основного трансмембранного рецептора.

Сопоставление количественных изменений СЭФР-R1 и ЭФР-R позволяет отметить, что наиболее значительные отклонения от физиологических величин в плаценте наблюдаются при прерывании гестации в ранние сроки. Этот период отличается незрелостью плацентарных структур и еще несформированными механизмами обеспечения компенсаторных реакций. Кроме того, именно на ранних стадиях беременности, согласно современным представлениям, имеет место сниженное кровоснабжение маточно-плацентарного ложа и низкий уровень кислорода в околоплодной среде (F. Lyall et.al., 2001).

Сравнение характера изменений в содержании ростовых факторов и отдельных их рецепторов в хорионе и плаценте женщин с осложненной беременностью, позволяют сделать вывод, что выявленные нарушения, свидетельствующие о формировании плацентарной недостаточности, раннего и позднего гестоза, имеют место уже на начальных этапах развития органа, но в значительной степени они сохраняются и к середине второго триместра.

Прогрессирование беременности невозможно без четкого функционирования сложной сосудистой системы, которая обеспечивает адекватный обмен веществ между организмами матери и плода. Изменение баланса эндогенных регуляторов ангиогенеза и соединений, влияющих на тонус сосудов плаценты, очевидно, вносит существенный вклад в нарушение кровотока между матерью и плодом.

Вазоактивные соединения плаценты в разные сроки физиологической и осложненной беременности

При физиологической беременности содержание важнейших вазоконстрикторов - эндотелина-1 (таблица 2) в зрелой плаценте (39-40 нед.) выше в 3 раза, чем в начальные сроки беременности (6-10 нед.).

Таблица 2

Содержание эндотелина и тромбоксана (нг/г ткани) в плаценте женщин в разные сроки физиологической беременности (Мm)

- достоверность отличий между показателями в 6-10 и 39-40 нед.

Данные о динамике продукции эндотелина в плацентарной ткани при нормальной гестации имеют большое значение для понимания механизмов биохимического обеспечения формирования эндотелия сосудистого русла плаценты в процессе ее развития. В настоящее время не вызывает сомнений, что эндотелий это не простой физический барьер, отделяющий кровоток от структур сосуда. Он непрерывно вырабатывает большое количество биологически активных веществ, среди которых эндотелин-1 наряду с NO занимает ведущее место. Помимо мощного вазоактивного эффекта, эндотелин вызывает широкий спектр пролиферативных ответов в клеточных структурах. Кроме того, регуляторные функции эндотелина распространяются также на такой процесс как апоптоз, который ингибируется данным пептидом (T.R. Wu Wong et.al., 1997). Поддержание баланса между апоптотическими и пролиферативными процессами чрезвычайно важно при формировании гемохориального типа плаценты, к которому принадлежит плацента человека. Обнаруженное снижение апоптоза в плаценте к концу физиологической беременности (О.В. Борисенко, 2003), в определенной степени может объясняться значительным повышением содержания эндотелина.

Содержание ещё одного вазоконстриктора тромбоксана В в нормально развивающейся плаценте подобно эндотелину во втором триместре беременности не отличается от его содержания в первом и лишь в третьем триместре возрастает в 1,8 раза. Хотя тромбоксан в плацентарной ткани представлен в среднем в таком же количестве, как эндотелин, но его вазоконстрикторный эффект, очевидно, подобно действию в сосудах других тканей, значительно ниже (Р.Н.Степанова, 2001). Метаболические эффекты тромбоксана в плаценте менее изучены, однако исходя из его ауто- и паракринных регуляторных воздействий (S. Moncada, 1983), можно полагать, что повышение уровня этого эйкозаноида в конце физиологической гестации, сопряженное с изменением содержания цАМФ и внутриклеточного Са²⁺, направлено на увеличение тонуса сосудов и усиление агрегации тромбоцитов, процессов необходимых к моменту родов.

При осложненной беременности в хорионе, полученном после её самопроизвольного прерывания (6-10 недель), уровень эндотелина превышал физиологический показатель на 92% в группе с верифицированной ПН и в 2,5 раза - в группе с ранним гестозом (рис. 3). Содержание тромбоксана в этом сроке осложненной беременности (гестоз и ПН) было повышено менее выражено на 20-25%.

Значительное повышение содержания эндотелина (в 3,3 раза) наблюдалось в плаценте женщин с ПН в 19-20 недель прервавшейся беременности. При гестозе концентрация эндотелина в указанные сроки, как и в раннем хорионе, также была в 2,2 раза выше нормальных показателей. Что касается тромбоксана, то его плацентарная концентрация в эти сроки гестации была увеличена на 63% в группе женщин с ПН, и имела лишь тенденцию к повышению у женщин с гестозом. В плацентах женщин, взятых после преждевременных родов (36-37 недель), содержание эндотелина и тромбоксана было повышено на 77% и 34%, соответственно по сравнению с данными при доношенной беременности. Повышение уровня указанных вазоконстрикторов, одновременно с увеличением продукции СЭФР у этих пациенток, по-видимому, вызывает спазм сосудов в плаценте и пуповине, а следовательно снижение транспорта кислорода и питательных веществ, поступающих к плоду, что также способствует досрочному прерыванию беременности.

У женщин с ПН, гестозом и СЗРП, доносивших беременность, продукция эндотелина и тромбоксана в плаценте, напротив была снижена (рис.3) по сравнению с нормой. Выявленная динамика, очевидно, имеет компенсаторный характер и приводит к улучшению фето-плацентарного кровотока в результате уменьшения констрикторной составляющей в нарушенном балансе вазотоников. Этот сдвиг, по-видимому, позволяет создать условия для донашивания беременности, которая протекала с угрозой прерывания.

В процессах, связанных с нарушением плацентарной гемодинамики и плодно-материнского кровообращения наряду с вазоконстрикторами важную роль играют и вазодилятаторы. Среди последних особое место принадлежит NO, обладающему выраженными сосудорасширяющими свойствами. Роль оксида азота в поддержании сосудистого гомеостаза не ограничивается дилатацией локального участка, а оказывает также антипролиферативное влияние на гладкомышечные клетки сосудистой стенки, блокируя агрегацию тромбоцитов, экспрессию молекул адгезии, продукцию эндотелина (О.А. Гомазков , 1999; Ф.Т. Агеев и соав., 2006).

Рис. 3 Изменение уровня эндотелина и тромбоксана (в % к контролю) в плаценте женщин (39-40 нед.) с осложненной беременностью

По мере развития физиологической гестации (таблица 3) продукция NO, как и активность NO-синтазы, существенно возрастала во втором триместре по сравнению с аналогичными величинами первого триместра (в 1,7 и 1,6 раза, соответственно). Именно в этот период плацента формируется как орган, достигающий своей функциональной зрелости, а в организме плода происходят существенные преобразования процессов биохимической и морфологической дифференцировки, требующие формирования адекватного плацентарно-плодового кровотока.

Таблица 3

Содержание простациклина (нг/г), NO_x (нмоль/г) и активности NO-синтазы (нмоль/г) в плаценте женщин в разные сроки физиологической беременности (Мm)

достоверность отличий между показателями: * - в 6-10 и 19-20 нед., ** - в 19-20 и 39-40 нед., - в 6-10 и 39-40 нед.

Следствием повышения генерации NO в плаценте в процессе её нормального развития является не только снижение тонуса сосудов в фетоплацентарной системе, но и адекватное изменение различных метаболических процессов, поскольку физиологически активная молекула NO, имеющая свободнорадикальную природу, обладает чрезвычайно широкисм спектром действия. Свободно проникая через клеточные мембраны, NO служит как переносчиком межклеточного сигнала, так и внутриклеточным мессенджером (Х.М. Марков,1996; Е.Б. Манухина и соавт., 2000). Для плаценты, не обладающей иннервационным аппаратом, именно гуморальные медиаторы являются главными механизмами, регулирующими её внутриклеточные процессы.

В процессе формирования плаценты к 19-20 неделям гестации увеличивается также уровень ещё одного вазодилататора - простациклина (PGI₂), хотя степень увеличения менее выражена и составляет 20% относительно соответствующей величины в первом триместре.

Усиление продукции NO и PGI₂ в плаценте, очевидно, способствует улучшению гемодинамических параметров и обеспечению возрастающей трофики плода. В более поздние сроки содержание NOх стабилизируется и практически не изменяется до момента родов, в то время как активность NO-синтазы остается повышенной и к концу беременности.

Возможно, что такие отличия между динамикой NOх и активностью NO-синтазы связаны с модификацией активности нитритредуктазы и более интенсивным вовлечением этого фермента в замыкание цикла NO (В.П. Реутов, 2002) в исследуемых условиях. Кроме того, различия в степени накопления NOх и повышения активности NO-синтазы, могут быть обусловлены тем фактом, что часть избытка NO способна связываться в комплексы, которые образуют в клетках физиологически активные депо оксида азота в форме S-нитрозотиолов и динитрозольных комплексов железа (А.Ф.Ванин, 1998; Е.Б.Манухина и соавт., 2002; 2004).

Содержание PGI₂ в доношенной плаценте при физиологической беременности снижается относительно аналогичной величины в предыдущий период гестации. Очевидно, перед родами он берет на себя основную роль в уменьшении вклада вазодилататоров в соотношение вазоактивных веществ с противоположным воздействием на тонус сосудов.