В плаценте, развивающейся в условиях ее функциональной недостаточности, продукция NO отличается от физиологических величин на протяжении всего процесса гестации.

Так, уже в хорионе (6-10 нед.), полученном у женщин при самоабортах на фоне верифицированной плацентарной недостаточности и с ранним гестозом, содержание NOх уменьшено в 3 и 2,5 раза соответственно, а активность NO-синтазы в обеих группах - на 54% по сравнению с таковыми при нормальной беременности. Аналогичная динамика характерна для содержания простациклина, которое уменьшалось в группах женщин как с ПН, так и с гестозом. Подобная направленность изменений в плаценте обнаружена и при прерывании осложненной беременности в 19-20 недель, однако их степень менее выражена. При недонашивании беременности в третьем триместре (36-37 нед.) также наблюдалось уменьшение содержания NOх и активности NO-синтазы (рис.4). Выявленная динамика показателей NOх свидетельствует о несомненном вкладе снижения вазодилятаторов в нарушение плацентарной гемодинамики, приводящее в конечном итоге к невынашиванию беременности. Причем наиболее значимое уменьшение метаболитов NO приводит к прерыванию гестации на ранних сроках.

Рис. 4 Изменение уровня вазодилататоров (в % к контролю) в плаценте женщин с осложненной беременностью (36-37 нед. и 39-40 нед.)

В случае донашивания осложненной беременности содержание PGI_2, и NOх в плаценте женщин с плацентарной недостаточностью и при СЗРП, было повышено по сравнению с физиологическими величинами. Очевидно, такое изменение генерации оксида азота носит компенсаторный характер и способствует, как указывалось выше, поддержанию плодово-плацентарной гемодинамики за счет уменьшения спазма сосудов и усиления кровотока в условиях внутриутробной гипоксии, имеющей место у данных женщин. В отличие от вышеуказанных состояний, при беременности, доношенной на фоне гестоза, уровень NOх и активность NO-синтазы, напротив, были снижены относительно показателей при физиологической беременности. Однако менее выраженная степень снижения продукции оксида азота и повышенное содержание PGI₂ в 39-40-недельной плаценте при гестозе по сравнению с таковой в 36-37 недель беременности, очевидно, позволяют в определенной мере поддерживать тонус сосудов в фетоплацентарной системе, необходимый для вынашивания беременности.

Особую информативность для суждения о состоянии баланса вазотоников в плаценте дают коэффициенты соотношения NOх/эндотелин. В процессе развития нормальной гестации в первой ее половине этот коэффициент возрастает в 1,6 раза, снижаясь в последующем к родам более чем в 3 раза. Такая динамика при физиологической беременности, по-видимому, определяется необходимостью усиления сосудосуживающей составляющей в спектре вазотоников в период родов. При беременности, прервавшейся на фоне плацентарной недостаточности и гестоза коэффициент NOх/эндотелин в первом и втором триместрах в несколько раз ниже, чем в аналогичные сроки при физиологической беременности. В случае донашивания осложненной беременности этот показатель в различной степени (в зависимости от вида акушерской патологии) увеличивался. Что касается коэффициента простациклин/тромбоксан, то его динамика при патологической гестации имеет ту же направленность, однако менее выражена. Последнее, по-видимому, связано с ведущей ролью NO и эндотелина в регуляции маточно- и фетоплацентарного кровотоков по сравнению с другими вазоактивными соединениями.

Полученные данные свидетельствуют о том, что осложненная беременность развивается на фоне нарушенной плацентарной продукции вазоактивных веществ, регулирующих гемодинамические показатели фетоплацентарного кровотока. Следствием этих нарушений может явиться усиление внутриутробной гипоксии, приводящей к различным пренатальным повреждениям плода и последующим отклонением в развитии новорожденного.

Активность прооксидантных процессов и структурные изменения белков в плаценте в разные сроки физиологической и осложненной беременности

Морфо-функциональные и биохимические изменения в плаценте, приводящие к нарушению маточно- и фетоплацентарной гемодинамики, во многом могут быть связаны с гиперпродукцией активных форм кислорода в плаценте и развитием «окислительного стресса», что создает условия для повреждения эндотелия сосудов и хориальной ткани в целом.

Свободнорадикальные повреждения в организме матери и плода являются одним из основных механизмов в общей цепи нарушений, формирующихся в гипоксических условиях. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что во всех реакциях с участием молекулярного кислорода наблюдается образование элементоорганических форм неполного окисления кислорода. К числу ферментов, приводящих к таким последствиям, относится НАДФН-оксидаза (КФ 1.11.1.2), которая наряду с регуляцией соотношения НАДФ/ НАДФН приводит к образованию супероксидного аниона O₂ и ксантиноксидаза (КФ 1.2.3.2) - фермент, приводящий к образованию супероксиданиона и перекиси водорода.

Определение активности НАДФН-оксидазы и ксантиноксидазы в плаценте позволило установить что, плацентарная недостаточность и ранний гестоз развивались на фоне увеличенной активности этих ферментов. Причем повышенной активность НАДФН-оксидазы и ксантиноксидазы оставалась и при донашивании патологической беременности, хотя и в меньшей степени чем во втором триместре. Несмотря на то, что выявленные нарушения, приводящие к накоплению активных форм кислорода неспецифические и включаются, как правило, в патогенез осложнения беременности вторично, тем не менее они могут играть важную роль в его прогнозе и исходе, а также влиять на развитие внутриутробного плода. Последнее подтверждается рождением детей с церебральными повреждениями при высоких уровнях плацентарной НАДФН-оксидазы. Нами выявлена прямая зависимость между тяжестью постгипоксической ишемической энцефалопатии новорожденных и степенью повышения активности фермента в плаценте. Эти данные легли в основу созданного нами изобретения «Способ прогнозирования энцефалопатии новорожденного» (Патент N 2254573, 2005).

Важным субстратом свободнорадикальной модификации в условиях повышенного накопления активных форм кислорода являются белки, окисленные формы которых рассматриваются как один из ранних маркеров окислительного поражения клеток. В то же время вопросы деструкции белков плаценты (в отличие от проблемы свободнорадикального окисления липидов) остаются во многом не изученными. Нами было проведено изучение спонтанного и металл-катализируемого окисления белков. Результаты исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что окисление белков плаценты, оцененное по уровню карбонильных производных, как и активность прооксидантных ферментов, возрастает по мере пролонгирования гестации. При плацентарной недостаточности и гестозе имеет место усиление окислительной деструкции белков, наблюдающееся уже в 1 триместре беременности и в разной степени сохраняющаюся во втором триместре.

Таблица 4

Спонтанное и металл-катализируемое окисление белков (мкмоль/г) в плаценте женщин в разные сроки физиологической беременности (Мm)

достоверность отличий между показателями: * - в 6-10 и 19-20 нед., - в 6-10 и 39-40 нед.

В плаценте, полученной после срочных родах (39-40 недель), которыми закончилась осложненная беременность, независимо от вида акушерской патологии, окислительная деструкция белков остается повышенной, хотя степень повышения менее выражена, чем в ранние сроки гестации. Причем выраженность деструктивных процессов усиливается пропорционально активности прооксидантных ферментов в плаценте, что подтверждает роль свободнорадикальных реакций в посттрансляционной модификации белков плаценты при осложненной беременности.

Проведенный корреляционный анализ выявил прямую связь между степенью окислительной деструкции белков плаценты и сыворотки крови при гестозе (r=0,78). Это расширило информационную ценность данного биохимического маркера и позволило использовать изучение окислительной деструкции сывороточных белков в первые недели беременности для прогнозирования гестоза даже в тех случаях, когда клинические его проявления развивались позднее. Полученные данные легли в основу созданного нами совместно с клиницистами изобретения «Способ прогнозирования гестоза» (Патент N 2249212, 2005).

К числу важных механизмов, приводящих к структурным изменениям белков, относится также их посттрансляционное фосфорилирование и дефосфорилирование. Осуществляющие эти процессы протеинкиназы (ПК) весьма разнообразны по своей субстратной специфичности и ассортименту их рецепторов. Субстратами протеинкиназ, активируемых циклическими нуклеотидами, могут являться белки хроматина, рецепторы гормонов, ферменты различных субклеточных фракций, мембранные белки и др., что определяет широкий спектр клеточных функций, регулируемых путем переноса фосфатного остатка молекулы макроэрга на определенные аминокислотные остатки в молекуле белка (Перцева М.Н., 1989).

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что интенсивность фосфорилирования белков отличается в различных субклеточных фракциях плаценты и зависит от циклического нуклеотида, регулирующего протеинкиназную активность. При физиологической беременности характерен более высокий уровень цАМФ-ПК, чем цГМФ-ПК по отношению к белкам-субстратам ядерной и митохондриальной фракций плаценты. цГМФ-зависимое фосфорилирование белков, напротив, наиболее интенсивно происходит в цитоплазме. При беременности, осложненной ПН, но закончившейся родами в срок (39-40 нед.), наблюдается изменение степени фосфорилирования как эндогенных белков плаценты, так и экзогенного белка. Активность цАМФ-зависимой протеинкиназы в различной степени уменьшается по отношению ко всем изученным субстратам. Фосфорилирование белков, катализируемое цГМФ-зависимой протеинкиназой плаценты у этих женщин также снижено в ядерной фракции и цитоплазме, но повышено при использовании в качестве субстрата белков митохондрий. У женщин, беременность которых закончилась преждевременными родами (36-37 нед.), нарушение процессов фосфорилирования плацентарных белков носит еще более выраженный характер, хотя направленность изменений в основном аналогична таковой при донашивании осложненной беременности, за исключением уменьшения активности цГМФ-зависимого фосфорилирования белков митохондрий. При любом исходе осложненной беременности имеет место снижение фосфорилирования экзогенного белка-протамина.

Анализ представленных результатов исследований свидетельствует о том, что активность протеинкиназ плаценты при физиологической беременности достаточно высока, причем для большинства эндогенных и экзогенных белков наиболее высокие величины обнаружены при цАМФ-зависимом фосфорилировании. Развитие плацентарной недостаточности сопровождается посттрансляционной модификацией различных групп белков плаценты. Весьма серьезные метаболические и функциональные последствия может иметь снижение фосфорилирования ядерных белков, поскольку негистоновые белки хроматина являются специфическими регуляторами биологической активности ДНК (репликации и транскрипции) и следовательно пролиферативных процессов, высокая активность которых характерна для плацентарной ткани.

Интерлейкины и фактор некроза опухоли в плаценте в разные сроки физиологической и осложненной беременности

Особого внимания заслуживают количественные изменения в спектре такого важного класса цитокинов, как интерлейкины в связи с иммуномодулирующими функциями и, значительной ролью в процессах метаболического обеспечения межклеточных взаимодействий.

Ряд эффектов интерлейкинов сопряжен с индукцией (или ингибированием в зависимости от типа цитокина) генерации оксида азота и эндотелина. Так, ИЛ-1 обладает стимулирующим эффектом на активность NO-синтазы, а ИЛ-10, напротив, ингибирует её (F. Q. Cunha., et.al., 1992).

Через регуляцию синтеза ИЛ-1 и ИЛ-6 опосредуется антипролиферативное действие NO, усиливается экспрессия эндотелина и его рецепторов (S.Sladek, et.al., 1997; H. Singh et.al., 2001). Наряду с влиянием на активность NO-синтазы, ИЛ-1 и провоспалительный цитокин - ФНО- усиливают и активность аргиназы, влияя тем самым на обе основные ферментные системы метаболизма аргинина (О.Н. Бондаренко и соавт., 2004; Шестопалов А.В. и соавт., 2004). Приведенные метаболические «мишени» воздействия интерлейкинов свидетельствуют об их возможном опосредованном влиянии на функции эндотелия сосудов путем модификации продукции основных его компонентов. Исходя из вышеизложенного, очевидно, что поддержание определенного баланса цитокинов на каждом этапе развития плаценты является одним из условий метаболической и функциональной полноценности плаценты, а также формирования толерантности к «чужеродному» плоду.

Полученные результаты, представленные в таблице 5, свидетельствуют о том, что в процессе физиологической гестации наиболее высокий уровень изученных нами цитокинов наблюдался в 19-20 недель беременности.

Таблица 5

Содержание цитокинов (нг/г ткани) в плаценте женщин в разные сроки неосложненной беременности (Мm)

достоверность отличий между показателями: * - в 6-10 и 19-20 нед., ** - в 19-20 и 39-40 нед., - в 6-10 и 39-40 нед.

Продукция цитокинов в хорионе женщин с осложненной беременностью имела свои особенности. При самопроизвольно прервавшейся беременности в первом и втором триместрах, а также при преждевременных родах в 36-37 недель уровень провоспалительных интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12) и ФНО- в плаценте в различной степени был повышен на фоне сниженной продукции противовоспалительного ИЛ-10. Наиболее выраженное увеличение имело место для классического провоспалительного цитокина ИЛ-6: его уровень превышал физиологические величины в 1,5-4 раза в зависимости от вида акушерской патологии и срока прерывания гестации. В первом триместре значительное увеличение имело место и для ФНО-. Негативное влияние ФНО- на процессы плацентации, кроме провоспалительных эффектов, обусловлено, очевидно, и его вазоконстрикторным действием на сосуды плацентарной сети, приводящим к снижению в ней кровотока (C. Holcberg et.al., 2001). Характер изменений при доношенной, но осложненной беременности практически не отличался от динамики цитокиновой продукции в ранее описанных группах. Однако по степени этих изменений обнаруживалось перераспределение «очередности» отдельных цитокинов (рис. 5). Среди интерлейкинов максимальное снижение наблюдалось для ИЛ-12.

Рис. 5 Изменение содержания цитокинов (в % к контролю) в плаценте женщин при осложненной беременности (39-40 недель)

Для выявления возможных взаимосвязей в продукции различных цитокинов нами был проведен корреляционный анализ между изученными показателями. При осложненной беременности установлена обратная связь между уровнем ИЛ-10 и ФНО (r= -0,72-078) и прямая между содержанием ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО (r=0,81-0,85). Изменение содержания цитокинов в разные сроки физиологической гестации, может играть важную роль в становлении плаценты как полноценного органа. В то время, как нарушение их нормальной продукции (с учетом основных метаболических и функциональных эффектов) способствует повреждению пролиферации трофобласта, клеточной дифференцировки, а также усилению апоптоза и развитию эндотелиальной дисфункции плаценты.

Сопоставление изученных плацентарных компонентов с состоянием новорожденных, позволило установить зависимость между интенсивностью цитокиновой продукции и формированием синдрома задержки развития внутриутробного плода. Среди родившихся детей у женщин с СЗРП гипотрофия имела место в 18% именно тех случаев, при которых наблюдались максимальные изменения цитокинов (особенно ФНО- и ИЛ-12). Приведенные данные свидетельствуют о важности сохранения баланса в цитокиновой сети плаценты для нормального развития фетоплацентарной системы.

Показатели клеточной регуляции в околоплодной среде и элементах плодного яйца, участвующих в параплацентарном обмене между организмами матери и плода

Для более полного представления о взаимосвязи организмов матери и плода, помимо изучения плаценты - центрального звена этой биологической системы, необходимо оценить роль других элементов плодного яйца, участвующих в параплацентарном обмене (т.е. минуя плаценту). В этом процессе задействованы плодные оболочки и околоплодные воды. Кроме того, более или менее самостоятельным элементом системы мать-плацента-плод является пуповина, поскольку наряду со своей основной ролью проводника крови от плаценты к плоду и обратно она обладает и другими, весьма важными функциями (А.П. Милованов., 1999).

Проведенные нами исследования свидетельствуют об активной продукции факторов роста плодными оболочками, причем в наибольшем количестве в них представлен СЭФР, уровень которого при физиологической беременности превышает концентрации других факторов роста в 2 -3 раза. При беременности, осложненной плацентарной недостаточностью и закончившейся родами в срок, содержание СЭФР и ТФР- в плодных оболочках повышено, а ЭФР и ИПФР снижено по сравнению с аналогичными физиологическими величинами (рис. 6).

При преждевременных родах степень нарушения баланса факторов роста в плодных оболочках еще более выражена, причем в отличие от отрицательной динамики при доношенной беременности, содержание ЭФР в случае ее невынашивания повышено. Максимальное увеличение имеет место для СЭФР. Очевидно, как и в плаценте, это связано с развитием внутриутробной гипоксии, являющейся индуктором экспрессии данного фактора роста. Различная степень модификации продукции факторов роста и даже противоположная ее направленность при доношенной и недоношенной беременности, по-видимому, вносит несомненный вклад в характер регуляторных процессов и компенсаторных механизмов, определяющих исход гестации. Полученные данные позволяют говорить о том, что являясь важной «дискретной системой для транспорта» (Радзинский В.Е., Милованов А.П., 2004), плодные оболочки могут выполнять и биохимические функции в материнско-плодовых взаимоотношениях. Выявленная нами продукция факторов роста, имеющиеся в литературе сведения о синтезе белков, аминокислот (Погорелова Т.Н., 1984), простагландинов (Cheung P., et.al., 1990, Challis J., Gibb W., 1996), интерлейкинов (Ohno Y. еt.al., 1994) и других биоактивных веществ в плодных оболочках свидетельствуют об их регуляторных возможностях в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом. Динамика факторов роста в околоплодных водах при осложненной беременности (рис. 7) аналогична таковой в плодных оболочках, что позволяет рассматривать последние в качестве важного источника этих биоактивных пептидов.

Результаты исследования содержания фaкторов роста в пуповине свидетельствуют о том, что их продукция в ней при физиологической беременности достоверно ниже, чем в плаценте, особенно это выражено для ИПФР и СЭФР.

Однако даже выявленный уровень факторов роста в пуповине, очевидно, позволяет говорить об их возможном паракринном воздействии на фетоплацентарные взаимосвязи.

Рис. 6 Изменение содержания факторов роста ( в % от контроля) в плодных оболочках женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

Рис. 7 Изменение содержания факторов роста ( в % к контроля) в околоплодных водах женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

При преждевременных родах содержание трех изученных нами ангиогенных факторов роста - ТФРв, ЭФР и СЭФР - увеличено в пуповине на 40-60%. Уровень ИПФР обнаруживает противоположную направленность - снижается на 67%. В пуповине женщин с ПН, доносивших беременность, содержание ЭФР и СЭФР, напротив, ниже, чем при физиологической беременности, в то же время уровень ТФР-в остается повышенным, хотя и в меньшей степени, чем при невынашивании беременности (на 26%).

Содержание ИПФР в пуповине, как и в других гестационных тканях, снижено независимо от исхода осложненной беременности. Аналогичная динамика факторов роста у этой группы женщин имеет место и в плаценте, что, очевидно, связано с одинаковыми механизмами нарушения их продукции в разных элементах последа.

Уровень вазоактивных соединений в пуповине при осложненной беременности значительно отличается от соответствующих величин при нормальной гестации. При преждевременных родах содержание эндотелина в пуповине повышено, а содержание NОx и активности NO-синтазы снижено относительно таковых в контрольной группе женщин. В случае донашивания беременности динамика вазотоников имеет противоположный характер: концентрация NОx повышается (на фоне увеличения активности NO -синтазы), а эндотелина уменьшается. Изменение содержания NO и эндотелина в пуповине, аналогично по направленности таковому в плаценте, что подтверждает общность механизмов повреждения тонуса сосудов в этих тканях. Достаточно высокий уровень эндотелина и NОх в пуповине свидетельствует о собственной продукции их сосудами пуповины и возможном участии в регуляции фетоплацентарного кровообращения. Установленные повышение уровня эндотелина и снижение NO_x при преждевременных родах способствуют спазму сосудов пуповины и снижению транспорта кислорода и питательных веществ к плоду.

В плодных оболочках содержание изученных вазоактивных соединений, особенно эндотелина, значительно ниже, чем в пуповине (рис.8).

Продукция эндотелина в плодных оболочках, очевидно, возможна только в их децидуальной части, в которой обнаруживаются капилляры-синусоиды и венулы, являющиеся самыми дистальными отделами кровеносной системы матки. Содержание эндотелина в плодных оболочках женщин с плацентарной недостаточностью при преждевременных родах увеличено, а при родах в срок снижено по сравнению с уровнем этого вазоконстриктора при неосложненной беременности.

В противоположность динамике эндотелина, количество NОx в плодных оболочках при гестации, прервавшейся досрочно, ниже, чем при доношенной беременности. Характер сдвига в балансе вазоактивных веществ в этих тканях находит свое отражение в динамике коэффициента NОx/эндотелин, который в первом случае снижен на 42%, а во втором - повышен на 68%.

Рис. 8 Изменение содержания эндотелина, NO_x и активности NO-синтазы ( в % от контроля) в плодных оболочках женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

Динамика вазоактивных компонентов в околоплодных водах при плацентарной недостаточности (рис. 9) аналогична таковой в ранее описанных элементах плодного яйца.

Рис. 9 Изменение содержания эндотелина, NO_x и активности NO-синтазы (в % от контроля) в околоплодных водах женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

Повышение продукции NОx и коэффициента NОx/эндотелин при донашивании осложненной беременности в пуповине, плодных оболочках, околоплодных водах и тем более в плаценте, очевидно, носит компенсаторный характер и способствует улучшению гемодинамических показателей в условиях внутриутробной гипоксии, имеющей место при плацентарной недостаточности.

В числе многих биоактивных молекул, обнаруженных в околоплодных водах в последние годы, важное значение имеют интерлейкины. Содержание их в околоплодной среде отражает состояние интерлейкинового баланса в гестационных тканях, а также в органах и тканях эмбриона и плода, поэтому определение этих цитокинов имеет высокую информативную ценность для суждения о течении беременности и внутриутробном развитии плода.

Наиболее высокий уровень при физиологической беременности обнаружен для ИЛ-12 (235,4 пг/мл 25,6), затем в убывающем порядке следуют концентрации ИЛ-6 (187,2 пг/мл 19,3), ИЛ-10 (52,6 пг/мл 6,1) и ИЛ-1в(10,3 пг/мл 1,4). Такая «последовательность» отличается от плаценты, в которой содержание ИЛ-1 в, напротив, превышает содержание ИЛ-6 в 6 раз, что, также подтверждает роль плодовых источников в формировании состава околоплодных вод.

Рис. 10 Изменение содержания интерлейкинов ( в % от контроля) в околоплодных водах женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

При осложненной доношенной беременности наибольшая степень увеличения в этой биологической среде имеет место для ИЛ-6, уровень которого в околоплодных водах выше такового при физиологической гестации более чем в 2 раза (рис. 10). При недонашивании беременности содержание ИЛ-6 в околоплодных водах повышено более чем в 3 раза. Уровень еще одного провоспалительного цитокина - ИЛ-12 при плацентарной недостаточности также превышает этот показатель при нормальной гестации, соответственно в 1,5 раза (роды в срок) и в 1,8 раза (преждевременные роды). Что касается противовоспалительного ИЛ-10, то его содержание в околоплодных водах при осложненной беременности снижено по сравнению с контрольной величиной. Уменьшение продукции этого цитокина, нашедшее отражение в сниженной экспрессии его в амниотическую жидкость, очевидно, угнетает протекторное действие, направленное на сохранение плода. Имеются указания, что ИЛ-10 способствует генерации регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью (Тh-2 клеток), которые определяют состояние иммунологической толерантности плода, а их снижение приводит к срыву последней и прерыванию беременности (Goldenberg R., et.al., 2001).

В плодных оболочках женщин с физиологической беременностью, подобно околоплодным водам, в наибольшем количестве представлены ИЛ-12 и ИЛ-6, в наименьшем ИЛ-1 в Такое распределение содержания интерлейкинов, по-видимому, можно объяснить тем фактом, что ИЛ -1 в продуцируется, по данным Fortunato S. еt al. (1996), только амнионом, а ИЛ-6 и амнионом и гладким хорионом (основными тканями плодных оболочек). У женщин с плацентарной недостаточностью изменение баланса интерлейкинов в плодных оболочках было аналогично их динамике в околоплодных водах: уровень ИЛ-10 снижался, а ИЛ-6, ИЛ-1в, ИЛ-12 повышался в различной степени в зависимости от донашивания беременности или прерывания её до срока. Между содержанием интерлейкинов в плодных оболочках и амниотической жидкости выявлена прямая зависимость.

Рис. 11 Изменение содержания интерлейкинов ( в % от контроля) в плодных оболочках женщин при плацентарной недостаточности (преждевременных родах и родах в срок)

Это ещё раз подтверждает, что плодные оболочки можно рассматривать как источник цитокинов околоплодных вод, а интерлейкиновый баланс (или дисбаланс) последних отражает состояние амниона и гладкого хориона.

Приведенные данные позволяют заключить, что продукция интерлейкинов в плодных оболочках изменяется при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью, особенно при ее преждевременном прерывании. В связи с этим представляет особый интерес изучение механизмов участия этих цитокинов в развязывании родовой деятельности.

Известно, что ряд интерлейкинов, в частности ИЛ-6, ИЛ-12 и ИЛ-1 в, повышают продукцию простагландинов в плодных оболочках (М. Sun, et.al., 1993; Varner M., 2004). В то же время роль простагландинов, активно синтезируемых плодными оболочками, в инициации родовой деятельности, в настоящее время не вызывает сомнения (Е.Т. Михайленко, М.Я. Чернега, 1988).

Для более глубокого понимания механизмов регуляторного действия интерлейкинов на процессы, участвующие в продукции простагландинов в плодных оболочках, нами были изучены взаимосвязи между содержанием ИЛ-1 в, ИЛ-6, арахидоновой кислоты и активностью фосфолипазы А₂ при спонтанных родах, а также при слабости родовых сил. В последнем случае указанные биохимические параметры были исследованы в плодных оболочках женщин, родоразрешенных в экстренном порядке путем кесарева сечения (в 39-40 недель).

Полученные при выполнении данной серии исследований результаты свидетельствуют о значительном снижении содержания интерлейкинов плодных оболочек при отсутствии родовой деятельности. Аналогичная направленность изменений установлена для арахидоновой кислоты и активности фосфолипазы А₂, что, очевидно, является важной причиной уменьшения продукции простагландинов в этих условиях. Сопоставление активности фосфолипазы А₂ и содержания арахидоновой кислоты с уровнем интерлейкинов выявило прямую корреляционную связь между ними (r=0,74 - 0,78). Поскольку арахидоновая кислота - исходный субстрат в синтезе эйкозаноидов, можно полагать, что подобные связи имеют место также между уровнем ИЛ-1 в и ИЛ-6 и продукцией простагландинов.

Для дальнейшего уточнения представлений об участии плодных оболочек в механизмах развития родовой деятельности необходимо, на наш взгляд, исследовать процессы влияющие на продукцию самих интерлейкинов. Учитывая полученные нами результаты об относительно высоком содержании метаболитов NO в плодных оболочках, а также многочисленные эффекты этой молекулы на биохимические и физиологические процессы в клетках, мы изучили интенсивность продукции NO плодными оболочками при слабости родовых сил и сопоставили ее с уровнем интерлейкинов. Как показали эти исследования, генерация оксида азота плодными оболочками у женщин со слабостью родовой деятельности была увеличена. Так, активность NO-синтазы и количество метаболитов оксида азота в плодных оболочках этих беременных выше, чем при спонтанной родовой деятельности соответственно на 54% и 63%,. Коэффициенты корреляции между уровнем ИЛ-1, ИЛ-6 и NOх составили -0,81 и -0,85 соответственно. Выявленная закономерность позволяет высказать предположение о возможности участия NO плодных оболочек в регуляции уровня компонентов цитокиновой системы.

С целью проверки этого положения нами проведены исследования in vitro на экстрактах плодных оболочек с введением N-нитро-l-аргинина (L-NNA), являющегося классическим ингибитором NO- cинтазы и нитропруссида натрия - донора NO. При добавлении к экстрактам плодных оболочек женщин со спонтанными родами L-NNA одновременно со значительным снижением продукции NO отмечалось увеличение уровня ИЛ-1 и ИЛ-6 на 71-73%. Повышение количества NOх после добавления его донора сопровождалось соответственным снижением генерации обоих интерлейкинов более чем в 2 раза. Аналогичные направленность и степень изменений обнаружены и в группе женщин со слабостью родовых сил, что свидетельствует об общности биохимических взаимосвязей, независимо от базисного фона метаболитов. Эти данные подтверждают роль оксида азота в качестве, по крайней мере, одной из сигнальных молекул, ответственных за регуляцию выработки интерлейкинов и опосредованно влияющих на продукцию простагландинов. В то же время не исключено и прямое влияние оксида азота на активность ферментов, участвующих в синтезе простагландинов. В нашей работе мы не имели возможности изучить активность циклооксигеназы, с геминовой группой которой может связываться оксид азота, лимитируя тем самым ее действие. Однако установленный нами факт снижения активности фосфолипазы А₂ и уровня арахидоновой кислоты в плодных оболочках при слабости родовых сил на фоне повышения содержания NOх может свидетельствовать об ингибировании последним синтеза простагландинов.

В связи с вышеизложенным можно полагать, что плодные оболочки (очевидно, вместе с околоплодными водами) именно тот «инструмент», с помощью которого плод осуществляет паракринную поддержку пролонгирования беременности (сдерживая продукцию простагландинов) и прекращает эту поддержку перед инициацией родов.

Резюмируя данные, приведенные в этом разделе работы, можно заключить, что плодные оболочки относятся к числу гестационных тканей с достаточно активными метаболическими процессами, что позволяет им наряду с транспортными функциями выполнять и другие не менее важные регуляторные функции в биологической системе мать-плацента-плод, направленные на создание условий для развития плода и благополучного «перехода» его после исчерпания безопасных условий внутриутробного существования к внеутробной жизни. Изменение состава плодных оболочек и околоплодных вод в процессе физиологической и осложненной гестации, являясь отражением биохимичоской ситуации в системе мать-плацента- плод, в свою очередь влияет на развитие плода, определяя характер параплацентарного обмена.

Представленные итоги исследований свидетельствуют о том, что развитие осложненной беременности происходит на фоне повреждения метаболических процессов, участвующих в механизмах клеточной регуляции в плаценте. Модификация плацентарной продукции различных биоактивных компонентов может иметь либо неспецифической характер и наблюдаться при любых отклонениях в процессе гестации, либо служить специфическим механизмом для формирования конкретного осложнения. Степень нарушения метаболических процессов в плаценте является важным показателем перинатального риска.

ВЫВОДЫ

1. В процессе физиологического развития плаценты имеет место неоднородная по направленности и степени выраженности динамика продукции факторов роста. Для ИПФР, ЭФР и СЭФР характерно постепенное увеличение их содержания по мере развития плаценты. Содержание ФРП и ТФР- достигает максимальных значений в середине гестации к 19-20 неделям, а ТФР- и оФРФ, напротив, снижается к этому сроку, в последующем увеличиваясь до величин, превышающих исходные показатели ( в 6-10 недель). Характерной чертой спектра факторов роста в плаценте на всех этапах ее развития является высокий уровень ИПФР, оФРФ, СЭФР, обладающих выраженной митогенной, пролиферативной и ангиогенной активностью.

2. Динамика вазоактивных веществ в плаценте в течение нормальной гестации характеризуется увеличением содержания вазоконстрикторов (эндотелина-1 и тромбоксана В₂) в последнем её триместре и повышением уровня вазодилататоров (оксида азота и простациклина) в середине беременности с последующей тенденцией к снижению. Соотношение вазодилататоров и вазоконстрикторов в плаценте в конце беременности снижается в несколько раз, обеспечивая усиление сосудосуживающих эффектов перед родами.

3. Развитие плаценты при неосложненной беременности сопровождается повышением продукции интерлейкинов и ФНО-, достигающим наибольших значений к 19-20 неделям; в последующем степень продукции этих цитокинов снижается, однако в большинстве случаев остается выше начальных величин (в 6-10 недель). Формирование плацентарной недостаточности сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12) и снижением противовоспалительного ИЛ-10.

4. Осложненное течение беременности формируется на фоне изменения содержания факторов роста в плаценте, наблюдающегося уже в 1 триместре и сохраняющегося в последующие сроки гестации. Уровень ФРП, ИПФР, ЭФР снижен, а ТФР- - повышен в хорионе и плаценте при всех изученных вариантах развития беременности на всем ее протяжении, что свидетельствует о неспецифическом характере этих изменений. Для СЭФР характерны разнонаправленные изменения при разной патологии: снижение содержания при СЗРП и повышение - при гестозе. Направленность динамики СЭФР, оФРФ и ТФР-, а также рецепторов факторов роста при плацентарной недостаточности зависит от срока гестации.

5. При осложненной беременности, прервавшейся в разные сроки, имеет место сдвиг баланса вазоактивных компонентов плаценты, заключающийся в снижении содержания простациклина и оксида азота (на фоне уменьшения активности NO-синтазы), а также повышении содержания эндотелина-1 и тромбоксана В₂. В случае донашивания беременности (при всех видах её осложнений) имеет место обратная ситуация: увеличение уровня вазодилататоров, снижение вазоконстрикторов и как следствие повышение их соотношения, способствующее улучшению фетоплацентарного кровотока.

6. Изменения метаболизма плаценты при осложненной гестации на фоне внутриутробной гипоксии возрастают в результате усиления прооксидантных процессов. Активность НАДФН-оксидазы и ксантиноксидазы при плацентарной недостаточности была повышена как в раннем хорионе, так и в «зрелой» плаценте. Наиболее выраженное увеличение активности радикалообразующих ферментов происходит в первой половине гестации. Установлена прямая взаимосвязь между активностью ферментов, участвующих в генерации активных форм кислорода и окислительной деструкцией белков плаценты.

7. При плацентарной недостаточности изменяется интенсивность фосфорилирования белков различных субклеточных фракций плаценты. Активность цАМФ-зависимой протеинкиназы снижена в различной степени по отношению ко всем изученным эндогенным белкам -субстратам плаценты и экзогенному белку. Наиболее значительное уменьшение активности этого фермента в случае донашивания осложненной беременности обнаружено для белков митохондрий, затем в убывающем порядке следуют негистоновые белки хроматина и белки цитоплазмы. Фосфорилирование белков, катализируемое цГМФ-зависимой протеинкиназой плаценты, при функциональной недостаточности органа также снижено в ядерной фракции и цитоплазме, но повышено при использовании в качестве субстрата белков митохондрий. При недонашивании беременности имеет место более выраженное уменьшение фосфорилирования плацентарных белков всех исследованных субклеточных фракций.

8. Нарушение физиологического баланса факторов роста при плацентарной недостаточности, имеет место не только в плаценте, но и в околоплодной среде. При осложненной беременности, закончившейся родами в срок, в амниотической жидкости и плодных оболочках уровень ЭФР и ИПФР снижен, а СЭФР и ТФР- повышен по сравнению с нормальными показателями. При преждевременных родах степень изменения содержания факторов роста в этих биологических объектах более выражена. В пуповине дисбаланс в содержании факторов роста сходен с нарушениями в плаценте и отличается от такового в околоплодной среде снижением уровня СЭФР.

9. Динамика вазоактивных соединений в околоплодных водах и элементах плодного яйца при преждевременных родах (на фоне плацентарной недостаточности) отличается сдвигом соотношения вазоконстрикторов и вазодилататоров в сторону снижения содержания последних. При родах в срок дисбаланс вазотоников менее выражен. Аналогичные изменения вазоактивных веществ в плаценте и пуповине при осложненной беременности свидетельствуют об общности механизмов повреждения тонуса сосудов в этих тканях.

10. В плодных оболочках при плацентарной недостаточности повышена продукция провоспалительных интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12) и снижена продукция противовоспалительного - ИЛ-10. Между уровнем цитокинов в амниотической жидкости и оболочках плода обнаружена прямая корреляционная связь, позволяющая рассматривать последние как важный источник цитокинов околоплодных вод. Интерлейкины плодных оболочек влияют на процессы синтеза простагландинов, изменяя уровень арахидоновой кислоты и активность фосфолипазы А₂, и тем самым регулируют развитие родовой деятельности. При слабости родовых сил на фоне значительного снижения в плодных оболочках содержания ИЛ-1 и ИЛ-6 имеет место уменьшение уровня арахидоновой кислоты и активности фосфолипазы А₂. Продукция интерлейкинов в плодных оболочках в свою очередь регулируется генерацией оксида азота.

11. Содержание факторов роста и вазоактивных компонентов в плаценте, околоплодных водах и сыворотке крови отражает метаболическую полноценность плаценты и может быть использовано для прогнозирования состояния новорожденного.

список ОСНОВНЫХ работ, опубликованных по теме диссертации

Список статей, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1. Погорелова Т.Н. Особенности внутриклеточной регуляции метаболизма плаценты при плацентарной недостаточности /Погорелова Т.Н., Друккер Н.А.,Крукиер И.И., Длужевская Т.С // Вестник Российской ассоциации акушеров- гинекологов.1998. N 3. С. 18-21 (45% участия, 0,25 п.л.).

2. Крукиер И.И. Дисбаланс системы: простациклины, эндотелины, тромбоксаны в плаценте при осложненной беременности / Крукиер И.И., Орлов А.В., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А. // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2003. № 1.С. 66-71(75% участия, 0,25 п.л.).

3. Орлов А.В. Клинико-диагностическое значение факторов роста, интерлейкинов и вазоактивных компонентов в оценке характера осложнений беременности в 1 триместре /Орлов А.В., Орлов В.И., Сагамонова К.Ю., Друккер Н.А., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. // Российский Вестник акушеров-гинекологов. 2003. №2. С.4-6 (45% участия, 0,20 п.л.)

4. Крукиер И.И. Факторы роста в развивающейся плаценте Факторы роста в развивающейся плаценте /Крукиер И.И.// Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2003. № 4.С. 57-60 (100% участия, 0,25 п.л.)

5. Крукиер И.И., Влияние генерации оксида азота на продукцию интерлейкинов и процессы синтеза простагландинов в плодных оболочках при спонтанной родовой деятельности и слабости родовых сил /Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Орлов А.В.// Биомедицинская химия. 2004.Т. 50, вып.3. С. 304-308 (50% участия, 0,3 п.л.)

6. Крукиер И.И. Продукция интерлейкинов в гестационных тканях и ее влияние на процессы синтеза простагландинов при срочных и преждевременных родах /Крукиер И.И., Орлов А.В.// Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2004. № 2. С. 67-69 (90% участия, 0,20 п.л.)

7. Крукиер И.И. Продукция NO и окислительная деструкция белков в плаценте при физиологической беременности и плацентарной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.2003.N 10. C. 418-420 (100% участия, 0,20 п.л.)

8. Крукиер И.И. Процессы радикалообразования в плаценте при плацентарной недостаточности // Российский Вестник акушеров-гинекологов. 2004. №4. С. 6-8(100% участия, 0,20 п.л.).

9. Крукиер И.И. Динамика цитокинов в разные сроки развития плаценты при физиологической и осложненной беременности // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2005. N1. С. 18-21 (100% участия, 0,25 п.л.).

10. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. Протеинкиназные системы плаценты при физиологической и осложненной беременности //Акушерство и гинекология. 2005. N1. С. 6-9 (50% участия, 0,25 п.л.).

11. Орлов А.В., Друккер Н.А., Крукиер И.И. Роль факторов роста в патогенезе неразвивающейся беременности //Российский Вестник акушеров-гинекологов. 2005. № 3.С. 7-9 (55% участия, 0,20 п.л.).

12. Крукиер И.И., Орлов А.В., Каушанская Л.В., Погорелова Т.Н., Маркарьян И.В.. Ангиогенные факторы роста в околоплодных водах и сыворотке крови женщин при осложненной беременности // Известия высших учебных заведений. Северо- Кавказский регион. Естественные науки. Спец. выпуск. 2005. С. 14-16 (80% участия, 0,20 п.л.).

13. Крукиер И.И. Влияние плацентарной недостаточности на спектр фосфолипидов и уровень окисленных липопротеинов синцитиотрофобласта // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. «Актуальные проблемы акушерства и педиатрии» (Спецвыпуск). 2005. С. 30-31 (100% участия, 0,12 п.л.)

14. Погорелова Т.Н., Крукиер И.И., Друккер Н.А. Процессы внутри- и межклеточной регуляции в плаценте при физиологической и осложненной беременности // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. «Актуальные проблемы акушерства и педиатрии».(Спецвыпуск). 2005. С. 57-60 (35% участия, 0,25 п.л.)

15. Крукиер И.И. Плацентарная продукция факторов роста и ее значение в прогнозировании церебральных повреждений новорожденных //Клиническая лабораторная диагностика. 2006.N1. C. 19-20, 36 (100% участия, 0,2 п.л.)

16. Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А.Динамика продукции оксида азота в плаценте и пуповине при беременности высокого риска // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2006. № 1. С. 66-71 (75% участия, 0,40 п.л.)

17. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. Продукция сосудисто-эндотелиального фактора роста и эндотелина в плаценте и пуповине при нормальной и осложненной беременности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. N 2. C. 177-179 (55% участия, 0,2 п.л.)

18. Авруцкая В.В., Орлов В.И., Пономарева А.Ю., Крукиер И.И., Вишина А.В. Изменения в эндотелиальной системе сосудов беременных при гестозе //Российский Вестник акуш. гинек. 2007. N1. С.4-6 (30% участия, 0,20 п.л.)

19. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Орлов В.И. Продукция и рецепция факторов роста в плаценте при физиологической беременности и осложненной гестозом // Биомедицинская химия. 2007, Том 53. вып. 1. N 3.С. 8-11 (50% участия, 0,25 п.л.)

20. Крукиер И.И. Рецепторы СЭФР и ЭФР в плаценте, плодных оболочках и пуповине при физиологической и осложненной гестации. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2007. N1. С. 18-21 (100% участия, 0,25 п.л.)

Монографии

21. Погорелова Т.Н., Орлов В.И., Друккер Н.А., Крукиер И.И Молекулярные аспекты плацентарной недостаточности. Изд-во РГУ, 1997. 176 с.(45% участия, 11п.л.).

22. Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Длужевская Т.С., Мелконова К.Ю., Крукиер И.И. Околоплодные воды. Химический состав и биологические функции. Изд-во МП «Книга», 1998. 216 с.(45% участия, 13,5 п.л.)

Патенты на изобретения

23. Орлов А.В., Орлов В.И., Крукиер И.И, Сагамонова К.Ю., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А.. Способ выбора тактики родоразрешения // Патент № 2193198 от 20 ноября 2002. (35% участия, 0,20 п.л.) (65% участия).

24. Орлов А.В., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В., Донченко Л.А.. Способ прогнозирования фето-плацентарной недостаточности // Патент на изобретение № 2238567 от 20 октября 2004г. (70% участия).

25. Орлов А.В., Крукиер И.И., Друккер Н.А., Погорелова Т.Н.,.Авруцкая В.В. Способ прогнозирования гестоза // Патент на изобретение № 2249212 от 27 марта 2005г. (70% участия).

26. Орлов А.В., Крукиер И.И., Друккер Н.А., Маркарьян И.В., Мелконов Э.Ю. Способ прогнозирования задержки развития внутриутробного плода // Патент № 2246733 от 20 февраля 2005г. (75% участия).

27. Крукиер И.И. Способ прогнозирования энцефалопатии новорожденного // Патент N 2254573 от 2005г. (100% участия).

28. Авруцкая В.В., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А. Способ оценки степени тяжести гестоза (приоритетная справка 2006.101754, 2006).

29. Авруцкая В.В., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Ермолова Н.Н., Пономарева А.Ю. Способ прогнозирования неразвивающейся беременности (приоритетная справка N 2006. 117893 от 26.05.2006).

Список статей, опубликованных в других журналах, а также сборниках трудов конференций, симпозиумов и конгрессов

30. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Крукиер И.И, Длужевская Т.С. Особенности внутриклеточн ой регуляции метаболизма плаценты в условиях гипоксии //Второй съезд Биохимического Общества Росс. академии наук Москва. Пущино. 1997 ч. 1. С. 224-225 (55% участия, 0,13 п.л.).

31. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Крукиер И.И, Орлов В.И.Плацентарные маркеры перинатального повреждения мозга плода //Мат. II съезда РАСПМ «Перинатальная неврология» Москва. 1997. С.

32. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Крукиер И.И, Орлов В.И. Механизмы клеточной регуляции плаценты и плодных оболочек при плацентарной недостаточности //Сб. научных трудов II съезда акушеров-гинекологов Сев. Кавказа. 1998. С. 19-20 (65% участия, 0,13 п.л.).

33. Pogorelova T.N, Drukker N.A.,Krukier I.I., Orlov V.I. Physical and chemical modification of placental plasmatic membranes under hypoxia // J. Hypoxia medical, 1998. N 2. V.6., P.56 (50% участия, 0,07 п.л.).

34. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Крукиер И.И, Длужевская Т.С.Влияние плацентарной недостаточности на показатели свободнорадикального окисления в плаценте и плодных оболочках // Цитология. 1999. N 9, Т. 41. С. 789 (75% участия, 0,07 п.л.).

35. Gashenko O.V., Drukker N.A.,Krukier I.I. The role of free radical-processes in deve opment of fetus encefalopathy in high risk pregnant women //J. Advances in Gerontology. 2001 V. 6. P. 50 (67% участия, 0,07 п.л.).

36. Погорелова Т.Н., Крукиер И.И, Друккер Н.А. Активность ферментов радикалообразования околоплодных вод в диагностике гипоксии плода //Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты, Смоленск. 2001. С.252 (67% участия, 0,07 п.л.).

37. Погорелова Т.Н., Друккер Н.А., Крукиер И.И. Орлов А.В., Трофименко И.И.. Прогностическое значение оксида азота околоплодных вод в выборе тактики родоразрешения //Актуальные вопросы акушерства и гинекологии: сб. научн. материалов. 2001-2002. Т.1, № 1. С. 73 (35% участия, 0,07 п.л.).

38. Орлов А.В., Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Крукиер И.И.,.Друккер Н.А, Сагамонова К.Ю., Некрасова М.Г. Диагностическое значение оксида азота околоплодных вод в выборе тактики родоразрешения // Охрана здоровья матери и ребенка:материалы 4 -го Российского научного форума 21-24.05. 2002. Москва. С. 454-455. (30% участия, 0,13 п.л.).