Роль стохастических факторов в процессе формирования первичных повреждений ДНК и хромосомных аберраций при воздействии радиации на соматические клетки млекопитающих in vitro и in vivo

Для исследования первичных радиационно-индуцированных поврежде-ний ДНК в настоящей работе была разработана оригинальная биофизическая модель, включающая пространственную структуру биологической мишени, стохастическую структуру трека и воздействие свободных радикалов на радиационно-химической стадии. Использованные биофизические методы заключались в моделировании методом Монте Карло воздействия излучения на структуры живой клетки и межклеточного взаимодействия.

Хромосомные аберрации изучались метафазным методом в лимфоцитах крови человека. Использовалась стандартная методика IAEA (2001) с фиксацией на 48 ч после начала культивирования. Для анализа нестабильных и стабильных аберраций хромосом использовали стандартный метод окрашива-ния по Гимза и FISH-метод, соответственно. При анализе части генома методом FISH частота аберрации на весь геном составляла F_G = F_P / N_GE, где F_P -частота с участием только «окрашенных» хромосом, N_GE - число эквивалентных клеток (GEкл.), соответствующих числу проанализированных метафаз N. Эти величины связаны между собой по известной формуле Lucas J.N. et al. (1992).

Экспериментальные исследования с облучением образцов крови человека in vitro выполнялись на г-⁶⁰Co установке при комнатной температуре. Дозимет-рия выполнялась путем измерения мощности экспозиционной дозы иониза-ционной камерой VAK-253 с г-дозиметром 27012. Одновременно с биологи-ческими образцами в точках облучения размещались ТЛД-детекторы Li-F.

Материалом для исследования аберраций in vivo являлись образцы крови доноров и лиц, подвергшихся аварийному воздействию ионизирующего излуче-ния. В группе облучившихся лиц из 73 чел. было выполнено 265 анализов стандартным методом и 97 - методом FISH. Контрольная группа состояла из 398 человек, из них 386 чел. были обследованы стандартным методом, в среднем по 630 метаф/чел, 12 - методом FISH в среднем по 1500 метаф/чел.

Стандартные ошибки вычисляли для аберрантных клеток в предположении биномиального распределения, а для частоты аберраций - распределения Пуассона. Распределения аберраций по клеткам сравнивали с распределением Пуассона по U-критерию, Edwards A.A. et al. (1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе была исследована роль стохастических факторов в процессе образования первичных повреждений ДНК под влиянием ее пространственной организации и стохастической структуры трека заряженных частиц с различной ЛПЭ. В качестве наблюдаемых проявлений воздействия рассматривалось распределение одиночных (ОР) и двойных (ДР) разрывов ДНК с учетом их кластеризации, а также выход фрагментов ДНК, соотношение различных типов первичных повреждений ДНК и выживаемости клеток. Учитывался вклад прямого действия радиации и косвенное воздействие свободных радикалов. Были проведены экспериментальные исследования частоты хромосомных аберраций при облучении лимфоцитов крови человека in vitro. Закономерности частоты аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении in vivo были исследованы путем цитогенетического обследования аварийно облучившихся лиц в острый и отдаленный периоды. Полученные данные были обобщены в форме рекомендаций по совершенствованию методов ретроспективной биодозиметрии на основе частоты хромосомных аберраций.

1. Биофизическая модель взаимодействия ионизирующего излучения с биологическими структурами клетки.

Для решения поставленных в работе задач была разработана оригинальная биофизическая модель, которая состоит из взаимосвязанных компонент: (1)- пространственной структуры биологической мишени, (2)- стохастической структуры трека и (3)- диффузионно-рекомбинационной кинетики свободных радикалов. Состоятельность модели была установлена путем исследования на воспроизводимость таких физических величин как: ЛПЭ, энергия образования пары ионов, кинетика свободных радикалов, зависимость кинетики радикалов от ЛПЭ, поглощенной дозы и концентрации поглотителя свободных радикалов.

Основные постулаты разработанной модели состоят в следующем:

o воздействие излучения моделируется в виде представительного набора стохастических треков в форме совокупности точек передачи энергии с учетом как первичных взаимодействий, так и всех вторичных д-электронов;

o первичные продукты радиолиза воды (свободные радикалы) образуются в точках передачи энергии стохастического трека, при этом процесс диффузии и рекомбинации учитывается путем моделирования их кинетики методом Монте Карло с целью оценки косвенного действия излучения на ДНК;

o молекулярная структура ДНК конструируется с использованием координат атомов нуклеотидов и биологически обоснованных параметров простран-ственной конфигурации высших форм ее организации;

o ОР и ДР ДНК образуются в результате кластеризации повреждений сахаро-фосфатного остова за счет прямого и косвенного воздействия излучения;

o комплексные ДР, которые характеризуются низкой вероятностью репарации, являются причиной возникновения хромосомных аберраций;

o облученные клетки могут передавать интактным клеткам межклеточный сиг-нал, который распространяется в соответствии с законами диффузионно-рекомбинационной кинетики, что приводит к эффекту "свидетеля".

Модель применима для расчета микродозиметрических распределений поглощенной энергии в биологических мишенях с характерными размерами от 1 нм до десятков мкм при воздействии заряженных частиц нерелятивистских энергий от электрона до тяжелых ядер. На радиационно-химической стадии моделируется динамика свободных радикалов в течение 10^-12 - 10^-6 с после физической стадии воздействия. Модель структуры мишени реализована в атомарном и субобъемном вариантах. В первом случае структура ДНК представлена декартовыми координатами атомов, составляющих четыре типа нуклеотидов и сахаро-фосфатный остов. Во втором - нуклеотид представлен в виде сегмента коаксиального цилиндра диаметром 2,3 нм и толщиной 0,34 нм. Соответственно, в первом варианте расчеты повреждений ДНК производятся с точностью до координат отдельных атомов, а во втором - с точностью до координат отдельных нуклеотидов. Основные параметры модели образования разрывов таковы: е_min - пороговая энергия, поглощение которой в сахаро-фосфатном остове нуклеотида вызывает ОР; - минимальное расстояние между последовательными ОР на комплементарных цепочках ДНК, необходимое для образования ДР; _ssb и _dsb - расстояния между последователь-ными ОР и ДР, при превышении которых образуются новые разрывы.

В целом, в отличие от других стохастических подходов, разработанная биофизическая модель позволяет вычислять абсолютные значения вероятности поглощения энергии в различных структурах, эффективность образования первичных повреждений ДНК, декартовы координаты повреждений, размеры и координаты радиационно-индуцированных фрагментов ДНК.

2. Оценка роли стохастических факторов воздействия ионизирующего излучения в рамках микродозиметрической концепции.

В рамках микродозиметрической концепции была исследована роль геометрической формы моделей ядра клетки и субъядерных структур, включая различные формы высшей организации молекулы ДНК, а также фактор стохастической структуры трека без учета молекулярной структуры мишени. Целью исследования была проверка гипотезы о том, что конформации хроматина в клетке могут влиять на ее радиационную чувствительность.

Рис. 1 Вероятность одиночного события поглощения энергии в ДНК в форме линейного сегмента двойной спирали ( * ) и фибриллы хроматина ( Д ) с одинаковой массой 5,2 кПО при воздействии трека тяжелого иона в зависимости от ЛПЭ

Расчетным путем показано, что с увеличением компактизации мишени наблюдается снижение вероятности поглощения в ней энергии. В простейшем случае модели ядра клетки в форме эллипсоида и сферы вероятность поглощения энергии в сфере в 1,5 раза меньше, чем в эллипсоиде, на что указывает увеличение частотного среднего удельной энергии z_F для сферы. С ростом компактизации структуры ДНК возрастает роль событий с большой поглощенной энергией за счет кратных пересечений мишени одним треком при сворачивании двойной спирали ДНК в нуклеосому или фибриллу. На рис. 1 представлена вероятность поглощения энергии от трека тяжелого иона в линейном сегменте ДНК и в фибрилле хроматина в зависимости от ЛПЭ. Такая вероятность существенно ниже для компактной фибриллы по сравнению с линейным сегментом ДНК той же массы. Проявляется это в росте частотного среднего z_F от 1,5 до 50 раз при увеличении ЛПЭ от 2 до 10⁴ кэВ/мкм (рис. 1).

При исследовании фактора пространственной гетерогенности мишени был предсказан эффект "скользящего" воздействия (grazing effect) от тяжелой заряженной частицы, проходящей по границе сферического пропорциональ-ного счетчика. Приборы данного класса являются важными источниками микродозиметрических данных для оценки эффективности смешанных радиа-ционных полей и космического излучении. Путем моделирования структуры трека на границе плотной и разреженной среды была обоснована оригинальная интерпретация указанного эффекта за счет повышенного вклада вторичных д-электров, образующихся в стенке счетчика, Rademacher R.S. et al. (1998) (рис.3), где точками показаны экспериментальные значения поглощенной энергии в зависимости от прицельного параметра b. При b=R_SV, где R_SV - радиус чувствительной сферы, наблюдается резкий максимум.

Рис. 2 Поглощенная энергия в сферическом счетчике радиуса R_SV в зависимости от прицельного параметра b от ионов железа ⁵⁶Fe с энергией 1,05 ГэВ/нукл. Для сравнения приведены расчеты других авторов

В настоящем исследовании впервые показано, что этот эффект вызван вторичными д-электронами, образующимися в стенке счетчика. Расчеты других авторов не представили интерпретации эффекта. Кроме того, наши расчеты показали, что подобный феномен может наблюдаться только в сферическом счетчике при воздействии многозарядных тяжелых ионов больших энергий. В цилиндрических счетчиках проявление подобного эффекта не ожидается.

Фактор стохастической структуры трека, с учетом полного замедления первичных частиц в мишени, был исследован путем оценки воздействия протонов на клетки линии V79 при облучении их в монослое. На рис. 3 и рис. 4 представлены спектры линейной энергии «y» в ядре клетки и в сфере диаметром 1 мкм при облучении их протонами различных энергий. Результаты представлены в безразмерной форме y f(y), поэтому площадь под кривыми равняется среднему частотному y_F. Показано, что спектр линейных энергий от 10 МэВ протонов очень узкий, при этом ЛПЭ совпадает с y_F, которая в 1,2ч1,4 раза меньше y_D. Разброс линейных энергий от 250 кэВ протонов достигает 160 кэВ/мкм, что в 2,6 раза больше ЛПЭ первичного протона, при этом сама ЛПЭ немного меньше y_F, которая, в свою очередь, в 1,6 раза меньше y_D (рис.4).

Установлено, что на ядро клетки наиболее эффективно воздействуют протоны с энергией 550 кэВ, которые способны полностью в нем поглощаться. На субъядерные мишени с размерами порядка 1 мкм наиболее эффективно воздействуют пересекающие мишень протоны при условии, что их начальная энергия порядка 250 кэВ.

Рис. 3 Спектры линейной энергии при воздействии протонов с энергией E на ядро клетки V79

Рис. 4 Спектры линейной энергии при воздействии протонов с энергией E на сферу диаметром 1 мкм

Это означает, что 1 мкм сфере наиболее эффективно передают энергию «кроссеры», т.е. частицы, пересекающие мишень с потерей в нем существенной доли своей начальной энергии. В рамках микродозиметрической концепции дозовое среднее удельной энергии y_D коррелирует с биологической эффективностью, ICRU 36 (1983). По этому критерию протоны с энергией 550 кэВ в 13 раз более эффективны, чем 10 МэВ протоны при условии, что чувствительной областью клетки является ее ядро. Если же эффект определяется областью диаметром 1 мкм, то протоны с энергией 250 кэВ оказываются в 18 раз более эффективны, чем 10 МэВ протоны.

3. Биофизическое моделирование радиационных повреждений ДНК и хроматина, индуцированных излучением с различной ЛПЭ.

Анализ образования начальных повреждений ДНК является важным инструментом в изучении биологических эффектов действия радиации. Различия в относительной биологической эффективности (ОБЭ) в зависимости от ЛПЭ часто связывают со структурой первичных повреждений ДНК вследствие высокой плотности ионизаций. Предполагается, что большие ОБЭ излучений с высокой ЛПЭ обусловлены низкой эффективностью репарации локальных участков ДНК с множественными повреждениями, Ward J.F. (1994). Кроме того, эффективность репарационных систем в клетке может зависеть от распределения повреждений на масштабах значительно больших, чем десятки ПО, т.е. определяться параметрами надмолекулярной организации ДНК в клетке, Lobrich M. et al. (1996). Кластерное распределение повреждений в хроматине может быть обусловлено высокой объемной концентрацией участков цепи ДНК при ее сворачивании в структуры высших порядков. И если распределение повреждений в хроматине отличается от случайного, то взаимное расположение ДР может оказаться фактором, определяющим разли-чия в эффективности репарации, т.е. различия в ОБЭ в зависимости от ЛПЭ.

Рис. 5 Эффективность индукции одиночных (ОР) и двойных (ДР) разрывов в сегменте ДНК массой 54 ПО при прямом и прямом+косвенном воздействии электронов с энергией 1,5 кэВ (ЛПЭ=0,2 кэВ/мкм) и тяжелых заряженных частиц. Расчет проведен в рамках субобъемной модели

Путем моделирования индукции первичных повреждений с учетом прямого и косвенного действия была исследована эффективность образования ОР и ДР в линейном сегменте ДНК в зависимости от ЛПЭ (рис.5), где представлены результаты расчета при заданной дозе и высокой концентрации поглотителя радикалов гидроксила OH. Среднее время жизни этих радикалов составляло ф_OH = 0,95 10^-9 с (длина свободного пробега 4 нм), что соответствует внутриклеточным условиям с высокой эффективностью их поглощения. Полученные результаты (рис. 5) показывают, что при внутриклеточных условиях с ростом ЛПЭ в пределах от 1 до 120 кэВ/мкм вклад косвенного действия составляет ~30% при индукции ОР и ~30-40% для ДР. Оценка ОБЭ по ОР равна (0,77), а по ДР - (1,5), соответственно, что вызвано образованием кластерных повреждений ДНК при прямом и косвенном действии радиации.

Эффективность индукции повреждений ДНК в клетках линии V79 протонами различных энергий (включая область пика Брэгга) была исследована при помощи разработанной модели. В проведенных расчетах учитывалось снижение энергии протонов при их замедлении в клетке вплоть до полного поглощения. Эффективность индукции ОР и ДР в ядре клетки была рассчитана с учетом классификации разрывов на простые (ssb, dsb), сложные (ssb+, dsb+) и комплексные (2ssb, dsb++), Charlton D.E. et al. (1989). При расчетах использовалась субъобъемная модель ДНК в виде линейного сегмента массой 300 ПО. Для учета внутриклеточных условий с высокой концентрацией поглотителя радикалов OH применялась аппроксимация вклада прямого и косвенного действия с параметрами разрыва e_min = 17,5 эВ, (10,10,10) ПО в геометрии облучения клеток при заданной дозе. Результаты представлены на рис. 6 для протонов с энергией более 100 кэВ, которые могут пересечь слой цитоплазмы толщиной около 1 мкм на пути до ядра клетки.

Рис. 6 Рассчитанная эффективность двойных разрывов (ДР) ДНК в зависимости от энергии протона, воздействующего на линейный сегмент ДНК в ядре клетки V79 (сплошные линии, справа) в сопоставлении с экспериментальными величинами ОБЭ_MAX протонов (точки, слева)

На основе рассчитанной эффективности ДР для протонов была оценена их ОБЭ и сопоставлена с экспериментальными ОБЭ_MAX по выживаемости и частоте мутаций в клетках V79. Показано, что сложные (dsb+) и комплексные (dsb++) ДР более эффективно индуцируются протонами с энергией 400 кэВ по сравнению с 10 МэВ протонами в 5 и 9 раз, соответственно. Эти оценки хорошо согласуются с экспериментальными данными (рис.6). Остальные разновид-ности ОР и ДР качественно отличаются от экспериментальных зависимостей и не могут рассматриваться в виде показателей биологической эффективности. Выявленная значимость сложных и комплексных ДР в качестве критических повреждений согласуется с гипотезой о важной роли локальных кластеров ионизаций в структуре ДНК, Goodhead D.T. (1999), Ottolenghi M. et al. (1999), Ward J.F. (1995).

Эффективность репарационных систем на клеточном уровне может также зависеть от распределения повреждений на масштабах надмолекулярной организации ДНК в клетке. Неслучайное или кластерное распределение повреждений в хроматине может быть обусловлено высокой объемной концентрацией участков цепи ДНК при ее сворачивании в структуры высших порядков. Так, впервые предсказанное в настоящем исследовании и в работе Holley W.R. et al. (1995) неслучайное, кластерное распределение длин коротких фрагментов ДНК при воздействии тяжелых ионов нашло подтверждение в экспериментах Rydberg B. et al. (1996). На рис. 7 представлены результаты расчета распределений длин фрагментов ДНК для различных вариантов структуры хроматина, индуцированных ионами азота с ЛПЭ=98 кэВ/мкм, в сопоставлении с экспериментальным распределением, Rydberg B. et al. (1996).

Расчетные кривые показывают, что распределение коротких фрагментов зависит от параметров структуры фибриллы хроматина. Для фибриллы с меньшим числом нуклеосом на виток (5) и с бульшим шагом соленоида (22 нм) величина второго максимума уменьшается по сравнению с фибриллой с 7,4 нуклеосомами на виток и шагом соленоида 11 нм. Кроме того, положение максимума сдвигается в сторону меньших длин фрагментов и отношение второго максимума к локальному минимуму (при 500 ПО) существенно уменьшается. При этом форма теоретической кривой согласуется с наблюдаемой зависимостью в диапазоне фрагментов более 250-300 ПО.

Рис. 7 Расчетное и экспериментальное, Rydberg B. et al. (1996), распределения длин фрагментов ДНК индуцированных ионами азота в хроматине

Расчеты с помощью соленоидальной модели хроматина, параметры расчета: e_min = 17,5 эВ, (10,10,10) ПО.

Таким образом, расчеты показали, что распределение коротких фрагментов ДНК зависит от параметров структуры фибриллы хроматина, отражая нуклеосомный и фибриллярный уровень организации. Было доказано наличие кластеров ДР ДНК в хроматине, что согласуется с эксперименталь-ными измерениями коротких фрагментов ДНК в диапазоне до 3 тыс. ПО.

Роль мульти-петлевой интерфазной структуры ДНК была исследована при моделировании спектра фрагментов ДНК в диапазоне до 6 млн. ПО при воздействии ионов азота с ЛПЭ=125 кэВ/мкм. Для корректного сопоставления с экспериментальными данными был учтен спонтанный уровень ДР, равный 0,12 10^-6 ДР/ПО, Hoglund E. et al. (2000). При моделировании воздействия трека методом Монте Карло, вначале на мишени размещались спонтанные ДР, используя для их числа распределение Пуассона с заданным средним на геном (0,71 ДР) и эмпирически подобранную зависимость положения спонтанного ДР от центра розетки. Это позволило воспроизвести экспериментальное распре-деление фрагментов, вызванных спонтанными ДР (рис. 8). Распределение радиационно-индуцированных фрагментов моделировалось при параметрах разрыва e_min = 15 эВ, (10, 30, 30) ПО в рамках субобъемной модели.

Рис. 8 Расчетное и экспериментальное (Hoglung et al. 2000) распределения фрагментов ДНК, индуцированных ионами азота (ЛПЭ=125 кэВ/мкм) при воздействии на интерфазную хромосому в дозе 100 Гр. Наблюдаемые фрагменты: (I)- эксперимент (III) - расчет. Контрольный уровень (необлученные образцы): (II) - эксперимент, (IV) - расчет

На рис. 8 показаны расчетные и экспериментальные распределения коротких фрагментов ДНК, вызванных спонтанными и индуцированными ДР при облучении ДНК ионами азота. Ранее было показано, Pinto M. et al. (2000), что распределение наблюдаемых в опыте фрагментов ДНК не является простой суммой спонтанной и индуцированной компонент. В настоящей работе экспериментальное распределение моделировалось путем суперпозиции распределений спонтанных и индуцированных ДР на одной мишени. Рис. 8 показывает хорошее согласие экспериментального и теоретического распределений как для необлученной мишени, так и при воздействии ионов в дозе 100 Гр. В результате было установлено, что распределение фрагментов отличается от модели случайного равномерного распределения ДР по двойной спирали ДНК и зависит от ее мульти-петлевой интерфазной структуры. Наблюдаемое распределение длин фрагментов не совпадает с суммой индуци-рованной и спонтанной компонент из-за их взаимной зависимости. Выводы подтверждаются экспериментальными результатами Hoglund E. et al. (2000).

Таким образом, разработанная методика моделирования образования первичных повреждений ДНК позволяет корректно интерпретировать и планировать экспериментальные исследования спектров радиационно-индуцированных фрагментов ДНК при различных вариантах облучения.

Экспериментальные исследования показывают, что радиационно-индуцированные эффекты могут проявляться не только в облученных, но и в интактных (необлученных) клетках за счет эффекта межклеточного взаимодействия (bystander effect). Для учета этого эффекта была разработана биофизическая модель, основанная на гипотезе о диффузионном механизме распространения межклеточного сигнала (например, активного белка). Основные постулаты модели формулируются следующим образом: (1)- облученные клетки испускают межклеточные сигналы (bystander signals); (2)-сигналы диффундируют в межклеточной среде и взаимодействуют с необлученными клетками; (3)-радиус реакции сигнала с необлученной клеткой составляет примерно половину диаметра клетки-мишени; (4)- провзаимодейст-вовавшие с сигналом необлученные клетки также испускают межклеточные сигналы; (5)- наблюдаемые межклеточные эффекты (гибель клетки, трансфор-мация и т.д.) вызываются сигналами различных видов; (6)- сигналы не взаимо-действуют друг с другом; (7)- диффузией клеток-мишеней можно пренебречь.

Разработанная модель межклеточного взаимодействия была апробиро-вана на экспериментальных данных по воздействию на клетки млекопитающих среды, содержавшей облученные клетки и тяжелых ионов в геометрии широкого пучка и микропучка. Было показано, что при высоких дозах облучения тяжелыми ионами на каждую инактивированную прямым облучением клетку приходится примерно две клетки, погибшие за счет межклеточного взаимодействия. С ростом числа попаданий треков в ядро клетки (с ростом дозы) возрастает число инактивированных клеток и, следовательно, возрастает концентрация межклеточных сигналов.

Рост концентрации сигналов приводит к увеличению числа клеток, воспринявших такой сигнал, и повышению эффекта. В работе была получена оценка среднего числа межклеточных сигналов, которое может испускать клетка при облучении. Так, для -излучения она равна (1,2), а при воздействии б-частиц с ЛПЭ=90 кэВ/мкм число сигналов может варьировать от 6 до 12. Кроме того, получена оценка массы объекта, несущего сигнал менее 10 кДа, что существенно сужает область поиска физического носителя такого сигнала.

На рис. 9 представлена рассчитанная дозовая зависимость частоты трансформированных клеток при облучении монослоя клеток широким пучком -частиц в сопоставлении с экспериментальными данными и расчетом по модели Brenner et al. (2001). Модель межклеточного взаимодействия пред-сказывает увеличение начального наклона дозовой зависимости, что подтверж-дается в эксперименте. Такой эффект имеет важное значение для оценки радиационного риска отдаленных последствий облучения в малых дозах.

Известно, что в живой клетке радиационно-индуцированные поврежде-ния ее ядра восстанавливаются достаточно эффективно. Так, при -облучении соматической клетки человека в дозе 1 Гр в объеме ее ядра образуется порядка 100 000 пар ионов, что в итоге приводит, в среднем, к 500 ОР и 40 ДР ДНК. Из числа этих разрывов лишь незначительная часть, в основном, сложные, комплексные разрывы, сохраняется после процесса восстановления клетки. В том случае, когда повреждения ДНК оказываются все же нелетальными для клетки, но их репарация пошла по ошибочному пути, то в дальнейшем они могут проявляться в форме хромосомных аберраций. Помимо этого, для образования обменных аберраций необходимы дополнительные условия, в частности, разрывы ДНК должны относиться к разным хромосомам и располагаться в ядре клетки достаточно близко друг к другу и во времени и в пространстве. В итоге, при -облучении в дозе 1 Гр возникает в среднем всего лишь 1,5 - 2 обменные аберрации на 100 клеток, IAEA (2001).

Рис. 9 Частота индуцированных трансформированных клеток линии C3HT10Ѕ после воздействия широкого пучка -частиц (ЛПЭ=90 кэВ/мкм). Экспериментальные данные Miller R.C. et al. (1999). Сплошные линии - расчет: прямое действие (пунктир), прямое и межклеточное действие (сплошная). Для сравнения приведена модель Brenner et al. (2001)

Процесс формирования хромосомных аберраций имеет вероятностную природу. Их количественными показателями являются частота встречаемости аберраций среди облучённых клеток и распределение аберраций по клеткам. Одним из наиболее эффективных методов исследования закономерностей образования аберраций является метафазный метод анализа хромосом при облучении клеток in vitro и in vivo. В настоящей работе исследование аберраций было сосредоточено, главным образом, на задачах биологической дозиметрии при достаточно высоких дозах преимущественно -облучения.

4. Закономерности образования хромосомных аберраций при облучении лимфоцитов in vitro и in vivo.

Анализ радиационно-индуцированных хромосомных аберраций позволяет изучать как особенности первичного радиационного воздействия, так и возможности живой клетки восстанавливать поврежденную генетическую структуру путем репарации разрывов ДНК. Частота радиационно-индуцирован-ных хромосомных аберраций в клетках млекопитающих тесно связана с ОБЭ и, в ряде случаев, может использоваться для оценки воздействия ионизирующего излучения на отдельные органы или организм в целом, Natarajan A.T. (2002).

В настоящем работе изучалась частота спонтанных и радиационно-индуцированных аберраций в лимфоцитах крови человека. Индуцированные аберрации исследовались при облучении лимфоцитов in vitro в различных дозах и в образцах крови лиц, облучившихся в результате различных аварийных или неконтролируемых ситуаций с радиационным воздействием. Спонтанные аберрации изучались в контрольной группе из 386 человек различного пола и возраста (от 5 до 75 лет), где стандартным методом было проанализировано в сумме 243 830 метафаз для оценки частоты нестабильных аберраций и аномальных моноцентриков (АМ). В результате доля аберрантных клеток с нестабильными аберрациями хромосомного типа составила 0,24±0.01%, частота нестабильных аберраций равнялась 2,51±0.10 абер/1000кл, из них дицентриков 0,44±0,04 абер/1000 кл. При этом не было выявлено зависимости частоты дицентриков и центрических колец от пола и возраста. В этой же контрольной группе частота стабильных аберраций в форме АМ, со средним значением 0,260,03 абер/1000 кл, изменялась в пределах от 0,04 до 0,88 в зависимости от возраста обследованных лиц. Установлено, что регрессионная зависимость АМ от возраста имела вид: Y_MONO = (0,00960,0017)x(age), где Y_MONO - частота АМ на 1000 кл, (age) - возраст человека, лет.

В контрольной группе из 12 чел. мужского пола методом FISH было проанализировано в сумме 17 967 метафаз (5 857 клеточных эквивалентов) для оценки спонтанного уровня стабильных аберраций в форме полных и неполных транслокаций. Показано, что частота суммы полных и неполных транслокаций составила 8,51,2 абер/1000GEкл, из них полных транслокаций - 6,71,1 абер/1000GEкл. В силу немногочисленности группы собственную регрессионную зависимость от возраста построить не удалось. Однако полученные нами данные в отдельных возрастных группах полностью совпали с результатами работы Whitehouse C.A. et al. (2005), где возрастной контроль был исследован силами 7-ми Европейских лабораторий в группе их 385 человек и была получена зависимость спонтанной частоты транслокаций от возраста в виде: Y_T = (0,0930,0017)x(age) + (0,00110,0002)x(age)², где Y_T - частота суммы транслокаций на геном (на 1000GEкл), (age) - возраст человека, лет.

Дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированных аберраций при облучении образцов крови доноров in vitro была выполнена при окраске стандартным методом в группе из 4 человек в возрасте от 29 до 43 лет (2 муж. и 2 жен.). Исследовалась зависимость выхода аберраций при г-облучении ⁶⁰Co в дозах от 0,035 до 5,0 Гр с мощностью дозы от 0,06 до 0,5 Гр/мин. В результате были получены дозовые зависимости для суммы всех нестабильных аберраций, дицентриков, суммы дицентриков и центрических колец и ацентриков. В частности, дозовая зависимость частоты дицентриков имела вид:

Y_DIC = (0,017±0,013) + (1,43±0,22) D + (4,16±0,13) D²,

где Y_DIC - частота дицентриков на 100 кл, D - доза, Гр. Кроме того, получена дозовая зависимость частоты стабильных аберраций в форме АМ в виде:

Y_MONO = (0,32±0,27) D + (0,25±0,07) D²,

где Y_MONO - частота АМ на 100 кл., D - доза, Гр. Дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированных транслокаций при облучении образцов крови доноров in vitro была получена методом FISH в группе из 2 человек мужского пола в возрасте 29 и 37 лет. Исследовалась зависимость индукции транслока-ций при г-облучении ⁶⁰Co в дозах от 0.1 до 5.0 Гр с мощностью дозы 0.5 Гр/мин. В результате была получена зависимость в виде:

Y_TRN =(0,67±0,25) + (4,59±1,33) D + (2,92±0,51) D²,

где Y_TRN - частота транслокаций на 100 кл., D - доза, Гр. Полученные регресс-сионные коэффициенты дозовых зависимостей частоты нестабильных и стабильных аберраций хорошо согласуются с результатами других авторов. Закономерности индукции аберраций в лимфоцитах крови при облучении in vivo в больших дозах и с высокой мощностью дозы были исследованы в группе из 73 человек (табл. 1), из них 62 человека с острым облучением имели клинические последствия в форме ОЛБ, а у 56 человек имелась официальная запись о степени тяжести ОЛБ в сопроводительных документах.

Подгруппы обследованных лиц (табл. 1) имеют следующее происхож-дение: (АЭС) - пострадавшие при аварийных ситуациях на АЭС, главным образом, при аварии на ЧАЭС; (АПЛ) - военнослужащие ВМФ РФ, получив-шие высокие дозы при радиационных авариях на борту атомных подводных лодок (в период 1961-1984 гг.); (ЯО) - сотрудники учреждений, проводивших испытания ядерного оружия, которые стали участниками нештатных ситуаций и подверглись аварийному облучению; (ИСТ) - инциденты с источниками ионизирующих излучений (нарушения техники безопасности, потеря источни-ков, их воровство и пр.); (СРКФ) - работа профессиональных дозиметристов и сотрудников предприятия «Укрытие», которые в 1987ч1993 гг. принимали участие в исследовании разрушенного реактора внутри саркофага ЧАЭС.

Таблица 1

Подгруппы обследованных лиц при анализе индукции аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека in vivo при аварийном облучении

* возраст при облучении

Цитогенетические данные обследованной группы состояли из 265 результатов анализа аберраций стандартным методом и 97 анализов методом FISH, выполненных как в острый, так и в отдаленный (до 45 лет после облучения) период. Многие люди наблюдались повторно от 2 до 15 раз. Полученные результаты позволили детально исследовать зависимости частоты аберраций при облучении in vivo от таких факторов как степень тяжести ОЛБ, поглощенная доза, время после облучения и др.

Сопоставление частоты хромосомных аберраций при облучении in vitro и in vivo позволяет выявить особенности индукции и последующего формиро-вания аберраций в соматических клетках человека. Результаты сопоставления имеют важное практическое значение, поскольку дозовые зависимости выхода аберраций хромосом после облучения in vitro нашли широкое применение в качестве калибровочных кривых для биологической дозиметрии.

Так, анализ соотношения частоты дицентриков в остром периоде в диапазоне от 5 до 500 диц/100 кл и степени тяжести ОЛБ от I до IV степени тяжести в подгруппе из 21 человека показал, что между степенью тяжести ОЛБ и частотой дицентриков имеется четкая корреляция. Для такого сопоставления были отобраны лица с данными в пределах одного месяца после аварийного облучения, преимущественно из группы (АЭС) и (ИСТ). Расположенные по возрастанию частоты дицентриков, эти результаты представлены на рис. 10. Встречающийся в двух случаях повышенный уровень дицентриков может быть следствием дополнительного внутреннего облучения от короткоживущих радионуклидов при ингаляционном, пероральном или перкутантном (через кожу) путях поступления этих радионуклидов в организм человека.

Рис. 10 Соотношение частоты дицентриков в лимфоцитах крови облученных лиц и степени тяжести ОЛБ

Благодаря репрезентативным цитогенетическим данным удалось с хорошей статистической точностью оценить индивидуальную динамику числа аберрантных клеток в крови облучившихся лиц после облучения. Для ее описания была использована следующая двухфазная зависимость:

Y_AC=A₀ [ c exp(-t/T₁) + (1-c) exp(-t/T₂) ],