2.3 Изоэлектрофокусирование. - Принцип метода, параметр разделения. - Амфолины

Изоэлектрическое фокусирование заключается в том, что создается система с градиентом рН. Белки, движущиеся в электрическом поле, достигают в этой системе такой области, в которой значение рН равно их изоэлектрической точки [7].

Принципиальные различия между ИЭФ и обычным электрофорезом проиллюстрированы на рис.5. При обычном электрофорезе разделяемая смесь исходно вносится в виде узкой зоны, как правило со стороны катода. Разделение происходит в процессе вынужденной электромиграции образца в слое инертной матрицы (ацетилцеллюлоза, крахмал, агароза, полиакриламидный гель, сефадекс и т.п.), насыщенной буфером с определенным значением pH. В отсутствие заметных молекулярно-ситовых явлений белковые зоны мигрируют с постоянной скоростью, поскольку в данном буферном растворе они несут постоянный суммарный поверхностный заряд.

Рисунок 5-Сравнение зонального электрофореза и ИЭФ.

В каждом случае проводится разделение смеси двух белков А (р1=5) к Б (р! = 8), кривые титрования которых показаны справа. При обычном электрофорезе в среде поддерживается постоянное значение pH = 9, при котором оба макроиона обладают постоянным суммарным отрицательным зарядом и мигрируют с постоянными скоростями (в отсутствие дифференцированных молекулярно-ситовых эффектов антиконвекционной среды разделения). В ходе фракционирования зоны, диффундируют. В случае ИЭФ белки мигрируют с постоянно убывающей скоростью по направлению к стационарным зонам нулевого заряда (pH=pI). (С любезного разрешения фирмы LKB Produkter АВ.)

В рассматриваемом примере (рис.5) это отвечает миграции двух компонентов, А и Б, при постоянных значениях заряда, которые можно определить по кривым титрования. При данном фиксированном значении pH = 9 суммарный поверхностный заряд для белков А и Б со ставляет - 3 и - 1 соответственно. По мере продвижения обоих компонентов от точки нанесения к аноду компонент А будет постоянно опережать Б. В то же время обе зоны в ходе электрофореза будут уширяться, поскольку в данной системе ничто не противодействует тепловой диффузии макромолекул. При обычном электрофорезе стационарное состояние в принципе недостижимо и процесс разделения необходимо прервать в какой-то момент прежде, чем произойдет элюция мигрирующих компонентов в анодную камеру.

При ИЭФ, напротив, устанавливается стабильный градиент увеличения pH в направлении от анода к катоду, формирующийся за счет электрофоретической "сортировки" амфолитов - носителей в подходящей антиконвекционной жидкой среде. Попадая в такую систему, белки или иные амфотерные молекулы: начинают мигрировать в электрическом поле опять-таки в соответствии со своими значениями поверхностного заряда. Так, если некая молекула на данном участке градиента при данном значении pH заряжена положительно, то она будет' мигрировать к катоду, т.е. в сторону увеличения pH. По мере такого - продвижения положительный заряд этой молекулы будет уменьшаться, а отрицательный возрастать, например за счет депротонирования аминогрупп и карбоксилов. В итоге молекула достигнет такой зоны, где ее электрический заряд окажется равным нулю, т.е. зоны с pH, равным pI этой молекулы. Следовательно, в процессе ИЭФ скорость миграции белка постоянно уменьшается, поскольку его суммарный поверхностный заряд, соответствующий положению равновесия протонирования-депротонирования (которое в каждой точке определяется кривой титрования данного белка), также уменьшается, стремясь к нулю. В конце концов миграция белковой молекулы полностью прекращается. Как только молекула случайно выйдет за пределы зоны pI, она тотчас приобретет отличный от нуля заряд и вынуждена будет вернуться к равновесному положению.

Таким образом, электрическое поле прямо, противодействует диффузии, и при соответствующих условиях белки или иные амфотерные макромолекулы достигают своего равновесного положения, вблизи которого они концентрируются в виде необычайно узких зон. Как и следовало ожидать, разделение двух амфолитов, помимо всего прочего, определяется крутизной градиента pH, в котором происходит фокусирование. При данной геометрии разделительной колонки (при неизменной длине пути) разрешение тем выше, чем положе градиент (см. рис.6).

Рисунок 6 - Разделение амфолитов в зависимости от крутизны градиента pH.

В крутом градиенте pH (пунктирная линия А) два типа амфотерных молекул с изоточками plj и р1₂ расходятся лишь на небольшое расстояние (а). В более пологом градиенте pH (сплошная линия Б) разрешение значительно выше (расстояние б). (С любезного разрешения LKB Produkter АВ.)

Изначально ИЭФ было разработано как препаративный метод. Фракционирование проводили в градиенте плотности раствора сахарозы, который служил антиконвекционной средой, стабилизирующей градиент pH и сфокусированные белковые зоны. Эксперименты обычно выполняли в колонках объемом 110 или 440 мл; равновесие устанавливалось лишь через 2-4 сут. Проведение ИЭФ в этих условиях требовало большой затраты времени и тщательной стандартизации всех условий эксперимента.

Процесс регистрации сфокусированных зон был весьма кропотливым, а иногда и едва ли не безнадежным делом. Разумеется, в таком варианте метод был явно непригоден для проведения рутинных анализов. Многие недостатки, присущие методу ИЭФ в градиенте плотности, удалось преодолеть с введением более удобных антиконвекционных систем, таких, как полиакриламидный гель; сефадекс или агарозная матрица. Это позволила полностью 'реализовать необычайно широкие возможности ИЭФ - высокоэффективного метода разделения амфотерных макромолекул.

Методология ИЭФ в геле в настоящее время достаточно хорошо разработана как для аналитического, так и для препаративного вариантов разделения. В заключение отметим, что ИЭФ в геле - это на редкость благодарное занятие, поскольку при минимуме квалификации и вложенного труда экспериментатор получает высококачественные результаты [5].

Формирование и стабильность градиента рН

Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда удается осуществить в ходе одного опыта. Всегда достаточно высока вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения значений их электрофоретических подвижностей при выбранном значении pH, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после первого электрофоретического фракционирования смеси белков следует проверить на гомогенность, используя ее как исходный препарат для электрофореза в других условиях.

Это можно сделать одновременно для всех полос первого разделения, или, как его часто называют, "разделения в первом направлении". Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека из пластины первого направления, накладывают на стартовую зону пластины "второго направления". Контакт между двумя гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стартовым буфером или, для надежности, расплавленным раствором агарозы в этом же буфере.

Электрофорез ведут в направлении, перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомогенная белковая полоса может дать несколько пятен, если при новых условиях электрофореза подвижности первоначально образовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми. В результате на пластине второго направления после прокрашивания выявляется картица распределенных по всей поверхности пятен, напоминающая "фингерпринт" в двумерной тонкослойной хроматографии. Число пятен, которое удается различить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к двум тысячам.

При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно, чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из трубки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщиной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине следует образовать продольно расположенную полость, предпочтительно клиновидного сечения, куда можно заложить цилиндрик геля и залить его там буфером, агарозой или даже заполимеризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образования и форма сечения этой полости не играют большой роли. Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или полоска геля первого направления должны лежать параллельно краю геля в пластине второго направления. Можно, например, воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис.3). Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для электрофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978а]. Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают плоский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вырезания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии) удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].

Рис.3. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman, Dowben, 1978а]

В каждом из направлений двумерного электрофореза используют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую специфическим особенностям фракционируемых белков. Широкое применение двумерный электрофорез нашел, например, для анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном, слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют чаще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель, чтобы различие молекулярных размеров по возможности не сказывалось на разделении белков в этом направлении, т.е. не накладывалось на разделение по заряду. Во втором направлении в этом случае белки разделяют по их размерам. [4]

Заключение