Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПАВЛОВА ГАЛИНА ВАЛЕРИЕВНА

Новосибирск

2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, в лаборатории нейрогенетики и генетики развития

Научные консультанты: член- корреспондент РАН,

доктор медицинских наук, профессор

Корочкин Леонид Иванович

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор

Георгиев Георгий Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Викторов Илья Викторович

доктор медицинских наук, профессор

Попова Нина Константиновна

доктор биологических наук, профессор

Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится «___»_________2009 года на утреннем заседании Диссертационного совета Д-003.011.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, Россия, пр.ак.Лаврентьева,10, тел/факс: (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » ____ 2009 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

Доктор биологических наук Груздев А.Д.

Актуальность темы

Известно, что нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера и др., а также ишемический инсульт и ему подобные травматические нарушения мозговых тканей - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте. Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект. Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении. Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации.

Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина. В глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга. Это может привести к его полному отмиранию уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю. Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000).

Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии. В разрабатываемых конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов. В состав этих конструкций не должны входить вирусные элементы.

Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии. Этому и посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является: поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемости трансплантата. Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.

2. Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы.

3. Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации.

4. Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца.

5. Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 в клетках млекопитающих в качестве управляющего элемента трансгенов.

6. Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.

7. Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы. Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца.

Положения, выносимые на защиту

1. Нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку клеток млекопитающих нейрального происхождения при их совместном культивировании.

2. Смешанная ксенотрансплантация эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы стимулирует дифференцировку клеток крысы в нейральном направлении трансплантируемых клеток на границе трансплантат - мозг реципиента.

3. Ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат - ткани мозга реципиента.

4. Обнаружена позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях.

5. Обнаружено, что трансдуцированный промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 активизируется в клетках млекопитающих при температуре 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки.

6. Обнаружено, что трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижают образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс.

7. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у эмбриональных спинальных ганглиев и у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf .

Научная новизна и практическая ценность работы

Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны. Данная работа поможет перевести клиническое применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу. В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов. Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и трансплантаций полученного материала в мозг.

1. Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы. Экспрессия чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих. При этом данные клетки -носители не склонны к делению. В результате был разработан метод трансплантации смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового шока.

2. Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом

3. Предложен новый невирусный промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Возможность использования невирусных регулируемых структур позволяет включать активность чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения.

4. Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена. Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно. Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического белка.

Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение. Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, а также открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии.

Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток.

Апробация работы

стволовой клетка трансгенный эмбрион

Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004г, . ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя 284 источника. Работа иллюстрирована 102 рисунками и 6 таблицами.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену человека.

Ранее было показано, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы переживают и дифференцируются после трансплантации в мозг развивающихся амфибий (Корочкин,1991). В связи с этим возникла идея использования ксенотрансплантатов для продукции нейротрофических факторов, способствующих переживанию и развитию трансплантированной нервной ткани. Для исследования были использованы три нейротрофических гена gdnf, bdnf и ngf , физиологическое действие которых на нервную ткань основательно исследовано.

Поскольку длительное инъецирование фактора в область повреждения чрезвычайно травматично для ткани мозга, работа была направлена на создание генно-инженерными методами клеток, способных экспрессировать нейротрофический фактор. Трансплантаты, содержащие такие клетки, пригодны для длительного экзогенного выделения фактора в области повреждения мозга.

Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 может автоматически активироваться в условиях температуры тела млекопитающих, обеспечивая тем самым постоянно высокий уровень синтеза продукта, кодируемого геном, «поставленным» в генно-инженерной конструкции под этим промотором.

Надлежало выяснить, будут ли активироваться и функционировать нейротрофические гены млекопитающих в клетках и тканях дрозофилы. Для этого были получены три генно-инженерные конструкции на основе вектора CaSper (рис.1,2,3), содержащие соответственно один из исследуемых нейротрофических генов млекопитающих (gdnf, bdnf, ngf). В каждой конструкции нейротрофические гены были поставлены под промотор гена белка теплового шока дрозофилы, благодаря которому активируется транскрипция этих генов при температуре 370С (температура теплового шока насекомых). Данные конструкции были инъецированы в эмбрионы дрозофилы линии Df(1)w67c23(2), которая содержала ген white, обуславливающий фенотип «белые глаза» у взрослых мух. Конструкции же содержали ген mini-white, который позволяет идентифицировать трансформантов в поколении F1.

А

Б

В

Рис 1 . А -Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген gdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. GDNF - ген фактора роста нервов; hsp70 prom. - промотор гена белка теплового шока Hsp70;. mini white - ген, ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух.

Б - Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген ngf мыши под промотором гена белка теплового шока Hsp70. NGF - ген фактора роста нервов.

В - Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген bdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. BDNF - ген фактора роста нервов.

Из трансформантов поколения F1 были выведены гомозиготные линии. В результате мы получили три линии: C3- содержащая в гомозиготе ген человека gdnf, G8- содержащая ген ngf мыши и G7- содержащая ген bdnf человека. Каждая из этих линий была скрещена с ранее полученной линией, несущей ген бактериальной галактозидазы lacZ и мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной нейроэктодермы в нейральном направлении. Полученные линии C3-1M, G8-1M и G7-1M содержали lacZ и Delta, а также гены млекопитающих gdnf, ngf, bdnf соответственно. Полученные линии были проанализированы молекулярными методами. Методом блот-гибридизации по Саузерну были подтверждены вставки в геном дрозофилы. Контроль экспессии встроенных генов был осуществлен методом блот-гибридизации по Нозерну. В опыте была выявлена индуцированная экспрессия мРНК. Мы не наблюдали экспрессии мРНК нейротрофических факторов млекопитающих без воздействия стрессовой температуры (370 С). Известно, однако, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 “подтекает” и при более низких температурах и в ряде гибридизаций мы иногда наблюдали слабый сигнал. Аналогичный анализ на экспрессию мРНК был проделан и для конечных линий G7-1M,G8-1M и C3-1M. Перечисленные выше линии были исследованы на предмет активации гена при воздействии хит-шоковой температуры и без данного воздействия. Результаты блот-гибридизации по Нозерну для линий G7-1M,G8-1M и C3-1M показаны на рисунках 4, 5 и 6.



Рис 4. Молекулярный анализ трансгенных линий мух С3-1М, содержащих в геноме ген GDNF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 (C3)

Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену gdnf

1- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока;

2- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока;

3- РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль);

Рис 5. Молекулярный анализ трансгенных линий мух G8-1М, содержащих в геноме ген NGF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70

Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену ngf

1- РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) без теплового шока (контроль);

2- РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль);

3- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока;

4- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока;



Рис 6. Молекулярный анализ трансгенных линий мух G7-1М, содержащих в геноме ген BDNF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70

Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену bdnf

1- РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль);

2- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока;

3- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока;

В данном эксперименте не было обнаружено гибридизации с РНК клеток контрольной линии (контролем служила исходная линия, а также трансгенная линия без тепловой обработки). В опыте мы наблюдали индуцированную эскпрессию мРНК при воздействии на эмбрионы шоковой температурой (370С).

Для эмбрионов линии G8-1M, содержащей ген ngf, был проведен анализ синтез белка с помощью иммуноблотинга. На эмбрионы воздействовали температурой теплового шока. В результате иммуноблотинга был обнаружен соответствующий белковый продукт (рис. 7).

Рис 7. Вестерн-блот анализ. Результаты прямого иммуноблотинга с антителами к белку NGF контроль - исходная линия, подвергнутая тепловому шоку

NGF - трансгенная линия мух, содержащая в геноме ngf под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70, подвергнутая нагреванию до 37оС

Таким образом, гены исследуемых нейротрофических факторов млекопитающих успешно экспрессируются в клетках дрозофилы.

Определение локализации экспрессии мРНК трансфицированных генов gdnf, bdnf и ngf в тканях объекта и ее активности под данным промотором было проведено методом гибридизации in situ на целых эмбрионах.

После воздействия теплового шока на эмбрионы трансгенной линии С3-1М была обнаружена транскрипция человеческого gdnf на всех стадиях эмбрионального развития данной линии, как у гетерозигот Dl/+, так и у гомозиготных Dl/Dl особей.

На стадии синцитиальной и клеточной бластодермы реакция была умеренно положительной, равномерно распределенной по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная экспрессия гена gdnf была отмечена по парасегментам, в результате чего формировался характерный тигровый рисунок окраски.

С развитием нейральных элементов областью преимущественной локализации мРНК гена gdnf явилась центральная нервная система эмбрионов. Соответствующие транскрипты были выявлены как в головном, так и в торакальных ганглиях (рис. 8).

У исходной линии реакции гибридизации in situ обнаружено не было.

а б

Рис 8. Экспрессия гена gdnf в эмбрионах трансгенных мух D.melanogaster. Whole-mount - гибридизация с использованием в качестве зонда ДНК гена gdnf человека.

а,б, Эмбрион линии трансгенных мух в разных положениях. Масштаб 0,1 мм

После воздействия теплового шока на эмбрионы линии G8-1M была обнаружена мРНК введенного гена ngf на всех стадиях эмбрионального развития, а также у личинок.

Как и в случае с геном gdnf, на стадии синцитиальной и клеточной бластодермы наблюдали умеренную реакцию, равномерно распределенную по всей поверхности эмбриона. По мере сегментации повышенная экспрессия генов наблюдалась в парасегментах, что давало характерный тигровый рисунок. С развитием нейральных элементов у эмбрионов линии G8-1M (ngf) была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия.

При анализе экспрессии bdnf в линии G7-1M (метод гибридизации in situ на целых эмбрионах) окраска наблюдалась практически во всех областях эмбриона (рисунок не представлен). У исходной линии реакции гибридизации in situ с ДНК ngf и bdnf не наблюдалась.

2. Влияние экспрессии нейротрофического фактора млекопитающих на трансгенные клетки

Создание линий-носителей нейротрофических факторов для ксенотрансплантации в мозг млекопитающих и кокультивации с эмбриональными клетками поставило следующие вопросы: 1. каким образом будет влиять нейротрофический фактор на сами трансгенные клетки, 2. будут ли клетки выживать в условиях пригодных для клеток млекопитающих при температуре теплового шока и продуцировать трансгенный белок.

Для изучения влияния гена ngf человека на фенотип трансгенных клеток была получена культура клеток эмбриона линии G8-1M. В культуре клеток дрозофилы, трансфицированной геном ngf была обнаружена атипичность. Было замечено большое количество игловидных клеток, не встречавшихся в контрольных культурах не содержащих трансген. Наблюдались также сильно распластанные клетки, по форме напоминающие листок полиэтилена, прилипший к поверхности культуральной чашки. В трансгенной культуре не обнаружены наблюдаемые в контрольной культуре сетеподобные образования, которые, по всей видимости, имеют отношение к выработке хитина. Данное отличие говорит о том, в культуре, экспрессирующей нейротрофический фактор млекопитающих, подавляется дифференцировка клеток в иных направлениях, кроме нейрального. Особенности данной культуры, по-видимому, объясняются тем, что даже без теплового воздействия на клетки наблюдается подтекание промотора гена белка теплового шока дрозофилы, вследствие чего наблюдается слабое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные клетки.

Значительно более ощутимое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные культуральные клетки наблюдали после повышения температуры до уровня теплового шока 370С. Наблюдалось большое количество клеток с длинными отростками (более 50%), похожими на отростки нервных клеток насекомых (рис.9).



Рис 9. Культура клеток дрозофилы, несущих ген ngf, после температурного воздействия 370С

Рис 10. Органоподобные структуры в культуре клеток дрозофилы, несущих ген ngf, после температурного воздействия 370С

Клетки в модифицированной культуре теряли способность делиться. После обработки температурой теплового шока контрольной культуры клеток дрозофилы появление такого типа клеток не наблюдалось (или около 5%). Также в исследуемой культуре трансгенных клеток были обнаружены характерные округлые клеточные скопления. Тела клеток располагались по краям, в то время как отростки занимали внутреннюю часть скопления. Такая структура напоминает строение нервного ганглия беспозвоночных, Таким образом, температурное воздействие, активирующее ген ngf, не только стимулирует дифференцировку клеток дрозофилы в нейральном направлении, но и провоцирует образование органотипических структур, сходных с эмбриональным головным мозгом дрозофилы (рис 10).

При длительном (6 дней) культивировании клеток трансгенной линии дрозофилы при температуре 37оС были обнаружены нервные клетки аномальной величины (5%), в контроле такого размера нервные клетки не наблюдались.

Было установлено, что экспрессия нейротрофического фактора влияет на природу трансгенной клетки и стимулирует ее дифференцировку в нейральном направлении.

3. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации.

Фактор роста нервов является фактором, выделяемым из клеток в межклеточную среду, поэтому клетки, экспрессирующие этот фактор могут оказывать нейротрофное воздействие на окружающие клетки в культуре и, после трансплантации, на клетки тканей реципиента.

В экспериментах, проведенных совместно с Кафедрой отоларингологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) была исследована способность клеток дрозофилы, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять клетки органотипической культуры нервной ткани млекопитающих in vitro. С этой целью фрагменты нейроэктодермы эмбрионов селектированных нами линий дрозофил, содержащих трансгены нейротрофических факторов, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями крыс (11-й день эмбриогенеза), которые были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток, выходящие из спинального ганглия, появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру нейроэктодермы эмбриона трансгенной линии дрозофилы, содержащей ген человека, наблюдается бурный рост отростков нервных клеток спинального ганглия по направлению к ко-культивируемой ткани дрозофилы (рис.11). Этот процесс начинается уже спустя час после начала ко-культивирования.



Рис.11 Врастание отростков дифференцирующихся нервных клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы в эмбриональную нейроэктодерму линии дрозофил, в геном которой был введен ген gdnf человека. Флюоресцентная микроскопия. Масштаб 0,05 мм

Еще более четкая картина была получена при ко-культивировании клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы с клетками линии дрозофилы, содержащей трансген, кодирующий белок BDNF человека. Эффект сказывался так же быстро, как и в предыдущем случае, но можно было отчетливее проследить путь нервных волокон от клеток эмбриональных спинальных ганглиев к нейроэктодерме или к фрагменту трансгенного эмбриона дрозофилы.

Несколько менее отчетлив эффект клеток дрозофилы линии, несущей ген, кодирующий фактор роста нервов (NGF). В этом случае дифференцировка эмбриональных нейральных элементов спинального ганглия крысы начинается под влиянием нейроэктодермы дрозофилы так же рано, однако рост отростков нервных клеток не столь интенсивен, как в случае BDNF

Поскольку положительный эффект наблюдался во всех случаях, можно было предположить, что он обусловлен неспецифическим эффектом ткани дрозофилы и не связан с явлением трансгеноза. Однако в контрольных экспериментах, когда ткань эмбриональных спинальных ганглиев (меченных красным белком) крысы ко-культивировали с нейроэктодермой «нативных» линий дрозофилы без трансгена, эффекта не наблюдалось. Различия в эффекте клеток, несущих BDNF и NGF, возможно, связаны с тем, что первый стимулирует дифференцировку в первую очередь проприоцептивных нейронов, а второй - ноцицептивных.

Нельзя не отметить и то обстоятельство, что опыты по ко-культивированию продемонстрировали выраженное родство нервных тканей даже у столь отдаленных таксонов как насекомые и млекопитающие. Нейробласты дрозофилы мигрировали в эмбриональный спинальный ганглий крысы.

На основании изложенных результатов можно сделать вывод, что экспрессия нейротрофического фактора млекопитающих не только влияет на дифференцировку трансгенных клеток дрозофилы, но и меняет свойства других клеток, находящихся в непосредственной близости от них.

Известно, что при культивации эмбрионального спинального ганглия крысы, отростки появляются на третьи сутки и имеют звездчатую структуру. При добавлении в среду нейротрофических факторов, отростки образуются значительно быстрее, но также не имеют направленности. В данной работе была опробована новая модель стимуляции образования отростков эмбрионального спинального ганглия в определенном направлении по градиенту концентрации. Данная модель может быть использована для разработки терапевтических методов, стимулирующих направленный рост нервных волокон.

В нашей лаборатории был проведен эксперимент, с целью изучить изменение в стимуляции при увеличении расстояния между спинальным ганглием и тканью дрозофилы, экспрессирующей нейротрофический фактор. Было обнаружено, что при увеличении расстояния между исследуемыми объектами уменьшается количество образующихся отростков, однако, стимуляция происходит даже на значительном расстоянии, что видно на рисунке 12.



Риc.12 Ко-культивация спинального ганглия новорожденной крысы и нервной ткани эмбриона дрозофилы, экспрессирующей bdnf. Масштаб 50 микрометров

4. Влияние нейроэктодермы трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки при ксенотрансплантации.

Возможность выделения трансгенных нейротрофических факторов из трансфицированных клеток в окружающую среду делает логичным эксперименты по выявлению влияния клеток трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки в условиях трансплантации в мозг млекопитающих.

Для этой цели мы использовали трансгенные линии дрозофилы, в геном которых введен ген человека, кодирующий глия-производный нейротрофический фактор (GDNF).

GDNF, член суперсемейства TGF-beta, известен своим трофическим влиянием на развивающиеся дофаминэргические нейроны. В то же время, GDNF оказывает трофическое влияние и на другие популяции нейронов мозга.

Целью экспериментов было исследование приживления и развития ксенотрансплантатов нейральных закладок дрозофилы линии С3-1М(gdnf) при их котрансплантации с тканью неокортекса крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс и влияния клеток дрозофилы, экспрессирующих глияпроизводный трофический фактор (GDNF), на приживление и рост контрансплантируемого аллотарнсплантанта.

Было исследовано влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии С3-1М(gdnf) на аллотрансплантат мозга крыс при совместной трансплантации. Для этого было выделено две группы крыс. В затылочную кору мозга первой (контрольной) группы крыс трансплантировали неокортекс 15-ти дневных крысиных эмбрионов (Э-15). Животным второй группы в затылочную кору мозга вводили котрансплантат неокортикальной ткани Э-15 с нейральной закладкой дрозофилы С3-1М(gdnf). В качестве маркерного гена в клетках линии С3-1М(gdnf) содержался ген lacZ. Животных первой и второй групп фиксировали через 33 дня после операции.

Во всех случаях в мозге крыс первой и второй группы были обнаружены трансплантированные ткани. Трансплантированные клетки дрозофилы во второй группе были легко идентифицируемы. Иммуногистохимическая реакция на lacZ, проведенная на срезах мозга, подтвердила наличие вставки. Методом гибридизации in situ на срезах было установлено, что белок GDNF синтезируется в эмбриональных, нервных клетках дрозофилы при их совместной трансплантации с неокортексом крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс. Нервные клетки дрозофилы при трансплантации в мозг не погибают, и образуют отростки.

У первой (контрольной) группы животных трансплантаты были небольших размеров и имели нормальную плотность васкуляризации. Ткань трансплантатов состояла из компартментов нервных клеток, которые объединялись глиальными образованиями. Во второй (опытной) группе крыс ткань котрансплантатов была пронизана множеством сосудов, плотность которых была много выше (более, чем в 2 раза), чем в контроле. Выраженной иммунной реакции не наблюдалось. Котрансплантаты состояли из крупных участков, содержащих нейроны эмбрионального крысиного мозга, связанных глиальными мостами, среди которых располагались группы клеток нейральных закладок дрозофилы. Большинство клеток дрозофилы (5-6 мкм в диаметре), красящихся на lacZ, были вполне жизнеспособны, хотя часть проявляла признаки дегенерации.

Клетки дрозофилы никогда не отделялись от остальных тканей глиальным барьером, а напротив, часто наблюдалось множественное образование отростков между нейронами эмбрионального крысиного мозга и клетками дрозофилы Иммуногистохимическое исследование срезов мозга крыс контрольной группы показало наличие четко выраженного глиального рубца на границе ксенотрансплантата. При исследовании второй - опытной - группы крыс было обнаружено отсутствие глиального рубца на границе ткани реципиента с трансплантатом (рис 13). Наличие клеток дрозофилы в ксенотрансплантате было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер lacZ, а экспрессия gdnf человека - гибридизацией in situ.

Рис 13. Влияние ксенотрансплантата трансгенной (gdnf) эмбриональной нервной ткани дрозофилы на развитие гомотрансплантата в мозге взрослой крысы.

Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих. Морфологическое изучение показало, что в случаях котрансплантации наблюдается усиление роста трансплантированных аллогенных неокортикальных тканей. Можно предполагать, что хорошее приживление и нормальный размер трансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть клеток, которые погибли бы в результате некроза или путем апоптоза. Котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающих трансплантат тканей. Вероято, GDNF может, способствовать усиленному росту сосудов.

Наше исследование показало также, что ткани нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, видны тесные сплетения нервных отростков клеток дрозофилы и клеток крысы, свидетельствующие об отсутствии межвидового антагонизма. По морфологическим критериям, значительная часть клеток нейральных закладок дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение двух недель, с последующим уменьшением их количества в котрансплантате.

Часть аллогенных клеток котрансплантата экспрессируют тирозингидроксилазу при всех исследованных сроках переживания экспериментальных животных - до 1 месяца. Известно, что в эмбриональной коре кошек (Sawada, 2000) и в коре эмбрионов и ранних постнатальных крыс (Chun, 1987) имеется популяция временно существующих дофаминэргических (DA) нейронов, которые отсутствуют у взрослых животных. При этом неизвестно, какие факторы влияют на специфику развития данной популяции кортикальных нейронов. Результаты настоящего исследования позволяют высказать предположение, что одним из факторов, ответственных за судьбу транзиторных DA в неокортексе может быть GDNF. В пользу этого свидетельствовало наличие большого числа DA нейронов в контрольных трансплантатах неокортекса и их отсутствие в котрансплантатах. Вероятно, GDNF в котрансплантатах оказывает регулирующее действие на ход дифференцировки этой популяции нейронов, ускоряя прохождение транзиторной фазы или вообще «снимая» ее. Во взрослой коре этот фактор не экспрессируется (Berger, 1985; Trupp, 1997), и поэтому DA нейроны длительно сохранялись в неокортикальных аллотрансплантатах у животных контрольной группы.

Полученный нами препарат трансгенных клеток дрозофилы оказался обладающим выгодной комбинацией влияния нейротрофического фактора млекопитающих и факторов эмбриональных, нервных тканей дрозофилы на приживляемость трансплантатов. Эта комбинация препятствует образованию глиального рубца и улучшает приживляемость трансплантата. Именно блокада образования глиального рубца вокруг трансплантата, по всей вероятности, играет решающую роль в обеспечении лучшей его приживляемости.

Очевидно, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, продуцирующие GDNF человека, блокируют пролиферацию глии и образование глиального рубца. Это влияет, в свою очередь, на приживаемость трансплантата. В отсутствие клеток дрозофилы, экспрессирующих GDNF, трансплантат окружается плотным глиальным рубцом, что создает условия, несовместимые с его выживанием. Выделяемый нейротрофический фактор положительно влияют на приживаемость котрансплантата, стимулируя образование связей между клетками.

Количество эмбриональных, нервных клеток дрозофилы в трансплантате постепенно снижается с течением времени. Через один месяц после трансплантации обнаруживаются лишь единичные клетки дрозофилы в районе введения. Вероятно, это связано с тем, что клетки дрозофилы не могут долго существовать при повышенной температуре (37оС). Непродолжительность переживания клеток дрозофилы после трансплантации их в ткани млекопитающих может иметь положительное значение для применения этих клеток в качестве носителя терапевтического фактора, так как при этом ограничивается длительность воздействия препарата и снижается вероятность неоплазии.

5. Влияние белка теплового шока Hsp70 дрозофилы на образование рубца при трансплантациях.

Как изложено выше, эмбриональные, нервные клетки дрозофилы экспрессирующие нейротрофический фактор. При добавлении к аллотрансплантату эти клетки, блокируют образование рубцовой ткани на границе трансплантат - ткань хозяина. Мы предположили, что в блокировании глиального рубца участвует не только трансгенный фактор, но белки, вырабатываемые непосредственно клетками дрозофилы. Поскольку при температуре тела млекопитающих клетки дрозофилы активно синтезируют белки теплового шока, имеющие важное адаптивное значение, мы предположили, что именно с этими белками связано торможение пролиферации глии и формирования рубцовой ткани.

Для подтверждения данного предположения были проведены две серии экспериментов. В первой серии в затылочную область мозга взрослых крыс трансплантировали эмбриональные, нервные клетки Drosophila melanogaster трансгенной линии Oregon, меченой геном бактериальной галактозидазы lacZ. Во второй серии опытов для ксенотрансплантации использовали аналогичный материал, но от мутантной линии ts403, утратившей способность к синтезу главного белка теплового шока Hsp70.

Через неделю мозг фиксировали в 4% формальдегиде. Срезы окрашивали на бактериальную галактизидазу (Х-гал) для идентификации клеток дрозофилы, иммуногистохимически на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP) для выявления глиальных клеток и рубцовой ткани и на индуцируемый главный белок теплового шока для обнаружения соответствующего продукта - Hsp70.

Ксенотрансплантаты были идентифицированы в обеих сериях по Х-гал реакции. и с помощью обычной гистологической окраски.

Клетки ксенотрансплантата линии Oregon активно синтезируют белок теплового шока Hsp70, о чем свидетельствует интенсивная иммуногистохимическая реакция на данный белок Также наблюдалась экстраклеточная позитивная реакция на белок теплового шока дрозофилы, демонстрирующая его секрецию клетками дрозофилы в окружающие ткани. В этой серии опытов глиальный рубец вокруг ксенотрансплантата был значительно меньше, чем во второй серии экспериментов с мутантной линией ts403 иммуногистохимическая реакция ксенотрансплантата на Hsp70 белок была отрицательной. В то же время на границе ксенотрансплантат - ткань хозяина формировался четко выраженный глиальный рубец (рис. 14а, б).

Рис. 14. Результаты гистологического исследования. а. Глиальный рубец не формируется на границе ксенотрансплантат клеток линии Oregon - ткань хозяина. Окраска на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP). б. Формирование глиального рубца на границе ксенотрансплантат клеток мутанта ts403 дрозофилы-ткань хозяина. Окраска на GFAP. в. Клетки мутанта ts403 в ксенотрансплантате (стрелка). Окраска крезилвиолетом. Масштаб 10 микрометров

Полученные результаты указывают на возможную роль белка теплового шока Hsp70 в снижении образования глиального рубца вокруг ксенотрансплантата. По всей вероятности этот процесс играет значимую роль в обеспечении лучшей приживаемости аллотрансплантата в том случае, если он пересаживается в комбинации с ксенотрансплантатом эмбриональных, нервных клеток дрозофилы. Известно, что белок Hsp70 способен вызывать деградацию и выведение из клетки измененных белков, а также “активировать” митохондрии и препятствовать апоптозу. В связи с этим его благоприятный эффект, выявленный в наших экспериментах, не является случайным. Таким образом, экспрессия белка Hsp70 в трансплантируемых клетках ведет к уменьшению посттравматического глиофибриллярного рубца.

6. Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих.

Широкое распространение при лечении различных заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях. Существенное значение при этом имеет разработка способов повышения их жизнеспособности и управления путями их специализации при операциях трансплантации. Для этого необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в направлении, нужном для успешного лечения. Нами предлагаются регуляторные элементы генома дрозофилы, которые имеют определенные преимущества перед ретровирусными элементами в силу большей безопасности для терапевтического применения. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей.

Результаты опытов, показали, что нейрогены, введенные в геном дрозофилы, будучи соединенными с п/р областью гена hsp70 дрозофилы активируются под влиянием теплового шока. Они автоматически активируются также в ксенотрансплантатах эмбриональной, нервной ткани дрозофилы в мозгу взрослой крысы. Этот факт говорит о возможности использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для трансформации нужным генетическим материалом клеток млекопитающих и человека, подлежащих трансплантации пациентам. Температура тела человека должна быть опознана промотором дрозофилы как хит-шоковая и соответственно может обусловить активацию соединенного с ним гена. Для исследования функционирования этой п/р области в качестве управляющего элемента трансгенеза в клетках млекопитающих были созданы две конструкции. Одна, из них, содержала ген флюоресцентного белка Cyan находящийся под промотором CMV, другая содержала аналогичный ген под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы. Обе конструкции были приготовлены на основе вектора pcDNA 3,1+ .

В работе использовали эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши линии R1, полученные от доктора Наги (A.Nagy, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada). Эти клетки были выделены из бластоцист мышей линии (129/Sv~o 129/SvJ) F1, имеющих окраску агути. Трансфекцию ЭС клеток R1 осуществляли с помощью электропорации. Клетки R1, трансфицированные плазмидой pSV2neo, служили контролем.

В результате получили две культуры одна из которых, должна была содержать Cyan-ген под промотором гена цитомегаловируса человека (PCMV), другая - аналогичный ген под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. С помощью Нозерн блот-гибридизационного анализа было показано, что в клетках первой культуры синтезируется мРНК для цветного белка и, следовательно, соответствующий трансген активируется. При исследовании трансформированных культур ЭСК на флюоресцентном микроскопе было обнаружено, что клетки, которые трансформированы геном CFP под промотором CMV, светятся голубым светом, что свидетельствует о синтезе белка в этих клетках (рис. 15б).

Клетки, трансфицированные геном CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы в обычных условиях не светятся. Однако после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 42оС в течение 30 минут трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение.

В обычной ситуации, при температуре теплового шока фактор транскрипции теплового шока (Hsf) высвобождается из комплекса Hsf/Hsp90 млекопитающих или комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, образует тример и транспортируется в таком виде в ядро, где взаимодействует с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активирует промотор. В отсутствие предварительного нагревания клетки мыши, содержащие трансген CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы, не могут синтезировать CFP, поскольку комплекс Hsf/Hsp90 мышей, в отличие от комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, не реагирует на нормальную температуру тела млекопитающих. Воздействие температуры 42оС разрушает комплекс Hsf/Hsp90, и Hsf транспортируется в ядро. Полученные данные свидетельствует о том, что Hsf млекопитающих способен взаимодействовать с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активировать стоящий под ним трансген, но это происходит только после нагревания клеток до температуры теплового шока млекопитающих.

Для решения задачи, поставленной в начале этой работы (т.е. включение промотора при температуре 37оС) нами была сделана конструкция, содержащая аналог гена hsp90 млекопитающих ген hsp83, необходимый для активации промотора hsp70 дрозофилы при температуре 37оС. Данная конструкция методом электропорации была введена в культуру, содержащую ранее введенный ген CFP под промотором hsp70 дрозофилы.

В результате была получена культура, несущая ген белка теплового шока Hsp83 дрозофилы под CMV-промотором, и ген CFP под котролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. Мы наблюдали активное свечение данной культуры при нормальной температуре культивации клеток млекопитающих, т.е. был достигнут тот эффект, которого мы добивались.



Рис 15. Флуоресценция эмбриональных стволовых клеток мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ), инъецированных полученными конструкциями. а-культура клеток под световым микроскопом, b-флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором CMV, c- флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70; инкубация при 370С, d- флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70 инкубация при 420 С.

Следовательно, регуляторная система дрозофилы, распознающая температуру теплового шока способна функционировать в клетках млекопитающих. Разработанная методика может быть использована для трансфекции стволовых и прогениторных клеток млекопитающих и человека генами нейротрофических факторов и другими генами, полезными для использования в клеточной терапии.

Таким образом, была показана возможность создания системы, реагирующей на температуру тела млекопитающих включением нужных трансгенов, полезных при лечении некоторых заболеваний а значит и использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для регуляции экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих.

7. Использование полученного вектора LP1, содержащего п/р область гена hsp70 дрозофилы и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах

На основании данных результатов был получен вектор LP1 для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем нового регулируемого промотора и несущий ген флуоресцентного белка на N-конце для контроля вставки. Данный вектор обладает рядом преимуществ. Во-первых, он содержит промотор невирусной природы, что крайне выгодно при его возможном использовании в терапии. Во-вторых, экспрессию гена, находящегося под контролем данной последовательности, можно регулировать:

Данный вектор методом липофекции был введен в линию клеток эмбриональной почки человека НЕК 293. Для исследования функционирования введенной конструкции трансфицированные клетки были обработаны температурой теплового шока 42°С. В клетках человека мы наблюдали экспрессию маркерного гена не через 2-3 часа, как наблюдается у насекомых, а через 24 часа . Свечение было активным и наблюдалось в течение двух суток. При дальнейшем изучении было обнаружено, что активация промотора начинается и при менее травматичной температуре - 39оС. Через сутки было проведено повторное воздействие на культуру высокой температурой. Через 24 часа мы вновь наблюдали свечение. Таким образом, был получен новый вектор для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем регулируемого промотора. Данный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным.

Это свойство полученной конструкции представляет большой интерес для возможного применения в генно-клеточной терапии. Задержка экспрессии терапевтического трансгена дает время для предварительно прогретых клеток адаптироваться к условиям ткани реципиента и более эффективно наработать трансгенный белок.

Нами были предприняты попытки введения полученной конструкции в клетки первичных культур клеток человека и животных различного происхождения. В экспериментах использовались различные методы введения конструкции в клетки, такие как липофекция, электропорация или инъекция в ооциты рыб, однако нелинейные клетки плохо принимают любые конструкции, медленно делятся и быстро уходят в дифференцировку. Мы попробовали, что произойдет, если ввести конструкцию в смеси с реактивом для липофекции непосредственно в неостриатум мозга взрослой мыши.

Риc.16 Введение вектора LP1 непосредственно в мозг мыши. Масштаб 30 микрометров.

В результате мы наблюдали внедрение конструкции с GFP в клетки мозга, локализованные в герминативной области - субвентрикулярной зоне боковых желудочков (рис16). Незначительное количество светящихся клеток, объясняется тем, что в мозгу взрослой мыши деление клеток происходит крайне редко. По всей видимости, конструкция встраивалась только при делении клеток. Таким образом, был обнаружен еще один способ введения конструкций в стромальные клетки, при этом маркироваться будут только те клетки, которые делились в момент инъекции конструкции в мозг. Данный метод имеет еще один положительный момент: Встраивание чужеродного гена происходит в собственные клетки реципиента, имеющие лучшие перспективы длительного переживания и интеграции в мозге, чем трансплантированные экзогенные клетки при алло- или ксено-трансплантации.

8. Получение конструкции для экспрессии ngf в клетках млекопитающих

Необходимо попытаться заменить клетки дрозофилы на клетки более близкие человеку, а также проверить, как будет влиять гиперэкспрессия нейротрофического фактора на окружающие клетки при ко-культивации и позволят ли трансгенные клетки млекопитающих столь интенсивную экспрессию введенного гена. Для анализа влияния гиперэкспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации был использован ген ngf (фактор роста нервов) млекопитающих.

Для этих целей нами была получена генно-инженерная конструкция LP19 на основе вектора EGFP-N1, в которой ген фактора роста нервов ngf стоит в одной рамке считывания с геном зеленого флуоресцентного белка gfp под цитомегаловирусным промотором человека (CMV). Контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Секвинирование участка полилинкера показало наличие последовательности гена фактора роста нервов млекопитающих. Для анализа активации гена ngf в клетках данная конструкция была трансфицирована в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ) методом электропорации. А также конструкция LP19 была трансфицирована в клетки линии НЕК293 (линия эмбриональных клеток почки человека), методом липофекции. (Рис. 17) Наличие экспрессии ngf в линии ES и в НЕК293 проверяли с помощью метода блот-гибридизации по Нозерну (Рис. 18).

Рис. 17 Конструкция LP19 в линии HEK 293.

Свечение зеленого флуоресцентного белка в культуре клеток с LP19 (NGF-GFP).

1 2 3 4 5

Рис. 18 Блот-гибридизация по Нозерну конструкции LP19 в Hek 293 и ES (гибридизация на фрагмент NGF)

1- РНК из клеток линии ES, трансфицированных LP19

2- РНК из клеток линии ES, трансфицированных EGFP-N1

...