Теломерный механизм клеточного старения

Размещено на http://www.allbest.ru/

ТЕЛОМЕРНЫЙ МЕХАНИЗМ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ



Оглавление

Введение

Глава 1. Современные концепции старения

1.1 Молекулярно - генетическая теория

1.2 Мутационная теория

1.3 Теломерная теория А.М. Оловникова

Глава 2. Структура и функции теломер клеток

2.1 Длина теломер у растений

2.2 Длина теломер у животных

2.3 Длина теломер у людей

2.4 Длина теломер у птиц

Глава 3. Короткие теломеры

3.1 Функции теломерного аппарата в развитии процессов старения

3.2 Функции теломеразного комплекса и механизмы его регуляции

Глава 4. Методы анализа длины теломер

Глава 5. Влияние уровня физической активности на длину теломер и активность теломеразы

Глава 6. Роль фармакологических препаратов в удлинении теломер

Заключение

Список литературы



Введение

Старение необратимый биологический процесс. Веками философы обсуждали причины процесса старения, алхимики искали элексир вечной молодости. Понятия о причинах и механизмах старения менялись. Так, в начале этого века Алексис Каррель - известный специалист по культуре клеток, хирург, лауреат Нобелевской премии - описал эксперимент, поставленный, чтобы показать возможность последовательного и неограниченно долгого размножения в культуре фибробластов (фибробласт - клетка из семейства соединительных клеток, она может при необходимости превратиться в хрящевую, костную, жировую или гладкомышечную клетку), полученных из сердца цыпленка. Рост культуры был произвольно прекращен экспериментаторами через 34 года. Это открытие вызвало интерес во всем мире. (Анисимов В.Н. 2008)

Важность открытия о бессмертии культивируемых клеток цыпленка была ясна для биогеронтологов. Если считать этот факт установленным, он позволяет предполагать, что клетки, выпущенные из-под управления живым организмом, имеют потенциальную способность нормально размножаться и функционировать в течении периода, превышающего продолжительность жизни вида ( максимальная зарегистрированная длительность жизни кур - 12 лет.) Это означает, что старение должно быть результатом физиологических взаимодействий между клетками только при их объединении в ткани или в органы. Результаты исследований Карреля и их интерпретация были чрезвычайно важны для биогеронтологов, так как явно предполагали, что старение не является результатом процессов, происходящих на клеточном уровне. В течение нескольких лет после появления данных Карреля его интерпретация этих экспериментов получила подтверждение в работах нескольких лабораторий, где обнаружили, что популяции клеток, взятых у других видов, в том числе и у человека, также имели неограниченную способность к, казалось бы, неограниченной репликации. Сообщения о спонтанном возникновении иммортализованных популяций клеток большого числа тканей человека и животных поступили из десятков лабораторий за двадцатилетний период с начала 40-х до начала 60-х годов XX века. Иммортализованные популяции клеток и сейчас возникают случайно в культурах нормальных клеток.(Дильман В.М. 1987.)

Смерть клеток в культуре наблюдалась с тех пор, как Р. Харрисон создал первую общепризнанную культуру клеток в 1907 году. Однако распространилось мнение, в основном базирующееся на работах Карреля, что все клетки в культуре являются изначально иммортализованными, а гибель происходит лишь из-за того, что точные условия роста культуры неизвестны. В дальнейшем положение о врожденном бессмертии клеток стало догмой среди специалистов по культуре клеток. Это уводило внимание биогеронтологов от индивидуальной клетки как места возникновения возрастных изменений. Однако то, что в 50-х годах считалось бесспорным доказательством бессмертия клеток в культуре, вскоре уступило место новым взглядам и противоположным результатам. Так в 1961 году Л. Хейфлик и П. Мурхед показали ограниченность репликативной способности нормальных фибробластов человека. Впервые они исключили артефакты или незнание адекватных условий культуры как возможные причины смерти нормальных клеток в культуре. Ученые объяснили этот феномен как следствие старения на клеточном уровне. Они показали, что смерть нормальных клеток человека в культуре не была вызвана какими-либо тривиальными причинами, а была внутренним свойством самих клеток. Ученые показали, что когда нормальные эмбриональные клетки человека растут в наиболее благоприятных условиях, старение и смерть неизбежно наступают после ~50 удвоений популяции. (Дильман В.М. 1982.)

Старение присуще всем живым организмам. Оно возникло в ходе эволюции живых существ, как фактор, обеспечивающий генетическую изменчивость популяции и вида в целом. Протекает на всех уровнях организации живых систем, от молекулярно-генетического до организменного. На основании исследований установлено ,что в течение жизни живых организмов наступает момент, когда процесс развития, т.е. обогащения и усложнения функционирования внутренних органов, а также их соответствующего обеспечения замедляется, а позднее переходит в стадию регресса, следовательно, происходит процесс старения.

Существует несколько теорий старения, основное место среди которых занимают ? генетическая теория старения, эпигенетическая, хромосомная и теломерная, сущность которых сводится к тому, что первичные механизмы старения связаны с изменениями состояния генетического аппарата клетки.

По мнению одних ученых - это запрограммированный процесс снижения активности генома, другие утверждают, что старение есть результат повреждения генетического аппарата, путем накопления ошибок в системе генетической информации. (Милунски О.1981.)

Изменения, происходящие в организме в процессе старения, носят повреждающий, прогрессирующий характер, что приводит к наступлению заключительного этапа онтогенеза ? старости. Темпы старения определяются продолжительностью жизни особи.

Несмотря на качественное многообразие фенотипических признаков, старение животных организмов характеризуется рядом простых и универсальных закономерностей.

Доказано, что даже в идеальных лабораторных условиях животные, в том числе одноклеточные, также и микроорганизмы старею и умирают.

В настоящее время не прекращаются дискуссии вокруг этого вопроса ? чем же вызвано старение, генетической программой или воздействием мутагенных факторов.(Эффрос Р.Б.2008)

Цель теломер хромосомный старение трегуляция

Работа посвящена рассмотрению структуры теломер - концевых участков линейной хромосомной ДНК, в контексте проблемы старения. Проводятся особенности функционирования теломеразного комплекса, рассмотрены механизмы трегуляции длины теломер. Проанализирован ряд современных гипотез и теорий старения, среди которых, особое внимание уделено теломерной теории старения.

Задачи

Изучить структуру и функции теломерной клетки

Изучить функции теломерного аппарата в развитии процессов старения, механизмов его регуляции

Изучить методы анализа длины теломер

Выявить влияние уровня физической активности на длину теломер и активности теломеразы.



Глава 1. Современные концепции старения

1.1 Молекулярно-генетическая теория

Молекулярно-генетическая теория старения опирается на то, что существуют гены запускающие механизм старения. Между ними существует определенный баланс в экспрессии, который сдвигается в сторону более активной работы генов, запускающих старение. Экспрессия генов поддержки клеточного равновесия понижается, следовательно происходят изменения тканей и органов. На сегодняшний день не найден ген, который бы запускал этот механизм. Была предложена такая классификация генов, гомологичных генам, определяющим долголетие животных организмов, гены, участвующие в поддержании клеточного равновесия, гены, отвечающие за развитие основных заболеваний, связанных со старением. Для поиска гена старения послужило открытие генетических заболеваний, симптомами которых является ускоренное старение в молодом возрасте. Так синдром Хатчкинсона-Галфорда является следствием мутации в гене LMNA, отвечающего за нормальное строение ядерной мембраны. В мутантном состоянии этот ген дает аномальный продукт, вследствие чего образуется дефектная мембрана, становящаяся наиболее чувствительной к веществам, повреждающим генетический материал и провоцирующим раннее старение и клеточную гибель.(Анисимов В.Н. 2008.)

Синдром Вернера есть следствие мутации гена WRN, отвечающего за сборку репаративной машины. В результате нарушений сборки репаративной машины не происходит репарации повреждений ДНК, что ведет к образованию мутаций, ускоряющих процесс старения.

С возрастом ослабляется экспрессия генов контроля и поддержания клеточного равновесия и происходит накопление клеток с мутациями, что приводит к постепенному старению организма. Накопление стойких к апоптозу фибробластов в коже людей пожилого возраста сопровождается накоплением множественных повреждений, которые приводят к образованию неоплазий, нейро-дегенеративных процессов и инфаркта миокарда.(Егоров Н.С. 1987.)

Ген аполипопротеина Е и ангиотензинпереваривающего фермента АПФ играют большую роль в липидном метаболизме и защищают клетку от окислительного стресса. У столетних людей по сравнению с более молодыми возрастными группами в два раза чаще встречаются аллели HLA-A, HLA-C и др. Таким образом можно предположить наличие определенных аллельных вариантов разных генов, которые будут ускорять старение или предотвращать его. Недавно были обнаружены и другие гены, которые влияют на продолжительность жизни. У Drosophila melanogaster найдены гены per и tim, активность которых циклически регулируется на протяжении суток. К их числу относится ген INDY, мутация в котором приводила к увеличению продолжительности жизни мух в два раза. На данном этапе еще не до конца выяснена функция этих генов, одно известно, что мутации этих генов способствуют увеличению продолжительности жизни.

Лабораторные черви с блокированной экспрессией одного из генов CLK-1, вместо 10 дней, проживали 50 дней. На мышах исследовали продукт гена p66-shc, при окислении липидов клеточных мембран которого принимает участие в клеточном ответе, запуская механизм апоптоза, который сопровождает большинство патологических состояний при старении.

Элиминация этого гена вызывает продолжительность жизни мышей. Есть предположения, что гены старения локализированы в одной определенной хромосоме. Если удалить такие хромосомы из ядер клетки, то процесс старения не наступает. Деление клеток становится неограниченным, а клоны бессмертны.(Ричард Г.А.1998.)

При соматической гибридизации обычных человеческих фибробластов с раковыми клетками сирийских хомячков происходит иммортализация некоторых гибридов. Было доказано, что эти клетки преодолели лимит Хейфлика, и в их кариотипе отсутствовали обе копии первой хромосомы человека. Если ввести в такую гибридную клетку по одной копии первой хромосомы, то происходит картина клеточного старения.

Поставленный американскими учеными-биологами опыт, говорит о наличии генов старения именно в этой хромосоме и подтверждает генетическую теорию старения, которая происходит путем активации определенных генов.

Согласно другой гипотезы, гены старости находятся в четвертой хромосоме человека. Американские ученые сделали такой вывод исследовав группу людей в возрасте 90-100 лет. У всех обследовавшихся людей именно в четвертой хромосоме был найден идентичный участок генов, отвечавший за способность организма противостоять вредным факторам внешней и внутренней среды.(Лэмб М.1980.)

В настоящее время ведется большая работа по идентификации таких генов и определению мест их локализации. Таким образом, выявлен ряд генов, влияющих на продолжительность жизни.

1.2 Мутационная теория старения

Мутационная теория старения основана на том, что накопление хромосомных отклонений в ходе онтогенеза являются следствием старения, происходит гибель клетки и далее всего организма. С изменениями активности синтеза рРНК, со снижением уровня биосинтетических процессов в клетке снижается частота ассоциаций акроцентрических хромосом. У долгожителей уровень ассоциаций этих хромосом на десять процентов выше, чем у людей, не склонных к долголетию. У них падает уровень ассоциаций хромосом акроцентрических и уменьшается число окрашенных серебром участков ядрышкового организатора, что говорит об ослаблении биосинтетических процессов в клетке. С возрастом увеличивается количество повреждений генома, во многих опытах установлена взаимосвязь между продолжительностью жизни и скоростью репарации ДНК.(Ричард Г.А.1998.)

В процессе старения меняется структура генов, их функции, в соматических клетках собирается много хромосомных искажений. Повреждения восстанавливаются, но не все. Дезактивация систем восстановления вызывает деструкцию генома. Частота спонтанных повреждений генома весьма значительна, например, у крыс происходит около десяти окислительных повреждений ДНК в день в расчете на клетку.

Ведутся научные исследования воздействия возраста на транскрипцию и трансляцию. В основном активность биосинтеза клеток постепенно угасает. На экспрессию генов влияет химическая трансформация ДНК. Изменения организма в процессе старения связаны с нарушениями в ходе перемены основ ДНК - метилированием и гликозилированием. Так метилирование защищает ДНК от разрушающего действия клеточных рестрикционных эндонуклеаз-ферментов, способных к необратимому расщеплению ДНК. Гликозилирование белков и нуклеиновых кислот с возрастом повышается. Моносахара такие как D-глюкоза или D-галактоза способствуют проведению химических реакций, производящих метаболиты, создающие ковалентные связи внутри белковых молекул, связывая белки между собой. Гликозилирование ДНК ведет к мутациям через прямое повреждение и дезактивацию систем восстановления, ошибок повторности действия, повышается ломкость хромосом. Частые нарушения сегрегации хромосом связаны со снижением активности модификации ДНК, изменениями макромолекулярного состава и физико-химических свойств хроматина. Изменения происходят с повышением содержания негистовы белков и группировкой гистонов в составе хроматина, в уровне постсинтетических изменений белков, в снижении группировок фосфолипидов ДНП, в нарастании минорных оснований ДНК, в повышении содержания железа, что сопровождается фрагментацией макромолекул. (Сарецки Г.2002)

С точки зрения другой гипотезы процесс старения клеток основан на горизонтальном межклеточном переносе генетической информации. В результате старения организма происходит гибель клеток, образуется фрагментация ДНК, появляются мелкие обломки хроматина и генов. Через истонченную плазматическую мембрану они переходят внутрь соседних клеток, где вливаются в регуляцию биосинтеза белков, происходит накопление функциональных сбоев синтеза дефектного продукта генов. Несомненно, в организме есть системы восстановления повреждений, но с возрастом возможности организма к востанолению снижаются.

До определенного времени считалось, что любая клетка потенциально способна к делению в идеально благоприятных условиях бесконечно.

Однако от этого мнения пришлось отказаться в конце двадцатого века. Тогда ученые Л. Хейфлик и П. Мурхед установили, что клетки соединительной ткани человека, взятые у эмбриона, помещенные в питательную среду делятся ограниченное число раз, примерно пятьдесят. (Йоку, Фурумото 1996) Подобный эксперимент неоднократно проводился в других лабораториях мира, но объяснить причину этого явления тогда не удавалось. Тогда было введено обозначение для неожиданного открытия, которое стало называться «лимит- Хефлика».

1.3 Теломерная теория А.М. Оловникова

В1971 году А. М. Оловниковым была предложена гипотеза о том, что при каждом клеточном делении концевые участки хромосом ? теломеры немного укорачиваются и это приводит к тому, что клетка уже не может делиться, теряя свою жизнеспособность. И именно в этом, согласно теломерной теории и состоит старение клеток.

ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, просчитывает родительскую цепь в направлении от ее 3-конца к 5-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется от 5 к 3 концу. В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК- праймера, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК- праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Но на 3-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может и поэтому 3- концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а 5-концевые участки остаются недореплизированными. Таким образом, каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорачиванию. И, следовательно, прежде всего должна сокращаться длина теломерной ДНК. Этим и объясняется «лимит Хейфлика», так как после того как длина теломерной ДНК становится очень малой, наступает период кризиса, т. е. клетка не в состоянии делиться далее. Этим может быть обусловлено наличие программы, запускающей каскад процессов, ведущих к возрастному снижению структур и функций живого организма.(Ярыгин В.Н.2013.)

Рисунок 1. Теломерная теория (теория маргинации) А.М. Оловникова [5].



Рисунок 2. Генетический механизм старения и гибели клетки (А -- этап блокирования митоза; Б -- этап индукции апоптоза клетки) [5].



Глава 2. Структура и функции теломер клеток

Теломеры это концевые районы линейной хромосомной ДНК, состоящие из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей, сюда также входят многие белки, специфически связывающиеся с теломерными ДНК-повторами. Теломеры предотвращают изменение и слияние хромосом, поддерживая целостность генома клетки и ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре, и играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Сравнительно недавно молекулярными биологами были разработаны эффективные методы определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Первые исследования были проведены с одноклеточными простейшими из-за особенностей строения ядерного и хромосомного аппарата, содержащие несколько десятков тысяч мелких хромосом и, соответственно, множества теломер в одной клетке. Повторяющиеся много раз блоки в теломерной ДНК простейших состоят из шести- восьми нуклеотидных остатков, где одна цепь ДНК сильно обогащена остатками гуаниловой кислоты, а комплементарная ей цепь ДНК соответственно обогащена остатками цитидиловой кислоты.

У дрожжей повторяющиеся блоки намного длиннее, чем у простейших, но не столь регулярные. Учеными установлено, что теломерная ДНК человека, построенная из TTAGGG-блоков отличается от простейших лишь одной буквой в повторе. Более того, из TTAGGG-блоков построены теломерные ДНК всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб, а в теломерной ДНК не закодировано никаких белков, а теломеры всех организмов выполняют универсальные функции. (Чернышев Н.В. 2010.)

К настоящему времени известно, что теломерные фрагменты у большинства живых существ очень схожи, они обогащены нуклеотидами G и С, которые располагаются в определенной, похожей у всех организмов последовательности. Несколько отличается структура ТR у некоторых видов грибов и особенно сильно -- у дрозофилы. У Saccaromyces cerevisiae сравнительно короткие теломеры построены из нуклеотидов С и Т в последовательности, которая имеет непостоянную структуру Данные о строении теломер приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Последовательность нуклеотидов теломер у разных видов живых организмов

Таксон	Вид	Последовательность нуклеотидов 5'>3'
Простейшие	Euplotes	TTTTGGGG
Слизневые грибы	Phusarum	TTTAGGG
Жгутиковые	Trypanosoma	TTAGGG
Споровики	Plasmodium	TT(T/C)AGGG
Грибы	Neurospora Candida maltosa	TTAGGG ACGGATGGAGACTCGCTTGGTGT
Нематоды	Ascaris	TTAGGC
Насекомые	Bombus mori	TTAGG
Водоросли	Chlamidomonas	TTTTAGGG
Высшие растения	Arabidopsis	TTTAGGG
Позвоночные животные	Homo sapiens	TTAGGG

Кроме инфузории тетрахимены, теломерные повторы изучены у многих других представителей простейших, в том числе у стилонихии и окситрихи, у которых повторяющейся единицей является октамер 5'-ССССАААА-3'/ З'- GGGGТТТТ-З1. Этот октануклеотид расположен на концах хромосом особым образом, так что часть С-цепи ДНК остается одиночной из-за отсутствия второй цепи. Выступающие концы нитей ДНК обнаружены в теломерах всех организмов. Этот октануклеотид, выступающий за обычную двойную уотсон-криковскую спираль, называют одно цепочечным свободным G-концом. Длина простого повторенного дуплекса, расположенного проксимальнее, может варьировать от менее чем 50 пн (у

Еир1оtеs) до более чем 100 тпн (у мыши). Интересно, что теломерные однонитевые свободные G-концы фактически одинаковы у многих представителей совершенно различных филогенетических таксонов, за исключением дрожжей. Анализ показал, что четыре молекулы гуанина на выступающем конце, не имеющие возможности контактировать с молекулами цитозина, как это бывает в обычной молекуле ДНК, все же спариваются. Они располагаются в одной плоскости и образуют водородные связи между собой.

Особенность формирования этой структуры заключается в том, что соединение нуклеотидов происходит не по принципу комплементарности оснований, а между молекулами одного и того же основания - гуанина.

Как уже отмечалось, рядом с теломерным повтором располагаются участки ДНК большой протяженности, называемые субтеломерными повторами -- ТАS.

У дрожжей описано два субтеломерных повтора, X и Y'. X имеет размеры 0,3-3,75 тпн и менее консервативен, чем Y' (5,2-6,7 т п н). Они чередуются, или повтор может состоять только из Х-элементов. Последние имеют открытые рамки считывания. На основе слабой гомологии в первичных последовательностях с мобильными элементами предположили, что Y'- элементы возникли из одиночной инсерции в предковый геном дрожжей.(Канунго М. 1982.)

Субтеломерные повторы обнаружены у многих видов. Общая длина их может быть очень большой -- у хирономуса до 300 тпн в каждой теломере.

По иронии судьбы термин «теломера» возник в результате исследований на дрозофиле. В то же время до сих пор нет никаких доказательств того, что в геноме дрозофилы есть короткие теломерные G-богатые последовательности, характерные для большинства других видов.

У дрозофилы на концах хромосом расположены теломеро-специфичные ретротранспозоны, НеТ-Аи ТАRТ. В общих чертах они имеют похожее строение. У обоих на 5'- конце присутствуют небольшие повторенные последовательности, а на З'-конце -- более протяженный повтор, завершающийся длинным фрагментом, содержащим только нуклеотиды с аденином (А)n . Различаются они тем, что НеТ-Аимеет две частично наложенные одна на другую рамки считывания (ОRFs), кодирующие белки, в то время как ТАRТ ~ две, ОRF1 и ОRF2, расположенные тандемно. Оба рстротранспозона присутствуют во многих копиях, главным образом в прицентромерных районах. Они могут перемещаться по геному и в случае утраты теломерного района встраиваются на самый конец хромосомы, восстанавливая теломерную структуру (рис. 2).

Рисунок 3. Строение теломер у дрозофилы

Одной из важных характеристик теломерных ДНК является их длина. У человека она составляет от 2 до 20 тысяч пар оснований (т.п.о.), а у некоторых видов мышей может достигать сотен т.п.о.(Лэмб М.1980.)

Так как перемена условий обитания влечет за собой мобилизацию большинства функций в организме, то, несомненно, это приводит к стрессу и может влиять на процессы, связанные со старением. В этом отношении полезно вспомнить о теломерах [1], ведь эти концевые структуры хромосом могут служить удобной моделью отслеживания изменений, которые происходят в разные сезоны года, так как их основные свойства -- динамичность и чувствительность к переменам во внешней и внутренней среде. Уже показано, что изменения в длине теломер связаны как со стрессом, так и со старением [2, 3, 4, 5]. И чем хуже внешние условия, тем нагляднее изменения в этих хромосомных структурах. В настоящее время существует достаточно работ, подтверждающих сезонную чувствительность теломер и их связь со стратегиями переживания или избегания неблагоприятных времен года.

2.1 Длина теломер у растений

Самым красивым событием осени является листопад, но за этой внешней красотой скрываются драматические изменения, происходящие в теломерной биологии клеток листа. Группа китайских ученых, исследуя возрастную динамику длины теломер у разных видов древесных растений, обнаружила резкое укорочение теломер в их листьях в период с сентября по октябрь (рис. 1) [6, 7]. Причем как молодые, так и многовековые особи реликтового дерева гинкго были подвержены такой динамике теломер, то есть это естественный постоянно повторяющийся процесс, не зависящий от возраста дерева, но зависящий от возраста листа. Листопад -- это необходимая адаптация лиственных деревьев к сезонам засухи или холодов. Наблюдаемое укорочение теломер можно рассматривать как следствие взаимодействия внешних и внутренних факторов, которые запускают необратимые процессы в тканях листа (например, апоптоз). Температура и влажность окружающей среды здесь играют не последнюю роль, так же как уровни гормона этиленаи активных форм кислорода.(Галицкий В.А.2009.)



Рисунок 4. Динамика длины теломер в период с апреля по октябрь у трех видов листопадных деревьев: гинкго (Ginkgo biloba L.) [5], ясеня (Fraxinus pennsylvanica Mars. var. Subintegerrima [Vahl.] Fern.) и ивы (Salix matsudana Koidz.) [6]. По оси ординат на графиках указаны значения длины теломер в парах нуклеотидов (п.н.).

Здесь интересно заметить, что влияние температуры на теломеры было выявлено также у таких простейших, как тетрахимены [8] и трипаносомы [9], а кроме того -- у дрожжей Candida [10]. У тетрахимены, например, при повышении температуры культивирования длина теломер увеличивалась почти в три раза [8]. Теломеры и у этих организмов реагируют на изменение температуры окружающей среды, скорее всего, как на стрессовый фактор. Возможно, увеличение длины теломер является особым защитным механизмом.



2.2 Длина теломер у животных

Продолжая говорить о влиянии сезонов на длину теломер, стоит обратить внимание на животных, впадающих в спячку. Интересные работы в этом направлении были проделаны на трех видах мелких грызунов -- джунгарском хомяке [11], соне-полчке [12] и садовой соне [13]. Существуют данные о том, что маленькие впадающие в спячку грызуны имеют бульшую максимальную продолжительность жизни и медленнее стареют, чем грызуны того же размера, не впадающие в спячку [14]. Хотя рекордсменом по продолжительности жизни среди грызунов, конечно, является голый землекоп, который живет до 30 лет и обладает особыми адаптациями к долгожительству [15]. При исследовании теломерной биологии грызунов, впадающих в спячку, было обнаружено, что как в периоды оцепенения, так и во время спячки длина теломер у них остается постоянной или даже увеличивается [11, 12, 13]. Это может говорить о замедлении процесса старения. Однако у садовой сони при пробуждении -- когда происходит так называемое оттаивание, и температура тела повышается -- происходит усиление метаболизма, которое опосредуется окислительным стрессом и укорочением теломер [13]. Несмотря на это, компенсация длины теломер в другие периоды жизни позволяет этим грызунам жить дольше. В отличие от сонь, голый землекоп, по сути, является пойкилотермным животным с низким уровнем метаболизма и не испытывает стресса, связанного с повышением обмена веществ. В фибробластах у землекопа и у близких к нему по образу жизни и некоторым молекулярным адаптациям слепышей была обнаружена активная теломераза, а укорочения теломер с возрастом не происходило [16, 17, 18].

У летучих мышей, впадающих в спячку, во всех анализируемых органах (печень, поджелудочная железа, почки, легкие, сердце) была выявлена более высокая активность теломеразы по сравнению с представителями того же отряда, но в спячку не впадающими [19]. У ранее упомянутых впадающих в спячку грызунов, скорее всего, теломераза тоже активна. Это может объяснять поддержание теломер у животных, предпочитающих переживать неблагоприятные условия во сне.

2.3 Длина теломер у людей

Самым животрепещущим вопросом, наверное, является влияние смены сезонов на теломерную биологию людей. Удалось найти только одно исследование, проведенное в этом направлении [20]. Объектами исследования стали костариканцы. Для Коста-Рики характерны сильные сезонные различия: ежегодно в некоторых районах страны наступают периоды дождей. В анализ включили людей старше 60 лет. Оказалось, что в дождливый сезон их теломеры были значительно короче, чем в остальное время года (рис. 5). Если в райской Коста-Рике теломеры так реагируют на смену сезона, то можно только предполагать, что происходит с нашими теломерами, когда наступает русская осень и зима...

Рисунок 5. Сезонное изменение длины теломер у костариканцев. На графике видно, что наибольшее укорочение теломер происходит в июне (шестой месяц) [20].



2.4 Длина теломер у птиц

Глобальные климатические изменения и даже тектонические процессы могут также оказывать влияние на теломеры. На примере чернохвостой чайки Larus crassirostris было показано, что изменения в динамике длины теломер у этой птицы могут быть объяснены такими явлениями, как Эль- Ниньо (2009/2010 гг.) и землетрясение (2010/2011 гг.). В первый временной период наблюдалась тенденция к увеличению длины теломер, а во второй -- к сокращению, причем связи динамики теломер с возрастом выявлено не было (рис. 6) [21].

Рисунок 6. Изменения в длине теломер у чернохвостой чайки в зависимости от природных катаклизмов. На рисунке представлено частотное распределение темпов изменения теломер по годам наблюдения. Видно, что в период 2009/2010 гг. изменения в длине теломер сдвинуты вправо (увеличение), а в 2010/2011 -- влево (укорочение). На шкале справа треугольниками показано время сбора образцов (в мае каждого года). [21].

Возможно, увеличение длины теломер было связано с тем, что период Эль-Ниньо был благоприятен для добывания корма: снижались энергетические затраты на поиск пищи, что благоприятно сказывалось на физиологии птиц. А вот сильное землетрясение и последующее цунами вызвали перераспределение пищевых ресурсов, что потребовало от чаек больших энергетических затрат, при которых длина теломер стала укорачиваться. Понятно, что такое влияние условий происходит через стрессовое состояние, которое неизбежно возникает у организмов при подобных катаклизмах.

Стратегия избегания неблагоприятных условий путем миграции может быть наиболее выгодной в мире животных. Приспособления к длительным переходам или перелетам затрагивают многие структуры и функции организма, в том числе и теломеры. Исследование на обыкновенных моевках Rissa tridactyla показало, что перелет птиц в края зимовки оказывает положительное влияние на длину теломер (рис. 7) [22].

Рисунок 7. Длина теломер у обыкновенной моевки во время пребывания в регионах зимовки. Самки обозначены кругами, самцы -- треугольниками. [22].

Это значит, что механизм поддержания длины теломер работает как одно из следствий адаптаций к стрессу. Перелеты на большие расстояния требуют от организма многих затрат, которые компенсируются изменениями в физиологии. Например, перед перелетом у птиц происходит накопление жира, в то же время обмен веществ замедляется. Это позволяет птицам расходовать энергию оптимально, уменьшать окислительный стресс и сохранять теломеры.

Влияние сезона на динамику теломер, конечно, не может быть прямым. При перемене климата происходит изменение всех физиологических параметров. Теломеры же могут рассматриваться как своеобразные точки пересечения молекулярных процессов, которые при этом происходят. Чувствительность этих структур хромосом к разным факторам делает их очень популярными в научной среде. И тот факт, что в мире все взаимосвязано, благодаря подобным исследованиям теломер приобретает новый оттенок.



Глава 3. Короткие теломеры

Известно, что теломеры окружают специальные белки, обеспечивающие их работу и участвующие в их построении. Доказано, что для нормальной работы каждая линейная ДНК имеет две теломеры, по одно на каждый конец.

Строение хромосомы .

Анализ длины теломерных повторов показал, что соматические клетки теряют от 50 до 200 нуклеотидов во время каждого клеточного деления. Доказано, что в процессе старения снижается способность клетки к самовоспроизведению. По мере укорачивания теломер область гетерохроматина включает в себя все больше субтеломерной ДНК. Включение в эту область генасупрессора приводит к запуску механизма клеточного старения. Теломеры предотвращают рекомбинацию и позволяют концам хромосом присоединяться к ядерной оболочке, выполняя ряд клеточных функций, и выступают в роли буфера, тем самым защищая гены от потери при каждом цикле репликации ДНК. Научно установлено участие теломер в стабилизации линейных эукариотических хромосом путем элонгации и кэпирования. Теломеры координально отличаются от концов разорванных хромосом. Лишенные теломер хромосомы вследствие разрывов, сливаются изменяясь и перестают выполнять свои функции. В результате, разрывы хромосом вызывают задержку в клеточном цикле и подвергаются репарации, что приводит к лигированию с другими хромосомными фрагментами. Количество появления измененных хромосом резко повышается по мере уменьшения теломер в процессе концевой недорепликации стареющих клеток. Эти хромосомы рвутся в последующем митотическом цикле и это приводит к активации белка р53, запускающего ряд реакций в ответ на повреждение ДНК с последующей суперэкспрессией белка р21, который может связываться с CDK2 и CDK4, понижая их активность, а это приводит к остановке клеточного цикла в Gl. Такие белки могут нейтрализовать митогенетическую активность ростовых факторов. Суперэкспрессия других белков также может приводить к неспособности пройти через Gl. Объединенные вместе эти механизмы нужны для того, чтобы обеспечить ограниченную продолжительность жизни клеток человека. Хотя последовательность TTAGGG присуща как примитивным организмам, так и высшим животным, размеры теломерных участков хромосом гетерогенны в разных клетках и тканях даже одного организма. Длина ДНК в теломерах хромосом человека варьирует ? в клетках зародышевой линии составляет 10-15 т.п.о., а в лейкоцитах периферической крови ? 5-12 т.п.о. Еще более ярко выраженными являются межвидовые различия в длине теломер от 50 п.о. в клетках жгутиковых до 50 т.п.о. у одного из видов мышей. У дрожжей длина теломер близка к 300 п.о.

Укорочение теломер при старинии фибробластов человека, происходит в клетках эпидермиса кожи, лейкоцитах периферической крови, эпителии слизистой оболочки толстого кишечника. Существует взаимосвязь между пролиферативной способностью клеток и длиной теломер. Клеточные соединения с короткими теломерами создают меньше удвоений по сравнению с соединениями, имеющими наиболее длинные теломеры.

Длина теломер является биологическим маркером старения соматической клетки человека. У одноклеточных и вирусов хромосомы имеют кольцевую форму, за счет этого не происходит недорепликации. Фибробласты больных прогерией Хатчинсона-Гилфорда имеют короткие теломеры и низкий потенциал клеточных делений. Теломеры ДНК сперматозоидов не укорачиваются с возрастом в связи с наличием механизма поддержания длины теломер в половых клетках. У больных синдромом Дауна наблюдается более высокая скорость потери длины теломер, взятых из лимфоцитов переферической крови, чем у здоровых доноров.(Альбертс Б.1994.)

За последние годы опубликованы результаты независимых научных исследований, в которых указывается на наличие связи между сокращением длины теломер и развитием ряда серьезных заболеваний, связанных с возрастом.

Рисунок 8. Зависимость длины теломер от возраста человека



Таблица 3 - Заболевания, связанные с короткими теломерами

Заболевания сердечно- сосудистой системы	Среди лиц с короткими лейкоцитарными теломерами отмечаются более высокая распрастраненность факторов риска, приводящих к сердечно- сосудистым заболеваниям и поражению коронарных артерий. Наличие коротких теломер на 50 % превышает риск развития инфаркта миокарда.
Заболевания ЦНС	Короткие теломеры ассоциированн-ные с расстройства-ми настроения, депрессией на фоне биполярных расстройств , болезнью Альцгеймера, деменцией и др.
Нарушения минерального обмена костной ткани	Уменьшение длины теломер , ассоциированное с возрастом, достоверно коррлирует со снижением минеральной плотности костной ткани.
Дегенеративные изменения тканей глаза	Длина лейкоцитарных теломер напрямую связана со степенью прозрачности хрусталика.
Нарушение репродуктивной функции.	Длина теломер является предиктором фрагментации эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения. Короткие теломеры повышают риск ансуплодии.

3.1 Функции теломерного аппарата в развитии процессов старения

Найдено значительное число белков, связывающихся с ДНК теломерных повторов или с их белковыми комплексами, формирующимися на концах хромосом. Теломеры имеют способность создавать ассоциаты друг с другом. Они вовлечены в формирование ядерных доменов, что важно для регуляции транскрипции, спаривания сестринских хроматид в митозе и для гомологичного синапсиса в мейозе. Теломерные концы хромосом не подвергаются репарации ДНК в отличие от разорванных концов хромосом. Теломеры обеспечивают особый механизм введения дополнительных копий теломерной ДНК к концам хромосом, это необходимо для компенсации потери последовательностей ДНК вследствие неполнойрепликации.

В процессе старения организма не происходит обновления клеточной популяции во многих тканях, а клеточная пролиферация не бесконечна. Для активной пролиферации клеток теломерные последовательности не должны становиться короче определенного порогового размера. После достижения критической длины теломерной ДНК запускаются процессы остановки клеточного цикла. Сигнал укорочения теломер воспринимается клеткой как повреждение ДНК. Белки АТМ и р53, участвующие в мониторинге и регуляции теломерной ДНК, воспринимают этот сигнал в клеточный цикл. После этого соматические клетки совершают ограниченное число делений и приходят в состояние необратимой остановки в фазах клеточного цикла G1 и G2-M, которое и характеризуется старением. Доказательством этому служат взятые у больных фибробласты, которые ускоренно теряют теломерную ДНК, что активирует белок р53 и ведет к преждевременному старению. По мере укорачивания теломер происходит повышение молекулярного беспорядка. Множество биологических изменений, происходящих в нормальных клетках при старении нарушают внутреннюю среду, приводя к развитию клеточного старения. Эти изменения повышают вероятность развития патологических процессов, приводящих к завершению онтогенеза, задолго до достижения максимальной продолжительности жизни. Существует взаимосвязь между уменьшением длины теломерного участка и лимитом Хейфлика. Для его преодоления клетки должны активировать ген теломеразы. Учитывая, что ДНК-полимераза не может восстанавливать линейную хромосому полностью, необходим специальный механизм для поддержания концевых участков хромосом. Эту роль выполняет теломераза, открытая в 1985 году учеными Грайдером и Блэкборном. (Груиченко Е.В.2009.)



3.2 Функции теломеразного комплекса и механизмы его регуляции

Рисунок 9. Схематическое изображение работы теломеразы

Они подробно изложили действие фермента теломеразы, основная функция которого достраивать новые нуклеотидные последовательности в теломерных участках хромосом. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс. Для проявления ее активности нужны РНК и белковые компоненты. В качестве каталитической белковой субединицы содержит обратную транскриптазу и матрицу РНК для синтеза комплектарных цепей теломерной ДНК. Этот тип белковой структуры нужен как для репликации ретровирусов, так и для репликации хромосомных теломер эукариот.

Механизм удлинения теломер, называемый элонгацией, происходит путем связывания G-богатой цепи теломер с матричным участком теломеразной РНК, после чего осуществляется РНК-зависимый синтез теломерной ДНК, затем идет транслокация, перемещение ДНК, удлиненной за один повтор относительно фермента. Далее комплементарная цепь достраивается с помощью ДНК-полимеразы.

Теломеразный цикл работы состоит из двух стадий: элонгации и транслокации. Чередуя их, фермент присоединяет к старой цепи десятки или сотни теломерных повторов. Теломерная РНК является не только матрицей , но и важнейшей частью каталитической машины. Если заменить в ней несколько нуклеотидов, то происходит не синтез дефектных повторов, а потеря теломеразной активности.

Теломеразная активность культуры раковых клеток намного выше, чем у нормальных. Экспрессия теломераз также обнаружена в клетках плода, стволовых клетках костного мозга, селезенки и эпидермиса кожи. Эти клетки имеют особенность быстрого обновления. В определенный момент происходит выключение гена, кодирующего теломеразу, практически у всех соматических клеток. Вследствие этого геном оказывается подвержен уменьшению в процессе концевой недорепликации. Теломера укорачивается, ухудшается функционирование хромосом. Когда заканчивается запас теломерных последовательностей происходит деградация смысловых участков ДНК. Экспериментальные исследования выявили, что делетирование гена белка теломеразы ведет к прекращению ее активности. Этот белок формирует активный центр фермента. Существует несколько белков, которые проявляют теломеразную активность. Одни из них соединяются с теломеразным субстратом, регулируют присоединение теломеразы, участвуют в синтезе отстающей цепи, после действия теломеразы. Белковая субъединица теломерная обратная транскриптаза универсальна для эукариот.

Теломеразные РНК исследованы гораздо лучше, чем теломеразные белки. У человека синтез теломеразных РНК происходит с помощью РНК полимеразы нуклеотидных остатков. Ген представлен одной копией на клетку. Первичная структура теломеразных РНК у человека составляет 450, а их длина возрастает от низших организмов к высшим. Разные организмы имеют свою по структуре РНК. Ее последовательность отличается не только у эволюционно далеких организмов, но и у родственных. Нуклеотидные последовательности теломеразных РНК неоднаковы уже в пределах рода. Если нуклеотидные последовательности генов рибосомальных РНК у эволюционно далеких организмов совпадают между собой на 90 %, теломеразный комплекс состоит из якорного участка, образованного белком р123 и теломеразной РНК. У дрожжей присутствуют гомологичные белки

EST1 и EST2. Деление генов этих белков приводит к уменьшению длины теломер. У людей обнаружен теломерный белок ТР1, который взаимодействует с теломеразной РНК. Она в свою очередь распределяет последовательность хромосомных теломер. Научно доказано, что теломерный ген белка р123 при воздействии на него ионизирующей радиации изменяется. В результате этого аминкислотные замены остатков аспарагиновой кислоты приводят к дефектам. Клетки, которые имеют мутантные белки очень быстро стареют за счет резкого укорочения теломер.

Концевые участки, удлиняющиеся теломеразой, содержат ненуклеосомную организацию, в отличие от других частей ДНК, в которых присутствует нуклеосомная организация. У млекопитающих эту организацию имеет лишь небольшое количеств теломерных последовательностей, расположенных в направлении к центромере. В клетках млекопитающих находится теломерсвязывающий белок TRF1, который предположительно осуществляет негативный контроль длины теломер. Этот белок создает плотную упаковку теломер, благодаря чему они относятся к фракции гетерохроматина. Такая система стабилизирует теломеры и делает недоступным для взаимодействия с теломеразой. Наступающая мутация в гене теломеразной РНК, синтезирующей повторяющиеся последовательности, происходит изменение дистальных теломерных повторов и это не позволяет белку TRF1 присоединиться на этих повторах, вследствие чего теломераза становится способной к их удлинению. В S-фазе белок TRF1 диссоциирует от теломеры и вследствие этого начинается ее удлинение. Стабилизирующие белки создают малодоступность теломерной ДНК воздействию ДНК-метилаз и эндонуклеаз, обеспечивая низкую частоту появления двухцепочных разрывов в мейозе.

Исследования в этой области показывают, что увеличение продукции TRF1 приводит к интенсивному укорочению теломер в клетках человека, в то время как уменьшение продукции ведет их к удлинению. Таким образом TRF1 является супрессором элонгации теломер и отрицательным регулятором их длины, так как не наблюдалось его влияния на уровень активности теломеразы. Поэтому исследователи предположили, что он ингибирует действие теломеразы на концах отдельных теломер.

Согласно другому предположению белок TRF1 непосредственно управляет доступом теломеразы к теломерам, регулируя негативную работу данного фермента. Считается, что этот белок связывается с теломерной ДНК, чем индуцирует конформационные изменения, ведущие к ингибированию полимеразной активности. В ходе экспериментов с добавлением мутантных теломерных повторов на теломерный конец, теломерный комплекс доступен действию теломеразы. Теломерный комплек с данным белком может быть как в доступности так и недосягаем.

В соответствие с третьим предположением, белок TRF1 может регулировать теломеразную активность с помощью взаимодействия с белком PinX1, способным соединять каталитическую субъединицу теломеразы и ингибировать ее активность. У дрожжей аналогом главного теломерного белка, регулирующим длину теломер является Rap1. Механизм его действия заключается в образовании структуры, подобной t-петле млекопитающих. Белок Rap1 содействует изгибу двухцепочной теломерной ДНК, что помогает в образовании t-петли. ДНК образует t-петлю, а одноцепочечный выступ внедряется в двухцепочечный участок ДНК, расположенный дистально (рис.). Белковый комплекс позволяет клеткам отличать теломеры от мест разрыва хромосом (ДНК). Не все белки теломер входят в состав комплекса, который избыточен на теломерах, но отсутствует в других районах хромосом. Защитные свойства комплекса вытекают из его способности воздействовать на структуру теломерной ДНК по крайней мере тремя способами: определять структуру самого кончика теломеры; участвовать в образовании t-петли; контролировать синтез теломерной ДНК теломеразой. Родственные комплексы найдены и на теломерах некоторых других видов эукариот.



Рисунок 10. Модель образования t-петлевой структуры на конце хромосомы

Вверху - теломера в момент репликации хромосомы, когда ее конец доступен для комплекса теломеразы, который осуществляет репликацию (удвоение цепи ДНК на самом кончике хромосомы). После репликации теломерная ДНК (черные линии) вместе с находящимися на ней белками (показаны разноцветными овалами) образует t-петлю (нижняя часть рисунка).

Кроме этого белок выполняет функции транскрипционного активатора и репрессора одновременно. А длина теломер контролируется противоположным действием двух клеточных комплексов. Оба этих комплекса взаимодействуют с теломерной ДНК и контролируются ею. Мутации приводят к блокировке деления ядра. Синтез правильной теломерной последовательности зависит от структуры теломеразной РНК. В противораковой терапии возможно применение индукции изменений теломеразной РНК, которые вызывают появление аномальных теломер, что ведет к остановке клеточного деления.

Иммортализацию культуры клеток можно вызвать путем воздействия облучения. При воздействии радиации наблюдается переход от регулируемого к нерегулируемому состоянию теломер. Если теломера доступна действию теломеразы, то этот процесс будет нелегко обратить назад. Это ведет к потере контроля над длиной возрастающего числа теломер. Белок TRF1, соединившись с дуплексом теломерной ДНК, индуцирует на ней формирование более упорядоченного хроматина. Этот комплекс выполняет важную биологическую функцию по кэпированию концов хромосом.

Высокая теломеразная активность присутствует во всех тканях млекопитающих, подверженных раковой трансформации. In vitro теломеразу могут ингибировать модифицированные олигонуклеотиды, комплектарные матричной области теломеразной РНК, обладающие устойчивостью действию протеаз и нуклеаз. Поддержание определенной длины теломер зависит от взаимодействия с ними теломеразы, теломерных белков и других факторов, управляющих синтезом компонентов теломерного комплекса. Поскольку теломеразная активность присутствует во всех раковых опухолях, то изучение структуры, функции, механизма работы и регуляции активности теломераз представляет важную задачу современной биологии. Но активная теломераза содержится не во всех опухолях и клетках. Выяснилось, что у некоторых из них длина теломер поддерживается за счет рекомбинационного механизма образования теломерной ДНК. Проводятся исследовательские работы по внедрению методов избирательного подавления теломеразной активности в раковых клетках на основании ингибиторов обратных транскриптаз. Одна из ДНК полимераз и искомый ингибитор должен быть направлен на подавление теломеразной ДНК-синтезирующей активности, иначе он будет токсичен для нормальных клеток - в этом и заключается трудность. Недавние работы по описанию избирательного подавления теломеразной РНК, вызывающие гибель раковых клеток в культуре кажутся наиболее обнадеживающими.

С помощью методов молекулярного анализа можно определить наличие теломеразы в биологических культурах. Один из них прямой метод. Заключается он в следующем: в инкубационную смесь с исследуемым материалом вносят меченые дНТФ и добавляют олигонуклеотид, с содержащимися теломерными повторами. Праймер выступает в роли G-цепи, с которой связывается теломераза. О наличии теломеразной активности в материале судят по включению радиоактивной метки в состав олигонуклеотида. Другой метод заключается в использовании полимеразной цепной реакции. В смесь с образцом добавляют G-праймер, С-праймер, ДНК- полимеразу и меченые нуклеотиды. Многократно чередующиеся циклы включают взаимодействие С-праймера или G-праймера с одиночной цепью, далее идет ДНК- полимеразное образование новой цепи и последующее разделение двух цепей путем нагревания. Это позволяет в ходе реакции амплифицировать удлиненный теломеразой олигонуклеотид. Затем продукты реакции подвергают гель-электрофарезу и получают спектр радиоактивных полос, соответствующих удлиненным олигонуклеотидам. Этот метод является самым высокочувствительным и позволяет определить наличие теломеразы в разных биологических материалах.



Глава 4. Методы анализа длины теломер

Методы анализа длины теломер. После выделения ДНК определяется ее концентрация, выравнивается для всей серии образцов и определяется длина теломер. Из существующих различных методов тестирования длины теломер, как подходящий для потокового анализа можно предложить вариант с оценкой количества теломерных повторов с помощью ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) (Cawthon R.M., 2002). Этот метод несколько менее точен по сравнению с анализом TRF (технология иммуноблотинга), но менее трудоемок и менее требователен к количеству материала. Анализ проводится на геномной ДНК. В ходе анализа методом Real-time PCR оценивается количество ДНК с теломерной последовательностью в геноме. Параллельно проводится Realtime PCR к однокопийному участку геномной ДНК. Отношение количеств теломерной и однокопийной матриц пропорционально длине теломер. Одновременно с одними реактивами за исключением праймеров готовятся стоковые смеси. При проведении Real-time PCR оценивается количество (определяется пороговый цикл после которого идет рост сигнала на амплификаторе) элемента ДНК, встречающегося в геноме один раз (s) и оценивается общее количество теломерных повторов (определяется пороговый цикл после которого идет рост сигнала на амплификаторе) в геноме (t). Оба эксперимента проводятся в максимально близких условиях (за исключением праймеров одинаковые смеси ПЦР, сравниваемые образцы занимают одну ячейку амплификатора, смешивание образцов на автостанции по одной и той же программе). Для каждого образца делается три повторности теломерной реакции и три повторности контрольной реакции. Вычисляется разница пороговых циклов для теломерного и контрольного ПЦР и вычисляется относительное количество теломерных повторов в геноме (T/S) по формуле T/S=2^(t-s). Значение T/S по данным литературы пропорционально длине теломер в образце (при этом зависимость может не быть строго линейной). Система определения длины теломер проверялась на наборе клеточных линий основанных на линии HEK суперэкспрессирующих различные компоненты теломеразы: в линии суперэкспрессирующей теломеразную РНК hTR T/S ~ 30, то есть не меняется, поскольку hTR не является лимитирующим фактором теломеразной активности, в линии ~ 100, а в линии суперэкспрессирующей оба компонента T/S >200).

...