Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами

3- РНК из клеток линии ES

4- РНК из клеток линии HЕК293

5- РНК из клеток линии HЕК293, трансфицированных LP19

Результат нозерн-блот гибридизации для линий ES и HЕК293 оказался различным. У контрольных эмбриональных стволовых клеток мыши была обнаружена экспрессия собственного ngf. В то же время экспрессия этого фактора в трансгенной линии была гораздо более ярко выражена. Нозерн-блот гибридизация показала наличие в этих клетках двух мРНК различной подвижности. Одна из них соответствовала собственно хозяйской, тогда как другая была значительно тяжелее. Данный результат объясняется тем, что трансфицированные клетки кроме РНК нормального фактора содержат РНК химерного белка, в состав которого кроме фактора входит «зеленый хвост», который утяжеляет молекулу. Таким образом, трансгенные клетки содержат помимо собственного NGF также химерный белок NGF. Клетки линии НЕК293 не содержат собственного белка, тогда как трансгенная линия обладала белком ожидаемой подвижности. В результате для дальнейшего исследования была использована трансгенная линия НЕК293.

Наличие имуноцитохимической окраска клеток полученной линии антителами к NGF свидетельствует о наличии белка NGF в трансфицированных клетках. (Рис. 19) Таким образом, была получена линия Нек293, продуцирующая трансгенный белок NGF.

Рис. 19 Имуноцитохимическая окраска линии Hek 293/ LP3T.Окраска на антитела NGF , ядра клеток покрашены бисбензимидом

9. Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культивации.

В дальнейших экспериментах было исследовано влияние выделяемого трансфицированными клетками нейротрофического фактора на другие клетки, находящиеся в соседстве с трансгенными.

Рис.20 Ко-культивация спинального ганглия крысы с трансгенной линией НЕК293, экспрессирующей ngf. Масштаб 100 микрометров.

В этих экспериментах была исследована способность клеток линии НЕК293, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять на нервные клетки млекопитающих тканеспецифической культуры млекопитающих. С этой целью колонии селектированной нами трансгенной по ngf линии НЕК293, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями плода человека (11-я неделя эмбриогенеза). Трансгенные колонии НЕК293 были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру колоний клеток трансгенной линии, содержащей ген ngf мыши, наблюдается бурная реакция клеток спинального ганглия, выражающаяся в интенсивном росте отростков нервных клеток по направлению к колонии трансгенной линии (рис.20).

Было обнаружено, что нейротрофичесий фактор, высвобождаясь в среду, стимулирует образование отростков ко-культивируемых нервных клеток. Таким образом, была получена еще одна модель стимуляции образования отростков эмбриональных, нервных клеток в определенном направлении. Она также представляет интерес в связи с частой необходимостью выращивания нервных отростков в заданном направлении.

Не являясь чужеродными для тканей человека, клетки линии НЕК293 не исчезают со временем, поэтому данный метод целесообразно использовать, для постоянной экспресии терапевтического фактора. Таким образом, оба протокола имеют право на существование при различных целях. При нейродегенеративных заболеваниях может появиться необходимость, как в том, так и в другом подходе. В одних случаях нужно кратковременно стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, в других - восстановить продукцию недостающего белка.

10. Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих

В изложенных выше экспериментах было показано позитивное влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы, продуцирующих GDNF человека, на процессы посттравматического заживления в мозге млекопитающих. В дальнейших экспериментах мы исследовали влияние трансдукции гена этого фактора в линейные клетки человека на трансфицированные клетки и их окружение при кокультивации. Для данной работы была получена конструкция Lр14. Генно-инженерная конструкция для введения человеческого гена gdnf была синтезирована на основе вектора pEGFP-N1, содержащего CMV промотор и маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый) на N конце. В этот вектор был встроен человеческий ген gdnf. В результате была получена конструкция размером в 5,3 kb несущая гены gdnf и gfp под общим CMV промотором.

Клетки НЕК293 были трансфицированы плазмидой Lр14, содержащей химерный ген gdnf/gfp и ген устойчивости к неомицину (neo). Для получения стабильно трансфицированных клеток проводили селекцию на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл). Наблюдалось активное флуоресцентное свечение зеленого белка в культурах.

Анализ полученных культур проводили методом Саузерн-блот анализа. Для дальнейшей работы были отобраны клоны, полученные путем независимой трансформации, содержащие химерный ген gdnf/gfp по данным Саузерн-блот анализа и по активности свечения.

Для проверки нормальной транскрипции РНК был проведен Нозерн-блот анализ. Анализ показал, что ген gdnf нормально работает в отобранных клонах, полученных после трансфекции плазмидой несущей gdnf и отобранных на G-418.(рис. 21)

К 3 4 5

Рис. 21 Нозерн-блот гибридизация с РНК из клеток линии эмбриональных почечных клеток человека (НЕК293), несущих химерный ген gdnf/gfp. К- контроль (исходные клетки). 3-5-выбранные варианты культур, содержащих конструкцию LP 14.

Наличие нужной вставки в плазмиде LP14 было также подтверждено с помощью секвинирования. При сравнении полученной последовательности с последовательностями, имеющимися в базе GeneBank, было установлено, что вставка соответствует гену gdnf. Синтез химерного белка GDNF-EGFP клетками, трансфицированными Lр14, был подтвержден при помощи Вестерн-блот гибридизации (рис.22).

Рис.22 Вестерн-блот гибридизация. 1 - лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных pEGFP-N1, 2 - лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных Lр14. Цифрами отмечены молекулярные массы белков, входящих в состав маркера.

Полоса, присутствующая на дорожке 1 рис.3.6, соответствует молекулярной массе 34,5 кДа, а полосы, представленные на дорожке 2 - молекулярным массам 34,5 и 58,4 кДа. Можно сделать вывод, что в клетках линии НЕК293 экспрессируется собственный GDNF, имеющий молекулярную массу 34,5 кДа, что согласуется с литературными данными (Lin, 1993). Однако крайне незначительное количество собственного белка можно приравнять к следовому. Полоса с массой 58,4 кДа соответствует химерному белку GDNF-EGFP, который экспрессируется с введенной конструкции Lр14. Также можно заключить, что концентрация химерного белка GDNF/GFP превышает концентрацию GDNF.

11. Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки

Для изучения влияния гиперэкспрессии gdnf на клетки конструкция, содержащая химерный ген gdnf/gfp, была введена методом липофекции в культуру фетальных, нервных клеток мозга человека (культура любезно предоставлена исследовательской фирмой ИРИКТ). Наблюдалось активное образование отростков у нервных клеток, что говорит о стимуляции дифференцировки трансгенным белком GDNF в культуре (рис 23). Клетки, получившие химерный ген gdnf/gfp, дифференцировались в нейральном направлении, при этом клетки теряли способность к делению.

Рис.23 Фетальные нервные клетки мозга человека, содержащие химерный белок GDNF/GFP.Масштаб 50 микрометров

Культура была проанализирована на нейрональные маркеры, маркеры стволовых нейральных клеток. Также была проведена окраска на белок GDNF и глиальный фибриллярный кислый белок .

Было обнаружено, что GDNF влияет на дифференцировку трансгенных клеток в нейральном направлении. Данный результат выглядит достаточно привлекательным, если использовать регулируемый промотор при введении нейротрофического фактора. При трансплантации появится возможность активировать нейротрофический фактор непосредственно уже в мозгу и стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, а возможно и клеток реципиента в нейральном направлении.

Конструкция, содержащая gdnf, была введена в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ). Для этого клетки трансфицировали Lр14 (опыт) и pЕGFP-N1 (контроль). Экспрессию EGFP и химерного белка GDNF-GFP детектировали через 48-72 часа по зеленому свечению клеток. При культивации в присутствии G418 (200 мкг/мл) были получены стабильно трансфицированные клетки. Для подтверждения экспрессии введенного гена gdnf клетками линии R1 использовали метод Нозерн - блот гибридизации. Получали эмбриоидные тела, при культивировании которых в отсутствии фидера и LIF наблюдали дифференцировку клеток. При окрашивании клеток на вIII-тубулин была заметна разница в окрашивании контрольных и опытных препаратов. И в контроле и в опыте наблюдали дифференцирующиеся клетки нейрального типа. Однако в контроле такие клетки единичны. В опытных клетках с введенным химерным геном gdnf/gfp, напротив, наблюдалось преобладание дифференцирующихся клеток с многочисленными короткими отростками и одним длинным отростком, по-видимому, аксоном. Таким образом, в этих экспериментах отчетливо проявляется стимулирующее влияние трансгена на дифференцировку стволовых и прогениторных клеток мозга плода человека.

Однако, данные типы клеточных культур не подходили для изучения влияния трансгенного GDNF на образования нервных отростков in vivo и in vitro, в связи с наличием собственного GDNF. Для дальнейших исследований были использованы клетки линии НЕК293, не показавшие значительного синтеза собственного белка.

12. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf при ко-культивации



Рис. 24 Ко-культивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей gdnf. Масштаб50 микрометров

Были проведены эксперименты по проверке способности клеток трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей нейротрофический фактор, стимулировать образование нейральных отростков в уже дифференцированной и предварительно поврежденной нервной структуре. Клетки трансгенной линии, продуцирующей нейротрофический фактор ко-культивировали с фрагментом зачатка спинного мозга эмбриона человека. В контрольных культурах нейральные отростки не появлялись. При добавлении в культуру клеток, экспрессирующих gdnf человека, наблюдается активное образование нервных отростков прорастающих по направлению к клеткам трансгенной линии (рис. 24). Этот процесс начинается уже в течение первых суток ко-культивирования.

Таким образом, было обнаружено, что экспрессия нейротрофического фактора gdnf не только способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток, но и стимулирует образование нервных отростков у уже сформировавшихся, но травмированных нервных образований.

Данный результат перспективен для клинического примененеия

13. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf на образование глиальной ткани при трансплантациях

Для экспериментов на животных также была использована конструкция Lр14, содержащая ген химерного белка GDNF/GFP, экспрессия которого была подтверждена иммуногистохимически. Клетки трансплантировали взрослым (2 мес.) мышам линии СВА. В мозг животных подопытных групп вводили клетки, продуцирующие химерный белок GDNF/GFP, а животным контрольных групп - клетки, содержащие белок GFP. Анализ проводили через 6, 14 и 18 дней. Срезы окрашивали иммуногистохимически на маркеры рубцовой ткани GFAP, актин, фибронектин, коллаген типа IV. Наиболее ощутимые результаты наблюдались через 18 дней после трансплантации клеток.

Во всех случаях на срезах переднего мозга были найдены клетки, содержащие GFP. Клетки располагались плотной группой в средней части полосатого тела.. Сколько-нибудь значительной миграции трансплантированных клеток из места введения не наблюдали. Были найдены лишь единичные клетки, расположенные в более чем 50 миркометрах от границы трансплантата. Во всех экспериментах наблюдали глиальную реакцию в ткани мозга реципиента, непосредственно примыкающей к области инъекции. Глиальная реакция представляла увеличение количества клеток, экспрессирующих GFAP а также увеличение экспрессии фибронектина и коллагена типа IV. У животных контрольных групп, в мозг которых были трансплантированы клетки, не содержащие трансгенного GDNF, глиоз существенно нарастал с течением времени. У животных опытных групп, получивших трансплантаты, содержащие трангенный GDNF, не наблюдали существенного нарастания глиальной реакции. Таким образом, в эксперименте (через 18 дней после трансплантации) глиальная реакция в контрольной группе намного превышала реакцию в опытной группе (рис. 25).

Обнаружено, что при трансплантации в полосатое тело клеток линии НЕК293, экспрессирующих химерный белок GDNF/GFP, количество GFAP-позитивных астроцитов, участвующих в образовании глиального рубца, значительно меньше, чем при трансплантации клеток той же линии, экспрессирующих GFP.

контроль

GFP Fn GFAP GFP+Fn+GFAP

Опыт (GDNF)

Рис.25 Трансплантация клеток НЕК 293, содержащих LP14g (GDNF/GFP), в полосатое тело мозга крысы (18 суток после трансплантации). Масштаб 50 микрометров.

Также в опыте по сравнению с контролем образуется меньше ассоциированного с рубцом внеклеточного матрикса, выявляемого окраской на фибронектин, коллаген IV и актин.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены (18 дней), Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками человека линии НЕК293 и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента.

В данной работе было подтверждено нейропротективное действие белка GDNF. Выделяемый клетками трансгенный GDNF оказывает трофическое влияние на окружающую ткань. Это влияние может проявляться в уменьшении гибели клеток, обусловленной травмированием мозга сдавлением ткани от инъекции чужеродных клеток. Также было показано значительное уменьшение глиального рубца Результаты подтверждают перспективность применения клеток млекопитающих, продуцирующих GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии.

Однако, совокупность результатов предыдущих экспериментов позволяет предположить что оптимальным вариантом для предотвращения образования глиального рубца при трансплантациях, является сочетание нейротрофических факторов и белка теплового шока.

Обсуждение

Открытие стволовых клеток в нервной ткани вызвало переоценку целого ряда представлений, особенно для восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовые нервные клетки идентифицируют по молекулярным маркерам, которые отражают стадии их развития:: это нестин - для стволовой клетки, виментин - для клетки-предшественника, бета-III-тубулин - для нейробласта, GFAР - для клетки, развивающейся по глиальному пути и ряд других маркеров. Наличие таких маркеров позволило выявить популяционную гетерогенность первичных культур фетальных нейральных клеток. Например, типичное процентное распределение специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых нервных клеток человека следующее: нестин - 43,1 %, виментин - 63,2 %, бета-тубулин - 70,1 %, GFAP - 3,2 %, NCAM - 12,0 %, CD34 - 1,3 %, CD45 - 0,5 %. Подобная гетерогенность в какой-то степени определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия - в частности, изменение соотношения клеток с различным потенциалом отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду. Например, повышенное содержание нестин-содержащих клеток будет способствовать повышению эффективности воздействия микроокружения на их дифференцировку.

Одной из задач работы являлся поиск генетического способа управления дифференцировкой нейральных стволовых клеток в условиях их культивирования и трансплантации. Эта проблема важна в теоретическом плане, поскольку приближает нас к пониманию сущности клеточной дифференцировки. Кроме того, решение этой проблемы позволит получать популяции клеток, дифференцирующихся в нужном для клеточной терапии направлении.

Существуют три способа воздействия на дифференцировку клеток: а) добавление кондиционной среды; б) добавление к культуральной среде факторов, активирующих дифференцировку; и в) трансфекция культивируемых клеток генами, которые кодируют факторы, индуцирующие дифференцировку. В случае нервной ткани этими факторами являются нейротрофические факторы. В данной работе изучается третий способ воздействия.

Критическое значение для экспрессии трансфицированного гена имеет правильный выбор промотора. Желательно, чтобы он был регулируемым, например, мог бы активироваться при температуре тела человека или активироваться только при более высокой тепературе не выходящей за физиологические пределы.

При создании наших базовых генетических конструкций в качестве управляющего элемента мы применили п/р область гена hsp70 дрозофилы. Нами были выяснены основные вопросы, касающиеся функционирования полученных нами конструкций, содержащих нейротрофические факторы под контролем упомянутой п/р области в клетках и тканях дрозофилы и млекопитающих, включая человека.

При исследовании полученных нами трансгенных линий дрозофилы, содержащих гены нейротрофических факторов человека - NGF, GDNF и BDNF под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы было показано, что нейротрофические гены млекопитающих экспрессируются в тканях дрозофилы находясь под неродственным промотором. Как и предполагалось, экспрессия данных генов оказалась температурно-зависимой. Полученные трансгенные линии дрозофилы характеризуются высокой транскрипционной активностью человеческих генов gdnf, ngf и bdnf в условиях теплового шока - при 37оС. Наличие экспрессии чужеродных белков подтверждена гибридизацией in situ, методом иммуноблотинга. Действие этих белков на окружающие клетки и ткани исследованы при трансплантации клеток дрозофилы в мозг крыс и при кокультивации их с клетками и органотипическими культурами нервных тканей животных и человека. В этих экспериментах во фрагментах эмбриональной эктодермы трансгенных линий дрозофилы активировался синтез трансдуцированных нейротрофических факторов и маркерных белков, обусловленный температурным воздействием среды по сути хит-шоковым для тканей насекомых. Продуцируемые факторы оказывали нейротрофное воздействие на окружающие ткани млекопитающих.

В результате исследований по ко-культивации, была получена модель, в которой эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, будучи источниками синтеза нейротрофического фактора, стимулируют рост нейральных отростков у ко-культивированных эмбриональных, нервных клеток в строго заданном направлении. Интересно, что волокна млекопитающих не просто росли, но и вступали в контакт с нейральными тканями такого отдаленного таксона как дрозофила. Разработанная экспериментальная модель может быть полезна для дальнейших исследований действия трансдуцированных белковых факторов и сигнальных молекул на ткани и клетки подопытных животных и человека.

Одно из важнейших открытий в области транспланталогии, сделанное Л.И. Корочкиным, заключается в обнаружении выживаемости нервных клеток дрозофилы в нервных тканях амфибий и млекопитающих. Корочкин и Савельев с соавторами (1991) обнаружили, что нерные эмбриональные клетки дрозофилы образуют связи с клетками реципиента, т.е. встраиваются в нервную ткань хозяина. Причем, в тканях мозга амфибий данные клетки существовали длительное время, а в мозге млекопитающих исчезали в течение месяца, замещаясь нервными клетками хозяина. Такие характеристики ксенотрансплантата представляются нам крайне привлекательными для использования клеток дрозофилы в качестве носителей терапевтических трансгенов. Такие клеточные векторы позволят вносить необходимые гены в область поражения нервной системы с возможностью уменьшения уровня реактивного глиоза и последующим замещением нервных клеток дрозофилы на нервные клетки хозяина. На основе данной идеи в данной работе были построены эксперименты по ксенотрансплантации, с целью поиска решения проблемы восстановления нервных тканей млекопитающих.

Опыты с ксенотрансплантацией в мозг крысы нейральной ткани эмбриона трансгенной дрозофилы линии С3-1М (gdnf) в смеси с нервной тканью эмбриона крысы показали, что экспрессирующийся в ткани мухи тарнсдуцированный фактор выделяется в окружающюю ткань и оказывает трофическое воздействие на ткань реципиентного мозга и котрансплантированные фетальные клетки крыс. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих.

Морфологическое изучение показало, что в случаях такой ко-трансплантации наблюдается хорошая приживляемость трансплантата и резкое снижение гибели ко-трансплантированных фетальных клеток крыс. Хорошая выживаемость клеток трансплантата может быть отражением нейропротективной функции выделяемого тканью мухи GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы вследствие апоптоза. Помимо хорошей выживаемости ко-трансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающего трансплантат неокортекса крысы. Интересно отметить, что такой интенсивной васкуляризации не наблюдается в обычных аллотрансплантатах фетальной, нервной ткани в кору крыс. На этом основании можно предположить, что ангиогенный эффект обусловлен присутствием в трансплантате ксеногенной ткани дрозофилы. Усиленную васкуляризацию могут вызывать факторы, выделяемые ксеногенными клетками, в том числе возможно и трансдуцированный GDNF.

Было показало, что ткани трансгенных нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, в ряде случаев видны тесные межклеточные взаимодействия, свидетельствующие об отсутствии межвидового антогонизма, значительная часть клеток нейральных закладок трансгенной дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии и экспрессирует тирозингидроксилазу в течение всего времени эксперимента.

По всей видимости, и другие белки дрозофилы также принимают активное участие в процессе приживления. Одним из таких белков является белок теплового шока HSP70 дрозофилы. Этот факт был подтвержден в экспериментах по ксенотрансплантации в мозг крыс эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии Oregon, меченой lacZ и эмбриональной, нервной ткани мутанта ts403, утратившего способность к синтезу HSP70. В этих экспериментах показано, что белок теплового шока Hsp70 снижает образование рубцовой ткани вокруг ксенотрансплантата эмбриональных, нервных клеток дрозофилы.

Важно отметить, что раздельное действие белка теплового шока (в экспериментах с мутантами ts403) и нейротрофического фактора (в экспериментах с клетками трансфицированными HEK293) приводило лишь к ослаблению рубцевания, в то время как совместное действие GDNF и HSP70 (в экспериментах с трансгенными линиями мух) приводило к полной редукции рубца. Так как при трансплантации клетки дрозофилы попадают в среду поддерживающую температуру теплового шока для дрозофилы, то вероятно, что именно комбинация экспрессий нейротрофического фактора и активированного белка теплового шока дает столь положительную динамику приживления трансплантата и обуловленное этим подавление глиоза.

Наши исследования показали, что присутствие трансгенных клеток дрозофилы в составе клеточного терапевтического препарата может оказывать протективное, трофическое и антиглиозное действие на трансплантируемые клетки и на клетки окружающие ткани мозга реципиента. Перспективность использования клеточных препаратов с добавлением трансгенных клеток дрозофилы обусловлена на наш взгляд сочетанием нескольких факторов, принципиально недоступным в чистых алло- или аутотрансплантатах. В настоящее время получение клеточных препаратов носителей трансгенных белков на основе клеток млекопитающих возможно только с использованием линейных клеток или при помощи вирусных конструкций. Применение и тех и других в клинике опасно. Аутологичные или аллогенные клеточные препараты в сочетании с клетками дрозофилы в качестве носителя трансгена не несут вирусных генетических конструкций. Клетки дрозофилы обеспечивают эффективную доставку и экспрессию терапевтического трансгена в сочетании с протективным белком теплового шока Hsp70, действие которого показано в нашей работе. Продолжительность этого действия, как и действия трансгена, ограничена продолжительностью жизни клеток дрозофилы в условиях тканей реципиента и составляет 1 месяц. Этого времени во многих случаях достаточно для действия факторов, выживания и интеграции котрансплантированных аутологичных или аллогенных клеток в ткань мозга реципиента и для возможного замещения дегенерировавших нейронов. Такой сценарий терапевтического воздействия может быть оптимален для лечения многих патологических процессов.

Результаты исследования тканей линий дрозофилы содержащих гены нейротрофических факторов млекопитающих под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы показали целесообразность использования этого промотора для трансформации стволовых клеток человека, которые в дальнейшем могут быть использованы в экспериментах по нейротрансплантации, а возможно и в нейрохирургических операциях.

Также в нашей работе были получены конструкции, несущие гены нейротрофических факторов, для использования их непосредственно в клетках млекопитающих. Полученные нами генные конструкции, содержащие гены нейротрофических факторов, были трансдуцированы в клетки человека линии HEK293, в эмбриональные клетки мышей и в клетки фетального мозга человека.

При исследовании полученных трансгенных клеточных препаратов было обнаружено, что ко-культивация эмбриональной, нервной ткани фрагмента зачатка спинного мозга, получившей повреждения, с клетками линии НЕК293, экспрессирующими NGF, стимулирует образование нервных отростков у поврежденной ткани. При ко-культивации клеток линии НЕК293, продуцирующих GDNF, со спинальным ганглием новорожденного крысенка наблюдалось активное образование нервных отростков клеток спинального ганглия в сторону трансгенных клеток уже в течение первых двух часов в отличие от контроля, где отростки образовывались через 2-3 суток и в разных направлениях.

Также было показано, что при трансплантации эмбриональных НЕК293 клеток, трансфицированных генами gdnf в мозг крысы, присутствие GDNF снижает образование рубцовой ткани. В отличие от модели с клетками дрозофилы, клетки НЕК293, являясь клетками человека, в мозге млекопитающих находятся в более комфортных условиях. В результате мы не наблюдали исчезновения данных клеток с течением времени. Однако, в отличие от разрастания данной трансгенной культуры при культивации, при трансплантации трансплантат оставался нормальных размеров, что подтверждает известный факт отсутствия туморигенности у клеток линии НЕК293.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности длительного переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены. Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками линии НЕК293, которая была получена из клеток эмбриональной почки человека, и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента.

Результаты подтверждают перспективность применения трансгенного GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии. Дальнейшее совершенствование техники невирусной трансдукции терапевтических генов в клетки млекопитающих позволят создавать эффективные клеточные препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний.

При исследовании клеток млекопитающих, трансфицированных конструкциями с маркерными белками под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы было обнаружено, что п/р область способна активировать чужеродный ген в клетках млекопитающих. Данная п/р область выгодно отличается от ранее известных, так как обладает высокой активностью, не имеет вирусной природы и ее активность можно регулировать, двумя разными способами: температурным воздействием (39oC) и с помощью белка Hsp83. Полученный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным. Данные результаты являются новыми, так как ранее утверждалось, что исследуемый промотор в клетках млекопитающих активизируется при 42°С, что крайне травматично для клеток, и снижает возможности использования данного промотора в практике (Glazenburg K et.al.1992, Roigas J. et.al.1997).

Таким образом, получена модель для регулирования активности чужеродного гена в клетках млекопитающих. Также было обнаружено, что при введении голой ДНК вектора Lp1, несущего комплекс hsp70-GFP в мозг мыши, наблюдалась трансфекция клеток мозга причем активация вводимого гена gfp под контроле промотора hsp70 обнаруживалась при температуре тела млекопитающих (37оС). По всей видимости, в данном случае наблюдается воспалительный процесс, обсловленный травмированием инъекционной иглой, который и запускает активацию исследуемого промотора.

Использование п/р области гена hsp70 дрозофилы в качестве элемента управления экспрессией терапевтического трансгена дает возможность регулировать экспрессию чужеродного гена в трансплантате. При этом можно стимулировать гиперэкспрессию, с последующим снижением продуцирования трансгенного фактора.

Таким образом, нами были разработаны две клеточные системы экспрессии нейротрофических факторов для трансплантации трансгенных клеток или тканей в мозг млекопитающих. Для первой из них донорами факторов являются клетки дрозофилы. Эта система обладает рядом преимуществ, а именно: трансгенные клетки дрозофилы быстро образуют связи с клетками мозга реципиента; препятствуют образованию глиального рубца на границе тканей трансплантат - реципиент и короткий срок жизни трансгенных клеток (менее месяца). Данная система привлекательна для терапии заболеваний требующих локального и кратковременного действия нейротрофных факторов.

Вторая клеточная система на основе трансгенных линий клеток человека способна снабжать поврежденный участок мозга млекопитающих нейротрофным фактором длительное время, поскольку эти клетки способны долго жить после трансплантации. При экспрессии клетками нейротрофического фактора было показано резкое снижение (но не полное отсутствие как для первой системы) глиоза. По-видимому, обладая ярко выраженными ксеногенными свойствами трансгенные эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, в отличие от клеток человека, не вызывают межклеточной реакции на границе двух тканей при трансплантации.

Таким образом, обнаружено, что сочетание белка теплового шока и нейротрофического фактора блокирует образование глиального рубца, повышая при этом приживаемость трансплантата и его васкуляризацию.

На основании полученных данных напрашиваются некоторые практические рекомендации для использования в нейрохирургической практике. Суть их заключается в предложении изыскать способы мобилизации белка Нsp70 и введения нейротрофических генов при нейротрансплантациях. Таких способов несколько: 1. можно добавлять белок Нsp70 и нейротрофический фактор к трансплантату перед операцией, 2. можно активировать синтез белка в трансплантате посредством предварительного прогревания трансплантата при температуре, вызывающей тепловой шок, и при этом добавлять нейротрофический фактор с трансплантацией, 3. можно трансформировать используемую для трансплантации культуру, введя в ее геном гены, кодирующие белок Нsp70 и нейротрофический фактор.

Выводы

1. Показана функциональная активность генов, кодирующих нейротрофические факторы человека (bdnf, gdnf) и мыши (ngf) в геноме дрозофилы.

2. Установлено, что нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку нервных клеток млекопитающих при их совместном культивировании на искусственных средах. При этом происходит направленное образование отростков у эмбриональных спинальных ганглиев, что является необходимым условием при трансплантации.

3. Разработан метод смешанных ксенотрансплантаций эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы и его регуляторной области. Обнаружено, что трансгенные клетки дрозофилы дифференцировались в нейральном направлении на границе трансплантат - мозг реципиента. При этом они формировали контакты с окружающими нервными клетками, усиливали васкуляризацию области трансплантата.

4. Продемонстрировано, что ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат - ткани мозга реципиента.

5. Показана позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях. Обнаружено, что оптимальной для блокирования образования глиального рубца при трансплантациях является комбинация белков теплового шока HSP70 и нейротрофических факторов.

6. Получена трансгенная культура клеток дрозофилы, экспрессирующая нейротрофический фактор NGF млекопитающих. Данная культура может быть использована в качестве донора чужеродного нейротрофического фактора при трансплантациях в мозг млекопитающих.

7. Показано, что промоторно-регуляторная область гена hsp70 дрозофилы запускается сигнальным каскадом млекопитающих. На основании этого был получен вектор Lp1 для трансфекции клеток млекопитающих, в котором трансгены регулируются повышением температуры до 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки.

8. Разработан метод введения чужеродных генов встроенных в плазмиду, непосредственно в мозг млекопитающих, путем инъецирования голой ДНК. Данный метод наименее травматичен для тканей мозга.

9. Для клеточной трансплантации в мозг млекопитающих разработан метод клеточной доставки генов, в котором в качестве донора нейротрофического фактора были использованы трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижающие образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс.

10. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf .

11. Для изучения действия нейротрофических факторов in vitro и in vivo разработаны два типа клеточно-органных моделей, которые позволяют обеспечить как временное, так и постоянное действие этих факторов.

Публикации

1. Корочкин Л.И.,Сергеев П.В., Башкиров B.Н., Панин В.М., Габитова Л.Б., Мартинс К., Копанцева М.Р., Шостак Н.Г., Павлова Г.В., Барский В.Е., и др. Тканеспецифическая экспрессия гена estS у трансгенных дрозофил. ДАН (1995), т.340, с. 433-436.

2. Александрова М.А., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Башкиров В.Н., Модестова Е.А., Евгеньев М.Б., Сабурина И.И., Мерцалов И.Б., Венгрова С.П., Корочкин Л.И. Влияние чужеродного гена GDNF на развитие трансплантата и ксенотрансплантата в мозге крыс. Генетика (2000), т.36, с.1553-1560.

3. Павлова Г.В., Модестова Е.А., Венгрова С.Н., Ефанова А.А., Рыбцова Н.Н., Корочкин Л.И. Экспрессия человеческого гена gdnf в трансгенной линии Drosophila melanogaster. ДАН (2001), т. 376, с.694-696.

4. Корочкин Л.И., Александрова M.А., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Башкиров В.Н., Алексенко О.А., Евгеньев М.Б. Эффект белка теплового шока HSP70 на формирование глиального рубца при нейротрансплантации. ДАН (2001), т.383, №3, с.113-5.

5. Корочкин Л.И., Александрова M.А., Павлова Г.В., Башкиров В.Н., Ревищин А.В., Алексенко О.А., Евгеньев М.Б. Влияние семейства HSP70 белков при алло- и ксенотрансплантации в мозг крысы. Цитология (2001), т.40, с. 803-806.

6. Павлова Г.В., Ефанов А.А., Башкиров В.Н., Модестова Е.А., Мерцалов И.В., Корочкин Л.И. Экспрессия генов ngf и bdnf человека в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Цитология (2002); №44 (11), с.1104-8.

7. Корочкин Л.И., Александрова М.А., Башкиров В.Н., Трухачева А.А., Дзитоева С.Г., Павлова Г.В., Муркин Е.А., Евгеньев М.Б., Ревищин А.В., Модестова Е.А. Ксенотрансплантация эмбриональной нервной ткани нейромутанта Drosophila стимулирует развитие трансплантата в мозгу крысы в нейральном направлении и блокирует образование глиального рубца. Цитология (2002); №44 (12), с.1181-5

8. Pavlova G., Enblom A., Revishchin A., Sandelin M., Korochkin L., Kozlova E. The influence of donor Drosophila cells on survival of peripherally grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. Cell Transplantation (2003), V 12, p 705-715.

9. Павлова Г.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.А., Гривенников И.А., Муркин Е.В., Канайкина Н.В., Ревищин А.В., В.Н.Тарантул, Корочкин Л.И. Регуляция экспрессии белка BFP в эмбриональных клетках. Бюлл. Эксперим. Медицины. 2005, Т. 139. № 4. с. 514-516

10. Маркитанова Ю.В., Макарьев Е.О., Павлова Г.В., Зиновьева Р.Д., Миташев В.И. Локализация экспрессии гена Prox1 при регенерации хрусталика и сетчатки у тритонов. ДАН (2003); №391, с.361-4.

11.Павлова Г.В., Ревищин А.В.,Мирошникова О.А.,Муркин Е.В.,Харлампиева Д.Д., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. Влияние чужеродного гена gdnf в ксенотрансплантатах на посттравматические процессы в мозге мышей. Молекулярная медицина (2006), №2, с. 44-48.

12. Андреева Л.Е., Хайдарова Н.В., Родригес-Бланко А.В., Канайкина Н.Н., Ревищин А.В., Тарантул В.З., Корочкин Л.И., Павлова Г.В. Экспрессия репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена теплового шока дрозофилы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия (2006), Т. 4 (6), с.39-44.

13.Охоботов Д.А.,Зарайский Е.И.,Павлова Г.В.,Камалов А.А.Иммунологические факторы бесплодия и антигены сперматозоидов. Медицинские науки. (2007), №4, стр. 31-42.

14. Поляков А.С., Корочкин Л.И., Павлова Г.В. Исследование экспрессии и анализ функции гена Sip1 в развитии коры головного мозга. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, (2007), Т. 2, №2, с. 40-44.

15. Бутовская П.Р.,Мартиросян И.А.,Баранов В.С,Егорова А.А,Киселев А.В.,Павлова Г.В.,Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами. Генетика (2007),Т. 43, №12, с. 1694-1699.

16. Павлова Г.В.,Охотин В.Е., Корочкин Л.И., Ревищин А.В. Геномная регуляция судьбы нейральных стволовых клеток млекопитающих. Генетика (2008), Т. 44, № 3, с. 293-299.

17. Revishchin A.V.,Korochkin L.I.,Okhotin V.E., and Pavlova G.V. Neural Stem Cells in the Mammalian Brain. International Review of Cytology, (2008), V. 265, p. 161-175.

18. Koles K.,Repnikova E.,Pavlova G.,Korochkin L.I.,Panin V.M. Sialylation in protostomes: a perspective from Drosophila genetics and biochemistry. Glycoconj J.(2008) Epub ahead of print.

19. E.Savvateeva-Popova, A.Popov., A.Grossman, E.Nikitina, A.Medvedeva, D.Molotko, N.Kamyshev, K.Pyatkov,O.Zatsepina, N.Schostak, E.Zelentsova,G.Pavlova,D.Panteleev, P.Riederer and M.Evgen`ev. Non-coding RNA as a trigger of neuropathologic disorder phenotypes in transgenic Drosophila. J. of Neural Transmission, (2008), Epub ahead of print.

20. Корочкин Л.И., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Рыбалкина Е.Ю., Эрнст Л.К. (2007) Способ предифференцировки стромальных стволовых клеток костного мозга в тирозингидроксилаза-позитивные клетки. Заявка на патент №2007113908. 13.04.2007.

21. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ стимуляции регенерации нервной ткани млекопитающих. Заявка на патент №200701108. 20.06.2007

22.Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ предупреждения образования глиального рубца. Заявка на патент №200701109. 20.06.2007

23. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ активации регенерации нервной ткани млекопитающих. Заявка на патент №200701110. 20.06.2007

24. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ стимуляции регенерации нервной ткани. Заявка на патент №200701112. 20.06.2007

25. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ ускорения регенерации нервной ткани. Заяв. на патент №200701111. 20.06.2007

Главы в книгах

26. Korochkin LI., Alexandrova A, Pavlova G.et.al. Genetic Engineering Methods of the Regulation of Stem Cells Differentiation. Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p.121-136.

27.Korochkin L.I., Alexandrova A, Pavlova G.,et.al. Protein Hsp70 Blocks The Glial Scar Formation Around The Neurotransplant. Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p. 137-141.

28. Shegelskaya E.A., Mikulinskii Y.E., Revishchin A.V., Pavlova G.V. and Korochkin L.I. Differentiation of Stem Cells in the Culture. In book: Genes, Gene Families, and Isozymes. Medimond, Berlin (2003), p.69-73.

Тезисы конференций:

29. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzitoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgenev M., Modestova A., Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain: molecular genetic and embryological aspects. International Symposium on X-chromosome inactivation in mammals. Novosibirsk, 1999, p. 29.

30. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzytoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgeniev M., Grossman A. Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain: molecular genetical and clinical aspects. 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, p.76.

31. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzytoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgeniev M., Grossman A. Embryonic nerve cells from Drosophila melanogaster stimulate development of neural homografts in rat brain and blocked of glial scar formation. 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, р.704a.

32. Korochkin L.,Alexandrova M., Bashkirov V.,Dsitoeva S.,Pavlova G.,Trukhatcheva A, Evgeniev M. Xenotransplantation of Drosophila embryonic nerve cells into mammalian brain: molecular genetic and clinical aspects. 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology. Moscow-Puschino, 2000, р.68-69.

33. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Pavlova G., Trukhatchava A., Evgeniev M., Modestova E. Grosman A. Xenotransplantation of Drosophila embryonic cells into mammalian brain. Proc. of 2nd Internat. Conference on bioinformatics of genome regulation and structure. V.3, BGRS, Novosibirsk, 2000, р.2728-2729.

34. Корочкин Л.И., Александрова М.А., Башкиров В.Н., Дзитоева С.Г., Павлова Г.В., Трухачева А.П., Евгеньев М.Б. Ксенотрансплантации нервных клеток Drosophila melanogaster в мозг млекопитающих: Молекулярно-генетические и эмбриологические аспекты. Онтогенез, 2000, Т.31, №4, с. 293-294.

35.Pavlova G., Revischin, Miroschnikova O., Titova E., Murkin E., Enblom A., Sandelin M., Kozlova E., Korochkin L. The influence of donor age, nerve growth factor and cografting with Drosophila cells on survival of peripherically grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine.Egypt,Hurgada,2004, p.121.

36. Pavlova G., Titova E., Bragina T., Mirochnikova O., Murkin E., Grivennikov I., Manuilova E., Narantul V., Revishchin A., Korochkin L.. Activation of foreign protein synthesis in stem cells. ELSO. Nice. 2004, p.178-181.

37.Mirochnikova O., Pavlova G., Murkin E., Titova E., Bragina T., Korochkin L. The synthesis of genetical constructs to transform the humam stem cells. Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine. Egypt, Hurgada, 2004, p.111.

38.Павлова Г.В., Мануилова Е.С., Гривенников И.А., Мирошникова О.А., Титова Е.А., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Модестова Е.А., Корочкин Л.И. Активация синтеза чужеродного белка в культуре клеток. Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина. Украина, Судак, июнь 2004 г., с.34

39. Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Модестова Е.А., Корочкин Л.И. Селекция линии дрозофилы, несущей ген красного белка. Прогресс в биотехнологии и нейробиологии-интегративная медицина. Украина, Судак, 2004 г., с.48.

40.Korochkin L.I.,Grivennikov I.A.,Manuilova E.S.,Tarantul V.N.,Revishchin A.V.,Titova E.V., Miroshnikova O.A., Bragina T.V., Murkin E.V., Kanaikina N.V., Pavlova G.V. Transformation stem cells culture by genes of human neurotrophic. J.of Biotechnology (2005), V.1, p.64.

41.Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Муркин Е.В., Канайкина Н.Н., Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Экспрессия чужеродных человеческих NGF и GDNF в трансгенных линиях Drosophila. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с. 78.

42.Титова Е.А.,Брагина О.В.,Мирошникова О.А.,Корочкин Л.И.,Павлова Г.В. Создание модельных генетических систем для изучения нейротрофических факторов и флуоресцентных белков. В кн:Системная биология и биоинженерия. М.,Макс Пресс,2005, с. 81.

43.Харлампиева Д.Д., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансгенного нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с.82.

44.Павлова Г.В.,Корочкин Л.И.Новые подходы к регуляции дифференцировки стволовых клеток. В кн:Системная биология и биоинженерия. М.,Макс Пресс,2005,с.100-101.

45. Харлампиева Д.Д., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансфекции нейротрофического фактора GDNF на диффе-ренцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с. 123-124.

46.Корочкин Л.И., Гривенников И.А.,Мануилова Е.С., Тарантул В.З., Ревищин А.В., Титова Е.В., Муркин Е.В., Канайкина Н.А., Павлова Г.В. Трансформация стволовых клеток генами нейротрофических факторов В кн. Биотехн.: Состояние и перспективы развития. 2005. с. 64-66.

47. Муркин Е.В., Павлова Г.В., Титова Е.В., Гривенников И.А., Мануилова Е.С., Ревищин А.В., Тарантул В.С., Корочкин Л.И. Активация чужеродных белков в стволовых клетках. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с.149-150.

48. Павлова Г.В., Ревищин А.В., Зарайский Е.И., Титова Е.В., Рыбалкина Е.А., Брагина Т.А., Мирошникова О.В., Муркин Е.В., Пономарь С.Н., Канайкина Н.А., Корочкин Л.И. Индукция специфической дифференцировки в региональных стволовых клетках человека. Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ. Т.2, Сочи-Дагомыс, 2005, с. 126.

49. Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Харлампиева Д.В., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Канайкина Н.Н., Антонова Г.А.,Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Экспрессия чужеродных (человеческих) и нейротрофических генов NGF и GDNF в трансгенных линиях Drosophila. Материалы 6-ой Междунар. конф. Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, .81

50.Титова Е.А., Брагина Т.В., Мирошникова О.А., Корочкин Л.И., Павлова Г.В., Создание модельных генетических систем для изучения нейротрофических факторов и флуоресцентных белков. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.81-82.

51.Харлампиева Д.В., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансгенного нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.82-83.

52.Канайкина Н.Н., Павлова Г.В., Титова Е.А., Мирошникова О.А., Антонова Г.А., Харлампиева Д.В., Муркин Е.В., Гривенников И.А., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л. Ревищин А.В.,Тарантул В.З., Корочкин Л.И. Активация чужеродных белков в стволовых клетках. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.95

53. Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Новые подходы к регуляции дифференцировки стволовых клеток. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.100 -101

54. Павлова Г.В., Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Разработка и испытание методов подготовки аутологичного материала для клеточной терапии при нейродегенеративных заболеваниях. 1-ая всерос. школа-конференция. Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 20.

55.Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Деметилирование ДНК значительно усиливает индукцию нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, вызванную нейротрофическим фактором BDNF и ретиноевой кислотой. 1-ая всероссийская школа-конференция: Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 44.

56. Тимошенко Т.В., Полетаева И.И., Перепелкина О.В., Сазонова А.С., Павлова Г.В., Ревищин А.В. Управление уровнем пролиферации клеток переднего мозга с помощью нейропептида семакс и ингибитора NO-синтазы. Первая всероссийская школа-конференция: Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 55.

Размещено на Allbest.ru

...