Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Специальность - 03.03.01. физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

КОНТЕКСТ-ЗАВИСИМЫЙ ВЫБОР ПОВЕДЕНИЯ: НЕЙРОТРАНСМИТТЕРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

ДЬЯКОНОВА В.Е.

Москва 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный консультант:

Доктор биологических наук Сахаров Дмитрий Антонович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Балабан Павел Милославович

Доктор биологических наук Авдонин Павел Владимирович

Доктор биологических наук Мошков Дмитрий Алексеевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 12 октября 2011 г. В 14 часов

на заседании диссертационного совета Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

C диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан 5 сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Механизмы выбора поведения привлекают исследователей многих областей в силу не только фундаментальной, но и социально-прикладной значимости проблемы. В этологии, физиологии поведения, психологии, социологии хорошо установлен факт зависимости поведенческого выбора от контекста, т.е. от определенных внешних и внутренних факторов, таких как время суток, температура, предыдущий опыт и другие. Влияние одного и того же фактора воспроизводимо, а значит выбор поведения может быть статистически предсказуем на основе знания о существующем контексте. Этот факт позволяет перевести проблему в область изучения клеточных и нейрохимических механизмов контекст-зависимого выбора.

Большая часть нейрофизиологических описаний механизмов контекст-зависимого выбора основана на традиционном представлении о сетевой иерархической организации нервной системы, при этом ключевая роль отводится электрической активности определенных нейронов или отделов мозга и синаптическим (возбуждающим или тормозным) взаимодействиям между ними. Трансмиттерная специфичность, гетерохимизм нейронов при таком подходе не имеет функционального значения и потому не используется в обобщающих описаниях механизмов поведенческого выбора. Между тем накапливается все больше данных, заставляющих говорить о том, что контекст на клеточном уровне, это по-видимому, уровень нейромодуляторов или нейрогормонов, модулирующих работу «сетей». При этом нарастает понятийный дискомфорт, так как к числу нейромодуляторов, нейрогормонов, а также метамодуляторов (модулирующих действие последних) могут относиться те же нейротрансмиттеры, которые за пределами синаптических щелей («beyond neurotransmission») «приобретают дополнительные функции».

В этой ситуации все большую привлекательность приобретает другой теоретический подход к организации нервной системы, в котором ключевую роль играют химические факторы - такие, как множественность сигнальных молекул и интегративное действие каждой из них на множественные мишени (Д.А. Сахаров, 1990, 2010). Под интегративным действием сигнальной молекулы подразумевается характерная для объёмной передачи (volume transmission) ситуация, когда возбуждающие, тормозные и модулирующие, а иногда и гормональные эффекты сигнальной молекулы на разные клеточные мишени складываются в cкоординированный ответ локальной системы.

В пользу химической гипотезы механизмов поведенческого выбора свидетельствуют некоторые фундаментальные изменения в нейробиологических представлениях, наблюдающиеся в последние годы. К их числу относится ослабление представлений об иерархичной организации нервной системы. Этот тренд вызван как многочисленными свидетельствами непосредственного взаимодействия «периферий», так и безуспешными попытками идентифицировать с помощью оптических методов «нейроны, принимающие решение». В последние годы сразу несколько исследователей высказали сходные идеи о коллективной природе поведенческого выбора (W. Kristan 2010; R. Gillete 2010; Harris-Warrick 2010). В том же 2010 году Д. А. Сахаров предложил гипотезу, согласно которой выбор моторной программы ансамблем нейронов определяется химическим составом его экстраклеточной среды, которая, в частности, складывается благодаря активности локальных и входных нейронов. Уже существуют данные, демонстрирующие наличие “физической” основы для такого коллективного химического общения нейронов. На сегодняшний день установлено, что межклеточное пространство занимает 20 - 30% объема мозга в зависимости от области нервной системы (Sykova and Nicholson, 2008, обзор). В последнее десятилетие обнаружены несинаптические рецепторы ко всем известным нейротрансмиттерам, показана утечка нейротрансмиттеров из синаптических щелей, несинаптическая секреция нейротрансмиттеров. Наконец, немалую роль в усилении привлекательности «химического подхода» играет и осознание существующей филогенетической основы для химической самоорганизации нейронов. Демонстрация роли нейрональных сигнальных молекул в организации социального поведения бактерий, одноклеточных и ненейрональных клеточных культур свидетельствует о выработке простейших механизмов химической клеточной координации и самоорганизации уже на донервных стадиях (Бузников 2007, Бродский, 2009, обзор).

Все эти факты делают своевременной попытку сформулировать новую гипотезу о механизмах контекст-зависимого выбора в рамках химического подхода. Можно думать, что поведенческий контекст транслируется в контекст химический, а интегративное действие нейротрансмиттеров и других сигнальных молекул обеспечивает генерацию адекватной активности локальным нейрональным ансамблем (или даже обширными областями нервной системы).

Цели и задачи исследования. Целью работы была проверка гипотезы о том, что поведенческий контекст может транслироваться в контекст химический и о достаточности последнего для адекватного выбора поведенческого ответа. Если гипотеза справедлива, то должны выполняться следующие условия: (1) при изменении поведенческого контекста происходят значимые изменения в интенсивности синтеза и/или высвобождения определенного нейротрансмиттера; (2) повышением содержания определенного нейротрансмиттера можно имитировать действие поведенческого контекста и, наоборот, подавлением соответствующей нейротрансмиттерной системы можно снимать влияние поведенческого контекста; (3) на клеточном уровне существуют механизмы, обеспечивающие изменение объемного высвобождения нейротрансмиттера при формировании поведенческого контекста; (4) нейрохимический контекст влияет на спонтанную или вызванную активность нейронального ансамбля и отдельного нейрона. Выполнение этих условий в разных моделях контекст-зависимого поведения у далеких в систематическом отношении животных может свидетельствовать об универсальности химического механизма поведенческого выбора. Соответственно, были поставлены следующие задачи:

1. найти формы контекст-зависимого поведения у модельных нейробиологических объектов, далеких в систематическом отношении и доступных для последующего изучения элементарных механизмов;

2. проверить, происходят ли значимые изменения в активности определенной трансмиттерной системы при действии определенного контекста, и можно ли имитировать действие контекста искусственной активацией данной системы;

3. исследовать характер секреции нейротрансмиттера нейронами соответствующего фенотипа, активирующимися при данном контексте;

4. исследовать влияние нейрохимического контекста на выбор характера активности отдельным нейроном и моторной программы нейрональным ансамблем.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. На модельных объектах, представляющих две основные группы первичноротых (Lophotrochozoa и Ecdysozoa), показано, что влияние поведенческого контекста реализуется через изменение нейротрансмиттерного тонуса. При этом впервые продемонстрирована роль несинаптического пула нейротрансмиттеров. Найдены клеточные механизмы, обеспечивающие изменения несинаптической секреции нейротрансмиттера при изменении поведенческого контекста. Экспериментально доказана роль экстрасинаптической среды в контекст-зависимом выборе поведения организмом, функциональным нейрональным ансамблем и отдельным, полностью изолированными нейроном. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о трансляции поведенческого контекста в контекст химический, интегративным действием которого обеспечивается адекватный ответ системы.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы в образовательных курсах по нейробиологии, психологии, нейрофизиологии, эволюционной биологии, применены в медицине при изучении способов корректировки патологических психических и неврологических состояний фармакологическими и поведенческими методами.

2. Основные положения, выносимые на защиту

1. Контекст-зависимый выбор поведения во внутривидовых отношениях у сверчка Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda, Ecdysozoa) контролируется моноаминами серотонином и октопамином и эндогенной опиоидной системой. Влияние моторной нагрузки (полета) на высвобождение агрессии у субординантных сверчков опосредуется интегративным действием октопамина.

2. В механизме влияния голода и моторной нагрузки на ориентировочное, локомоторное и защитное поведение прудовика Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca, Lophotrochozoa) ключевую роль играет повышение синтеза и секреции серотонина.

3. Моноаминергические нейроны прудовика обладают механизмом несинаптической объемной секреции нейротрансмиттера. Несинаптическая секреция серотонина локомоторными нейронами усиливается при повышении синтеза серотонина.

4. Химический контекст определяет выбор моторной программы центральными нейронами, управляющими пищевым и локомоторным поведением прудовика.

5. Объемная секреция нейротрансмиттера участвует в механизме контекст-зависимого выбора поведения у обоих исследованных объектов, представляющих две разные группы первичноротых.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на многих российских и международных конгрессах и конференциях, в частности: Goettingen Neurobiol. Conference, 1997, Goettingen, Germany; 9th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 1999, Tihany, Hungary; 7th East European Conference of ISIN, Moscow-Pushino, Russiа, 2000; 28th Goettingen Neurobiol. Conference. 2001, Goettingen, Germany; European conference of ISIN, Krakov, Poland, 2001; Физиологический съезд 2001, Казань; 29th Goettingen Neurobiol. Conference. 2003, Goettingen, Germany; 10th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2003, Tihany, Hungary; 7th East European conference of the Society for Invertebrate Neurobiology. 2003, Kaliningrad-Svetlogorsk-Otradnoe, Russia; 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2007, Tihany, Hungary; IV Всероссийская конференция по поведению животных. 2007. Москва; European conference of the Society for Invertebrate Neurobiology. 2009, S-Peterburg, Russia; 9th Neuroethological Congress, Salamanca, Spain, 2010.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Большинство экспериментальных результатов получено лично автором. Изучение эффектов антагонистов октопаминовых рецепторов и ингибитора синтеза октопамина альфа-метил-триптофана на агрессивность сверчка G. bimaculatus проводилось совместно с П. Стивенсоном и Дж. Риллихом (Лейпцигский Университет, Германия). Исследование эффектов полета на половое поведение сверчка и возможного участия оксида азота в механизме этого влияния проведено совместно с А.Л. Крушинским (биофак МГУ). Совместно с И.А. Чистопольским (ИБР РАН) получены данные о прохождении нейроактивных факторов через толстые оболочки педальных ганглиев моллюска L. stagnalis. Совместно с Л. Хернади и Л. Хирипи (Лимнологический институт, Тихань, Венгрия) исследовано содержание серотонина и дофамина при голоде у L. stagnalis. Совместно с Т.Л. Дьяконовой (ИБР РАН) исследована зависимость эффектов глутамата от уровня оксида азота и механизм координации ритмов нейрона В2 и буккального генератора в буккальной сети L. stagnalis.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 статей, из них 13 - в отечественных журналах, соответствующих перечню ВАК, и 15 - в международных рецензируемых журналах .

Структура и объем. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение. Обзор литературы. Материалы и методы. Результаты из 4 глав. Заключение. Выводы. Список литературы. Работа содержит 273 страницы текста, документирована 102 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 278 источников, из них 245 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования.

В качестве объектов исследования были выбраны представители двух основных групп первичноротых Lophotrochozoa и Ecdysozoa, сверчок Gryllus bimaculatus (Insecta, Arthropoda) и моллюск большой прудовик Lymnaea stagnalis (Gastropoda, Mollusca). Оба вида относятся к так называемым модельным нейробиологическим объектам.

2.2. Поведенческие и фармакологические эксперименты.

2.2.1. Эксперименты на сверчках Gryllus bimaculatus.

Использовалась смешанная культура G. bimaculatus, которую поддерживали и разводили в лабораторных условиях, в отдельном помещении при температуре 270 С и световом режиме 12/12 часов. Использовали сверчков обоего пола в возрасте 2-3 недели после последней линьки, которых в течение 24 часов перед опытом содержали изолированно с достаточным количеством пищи и воды.

Оценка возбудимости и избегательного поведения. Анализировали ответ сверчка на дозированную стимуляцию церки воздушной струей. За грудной сегмент животное закреплялось в держатель и помещалось на поверхность белой сферы с равномерно нанесенными метками. Движение лап животного приводило к перемещению сферы, которое регистрировалось оптической установкой. Струя воздуха (скорость 2-3 м/сек, длительность 20 мсек) направлялась в область церок, сенсорных органов, улавливающих возмущения воздушной среды. Оценивалась максимальная скорость перемещения и длительность перемещения в течение первых двух секунд в ответ на стимул. Детально методика описана в работе (Staudacher and Schildberger, 1998).

Анализ агонистических отношений. Использовали стандартную методику для оценки агрессивности в парных тестах (Hofmann and Stevenson, 2000). Двух самцов помещали в разные отсеки прозрачной камеры (10х12х15 см), разделенные прозрачной перегородкой. Через 5 минут перегородку убирали. Каждую пару наблюдали в течение 5 минут с момента первого физического контакта. Регистрировали интенсивность драки (0 - взаимное избегание, 1- избегание одного из самцов при первом контакте, 2 - агрессивное биение антенн, 3 - демонстрация раскрытых мандибул одним самцом, 4 - демонстрация раскрытых мандибул обоими самцами, 5 - толкания, 6 - укусы мандибулами) и длительность драки. Отмечали также наличие ритуальной песни, наличие и интенсивность преследования в течение минуты после победы. Сходную схему использовали для изучения агрессивности у самок.

Анализ полового поведения. Пару животных, самца и самку, помещали в разные отсеки прозрачной камеры (10х12х15 см), разделенные прозрачной перегородкой. Через 5 минут перегородку убирали. Поведение каждой пары наблюдали в течение 5 минут с момента первого физического контакта. Регистрировали пение самца (латентный период, длительность, характер песни: призывная или копулятивная), процент копуляций в парах. Эксперименты записывали на видеокамеру Sony DCR-SR 220E.

Активация полета. Животным наносили на кутикулу грудного сегмента клейкое вещество и прикрепляли к специальному кронштейну, так чтобы они находились в подвешенном состоянии, обдували струей воздуха от вентилятора в течение 0.5, 1, 3 или 5 минут.

Инъекции фармакологических агентов. Вещества вводили в объеме 20- 50 мкл, растворяли в растворе Рингера для сверчков (0.82% NaCl; 0.075% KCl; 0.04% NaHCO3; 0.021% CaCl2; 0.5% глюкоза), контрольную группу инъецировали раствором Рингера. Инъекции делали в абдомен между третьей и четвертой пластинкой. Исследовали действие агониста октопаминовых рецептров хлодимеформа (1, 0.5, 0.1 мМ, 50 мкл), адренергических блокаторов пропранолола, эпинастина, фентоламина (20 мМ, 20 мкл), антагониста опиатных рецепторов налоксона (0.1 мМ, 50 мкл), агониста опиатных рецепторов мю-типа DAGO (0.1 мМ, 50 мкл), неспецифического блокатора NО- синтаз N-Nitro-l-Arginine (LNNA, 0.02 мг в 50 мкл). Через 2 часа начинали тестирование.

Фармакологическое истощение содержания моноаминов с использованием ложных предшественников. Альфа-метилтирозин (АМТ, Sigma) вызывает существенное снижение содержания октопамина и дофамина, а альфа-метилтриптофан (AMTP, Sigma) - серотонина (Sloley and Orikasa, 1988). Сверчки получали две последовательные инъекции АМТ (1.5 мг в 20 мкл раствора Рингера) с интервалом в 48 часов. Животных тестировали через 48 часов после последней инъекции. AMTP (1 mg, 30 мкл) инъецировали один раз. Тестирование начинали через 48 часов и повторяли через 24 часа в течение 4-х дней. Контрольная группа инъецировалась с тем же интервалом раствором Рингера.

2.2.2. Эксперименты на моллюсках.

Oпыты пpoвoдили нa прудовикax Lymnaea stagnalis aквapиaльнoй линии, кoтopыx coдepжaли в oтcтoeннoй вoдoпpoвoднoй вoдe пpи кoмнaтнoй тeмпepaтype с естественным световым режимом. Стандартная установка для регистрации поведения включала арену, цифровую видеокамеру Sony DCR-SR 220E, соединенную с персональным компьютером с установленной программой для анализа поведения RealTimer (www.openscience.ru).

Оценка общей и локомоторной активности. Улитoк пoмeщaли в заполненную водой арену и легким нажатием прикрепляли ко дну. Измеряли латентный период выхода из раковины и латентный период начала локомоции. Использовали видеозаписи для вычисления пройденного пути в размерах тела данной улитки. Для количественной оценки мышечной наземной локомоции использовали длительность периода натягивания раковины.

Оценка «пугливости» и защитного поведения. Использовали защитный теневой рефлекс прудовика - втягивание в раковину в ответ на затемнение. Для имитации затемнения выключали один из световых приборов на 1 секунду. Измеряли интенсивность реакции по длительности втягивания в раковину и длительности остановки (прекращения локомоции). Применяли также метод с тактильным раздражением щупальца. Животных тестировали поочередно, нанося тактильнoe paздpaжeниe нa кoнeц щyпaльцa, тaк чтo кaждoe живoтное иcпытывaлocь 10 paз. Moтopный oтвeт yлитки oтнocили к oднoмy из cлeдyющиx типoв peaкции, в пopядкe ослабления ee oбopoнитeльнoгo xapaктepa и усиления исследовательского: (1) нaдвигaниe paкoвины нa пepeдний кoнeц тeлa (2) peтpaкция щyпaльцa, (3) игнopиpoвaниe cтимyлa, (4) пoвopoт гoлoвы в cтopoнy cтимyлa. Получали распределения ответов для каждого животного и вычисляли среднее распределение, характеризующее группу.

Оценка поведения в ответ на внезапное предъявление незнакомого объекта. Tecтиpyeмyю yлиткy пepeнocили в бoльшoй плocкий cocyд, нaпoлнeнный чиcтoй oтcтoeннoй вoдoй нa 2 cм. Чepeз 1 мин пocлe нaчaлa лoкoмoции в воду опускался кaмeнь диaмeтpoм oкoлo 1 cм в 2 cм oт гoлoвы. B пoвeдeнчecкoй реакции yлитки ecтecтвeннo paзличaлись двe фaзы: нeпocpeдcтвeнный oтвeт (защитное втягивание) и oтcтaвлeнный oтвeт. Peпepтyap oтcтaвлeнныx oтвeтoв включaл cлeдyющиe четыре вapиaнта: (1) coxpaнeниe ocтaнoвки лoкoмoции в тeчeниe 5 мин нaблюдeния; (2) paзвopoт бoлee чeм нa 900 и yxoд oт кaмня; (3) пoвopoт мeнee чeм нa 900 и движeниe мимo кaмня; (4) coпpикocнoвeния c кaмнeм, пepexoдящee в нaпoлзaниe нa нeгo. Оценивалось распределение отставленных ответов в опытных и контрольных группах.

Моторная нагрузка. Использовали две экспериментальные модели для усиления моторной нагрузки. Первая: животное вынимали из воды и помещали дважды на стеклянную поверхность с перерывом в 5 минут для предотвращения обезвоживания. Продолжительность локомоции на суше была 10 минут в каждой сессии. Во второй модели улиток помещали в контейнер со сниженным уровнем воды (1-2 см) на 25-30 минут, в некоторых сериях опытов на 120 минут. После ползания в условиях повышенной моторной нагрузки улиток переносили в контейнер с высоким слоем воды (12 см) для анализа поведения.

Фармакологические опыты. Мы использовали неинвазивную методику администрации фармакологических агентов, инкубацию в соответствующих растворах. Эта методика хорошо работает на водных гастроподах благодаря высокой проницаемости их кожных покровов (см. напр., Сахаров, Каботянский, 1986). Улиток помещали в 100 мл соответствующего раствора и инкубировали в течение 2-3 часов.

2.3. Электрофизиологические эксперименты.

2.3.1. Препарат изолированной ЦНС улитки.

Улиток наркотизировали, инъецируя 0.2 мл 0.1 М хлорида магния, изолированный мозг обрабатывали протеазой (Sigma, США), 2,5 мг/мл, в течение 10-15 мин, освобождали от оболочек и укрепляли в камере на силгартовой подложке в растворе следующего состава: NaCl - 50 mM, KСl - 1,6 mM, CaCL2 - 4 mM, MgCl2 - 4 mM, Трис - 10 мМ, рН - 7.6. Электрическую активность нейронов регистрировали стеклянными микроэлектродами (15-30 МОм), заполненными 3 М КСl. Использовалось стандартное электрофизиологичское оборудование, электрические сигналы оцифровывались и переводились в компьютер для последующей обработки в программе Spike-3 (автор Д.Д. Воронцов). При фармакологических воздействиях в электрофизиологических опытах все вещества добавлялись в проток.

2.3.2. Изолированные нейроны. Для изоляции нейрона ЦНС после снятия толстых оболочек обрабатывали протеазой Е 3 мг/мл в течение 13-15 минут. Затем снимали тонкие оболочки и оставляли препарат в холодильнике на 40 минут. В выбранный для изоляции нейрон, вводили микроэлектрод, затем, используя микроманипулятор, вытягивали нейрон из ганглия по методике Т.Л. Дьяконовой (Дьяконова, 1989). В процессе эксперимента нейрон находился в проточной камере объемом 4 мл и постоянно омывался соответствующим солевым раствором (2.5 см/мин) при комнатной температуре.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Контекст-зависимое поведение Gryllus bimaculatus и его нейротрансмиттерные механизмы.

3.1.1. Модуляция поведения сверчка социальным статусом и полетом.

3.1.1.1. Модуляция агрессивности (контекст-зависимая агрессия). Известно, что агрессивное поведение G. bimaculatus подавляется у побежденных особей и активируется у победителей (Alexander, 1961). Недавние работы выявили необычное физиологическое явление - изменение агрессивного поведения животного после моторного поведения, казалось бы, никак не связанного с агрессией, полета. У проигравших самцов полет вызывал немедленное высвобождение агрессии и провоцировал драки с победителем (Hofmann and Stevenson, 2000). Более детальное изучение эффектов полета на поведенческй выбор при внутривидовых взаимодействиях у сверчков стало первой целью наших исследований.

Было найдено, что полет способен усиливать драки у наивных, т.е. у исходно агрессивных самцов. Чем дольше предварительно изолированные самцы летали перед первой дракой, тем интенсивнее и длительнее становились их агрессивные взаимодействия. Полет до драки также оказывал существенное модулирующее влияние на последующее поведение проигравшего самца. В отличие от контрольных животных, летавшие до драки восстанавливали способность драться вновь с победителем уже через 15 минут после первого проигрыша. Этот эффект также носил «дозо-зависимый» характер: чем дольше самцы летали перед дракой, тем дольше у них сохранялась способность вступать в повторные драки с победителем. Полет оказывал влияние и на поведение доминанта по отношению к субординанту, увеличивая длительность преследований, общее число атак и открытия мандибул. Сходный эффект полета на смещение выбора поведения в сторону агрессии наблюдался и у самок: полет значительно увеличил интенсивность и длительность драк в опытной группе.

3.1.1.2. Модуляция избегательного/защитного поведения.

Активация избегательного поведения у проигравших самцов отчетливо наблюдалась в экспериментах со стимуляцией воздушной струей на подвижной сфере, позволяющей регистрировать перемещение насекомого (Рис.1).

Рис. 1. Влияние полета (П) на избегательное поведение наивных (К) и субординантных (С) самцов сверчка. По вертикальной оси - максимальная скорость пробежки (см/сек) в ответ на стимуляцию воздушной струей. Среднее значение, стандартная ошибка среднего, парный тест Вилкоксона, p<0.01. О - контрольный эксперимент, влияние обдува.

Полет в течение 3 минут, напротив, подавлял избегательное поведение как у наивных так и у проигравших самцов (Рис.1).

3.1.1.3. Модуляция полового поведения. Контекст-зависимости ухаживания и спаривания G. bimaculatus также был посвящен ряд работ, результатом которых стала демонстрация зависимости реализации полового поведения от исхода межсамцовых драк (Simmons, 1986). Мы исследовали влияние полета на взаимоотношения между самцами и самками. В первой серии изучали, как влияет полет на выбор поведения самцом. В опытной группе, в которой самцы летали в течение 5 минут перед встречей с самкой, достоверно вырос процент ухаживающих (поющих) самцов и, соответственно, возрос процент копуляций (Рис. 2).

Рис. 2. Влияние полета на ухаживание и копуляцию у самцов сверчка. а, процент самцов, издававших звуковые (призывные и копулятивные) сигналы. б, процент пар, в которых наблюдалась копуляция. К - контроль (нелетавшие самцы), к - 5 минут полета самца до встречи с самкой. F - критерий Фишера.

Полет существенно ускорил принятие решения о начале ухаживания: латентный период призывного пения был существенно короче в опытной группе (32 7 сек, против 119 35, H = 4.7, p<0.03, Kruskal-Anova test). Общая относительная длительность пения (процент времени активного ухаживания, пения, от общего времени, проведенного с самкой до копуляции), а также длительность отдельного эпизода непрекращающегося пения была достоверно выше в опытной группе (H=7.2, p<0.01; H=8.6, p<0.005, соответственно, Kruskal-Anova test).

В следующей серии было проверено, оказывает ли полет сходное влияние на выбор поведения самкой в паре с самцом. Животные были разделены на четыре группы: 1. Контроль, нелетавшие самец и самка (24 пары). 2. И самец, и самка перед взаимодействием летали (18 пар). 3. Летала только самка (30 пар). 4. Летал только самец (16 пар). Во всех трех экспериментальных группах значительно возросло число копуляций по сравнению с контролем. Наибольшего значения процент копуляций достиг в группе 4 (летал только самец), достоверно превышая этот показатель не только в контроле, но и в остальных экспериментальных группах. В тех группах, где летала самка, наблюдалось отчетливое увеличение агрессивных взаимодействий. Процент установления отношений победитель-побежденный между самцами и самками также был значительно выше в группах 2 (72%) и 3 (80%) по сравнению с контролем (37.2% , F=5,3 и F=10.7, р<0,05 и р<0.01, соответственно) и группой 4 (20%, F=8.2 и F=14.2, p<0.01 и р<0.001).

Сходный эффект на половое поведение самки оказывала ее победа в драке с другой самкой. Самки-победительницы достоверно чаще реагируют агрессией на самца, чем субординантные самки: 11 из 15 (73.3%) против 2 из 14 (14.3 %, F=11/86, p< 0.002). Уровень и длительность драки с самцом тоже существенно выше у самок, одержавших победу в драке с другой самкой. При этом процент копуляций и процент активно ухаживающих самцов также оказался выше в группе самок-победительниц, а именно 73.3 и 86.7 % против 28.6 и 14.3 % у субординантных самок (F= 6.22 , 6.77; p< 0.018, 0.015, cоответственно.)

3.1.2. Нейротрансмиттерные механизмы контекст-зависимого поведения G. bimaculatus.

3.1.2.1. Роль октопамина в механизме модулирующего действия полета.

Предпосылкой для изучения возможной роли октопамина в механизме действия полета на поведение сверчков стала работа Адамо и соавтров (Adamo et al., 1995), которая показала выраженное изменение нейроактивного коктейля в гемолимфе G.bimaculatus после полета и увеличение концентрации октопамина в несколько раз.

В первой серии экспериментов было проверено, не заменит ли инъекция агониста октопамина хлордимеформа (ХДМ) действие полета на проигравших самцов. ХДМ (100 мкл, 1 мМ) вызвал высвобождение агрессивности у проигравших сверчков по отношению к победителям (Рис. 3). Поведение проигравших сверчков, получивших инъекцию ХДМ (черные столбики), четко отличалось от обоих контролей и было сходно с поведением летавших субординантов (черные столбики со штриховкой).

Во второй серии экспериментов ХДМ инъецировали наивным самцам и оценивали эффект на агрессивность в первой драке и способность субординантов вновь вступать в драку с победителем. В первом взаимодействии мы не нашли статистически достоверного эффекта ХДМ на интенсивность и длительность драки.

Рис. 3. Влияние агониста октопаминовых рецепторов хлодимеформа (ХДM) в сравнении с действием полета и разных контролей на поведение субординантов при повторном контакте с победителем.

А, интенсивность (уровень ) агрессивных взаимодействий. Б, длительность драки (сек). В, относительная частота проявлений отдельных характеристик агрессивного поведения субординантов: демонстраций открытых челюстей, физических драк, побед над доминантами. К -контрольные нелетавшие интактные самцы (белые столбики), О- интактные обдуваемые воздушной струей (белые со шриховкой), Р- нелетавшие инъецированные Рингером (светло-серые столбики), П- интактные летавшие 3 минуты (черные со шриховкой), Хдм - инъецированные ХДМ (СDM, черные столбики) штрихованные столбики. Пунктиром показаны те же параметры поведения интактных субординантов через 18 часов после первой драки.

Однако, в последующих взаимодействиях инъецированные ХДМ пары сверчков существенно отличались по поведению от контроля и были сходны со сверчками, летавшими перед первой дракой. 85% проигравших сверчков демонстрировали раскрытые челюсти, 52% драк переступали уровень демонстрации агрессии и переходили в физическую драку, 20% субординантов выигрывали драку.

Пары сверчков, обработанные альфа-метил-тирозином (АМТ), вызывающим снижение синтеза октопамина и дофамина у насекомых, демонстрировали существенно более низкий уровень агрессии, чем контроль. Трехминутный полет был способен несколько повысить интенсивность агрессивности в первой драке до уровня 4-5, средняя длительность 3-5 сек. Однако последующий эффект полета на способность проигравших сверчков вновь вступать в драку с победителем не проявлялся. Хлордимеформ был по-прежнему эффективен при инъекции АМТ-инъецированным животным.

Эпинастин, высокоселективный антагонист нейрональных октопаминовых рецепторов у насекомых (Degen et al., 2000), блокировал эффект полета на агрессию (Рис. 4). Другой эффективный блокатор октопаминовых рецепторов насекомых фентоламин (Evans, 1981), антагонист адренергических рецепторов млекопитающих, в той же дозе оказывал похожее, но менее выраженное действие на агрессию и эффект полета, чем эпинастин. В отличие от эпинастина и фентоламина, адренергический антагонист млекопитающих пропранолол , имеющий более низкое сродство к октопаминовым рецепторам насекомых (Roeder, 1995), оказал слабый эффект на агрессию.

Рис. 4. Влияние различных антагонистов аминергических рецепторов на агрессивность сверчков и эффект полета на агрессию. Интенсивность агрессии (1-6, медиана с квартилями). Сверчки инъецированы Рингером (20мкл; n=20 пар), пропранололом, (20мкл; 20mM; n=19 пар), фентоламином (20 мкл; 20 mM; n = 14 пар), или эпинастином (20 мкл; 20 mM; n= 20 пар). На сером фоне показаны результаты экспериментов с другими группами сверчков, летавшими в течение 3 минут перед первой дракой. (*p_0.05; **p_0.01; ***p_0.001).

Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой о возможной роли октопамина в механизме контекст-зависимого агрессивного поведения сверчка, модулируемого полетом. В пользу этой гипотезы свидетельствуют следующие факты, соответствующие критериям необходимости и достаточности: (1) cинтез и высвобождение октопамина увеличивается при полете; (2) агонист октопаминовых рецепторов имитирует действие полета на поведенческий выбор у субординантов; (3) эффект полета на агрессию снижается или снимается полностью при подавлении либо синтеза октопамина, либо блокировании октопаминовых рецепторов. Эти результаты стали первым указанием на связь агрессии с уровнем октопамина у насекомых.

3.1.2.2.Возможное участие других сигнальных молекул в модуляции поведения сверчка социальным статусом и полетом

Серотонин. АМТР, ингибитор синтеза серотонина, вызывает достоверное увеличение сильных избегательных ответов (прыжков) на тактильное раздражение церки. В норме в распределении ответов на тактильный стимул доля прыжков составляет 10 -20 %. У животных, инъецированных АМТР, она достигала 55%. «Пугливые» сверчки с фармакологическим дефицитом серотонина достоверно чаще проигрывают в драках. Длительность и интенсивность драк у них также существенно снижена. Эти данные хорошо согласуются с результатами японских исследователей, показавшими, что уровень серотонина снижается в мозге субординантов и неагрессивных самцов с удаленными антеннами (Murakami, Itoh, 2001; 2003). Напрашивается вывод, что контекст-зависимость избегательного поведения может опосредоваться уровнем серотонина.

Опиоид-подобные пептиды и опиатные рецепторы были идентифицированы у насекомых еще в 80-х годах. Поскольку опиоиды принимают участие в регуляции поведения, зависимого от социального контекста у позвоночных (Липина и др., 1998; Кудрявцева и др., 2001), было проверено возможное участие опиоидной системы в регуляции контекст-зависимого избегания и агрессии у сверчка. Результаты показали, что инъекция антагониста опиатных рецепторов налоксона (0.05, 0.1, 1 мM) доминантам, а также предварительно изолированным самцам, активирует у них избегательное поведение в ответ на тактильное раздражение церки, так что по этому показателю они становятся сходными с субординантными сверчками. Напротив, инъекция агониста мю-рецепторов DAGO (0.05 мM) субординантам (и изолянтам) подавляла их защитное поведение в этом тесте, увеличивая выбор реакций игнорирования. Налоксон (0.05, 0.1 мM) не влиял на длительность и интенсивность драк предварительно изолированных сверчков, а также не изменял агрессии доминанта по отношению к проигравшему сверчку. Однако у субординантов и у самок сверчка, которые в норме демонстрируют пассивное или активное избегание при столкновении с особью того же пола, налоксон высвобождал агрессивное поведение. Агонист мю-рецепторов DAGO (0.05 мM) уменьшал интенсивность драк между изолированными самцами и существенно подавлял агрессию доминанта по отношению к субординанту. Эти данные указывают на то, что опиоидная система у самок и субординантных самцов принимает участие в подавлении агрессии, а у доминантов в подавлении избегательного поведения.

Оксид азота. Исследовали эффекты неспецифического блокатора NO-синтаз LNNA на агрессивное и половое поведение G. bimaculatus и на эффект полета. Многомерный тест MANOVA показал статистически значимые различия между опытной и контрольной группой по параметрам поведения, характеризующим агрессивность в парах самцов. Все четыре параметра, характеризующие агрессивность, оказались существенно ниже в опытной группе по сравнению с контролем после полета. Напротив, в агонистическом взаимодействии самцов до полета не было выявлено отличий между контрольной и опытной группой ни по одному из показателей. Инъекция L-NNA перед полетом снизила действие последнего и на половое поведение самцов. Тест MANOVA, учитывающий латентный период и длительность призывного пения, выявил значимые различия между группами: Рингер/полет и Рингер, а также Рингер/полет и LNNA/полет. Различия не наблюдались между группами, содержавшими нелетавших самцов, инъецированных соответственно Рингером и LNNA, а также между летавшими и нелетавшими самцами, инъецированными LNNA. Эти данные указывают на то, что во время полета может происходить активация NO-синтазы, и что превышение продукции NO над исходным фоном вносит существенный вклад в формирование вызванного полетом поведенческого состояния. поведение секреция нейротрансмиттер фенотип

3.2. Контекст-зависимое поведение моллюска Lymnaea stagnalis и его нейротрансмиттерные механизмы.

3.2.1. Модуляция поведенческого выбора прудовика пищевой депривацией и моторной нагрузкой. Исследовали, как влияет голод и вызванное голодом араузальное состояние на ответ животного на относительно нейтральные стимулы. Достоверные различия наблюдались между группами голодавших (38 часов) и сытых животных по распределению ответов нa тaктильнoe paздpaжeниe щyпaльцa (р< 0.001). Наиболее характерным ответом сытых улиток оказалась умеренная защитная реакция - втягивания щупальца в ответ на прикосновение. Напротив, у голодавших особей 50% ответов составляла ориентировочная реакция - поворот в сторону раздражителя. Далее мы исследовали влияние того же поведенческого контекста на реакцию животного на внезапное предъявление нового объекта. Для этой задачи был разработан метод, который позволял анализировать ответы улитки на неожиданное появление перед ней нейтрального объекта - небольшого камушка (см. Материалы и методы). У голодавшей группы также было выявлено знaчитeльнoe пpeoблaдaниe исследовательского поведения: наползания и ощупывания (Рис. 6).

Результаты экспериментов с модуляцией поведенческих ответов голодом легко трактуются в терминах биологической целесообразности. Действительно, усиление ориентировочной и исследовательской компоненты поведения является характерной чертой голодного поведения всех исследованных в этом отношении животных. Однако предыдущий опыт работы со сверчком G. bimaculatus указывал на существование разных видов влияний предыдущего поведения на последующее, биологический смысл которых не всегда лежит на поверхности. Так, до сих пор существуют только разнообразные спекуляции в отношении биологического смысла мощных поведенческих перестроек, запускаемых полетом у сверчка. Мы предположили, что эффект полета у G.bimaculatus мог развиться в эволюции на основе некоего общего феномена, а именно влияния повышенной моторной нагрузки на поведенческое состояние животных. Примечательно, что к моменту исследований данные о существовании таких эффектов были получены на млекопитающих (Salmon, 2001). Существует ли подобный феномен у других групп животных?

Действительно, оказалось, что после периода повышенной моторной нагрузки у L. stagnalis снизился латентный период локомоции (p<0.001, z =3.3, парный тест Вилкоксона), увеличилась скорость водной локомоции (p<0.05, z=1.9), активировался мышечный тип локомоции в водной среде. Изменились защитные реакции на пугающие и нейтральные стимулы. Так, длительность втягивания в раковину на затемнение достоверно сократилась после периода наземной локомоции (p<0.008, z=2.6). В ответ на тактильную стимуляцию щупальца улитки демонстрировали меньший процент защитных реакций, втягиваний, напротив, доля игнорирований достоверно увеличилась (Рис. 5). Перечисленные выше характеристики свидетельствовали о двигательном араузале улиток после интенсивной моторной нагрузки и о подавлении защитных реакций. Эти эффекты в целом сходны с описанными у сверчка и млекопитающих.

Рис. 5. Распределение ответов улиток на тактильное раздражение щупальца в контроле (слева), после 20 минут наземной локомоции (в центре), после 30 минут локомоции в низком слое воды.

(i) частичное втягивание тела в раковину (ii) втягивание щупальца (iii) игнорирование (iv) поворот в сторону стимула. Среднее значение и стандартаная ошибка среднего. Результат многомерного теста Manova указывает на достоверное изменение в распределении ответов после моторной нагрузки (Rao's R (4,25)= 3.7, p=0.01 и Rao's R (4,19)= 12.6, p=0.001)

3.2.2. Роль серотонина в механизмах модулирующего действия голода и моторной нагрузки.

В совместной работе с венгерскими коллегами мы исследовали влияние голода на содержание серотонина в разных ганглиях прудовика. Голод достоверно увеличил содержание серотонина в буккальных и педальных ганглиях, ответственных за пищевое поведение и локомоцию: 9 0.44 пкмоль/мг и 136 14.8 пкмоль/мг, соответственно, против 4.5 0.56 пкмоль/мг и 90 15.2 пкмоль/мг в контроле у сытых животных. Повышенное содержание серотонина наблюдалось и у прудовиков, голодавших 48 часов (8 0.65 пкмоль/мг и 135 15 пкмоль/мг). В качестве контроля отслеживали также уровень дофамина в этих ганглиях, он достоверно не изменялся при голодании 12, 24, 48 часов. Повышение содержания серотонина в нервной системе прудовика зафиксировано Е. Каботянским и после повышенной моторной нагрузки (Kabotyanski et al., 1992).

Метаболический предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан (5-НТР) используется в нейрофармакологии для повышения синтеза серотонина, эффективен и у моллюсков (Fickbohm et al., 2005). 5-НТР, так же как и голод, вызывал активацию ориентировочного и исследовательского ответа и подавление защитного. В ответ на тактильное раздражение щупальца улитка не втягивала его, как это делают контрольные особи, а поворачивала голову в сторону раздражителя. Сходный эффект вызывал также серотонин, а действие 5-НТР снималось предварительной инкубацией улиток в растворе ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот м-гидроксибензил гидразина (0.01 мМ), предотвращающего превращение 5-НТР в серотонин. Прудовики, инкубированные в 5-НТР, в ответ на внезапное предъявление объекта подползали к нему и исследовали, касаясь губами и радулой (Рис. 6, р< 0.01, тест Фишера).

Рис. 6. Pacпpeдeлeниe oтcтaвлeнныx oтвeтoв у сытых (Сыт.), голодных (Гол.) и инъецированных 5-НТР улиток. 24 ч. - одна из голодавших групп после 24 часового кормления ad libitum. Средний процент по 5 группам и стандартная ошибка среднего. Черные столбики - избегательная реакция (поворот более, чем на 90⁰ градусов), светлые с точечной штриховкой - обход (смена курса на угол менее 90⁰ градусов), светлые столбики с сетчатой штриховкой - исследоваетльская реакция (наползание на камень, ощупывание губами и щупальцами).

Проведенные эксперименты, показали, что можно имитировать действие голода и повышенной моторной нагрузки на поведенческий выбор фармакологическими агентами, влияющими на состояние серотониновой системы. Принципиальным оставался вопрос о том, почему поведенческий контекст, с одной стороны, тотальная аппликация серотонина, адресующаяся в основном к экстрасинаптическим рецепторам, с другой, и метаболический предшественник серотонина, вызывающий повышенный выброс серотонина в синаптических контактах, с третьей, вызывают сходные изменения в поведении.

3.3. Клеточные механизмы, обеспечивающие изменения экстраклеточного содержания нейротрансмиттеров при изменении поведенческого контекста

3.3.1. Поведенческое состояние сохраняется в изолированной нервной системе. Электрическую активность серотонинергических клеток РеА, которые расположены большой симметричной группой (кластером) в медиальной области педальных ганглиев и иннервируют мышцы и ресничный эпителий ноги прудовика, в препаратах изолированной ЦНС, взятой от сытых и голодных особей, достоверно различалась. Нейроны в ЦНС голодавших в течение 36-40 часов животных демонстрировали более высокий уровень деполяризации и электрической активности (ANOVA F =4.6; 9.6, p= 0.005, N=40, 37). Увеличение длительности голода до 5 суток и выше вызывала противоположный эффект. Эффект кратковременного голодания на электрическую активность сохранялся и у полностью изолированных нейронов РеА кластера (N=16). Эти результаты показали, что поведенческое состояние (поведенческий контекст) сохраняется в изолированной нервной системе, что позволяет изучать клеточные механизмы контекст-зависимого поведения.

3.3.2. Изучение клеточных механизмов действия метаболического предшественника серотонина 5-НТР. Результаты предыдущих экспериментов показали, что непосредственый предшественник серотонина 5-НТР, имитирующий влияние голода и моторной нагрузки на поведенческий выбор, повышает электрическую активность РеА нейронов (Каботянский и др. 1991). Его эффект полностью снимался ингибитором декарбоксилазы ароматических аминокислот, отвечающей за синтез серотонина из 5-НТР (Чистопольский и Сахаров, 2000). Мы исследовали влияние 5-НТР на полностью изолированный нейрон, когда исключаются опосредованные влияния со стороны остальной нервной системы.