Интермиттирующая (периодическая) гипоксия: природа, некоторые системные механизмы

29

Размещено на http://www.allbest.ru

29

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ИНТЕРМИТТИРУЮЩАЯ (ПЕРИОДИЧЕСКАЯ) ГИПОКСИЯ: ПРИРОДА, НЕКОТОРЫЕ СИСТЕМНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

03.00.13 - физиология

СУХОВА Галия Керимовна

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в ФГОУ ВПО Санкт-Петербургском государственном университете

Научный консультант:

академик РАН Александр Данилович Ноздрачев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Нина Павловна Александрова

доктор медицинских наук, профессор Петр Дмитриевич Шабанов

доктор биологических наук, профессор Юрий Федотович Пастухов

Ведущее учреждение:

ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Ученый секретарь совета

доктор биологических наук,

профессор Н.П.Алексеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение гипоксии и ее последствий для организма занимает важное место среди проблем современной биологии и медицины. гипоксия сердечный сосудистый генетический гипертензия

В исследованиях гипоксических состояний традиционно рассматривались эффекты постоянной гипоксии, в том числе гипобарической. Однако, во многих своих проявлениях гипоксия может носить эпизодический характер. Болеее того, на начальных этапах сопряженных с гипоксией заболеваний она является не постоянной, а интермиттирующей (ИГ) или прерывистой. Особый интерес вызывает гипоксия, сопутствующая синдрому обструктивного апноэ/гипопноэ сна (ОАС), встречающемуся у 2-4 % населения (Yang et al., 1993) и характеризующемуся остановками дыхания (апноэ) длительностью более 10 секунд с частотой более 15 раз в час либо его ослаблением (гипопноэ) вследствие полного или частичного коллапса верхних дыхательных путей во время сна (Guilleminault, 1975; Бреслав, Ноздрачев, 2005, 2007).

Связанные с периодическими апноэ хроническая интермиттирующая гипоксия и повышенный уровень свободных кислородных радикалов рассматриваются как факторы нарушения регуляции автономного статуса организма, что ассоциируется с повышенным риском развития артериальной гипертензии, нарушений ритма сердца, инфаркта миокарда, инсульта и внезапной смерти во сне (Hung et al., 1990; Fletcher, 2000; Peppard et al., 2000; Phillips, Somers, 2002). Гипертония является наиболее частым следствием, встречающимся почти у 50% людей, страдающих от обструктивного апноэ сна (Law et al., 2002).

Апноэ недоношенных, обструктивные апноэ сна, бронхо-легочная дисплазия являются причинами интермиттирующей гипоксии у детей. Известно, что ранний онтогенез представляет собой критической период развития с повышенной восприимчивостью к внешним факторам, в том числе, интермиттирующей гипоксии, что может создать предпосылки для сердечно-сосудистой патологии взрослого периода. Однако потенциальная возможность таких последствий не была исследована. Данный вопрос тесно связан с изучением влияния ИГ на пластичность механизмов регуляции сердечно-сосудистой, а также других висцеральных систем организма, что важно для оценки адаптационных возможностей в условиях ИГ (Fletcher et al., 1992; Wilcox, 2002; Touyz, 2003, 2004; Zimmerman and Davisson, 2004; Hamilton et al., 2004; Zarubina, Nurmanbetova, Shabanov, 2005; Бреслав и Ноздрачев, 2005, 2007).

Важное теоретическое и практическое значение имеет понимание принципов действия ИГ на различных уровнях от молекулярного до поведенческого в контексте различных функциональных систем. Понятно, что такой фактор как оксидантный стресс на уровне организма, вызванный интермиттирующей гипоксией и опосредованный свободно-радикальными реакциями, может затрагивать частные и системные механизмы, определяющие функциональную целостность организма. Однако, на сегодняшний день не имеется единого представления о значении ИГ для состояния различных висцеральных систем. Настоящая работа представляет шаг в этом направлении и на примере исследования ряда регуляторных механизмов трех важнейших систем - сердечно-сосудистой, дыхательной (легочно-рецепторные рефлексы) и половой демонстрирует патогенетическую роль коротко-интервальной ИГ и ее конкретных механизмов.

Цель исследования: Дать концептуальную оценку роли интермиттирующей гипоксии в механизмах контроля висцеральных функций организма на примере сердечно-сосудистой, дыхательной и половой систем.

Были сформулированы следующие задачи:

1. Дать оценку последствиям пре- и постнатальной интермиттирующей гипоксии для системных механизмов контроля сердечно-сосудистой функции взрослых крыс (барорефлекторный парасимпатический контроль частоты сердечных сокращений).

2. Исследовать влияние постнатальной интермиттирующей гипоксии на симпатические рефлекторные и нейроэндокринные механизмы сердечно-сосудистого контроля (эфферентную активность почечного симпатического нерва, обмен катехоламинов норадреналина и дофамина в симпатических ганглиях, надпочечниках и каротидных тельцах у крыс Sprague-Dawley).

3. Исследовать сердечно-сосудистые эффекты постнатальной интермиттирующей гипоксии в контексте генетической модели гипертензии (спонтанно гипертензивные крысы).

4. Дать оценку роли легочно-рецепторных механизмов в кардио-респираторных реакциях на оксидантный стресс и свободно-радикальную активацию.

5. Исследовать роль интермиттирующей гипоксии для механизмов эректильной функции и паттернов поведенческой сексуальной активности у мышей in vivo c использованием новой авторской телеметрической модели.

Научная новизна. В работе впервые представлены свидетельства роли перинатальной интермиттирующей гипоксии в формировании сердечно-сосудистой патологии взрослых, что имеет особую важность в связи с высокой встречаемостью нарушений регулярного дыхания и оксигенации крови у новорожденных и детей раннего возраста. Показана роль неонатальной интермиттирующей гипоксии в нарушениях функциональной пластичности механизмов сердечно-сосудистого контроля, связанных с долгосрочными эффектами, затрагивающими барорефлекторный контроль сердечного ритма, симпатический баро- и хеморефлексы, ремоделирование проекций блуждающего нерва на сердце. Впервые приведена сравнительная оценка эффектов интермиттирующей и постоянной гипоксии на катехоламинэргические механизмы и показано, что хотя оба вида гипоксии достоверно повышают содержание дофамина и норадреналина в каротидных тельцах, эффекты интермиттирующей гипоксии являются более слабыми и отсроченными. Данный механизм интермиттирующей гипоксии может лежать в основе усиленного хеморецепторного входа и развития гипертензии (Benot and Lopez Barneo, 1990; Overholt and Prabhakar, 1999). Впервые показано, что фенотипически выраженные отсроченные повышения АД, связанные с неонатальной интермиттирующей гипоксией, имеют место при наличии генетической предрасположенности к развитию гипертензии, и что свободные кислородные радикалы и L-Са²⁺ каналы вовлечены в эти механизмы на ранних этапах онтогенеза. Миметики супероксиддисмутазы и блокаторы L-Са²⁺ каналов, примененные в раннем постнатальном периоде, могут быть эффективны в плане предотвращения гипертензивных последствий неонатальной интермиттирующей гипоксии.

Показано, что одним из механизмов нарушения барорефлекторной чувствительности у взрослых крыс вследствие ИГ является нарушение глутаматэргической трансмиссии с вовлечением НМДА рецепторов сердечных моторных нейронов nucleus ambiguus. Впервые продемонстрирована возможность прямой активации легочных рецепторов свободными кислородными радикалами (Н₂О₂), в ходе которой повышается центральная инспираторная активность, полностью угнетается возбуждение экспираторных мышц и отмечается небольшое повышение АД. Данные эффекты опосредованы волоконами в блуждающих нервах.

Впервые показано, что интермиттирующая гипоксия нарушает половую функцию, демонстрируя широкий диапазон влияний - от поведенческого до молекулярного уровня. ИГ снижает число спонтанных эрекций, подавляет психогенные эрекции и изменяет паттерны сексуального поведения. ИГ затрудняет расслабление сосудов в эректильной ткани и ее кровенаполнение вследствие повышения активности симпатических вазоконстрикторов, а также вследствие подавления образования еNOS протеина, влияющего на продукцию NO и расширение сосудов. Показана положительная роль тадалафила, ингибитора фосфодиэстеразы 5, в терапии эректильной дисфункции, вызванной ИГ.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа носит фундаментально-прикладной характер. Исследования эффектов коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии в экспериментальной модели обструктивного апноэ сна выявило их патогенетическую направленность, что было показано на примере трех висцеральных систем - сердечно-сосудистой (нарушения в механизмах контроля АД) , дыхательной (инспираторно-возбуждающие легочные рефлексы при отсутствии адекватного метаболического обеспечения) и половой (эректильная дисфункция, нарушение психогенных механизмов эрекций и полового поведения). Эффекты хронической коротко-интервальной ИГ связаны со снижением пластичности реакций ЦНС и периферических систем и носят дезадаптивный характер. Применение кислородного профиля, имитирующего нарушения дыхания и кислородо-транспортной функции по типу обструктивных апноэ, воспроизводило основные характерные признаки синдрома обструктивного апноэ сна - такие как гипертония, сердечная недостаточность, импотенция. Этот факт указывает на то, что ИГ является ведущим патогенетическим фактором данного состояния и превентивные меры по сохранению физиологических механизмов функций в первую очередь должны быть нацелены на коррекцию гипоксического статуса и устранение свободных кислородных радикалов.

Одним из важных теоретических результатов диссертационного исследования явилось представление концептуального положения о роли коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии в постнатальном программировании сердечно-сосудистой патологии - гипертонии и сердечной недостаточности взрослых. Эти эффекты имеют фенотипическое проявление, либо обнаруживаются в условиях острой ИГ и определяются усилением хеморефлексов и симпатической активности и снижением роли барорефлексов и блуждающего нерва в контроле сердечной деятельности. Результаты исследования позволяют отнести перинатальную периодическую гипоксию к числу факторов риска раннего программирования сердечно-сосудистой дисфункции. Примененные в работе миметики супероксиддисмутазы и блокаторы L-Са²⁺ каналов могут быть эффективны для предотвращения гипертензивных последствий неонатальной ИГ. Возможность долгосрочных последствий ИГ детского возраста нужно учитывать при анамнезе сердечно-сосудистых заболеваний у взрослых с целью правильной диагностики, выбора методов лечения и/или профилактики.

Во второй части работы при оценке роли легочных рецепторов в кардиореспираторных реакциях в условиях свободно-радикальной активации и использовании брадикинина было установлено, что афферентные импульсы от рецепторов легких могут проводиться в составе блуждающих нервов и других, не связянных с вагусом, висцеральных афферентов. Принадлежность чувствительных волокон к определенному проводнику определяет и соответствующие эфферентные компоненты рефлекторных ответов. Эти факты расширяют представление об афферентной системе легких и вносят вклад в теорию физиологии дыхания.

В третьей части работы показано, что ИГ, оксидантный стресс и свободные радикалы являются важнейшей причиной эректильной дисфункции, что может иметь прямое отношение к механизмам импотенции у мужчин при синдроме обструктивного апноэ сна. Учитывая, что психогенные механизмы эрекций чувствительны к ИГ, отсутствие либидо и недооцененность проблемы является одним из факторов, усложняющих диагностику нарушений сексуальной сферы при оксидантном стрессе.

Многосторонность последствий интермиттирующей гипоксии указывает на необходимость комплексного подхода и оценки терапевтических вмешательств при коррекции связанных с интермиттирующей гипоксией состояний.

В работе продемонстрирована применимость антиоксидантной терапии и блокады L-Са²⁺ каналов в целях минимизации или устрания связанных с ИГ проблем дисфункций в ряде висцеральных систем.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая коротко-интервальная интермиттирующая гипоксия изменяет структурно-функциональные характеристики автономных рефлекторных механизмов контроля сердечно-сосудистой функции.

2. Неонатальная интермиттирующая гипоксия является фактором программирования нарушений механизмов контроля артериального давления у взрослых крыс.

3. Свободно-радикальные реакции при оксидантном стрессе стимулируют рецепторный аппарат легких и вызывают рефлекторные изменения дыхания и повышение АД посредством системы блуждающих нервов.

4. Интермиттирующая гипоксия является фактором нарушения эректильной функции и паттерна половой активности у мышей.

Апробация работы. Experimental Biology Meeting, Washington DC, 1999; ALA/ATS International Conference, San Diego, CA 1999; Experimental Biology Meeting, Orlando, FL, 2001; Experimental Biology Meeting, San-Diego, CA, 2000; Experimental Biology Meeting, San Diego, CA, 2000; XXXIV International Congress of Physiological Sciences, Wellington, New Zealand, 2001; 16^th APSS Meeting, 2002; SFN Meeting, Washington, DC, 2002; 33^rd SFN Meeting, 2003, New Orleans, LA; 34^th SFN Meeting, San Diego, CA, 2004; 18^th APSS Meeting, Philadelphia, PA, 2004; Experimental Biology Meeting, Washington, DC, 2004; XXXV International Congress of Physiological Sciences, APS Meeting, San Diego, CA, 2005; SFN Meeting, Washington, DC, 2005; 19^th APSS Meeting, 2005; VI Всероссийская конференция с международным участием “Механизмы функционирования висцеральных систем”, CПб, 2008.

Исследования поддержаны персональным грантом National Institutes of Health USA/ National Research Service Award (2001-2004) Суховой Г.К.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ, включающих 14 статей из списка, рекомендованного ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из общего введения; описания основных методов (Глава 1); девяти глав результатов собственных исследований (Главы 2-10), каждая из которых включает литературную справку, описание использованных методических приемов, результаты, обсуждение и краткое резюме. Работа заключается одиннадцатью общими выводами и списком литературы, состоящим из 416 литературных источников. Работа изложена на 330 страницах, содержит 67 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе были использованы крысы линий Sprague-Dawley, спонтанно гипертензивные крысы (SHR), крысы Fisher 344, мыши C57BL/6 и кролики New Zealand White. При проведении хирургических процедур у крыс и мышей применяли нембуталовый наркоз (50 мг/кг) ?В острых экспериментах у кроликов применяли нембутал (35 мг/кг) с последующим переходом на смесь 1% б-хлоралозы и 10% уретана (1.6мл/час). В эхокардиографических обследованиях крыс использовали кетамин (22 мг/кг в/м) и ксилазин (2.7 мг/кг в/м).

Интермиттирующая гипоксия. Животных подвергали действию ИГ в камерах (Oxycycler A44XO; Biospherix, Redfield, NY, USA), снабженных системой компьютеризированного контроля подачи N2 и воздуха для поддержания в них уровня О2 в соответствии с заданным профилем (F_IO2 8 %, 90 сек, сменяющиеся F_IO2 = 21%., 90 сек , 12 часов в день с 7 до 19 часов). Остальное время F_IO2 = 21%. Профиль оксгенации/деоксигенации имитировал условия обструктивного апноэ во сне у животных (экспериментальная модель ОАС, Fletcher et al, 1992). Уровень СО₂ соответствовал 0.03% , температура в камере - 22-24єС. Продолжительность хронической интермиттирующей гипоксии составляла 30-35 дней, острой -18 мин.

Электрофизиологические исследования. Электрическую активность симпатического, диафрагмального нервов и электромиограмму мышц живота регистрировали с помощью биполярных платиновых и игольчатых металлических (миограмма) электродов, соединенных с высоко импедансным устройством входа (Grass Instruments). Сигналы были усилены (дифференциальный усилитель, модель 511, Grass Instruments, пропущены через фильтр (30-3000 Гц) и проинтегрированы (1/RC=50 мс; Grass P10F кумулятивный интегратор), записаны с помощью полиграфа (Grass, модель 7; Astro-Med, Dash IV) Аналоговые сигналы оцифровывали (Buxco Electronics) для последущего анализа.

Измерения артериального давления и ЧСС. 1) В острых экспериментах у крыс при исследовании барорефлексов и у кроликов АД регистрировали в бедренной артерии. Использовали преобразователь давления и усилители (Grass, модель 7; модель P23db; Statham Laboratories, Hato Rey, Puerto Rico или Buxco Electronics, Troy, NY) и полиграф Astro-Med, Dash IV. ЧСС измеряли тахографом (модель 7Р4Н, Grass Instrument, Quincy, MA). 2) Для регистрации АД, ЧСС и ЭКГ у свободно перемещающихся крыс в бодрствующем состоянии и во время сна применяли телеметрию (Data Sciences Int. Inc., St. Paul, MN, USA). 3)Неинвазивные измерения АД и ЧСС в серии онтогенетических исследований у бодрствующих крыс производили в хвостовой артерии с помощью окклюзионной и плетизмографической манжеток и компьютеризированной системы обработки сигнала (CODA2; Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA).

Исследование барорефлекторной функции. Барорефлекторная чувствительность - интегральный показатель статуса автономной системы контроля АД. Чувствительность барорефлекторного механизма, контролирующего ЧСС, а также активность почечного симпатического нерва, определяли при в/в введении фенилэфрина и нитропруссида натрия (6-12 мкг/мин; 1-2 мин). Определяли ЧСС - исходные и на уровне плато реакции АД. Показатели ДЧСС и ДАД усредняли по данным 2-3 измерений отрицательных и положительных хронотропных эффектов соответственно для каждого животного. Определяли изменения амплитуды интегрированной за 1 с активности нерва при смещениях АД на величины ±25 и ± 50 мм рт.ст. По результатам измерений для каждой группы экспериментальных животных расчитывали уравнения регресcии у=ах+в (Origin 6.0), где коэффициент а (наклон линии регресии; уд/мин мм рт.ст.) характеризовал барорефлекторную чувствительность (Kent et al., 1972).

Исследование вариабельности сердечного ритма Проводили спектральный анализ длительностей R-R интервалов, полученых на основе телеметрической записи ЭКГ у крыс Sprague-Dawley и SHR, на основе частотного домена. Делали 5-ти минутные записи ЭКГво время сна животных. R-R интервалы ЭКГ выделяли при помощи программы «Анализ» основного программного пакета (DSI), переводили в текстовый формат (ASCII) и экспортировали в программу анализа ВСР (Университет Куополо, Финляндия). Программа позволяла провести параметрический (ауторегрессивный) анализ наряду с непараметрическим (быстрые преобразования Фурье) и вычислить пиковые частоты и мощности частотных компонентов - ОНЧ (очень низкие частоты; 0,004-0,05 Гц), НЧ (низкие частоты; 0,05-0,15 Гц) и ВЧ (высокие частоты; 0,15-0,35 Гц), а также соотношение мощностей НЧ/ВЧ. Показатели ВСР исследовали у взрослых Sprague-Dawley а также у спонтанно гипертензивных крыс, подвергавшихся в постнатальном онтогенезе действию интермиттирующей гипоксии.

Телеметрия. Применяли систему Dataquest® A.R.T. Gold (Data Science International, Inc., St. Paul, MN, USA) для регистрации АД, ЧСС и ЭКГ у крыс и давления в bulbus penis у мышей в условиях свободного перемещения животных. Cистема включала референтный монитор внешнего давления (APR-1), устройство обмена данных (Data Exchange Matrix), воспринимающие устройства (RPC-1), на которых располагались индивидуальные контейнеры с животными. Телеметрические датчики моделей DSI PhysioTel® и ТА11С50-РХТ и ТА11PA-C40 (для крыс) размещали внутрибрюшинно, кончик катетера для измерения АД располагали в аорте. Электроды для ЭКГ, связанные с телеметрическим трансмиттером, подкожно подшивали к участкам тела в соответствии с положением 2-го стандартного отведения.

Для исследования половой функции у мышей использовали оригинальную авторскую модель телеметрии эректильной функции in vivo. Трансмиттер ТА11РА-С20 располагался внутрибрюшинно, кончик катетера для измерения давления при эрекциях полового члена мыши вводили в bulbus penis. Исследовали давление в ходе спонтанных эрекций, а также в поведенческих тестах с самками (контактных и бесконтактных). Проводили непрерывный мониторинг спонтанных эрекций 2 дня/нед в условиях хронической ИГ в течение 8 недель. Контактные и бесконтатные тесты с самками проводили через 5-8 недель применения ИГ. В условиях ИГ исследовали влияние на половую функцию тадалафила (Сialis; 0.014мг /25г веса тела мыши, что соответствует 40 мг/70кг веса человека; Eli Lilly , Indianapolis).

Конфокальная микроскопия. Для морфологического исследования эфферентных окончаний блуждающего нерва в правом предсердии крысам была сделана серия унилатеральных инъекций трейсера родамина (№ 3886; Molecular Probes, Eugene, OR) в nucleus ambiguus (NA) в девяти точках (-1,600 до + 1,600 мкм, с шагом 400 мкм; общий объем 22.5-112.5 нл). Флюорохром (1 мл, 2мг/мл в/б; Fluoroсhrome LLC, Denver, Co) был введен для контрастной окраски клеток интрамуральных предсердных ганглиев. Количественно оценивали эфференты блуждающего нерва с помощью конфокального микроскопа Lieca и цифровой системы оценки параметров изображения Neurolucida (MicroBright Field, Colchester, VT, USA).

Исследования содержания катехоламинов в плазме крови, нейроэндокринных тканях и симпатических ганглиях. Содержание катехоламинов - адреналина и норадреналина, а также дофамина, дигидроксифенилуксусной кислоты и 5-гидрокситриптамина в экстрактах каротидных телец, краниального шейного симпатического ганглия и надпочечников у крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Исследование ферментов синтеза катехоламинов в экстрактах каротидных тел, надпочечников и краниального шейного симпатического ганглия. Экспрессию тирозин гидроксилазы и ее фосфорилированных форм, дофамин-гидроксилазы, фениэтаноламин N-метилтрансферазы и ГТФ циклогидролазы-1 определяли методом иммуноблота (Western Blot).

Cтатистика. Применяли общепринятые методы вариационной статистики, результаты варажали как среднее ± m. При оценке различий использовали парный и непарный тест Стьюдента-Фишера, тест ANOVA, тест Wilcoxon'a, регрессионный анализ, спектральный анализ сердечного ритма. Различия считали статистически значимыми при P<0.05. Использовали пакеты программ DSI Analysis (DSI, St. Paul, MN), Buxco Analysis (Buxco Electronics Inc., Troy, NY), Мicrosoft Excel, Origin 6.0 (OriginLab Corp.,Northampton, MA), Neurolucida (MBF Neuroscience, Сolсhester, VT), SoftMax Pro (GMI, Inc, Ramsay, MN).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пре- и постнатальная интермиттирущая гипоксия и сердечно-сосудистая функция

1.1 Барорефлекторная чувствительность взрослых крыс после перинатальной интермиттирущей гипоксии

Барорефлекс представляет собой механизм поддержания постоянного АД, определяемый активностью барорецепторов при колебаниях АД. Его механизм включает афферентное звено (барорецепторы), центральное звено (ядро nucleus ambiguus и симпатические центры, связанные с ростральной вентролатеральной медуллой), эфферентные блуждающие нервы и симпатические вазоконстрикторы и эффекторные органы - сердце и сосуды. Чувствительноть барорефлекса - интегральный показатель, отражающий статус механизмов контроля сердечно-сосудистой функции.

Парасимпатическая иннервация сердца играет ведущую роль в рефлекторной регуляции ЧСС в покое. Отсроченные сердечно-сосудистые эффекты перинатальной интермиттирующей гипоксии изучали на крысах Sprague-Dawley, которых подвергали действию гипоксии в постнатальные дни 1-30 или пренатальные гестационные дни 5-21 (беременные крысы). Барорефлекторную чувствительность (БРЧ) и сердечные хронотропные эффекты измеряли в возрасте 3.5 - 5 мес у анестезированных животных, при в/в введении фенилэфрина и нитропруссида натрия (6-12 мкл/мин, 1-2 мин). Контролем служили животные, постоянно содержавшиеся в условиях нормоксии. БРЧ измеряли до и после применения 18 - мин острой ИГ. Постнатальная ИГ приводила к нарушению (снижению) барорефлекторной чувствительности у взрослых крыс, которая, по сравнению с контрольными, была наполовину ниже в покое и не изменялась после острой ИГ (Рис. 1). У контрольных животных после острой гипоксии БРЧ снижалась на 42% (Р<0.05). Реакция ЧСС на введение фенилэфрина у крыс с постнатальной ИГ была меньше, чем у контрольных (Р<0.05) и не изменялась после острой ИГ.

Рис. 1. Барорефлекторная функция 3.5-5-месячных крыс, выращенных в условиях нормоксии (контроль), постнатальной и пренатальной интермиттирующей гипоксии (n=6/группу).

Барорефлекторная чувствительность у крыс с пренатальной ИГ была сходной с величинами у контрольных крыс (Рис. 1), однако хронотропные влияния на сердце были снижены. Представленные данные свидетельствут о долгосрочных последствиях интермиттирующей гипоксии перинатального периода для контроля сердечно-сосудистой функции.

1.2 Исследование проекций блуждающего нерва к сердцу

Нейроморфологичекие исследования эфферентных проекций вагуса к сердцу при введении родамина в левый nucleus ambiguus у крыс показали, что пучок эфферентных волокон блуждающего нерва в предсердном ганглии формирует гроздь окончаний, обхватывающих ганглионарные нейроны множеством варикозных терминалей наподобие корзинки. В отличие от контрольных животных, меченые родамином корзинчатые окончания у крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ представлены более редко. Вставки на левой панели B (нормоксия) и правой панели A (ИГ) представляют собой составленные с помощью программы Neurolucida изображения-реконструкции корзинчатых окончаний вокруг нейронов, показанных стрелкой (Рис. 2).

.

Рис. 2. Примеры конфокальных изображений иннервации ганглионарных клеток предсердий у 2-месячных крыс - контрольной (правые панели) и после 30-дневной постнатальной интермиттирующей гипоксии (левые панели). Шкала: 50 мкм.

ИГ в первые 35 дней постнатальной жизни вызвала у 2-месячных крыс уменьшение числа корзинчатых контактов на 17% (Р<0.001) и число варикозных окончаний аксонов вагуса на 56% (Р<0.001) по сравнению с контролем. Такие изменения эфферентной иннервации сердца могут определять барорефлекторные дефициты и лежать в основе долгосрочных модификаций барорефлекторной функции, обусловленных постнатальной интермиттирующей гипоксией.

1.3 Влияние интермиттирующей гипоксии на центральные механизмы барорефлекса

У взрослых крыс Fischer 344, подвергавшихся 30-55 - дневной ИГ, микроинъекции L-глутамата (10мМ; 20 нл) в область nucleus ambiguus вызывали менее выраженные снижения ЧСС, чем у контрольных крыс. Электрическая стимуляция дистального участка перерезанного блуждающего нерва (1-30 Гц, 0.5 мА, 20с) у крыс после ИГ показала уменьшение времени достижения 50% максимального хронотропного эффекта по сравнению с контролем, что позволяло исключить возможность нарушений кабельной функции нерва и указывало на изменения в центральных нейротрансмиттерных механизмах ядра вагуса как на причину снижения барорефлекторной чувствительности. Действительно, показано, что ИГ приводит к эксайтотоксичности глутамата, что может нарушать НМДА-рецепторно-Са²⁺канальцевые комплексы на мембранах нейронов, приводя к усилению поступления Са²⁺ в клетку и последующей ее гибели (Ikonomidou et al., 1999). Количественная оценка окрашенных по Нисслю преганглионарных кардиомоторных нейронов nucleus ambiguus на 5 корональных срезах продолговатого мозга показала достоверное снижение их числа у крыс после ИГ (Таблица 1).

**, P<0.01; *, P<0.05 при сравнении с контрольными (среднее ± m). Срезы мозга относительно obex.

1.4 Интермиттирующая гипоксия и симпатические механизмы контроля АД

Каротидные хеморецепторы, реагирующие на гипоксию, связаны с механизмами контроля активности симпатической нервной системы и продукции катехоламинов мозговым веществом надпочечников. Были исследованы отсроченные эффекты постнатальной ИГ на показатели активности симпатической нервной системы.

У взрослых крыс, подвергавшихся ИГ в первые 30 дней постнатальной жизни, и контрольных не было различий в коцентрации катехоламинов (норадреналина и адреналина) в плазме крови. При регистрации активности почечного симпатического нерва в условиях 18-мин острой ИГ отмечалось изменение амплитуды сигнала нерва , которое модулировалось меняющимся хеморецепторным входом. Амплитуда сигнала в нерве на протяжении действия острой ИГ в нормоксических и гипоксических эпизодах превышала фоновую (Рис. 3, левая панель). У крыс, подвергавшихся неонатальной ИГ, реактивность симпатического нерва на оксидантный стресс - острую ИГ была повышенной. У этих крыс увеличение фоновой амплитуды более чем на 30% происходило в 3 раза чаще, чем у контрольных крыс, при этом она сохранялось повышенной в течение не менее десятка мин после окончания стимула, что свидетельствует об измененной пластичности ответов. Управление активностью симпатического нерва посредством барорефлекторного механизма сразу после применения острой ИГ изменялось (Рис. 3, правая панель). Полученные путем регрессионного анализа характеристики ответов представлены в виде графиков, описываемых уравнениями: Контрольные крысы: y= -2.71x+57.5 (острая ИГ); y= -1.18x+1.97 (нормоксия); ИГ (крысы, подвергавшиеся 30-дневной постнатальной ИГ): y= -1.26x-10.2 (острая ИГ); y= -1.38x-11.5 (нормоксия). Барорефлекторная чувствительность (в уравнениях - это коэффициент при х) у контрольных крыс после острой ИГ повышалась (Р<0.01), однако у крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ она не изменилаcь при том, что фоновая активность почечного симпатического нерва была повышена. Эти данные свидетельствуют о долгосрочных прогипертензивных изменениях в системе симпатического контроля АД у данных нормотензивных крыс.

1.5 Обмен катехоламинов в звеньях автономной дуги в условиях ИГ

Применение ИГ у взрослых крыс в течение 35 дней приводит к повышению АД (Fletcher et al., 1992). Механизмы симпатоактивации контролируются ИГ при непоседственном участии хеморецепторов. Для исследования влияния ИГ на автономную дугу, включающую каротидные хеморецепторы, надпочечники и симпатические ганглии был проведен анализ содержания катехоламинов - норадреналина и дофамина, а также фермента их синтеза тирозингидроксилазы и фосфорилирования ее участков Ser19, Ser31,Ser40. Сравнение с эффектами постоянной гипоксии показало более выраженную латентность и меньший уровень синтеза катехоламинов в каротидных тельцах в условиях ИГ (Рис. 4). Данные показатели могут восить вклад в усиление хеморецепторного входа при ИГ, так как катехоламины в каротидных тельцах подавляют их активность (Overholt and Prabhahar,1999). Роль симпатических ганглиев, равно как и надпочечников, в синтезе биогенных аминов в условиях ИГ была незначительной. Усиление хемоафферентных влияний, определяемое ИГ, может посредством повышения активации симпатической нервной системы приводить к гипертензивным состояниям у взрослых.



Рис. 3. Изменения в фоновой активности почечного симпатического нерва у крысы, подвергавшейся неонатальной ИГ: эффект острой ИГ (левая панель); барорецепторный контроль активности почечного симпатического нерва после острой ИГ (правая панель).

Ср АД - среднее артериальное давление; АПСН - электрическая активность почечного симпатического нерва, интегрированная за секунду. Изменения активности почечного симпатического нерва (% от фона) для каждой крысы были расчитаны при сдвигах АД от среднего на ±25 и ±50 мм рт.ст.

1.6 Постнатальная интермиттирующая гипоксия и гипертензия

Перманентные нарушения в контроле ЧСС, определяемые нарушениями в центральном, вагусном и симпатических механизмах контроля сердечно-сосудистой функции, являются показателем снижения пластичности нервных механизмов контроля АД и уменьшения компенсаторных возможностей в покое и при острой ИГ. Интересным наблюдением было то, что указанные изменения прогипертензивной направленности в барорефлекторных механизмах у взрослых крыс Sprague-Dawley, подвергавшихся ИГ в раннем постнатальном периоде, тем не менее, не привели к повышению АД (Рис. 5). Для оценки возможности гипертензивных последствий постнатальной ИГ были использованы спонтанно гипертензивные крысы (SHR) - модель генетической гипертонии. ИГ, примененная у SHR с 4-го по 30-ый дни жизни явилась пусковым стимулом в развитии более выраженного гипертензивного статуса в постнатальном онтогенезе (Рис. 5). Эхокардиографическое исследование левого

Рис. 4. Эффекты 14-дневной постоянной и интермиттирующей гипоксии на концентрацию в каротидном тельце дофамина (A), норадреналина (B), дигидроксифенилуксусной кислоты (C) и серотонина (D).

Среднее±m, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (нормоксические пробы: n =6; гипоксические пробы: n=15).

Рис. 5. Изменение систолического давления в постнатальном онтогенезе у крыс Sprague-Dawley и SHR (среднее±m).

(1) SHR (n=5) и (3) Sprague-Dawley (n=6), подвергавшиеся неонатальной интермиттирующей гипоксии в первые 30 дней жизни (пунктирная линия); (2) Контрольные SHR (n=6) и (4) Sprague-Dawley (n=7), развивались в нормоксии. * - Р<0.001 для соответствующих значений на графиках 1 и 2. SHR - спонтанно гипертензивные крысы.

желудочка у крыс, перенесших постнатальную ИГ, выявило ремоделирование сердца по концентрическому типу - гипертрофию левого желудочка (Табл. 2).

Одним из информативных методов оценки тонуса вегетативной нервной системы является анализ вариабельности сердечного ритма. Спектральный анализ R-R интервалов ЭКГ во время сна у спонтанно гипертензивных крыс, показал увеличение отношения спектральной мощности низкочастотного и высокочастотного компонентов (НЧ/ВЧ) в 1.4 раза (P<0.01) у крыс, подвергавшихся постнатальной хронической ИГ по сравнению с контрольными. Так как НЧ компонент ассоциирован с симпатическим, а ВЧ - с парасимпатическим отделом нервной системы (Task force of the ESC and NASPE, 1996), повышение соотношения спектральной мощности НЧ/ВЧ указывает на повышенный тонуса симпатической нервной системы в покое у SHR после ИГ по сравнению с контролем. Это могло определять повышенное систолическое и диастолическое давление у данной группы крыс во время сна, достоверно не отличавшееся от значений АД во время бодрствования. Достоверного изменения мощности НЧ/ВЧ компонентов спектра у нормотензивных крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ, не наблюдалось. Таким образом, существенно возросший тонус симпатической нервной системы в покое после неонатальной ИГ присутствовал у взрослых SHR, но не у крыс Sprague Dawley, что могло определяться генетически.

Примененные в неонатальном периоде одновременно с протоколом ИГ фармакологические методы коррекции гипертензии с использованием миметика

Рис. 6. Изменение АД в онтогенезе SHR после неонатальной интермит-тирующей гипоксии.

Крысы находились постоянно в условиях нормоксии (К, контроль) либо интермиттирующей гипоксии с 4-го по 30-ый день жизни (ИГ). Крысы К и ИГ получали один из видов инъекций: полиэтиленгликоль (К), миметик супероксиддис-мутазы [Mn(III) Tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin pentachloride] - MnTMPyP пентахлорид 10 мг/кг в сут (СОДм) или блокатор L-Ca²⁺ каналов нифедипин 5мг/кг в сут. Данные представлены как среднее ± m; n=8/ группу; *P< 0.001 при сравнении с соответствующими величинами систолического давления в других группах.

супероксиддисмутазы, блокирующего свободно-радикальные реакции и нифедипина,

антигипертензивного агента, блокирующего L-Са²⁺ каналы, обеспечило нормализацию систолического и диастолического АД и только частичное восстановление сердечной функции с большим компенсаторным участием нифедипина (Рис. 6; Табл. 2).

Таким образом, у генетически предрасположенных к гипертензии крыс, присутствие ИГ в раннем онтогенезе является пусковым фактором для развитии долговременных отсроченных эффектов или “программирования “ выраженной гипертензии, что связано с активацией L-Са²⁺ каналов сердечно-сосудистой системы в условиях оксидантного стресса. Сигнальные механизмы, вовлеченные в изменения сердечной функции в условиях оксидантного стресса, моделирующего обструктивное апноэ сна, могли приводить к последствиям, имеющим необратимый характер, что при указанном синдроме проявляется в виде сердечной недостаточности, ишемической болезни, инфарктов миокарда.

2. Влияние свободно-радикальной активации рецепторов легких на кардио-респираторную функцию

В условиях оксидантного стресса, вызываемого ИГ, продукция свободных кислородных радикалов (О₂?, Н₂О₂, и ·ОН) повышена. В целях исследования



Среднее ± m; Обозначения групп как на Рис. 6; КСД - конечно-систолический диаметр левого желудочка сердца; КДД - конечно-диастолический диаметр левого желудочка; Тзслж - толщина задней стенки левого желудочка сердца; Тпслж - толщина передней стенки левого желудочка сердца; ОТслж - относительная толщина стенки левого желудочка сердца; ФУ - фракционное укорочение; V_cf - средняя скорость циркулярного сокращения волокон левого желудочка. *P<0.001; †P<0.01; ‡P<0.05; НД - не достоверно.

возможности их влияния на рецепторный аппарат легких и индуцирование кардиореспираторных рефлексов проводили прямое введение Н₂О₂ (1 µмоль в 0.1 мл 0.9% NaCl) в периферические участки легких у искусственно вентилируемых кроликов со вскрытой грудной клеткой. Такая техника, в отличие от традиционного введения веществ через малый круг кровообращения, обеспечивает стимуляцию рецепторных образований легких и исключает возникновение других рефлексов из сердечно-сосудистой системы или с хеморецепторов.

Н₂О₂ приводила к усилению центральной инспираторной активности (Рис. 7), выражавшейся в увеличении амплитуды и частоты вспышек дыхательных разрядов в нейрограмме диафрагмального нерва, и угнетала активнсть экспираторных мышц. Интересно, что реакция на Н₂О₂ была сходна с ранее описанной реакцией на местную инъекцию 0.1 мл 8.1% NaCl (Yu et al., 1998), оказывающей влияния исключительно через механизм блуждающего нерва путем деполяризации его рецепторных окончаний. Латентный период ответов составил 2-10 с. Влияния Н₂О₂ на среднее артериальное давление было слабым. АД в среднем повышалось на 5.5 ± 0.7 и 6.7 ± 0.6 мм рт.ст., соответственно, в ответ на инъекции Н₂О₂ и 8.1% NaCl (n = 20; p < 0.01). Эффекты Н₂О₂ и 8.1% NaCl устранялись билатеральной ваготомией (n=5). Таким образом, рецепторы легких в условиях свободно-радикальной активации не оказывают симпато-активирующих влияний, а их роль ограничивается пределами участия блуждающих нервов. Сопоставление эффектов Н₂О₂ и классического медиатора воспаления брадикинина (20µМ в 0.1 мл NaCl 0.9%; В6026, Sigma), вводимого локально в легкое, показало разнообразие дыхательных и гемодинамических эффектов и их сочетаний под действием брадикинина. Наиболее типичным было снижение АД, повышение тонуса экспираторных мышц, усиление центральной инспираторной активности с резким укорочением длительности вдоха и выдоха и характерной динамикой развития ответа (латентный период составлял 14 с, max амплитуда ЭНГ достигалась через ~ 40 c) (Рис. 8).

.

Рис. 7. Одинаковые дыхательные и гемодинамические реакции на инъекцию 0.1 мл 8.1% NaCl (верхняя панель) или 1 мкмоль Н₂О₂ (нижняя панель) в периферическую область правого легкого у анестезированных искусственно вентилируемых кроликов с открытой грудной клеткой.

ЭНГ - электронейрограмма левого диафрагмального нерва; ? ЭНГ - интегрированная электронeйрограмма; Pтр - давление в трахее; АД - среднее артериальное давление. Три отметки наверху указывают на моменты введения иглы в легкое, начало и окончание инъекции.

Рис. 8. Пример типичного дыха-тельного и сердечно-сосудистого эффектов брадикинина.

Обозначения - как на Рис.7.

Эффекты брадикинина определялись волокнами проводников двух видов - вагуса и невагусных висцеральных нервов. Снижение АД под действием брадикинина было связано с уменьшением активности симпатических нервных волокон. Эффект сохранялся после ваготомии (Рис. 9). Рецепторы легких, таким образом, в условиях их активации свободными кислородными радикалами не играют контролирующей роли в отношении симпатической нервной системы. Рефлекторные реакции в этих условиях осуществляются только через блуждающие нервы.

Рис. 9. Активность волокон почечного симпатического нерва (АПСН) в ответ на локальную инъекцию брадикинина (1 мкг в 0.1 мл 0.9% NaCl) в легочную паренхиму до (A) и после (B) шейной билатеральной ваготомии у кролика.

Обозначения - как на Рис. 7.

3. Исследование эффектов интермиттирующей гипоксии на эректильную функцию и половое поведение у мышей методом телеметрии

У взрослых мышей с имплантированными в bulbus penis телеметрическими датчиками исследовали эректильную и половую поведенческую активность после 5-8 недель ИГ и последущего применения тадалафила (Табл. 3; Рис. 10). Тадалафил (Сialis), стимулятор эректильной функции, ингибирует фосфодиэстеразу 5 и повышает уровень цГМФ, необходимого для нормальных эрекций.

ИГ вызвала снижение числа спонтанных эрекций на 40% через 1 неделю, которое сохранялось в течение всего периода ИГ и оставалось ниже фонового уровня после 6 недель нормоксии. Нарушения были компенсированы тадалафилом. Это может свидетельствовать.о вовлечении быстрого нервного механизма подавления спонтанных эрекций.

Под влиянием 30 -дневной ИГ существенно изменилась поведенческая активность мышей в контактных тестах с самками (Рис.10). Применение тадалафила у мышей после ИГ восстанавливало поведенческий паттерн (Рис. 10).

ИГ достоверно снижала пики давления в bulbus penis, регистрируемые в ходе 20 мин бесконтактного теста с самками, что указывало на резкое снижение психогенной сексуальной активности (Рис.11). Тадалафил, примененный в этом тесте, существенно ее повышал (Рис. 11).



Рис.10. Латентные периоды для садок (С), интромиссий (И), эякуляции и индекс И/(С+И), измеренные во время контактных тестов с самками.

К - контроль (нормоксия), ИГ - интермиттирующая гипоксия; Тадалафил был использован в дозе 0.014 мг/25г веса тела; n=6/группу.* - P<0.001 ИГ и ИГ+ тадалафил; † - ИГ и К. ИГ=8 недель.

Рис. 11. Эффекты хронической периодической гипоксии и тадалафила на число пиков давления (80-120 мм рт.ст. и длительностью 0.4-0.5 с), зарегистри-рованных у самцов мышей в bulbus penis при бесконтактных тестах с самками.

Одной из важных причин ухудшения эректильной функции было влияние ИГ на функцию эндотелия сосудов полового члена, где было обнаружено снижение еNOS-протеина, что снижало продукцию NO и нарушало вазодилятацию и кровенаполнение полового члена (Рис. 12). Повышение активности симпатических нервных волокон, показанное при ИГ, также способствует вазоконстрикции и снижению эректильной функции.

Рис. 12. Влияние хронической интермиттирующей гипоксии на содержание изоформ NO-синтазы в эректильной ткани мыши.

А - Примеры иммуноблота для контрольной (К) мыши и мыши после 8 недель ИГ. Для количественной стандартизации проб был использован в-актин и моноклональные антитела. В - Количественная оценка иммунореактивности в эректильной ткани, полученной от мышей, находившихся в условиях нормоксии и периодической гипоксии. Иммунореактивность выражена в средних денситометрических единицах, откорректированных по в-актину (относительные единицы); eNOS (эндотелиальная NO-синтаза) - пустые столбики, nNOS (нейрональная NO-синтаза - серые столбики, iNOS (индуцируемая NO-синтаза) - черные столбики. К - контроль (нормоксия); ИГ- интермиттирующая гипоксия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интермиттирующая гипоксия является фактором, сопутствующим обструктивному апноэ сна и другим нарушениям дыхания, которые могут встречаться в онтогенезе в разные его периоды. Нарушения дыхания во сне связывают с сердечно-сосудистой патологией, наиболее частыми проявлениями которой являются системная артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность. В целях моделирования нарушений дыхания по типу периодического обструктивного апноэ была предложена модель, основанная на использовании интермиттирующей, или прерывистой, коротко-интервальной гипоксии (Fletcher, 1992). Данная модель была применена в настоящем исследовании с целью изучения последствий ИГ для функциональных характеристик висцеральных систем на примере сердечно-сосудистой, дыхательной (легочно-рецепторная функция) и половой.

Результаты исследований показали, что влияния коротко-интервальной интермиттирующей гипоксии носят дисфункциональный и дезадаптивный характер, способствуя инициированию хронических перманентных изменений в различных звеньях механизмов регуляции висцеральных систем организма.

В работе исследовались вопросы влияния ИГ на пластичность механизмов контроля висцеральных функций, которые рассматривались, в том числе, и в онтогенетическом аспекте. Среди изучаемых вопросов были долгосрочные последствия пренатальной и постнатальной ИГ и возможность программирования сердечно-сосудистой патологии взрослого периода. Исследования, проведенные на крысах, подвергавшихся 30-дневному воздействию ИГ в раннем постнатальном периоде, показали ряд нарушений контроля сердечно-сосудистой функции, которые уже в возрасте 3.5-5 мес, соответствовали показателям более старых животных (18-20 мес). Барорефлекторная чувствительность, как интегральный показатель статуса механизмов регуляции сердечно-сосудистой функции, был снижен у животных с постнатальной ИГ на 50%, причем эти изменения носили перманентный характер. Снижение барорефлекторной чувствительности могло объясняться изменениями в различных звеньях барорефлекса, в частности, снижением под влиянием ИГ числа эфферентных парасимпатических волокон и варикозных окончаний на ганглионарных клетках правого предсердия. Другой выявленной причиной нарушения механизмов барорефлекса под действием хронической ИГ явилась гибель части кардиомоторных нейронов в nucleus ambiguous и снижение глутаматергической трансмиссии в этом ядре. У крыс, подвергавшихся постнатальной ИГ, отмечалась повышенная индуцируемость активности почечного симпатического нерва при острой ИГ, происходившая одновременно со снижением барорефлекторного контроля симпатической активности. Была показана роль усиленного хеморецепторного входа в этих реакциях. Эти факты ясно указывают на про-гипертензивную направленность механизмов коротко-интервальной ИГ.

Однако, следует подчеркнуть, что применение ИГ в неонатальном периоде имело гипертензивные последствия только у крыс, с генетической предрасположенностью к гипертензивному статусу. Данная реакция у спонтанно гипертензивных крыс была обусловлена устойчивым повышением симпатической активности в покое и во время сна, что выявлено при спектральном анализе вариабельности сердечного ритма. Повышенному уровню гипертензии сопутствовала выявленная эхокардиографически дисфункция левого желудочка.

Оценивая регулирующую роль рецепторов легких в условиях оксидантного стресса важно отметить, что рецепторный аппарат легких при активации его свободными радикалами не обнаружил связи с повышением активности в симпатических нервах. Реакцией рецепторов легких являлась опосредованная исключительно блуждающим нервом рефлекторная стимуляция центральной инспираторной активности, угнетение экспираторной активности мышц и несильно обозначенная тенденция к гипертензивным эффектам. Таким образом, можно полагать, что в условиях ИГ ведущей причиной активации симпатической нервной системы остаются рефлексы с каротидных телец. Действительно, в ходе 18- минутной острой ИГ было показано модулирование активности в почечном симпатическом нерве в соответствии с изменяющейся активацией хеморецепторов с последующим длительным эффектом последействия.

...