Белки представляют собой макромолекулярные соединения, построенные из аминокислот. В состав белков различного происхождения входит всего лишь около 20 видов аминокислот, а все огромное разнообразие белков обусловлено различиями в составе и порядке чередования аминокислотных остатков в белковой молекуле.

С точки зрения электрофореза наиболее важное значение имеют свойства белков, связанные с их ионизацией. В каждой белковой молекуле содержится множество групп, способных отдавать или принимать протоны, что приводит к образованию в первом случае отрицательно заряженных, а во втором положительно заряженных групп. Преобладание одного из этих процессов зависит от состава данного белка, а также от окружения, в котором находятся его молекулы, главным образом от pH среды. В кислой среде основные группы протонированы, тогда как диссоциация кислотных групп подавлена, поэтому белки оказываются заряженными положительно. В щелочных растворах основные группы не имеют заряда, а карбоксильные группы легко диссоциируют, вследствие чего в молекуле образуется избыток отрицательно заряженных групп. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от pH среды, а также от числа и характера ионизируемых групп.

При определенном pH молекулы данного белка содержат равное число положительно и отрицательно заряженных групп: это значение pH называется изоэлектрической точкой (ИЭТ) белка. При pH, соответствующем ИЭТ, суммарный заряд молекулы равен нулю, поэтому в электрическом поле белок остается неподвижным. Для каждого белка характерна определенная ИЭТ. При значениях pH, лежащих выше ИЭТ, белки заряжены отрицательно, а при значениях pH, лежащих ниже ИЭТ, положительно.

ИЭТ можно определить путем измерения электрофоретической подвижности белка при разных pH. С этой целью строят график, выражающий зависимость найденной подвижности белка от pH, и путем интерполяции находят значение pH, при котором электрофоретическая подвижность белка равна нулю. Поскольку различные белки содержат те или иные виды ионизируемых групп в разных соотношениях, кривые, характеризующие зависимость подвижности белков от pH, непараллельны и нелинейны.

Другой метод определения ИЭТ основан на электрофоретическом разделении белков в среде с градиентом pH. В этом случае каждый белок движется к той зоне градиента, в которой значение pH соответствует его ИЭТ. Этот метод носит название изоэлектрического фокусирования.

Значение ИЭТ белка зависит от ионного состава среды, так как в молекулах белка присутствуют группы, связывающие не только водородные и гидроксильные ионы, но и другие катионы {например, JMa+, К+, Са2+ или Mg2+) и анионы (фосфат, хлорид и др.) -

Помимо ИЭТ кислотно-основные свойства белков характеризует также изоионная точка. Согласно определению, "изоионная точка соответствует pH раствора изоионного белка в воде или в растворе какого-либо другого вещества, которое само по себе при растворении в воде не дает водородных или гидроксильных ионов" [5].

Различие между изоионной и изоэлектрической точками обычно невелико и зависит от концентрации низкомолекулярных ионов, присутствующих в растворе. В экспериментальном отношении изоэлектрическую точку определять проще, чем изоионную, однако последняя является более строгим понятием, поскольку отражает истинную кислотность белков.

При разделении смеси белков очень важно знать зависимость электрофоретической подвижности от pH для каждого компонента, особенно в тех случаях, когда требуется выбрать такое значение pH, при котором электрофоретические подвижности компонентов различаются наиболее сильно. Это значение pH было бы идеальным для разделения. Так как лишь в редких случаях зависимость электрофоретической подвижности от pH известна для всех компонентов смеси, приходится подбирать наиболее подходящее значение pH эмпирическим путем в предварительных опытах [6].

Биологически активные формы белков часто состоят из нескольких идентичных или различающихся полипептидных цепей. Обычно полипептидные цепи удерживаются вместе в результате образования нековалентных связей, но иногда связь между цепями имеет ковалентную природу (например, осуществляется с помощью дисульфидных мостиков). Хотя в основном поведение белков при электрофорезе определяется их аминокислотным составом, во многих электрофоретических процессах важную роль, играют также (помимо уже упоминавшихся замаскированных групп) третичная и четвертичная структура белков. Дело в том, что изменение конформации молекулы может вызывать изменение ее размеров, а это имеет существенное значение в тех случаях, когда при электрофорезе в качестве дополнительного фактора разделения используется эффект молекулярного сита.

Изменения молекулярной структуры разделяемых белков могут привести к их необратимой инактивации. Этот фактор обязательно нужно учитывать, если электрофорез проводится с целью выделения активных веществ или изучения ферментов. Поэтому для предотвращения денатурации следует подбирать такую буферную систему, которая обеспечивала бы минимальное-нагревание белка, а также минимальное его окисление или восстановление.

Однако в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков.

Суммируя описанные выше электрофоретические свойства белков, можно сказать, что наиболее важное значение с точки зрения электрофореза имеют число и характер ионизируемых групп, присутствующих в молекуле белка. Знание аминокислотного состава белков позволяет сделать определенные выводы, помогающие выбрать наиболее подходящую систему для электрофоретического разделения. В некоторых методах электрофореза очень существенную роль играют также размеры и конформация белковой молекулы. Влияние этих молекулярных параметров на разделение зависит от среды, используемой для электрофореза, поэтому оно будет обсуждаться в разделах, посвященных детальному описанию отдельных методов.

Свойства белков и те разнообразные воздействия, которые оказывает на их разделение применяемая при электрофорезе среда, позволили разработать большое число самых разных электрофоретических методов. По принципу разделения все они распадаются на четыре основные группы:

· Электрофорез в среде с постоянным значением pH.

Разделение основано на различиях в заряде индивидуальных компонентов при данном pH.

· Изоэлектрическое фокусирование.

Разделение проводится в градиенте pH и основано на различиях в значениях ИЭТ отдельных компонентов.

· Электрофорез в средах, обладающих свойствами молекулярного сита.

При зональном электрофорезе в геле, используемом в качестве носителя, эффект молекулярного сита может служить дополнительным фактором, улучшающим разделение нативных белков. Кроме того, эффект молекулярного сита может быть единственным механизмом, лежащим в основе разделения белков. В этом случае путем комплексирования белков с анионным (реже с катионным) детергентом (см. гл. II.2) обеспечивается приблизительно одинаковое для всех белков отношение заряда к массе.

· Изотахофорез.

При разделении белков этим методом зоны распределяются в соответствии с их подвижностью и мигрируют с одинаковой скоростью.

Качество фракционирования можно повысить путем одновременного или последовательного применения нескольких указанных выше принципов электрофореза. Так, например, на первом этапе разделения используют электрофокусирование в геле, а на втором - электрофорез в среде, обладающей свойствами молекулярного сита. Можно также провести на первом этапе электрофорез в среде с постоянным значением pH, а на втором - электрофорез в присутствии анионного детергента и т.п.

Благодаря существованию огромного числа вариантов, а также возможности одновременного или последовательного применения различных принципов электрофорез стал одним из наиболее универсальных методов разделения белков для аналитических и препаративных целей [1].

Рассмотрим подробнее процессы, происходящие в ступенчатой буферной системе [11]. В качестве электродного буфера в системе Леммли выбран Трис-глициновый буфер низкой концентрации (0.025 М Трис / 0.192 М глицин) с pH 8.3 Глицин по отношению к Трису выступает в роли слабой кислоты. При рН 8.3 значительная доля его молекул должна быть заряжена отрицательно, что обеспечивает хорошую электропроводность электродного буфера. Концентрирующий гель в такой системе имеет концентрацию 3% Т, разделяющий - 10% Т. Для обоих гелей количество сшивок было выбрано как 2.6% С. В качестве буфера для разделяющего геля, используется 0.375 М Трис-HCl (pH 8.8), а полимеризации концентрирующего геля ведётся в 0.125 М Трис-HCl (pH 6.8). Высокая концентрация буфера в разделяющем геле, необходимая по двум причинам.

Во-первых, при рН 8.9 буферная емкость Трис-НСl уже мала, а в этом буфере должны мигрировать сконцентрированные белковые полосы.

Во-вторых, относительное содержание ионов С1Ї при таком значении рН невелико, и для обеспечения необходимой электропроводности концентрацию буфера приходится увеличивать.

В первый момент после включения тока напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступенях системы и начнется переход белков из буфера для проб в концентрирующий гель. В это же время, ионы ClЇ будут быстро уходить из верхней части концентрирующего геля в направлении разделяющего геля, а на их место из электродного буфера будут поступать ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с рН 6.8 При этом большинство молекул глицина восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и перестанет участвовать в проведении тока.

Сопротивление буфера для проб, а за ним и верхней части формирующего геля резко возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. Heмногочисленные при рН 6.8 заряженные молекулы глицина ускорят свое движение к аноду, обеспечивая непрерывность электрического тока по всему гелю. Состояние диссоциации-ассоциации аминогрупп - это статистическое равновесие, захватывающее все молекулы глицина в растворе. Поэтому все они (рывками) будут мигрировать в направлении анода, но в каждое мгновение электрический заряд будет переносить лишь небольшое число молекул, заряженных именно в это мгновение.

Оказавшиеся в верхней части концентрирующего геля белки под действием электрического поля повышенной напряжённости начинают мигрировать относительно быстро. Так же быстро идет переход белков из буфера для проб в концентрирующий гель. Постепенно подобная ситуация складывается во всём концентрирующем геле. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого геля. Вплотную за ними к границе с разделяющим гелем подходит глицин. Теперь весь концентрирующий гель находится в зоне повышенной напряженности поля, где относительно быстро мигрируют белки пробы. Никакого их концентрирования пока не происходит; оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие молекулы белка достигнут границы нижнего геля.

Тем временем линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в концентрирующий гель, где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напряженности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина оказываются при рН 8.9, который обеспечивается степеньюионизации и высокой концентрацией Трис. При этом рН большая часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ионы. Электропроводность Трис-глицинового буфера в верхней части концентрирующего геля оказывается столь же высокой, как и Трис-НСl (этого добились подбором рН 8.9 и концентрации всех компонентов системы).

Напряженность электрического поля в нижнем геле соответственно остается низкой, и это обстоятельство играет решающую роль в концентрировании белков. Впереди идущие молекулы белков достигают границы раздела и переходят в разделяющий гель, где попадают в область низкой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает. Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в объеме концентрирующего геля, т.е. в области высокой напряженности поля, и движутся быстро. Потом и они входят в нижний гель и почти останавливаются.

Между тем граница раздела ионов хлора и глицина уходит все дальше вперед, и через какое-то время весь разделяющий гель оказывается в Трис - глициновом буфере примерно с тем же рН.

То обстоятельство, что фракционирование белков начинается с узкой исходной зоны, дает колоссальный выигрыш - разрешающая способность системы в целом резко увеличивается.

Ступенчатый электрофорез по методике Лэммли можно использовать в сочетании с градиентом пористости разделяющего геля, что еще более повышает разрешающую способность метода. В случае угрозы агрегации, например при фракционировании кислых белков хроматина, в оба геля системы Лэммли можно ввести мочевину. Особенно совершенной оказалась фракционирования белков и пептидов, в которой в первом направлении используется изоэлектрическое фокусирование, направлении также использована методика Лэммли в сочетании с градиентом пористости ПААГ [2].

Нативный электрофорез по методу Орнштейна и Дэвиса.

Эта система в целом аналогична той, что описана подробно в методе Лэммли. При проведении электрофореза в нативных условиях в ступенчатой буферной системе с концентрирующим и разделяющим гелями можно использовать ту же рецептуру приготовления рабочих и концентрированных растворов, что и в денатурирующих условиях. Главным отличием является полное отсутствие денатурирующих факторов, таких как ДДС-Na, в-меркаптоэтанол и кипячение пробы перед нанесением в гель. Таким образом, можно использовать приведённые выше методики приготовления растворов, заменив в них ДДС-Na на эквивалентный объём дистиллированной воды [2].

Использование градиента концентрации геля, равновесный электрофорез

Ещё одним способом эффективного сужения полос при электрофорезе является проведение разделения в геле с монотонно уменьшающимся размером пор. О такой системе говорят, что в не создан градиент пористости, или градиент концентрации, т.к. в случае ПААГ концентрация мономеров в геле связана с его пористостью. Преимуществом такого подхода является не только возможность получения достаточно узких полос, но и стационарный характер разделения. Иными словами, по истечении некоторого времени картина распределения белковых полос в геле перестаёт изменяться и остаётся постоянной вплоть до окончания эксперимента.

Такое поведение разделяемых молекул в геле с градиентом пористости обусловлено следующими обстоятельствами. Продвигаясь в геле под действием электрического поля, молекулы постепенно попадают в области со всё меньшим размером пор. Постепенно, размер пор становится настолько мал, что дальнейшее движение молекулы оказывается невозможным, она останавливается и остаётся в таком положении, пока на неё действует электрическое поле. Таким образом, при движении пробы в геле из неё будут постепенно отфильтровываться и “застревать" в геле сначала самые крупные молекулы, потом те, что поменьше, и так далее до самых маленьких молекул (при условии, что градиент пористости позволяет создать достаточно маленькие поры).

Такой подход позволяет также получить достаточно узкие полосы, поскольку на молекулы, идущие впереди действует сила сопротивления со стороны геля немного бьльшая, чем на молекулы, мигрирующие позади. Это означает, что, по аналогии с описанным выше механизмом, задний фронт пробы будет постоянно приближаться к переднему фронту, сужая тем самым белковую полосу. Соответственно, отпадает необходимость в предварительной концентрации пробы и всё разделение можно проводить в непрерывной буферной системе. (Рисунок 4)