Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений

Специальность 03.01.06 ? Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Сиунова Татьяна Вячеславовна

Пущино ? 2011

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Владимир Васильевич Кочетков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Валентина Николаевна Хмеленина

кандидат биологических наук, Наталья Сергеевна Захарченко

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения, Пущино

Защита диссертации состоится «1» декабря 2011 г. в 10 часов 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук Кулаковская Т.В.

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами является одной из наиболее актуальных экологических проблем, поскольку затрагивает не только техногенные, но и природные ландшафты. По данным ВОЗ, никель и близкий по свойствам кобальт признаны веществами 2 класса опасности и канцерогенами. Территории, где осуществляется добыча или обработка металлов являются зонами чрезвычайной экологической ситуации, для которых характерно образование «биогеохимических провинций» с высоким содержанием никеля в воздухе, воде, почве и местных продуктах питания. По данным агрохимической службы Российской Федерации уровень загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является умеренным, однако почвы, загрязненные никелем, по занимаемой площади превосходят почвы, загрязненные свинцом, кадмием, цинком и другими высокотоксичными металлами (Аристархов, Харитонова, 2002). Основными источниками загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является неконтролируемое применение минеральных удобрений, а также осадков промышленных сточных вод, используемых в качестве мелиорантов (Аристархов, Харитонова, 2002).

В последнее десятилетие у производителей сельскохозяйственной продукции возрос интерес к применению биопрепаратов, разрабатываемых на основе ризосферных бактерий группы PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенов. Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что инокуляция растений ризосферными бактериями увеличивает риск аккумуляции металлов в растениях, выращиваемых на загрязненных почвах (Kamnev and van der Lelie, 2000; Zaidi et al., 2006; Белимов, 2008; Khan et al., 2009; Белимов, Тихонович, 2011). Устойчивые к тяжелым металлам ризосферные бактерии являются основой для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации загрязненных почв. В связи с этим представляется целесообразным исследовать ризосферные бактерии, обладающие разнообразными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, поскольку бактерии способны оказывать различное влияние на аккумуляцию металлов в растениях. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости к никелю/кобальту у бактерий, является активный экспорт токсичных катионов из клетки в окружающую среду. Роль данного механизма устойчивости исследовалась только в штаммах эндофитных бактерий в фиторемедиационных экспериментах с субстратами, загрязненными никелем (Lodewyckx et al., 2001) или в комплексе с хлорированными ксенобиотиками (Weyens et al., 2010; 2011). Однако исследованные эндофитные штаммы не обладали свойствами, характерными для бактерий группы PGPR. К настоящему времени ремедиационный потенциал аналогичных генетических систем устойчивости в ризосферных бактериях не изучен. В связи с этим актуальным является поиск природных или создание рекомбинантных штаммов ризосферных бактерий, обладающих системами экспорта никеля и других металлов. При этом следует учитывать способность бактерий к биосорбции и иммобилизации металлов, что является важным фактором, регулирующим поступление тяжелых металлов в растения. Исследование ризосферных бактерий, обладающих различными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, позволит понять принципы их взаимодействия с растениями и более эффективно реализовать генетический потенциал бактерий при разработке новых биотехнологий защиты растений и фиторемедиации почв, загрязненных как тяжелыми металлами, так и в комплексе с органическими токсикантами.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к никелю/кобальту штаммов PGPR Pseudomonas и исследование их взаимодействия с растениями в условиях загрязнения тяжелыми металлами.

В соответствии с данной целью решались следующие задачи:

1. Из различных экологических ниш выделить и идентифицировать бактерии, содержащие плазмиды устойчивости к никелю (кобальту, цинку, кадмию), и определить соответствующие детерминанты устойчивости.

2. Получить на основе различных видов PGPR Pseudomonas и выделенных плазмид новые штаммы, устойчивые к кобальту/никелю. Исследовать физиолого-биохимические особенности трансконьюгантов.

3. Исследовать у полученных ризосферных штаммов особенности аккумуляции металлов из среды культивирования.

4. Исследовать влияние устойчивых к кобальту/никелю ризосферных штаммов на аккумуляцию никеля в растениях и на параметры роста растений в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.

5. Сконструировать штаммы ризосферных бактерий, содержащие совместимые плазмиды - устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ). Исследовать у полученных штаммов эффективность биодеградации нафталина в присутствии никеля в среде культивирования и способность стимулировать рост растений в условиях, моделирующих смешанное загрязнение ПАУ (включая нафталин и фенантрен) и никелем.

Научная новизна работы

Впервые у бактерий рода Comamonas обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Установлено, что плазмида pBS501 содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную cnr оперону плазмиды pMOL28 из Cupriavidus metallidurans CH34 . Впервые показано, что экспрессия системы устойчивости cnr-типа из Comamonas testosteroni в штаммах PGPR Pseudomonas обеспечивает их выживаемость при высоких концентрациях никеля при сохранении комплекса свойств, обеспечивающих стимуляцию роста растений. Сконструированы штаммы PGPR Pseudomonas, содержащие природные плазмиды биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) и устойчивости к кобальту/никелю. Показана способность штаммов к полной утилизации модельного ПАУ в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании. ризосферный штамм бактерия

Научно-практическая значимость работы

Получен устойчивый к кобальту/никелю штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), аккумулирующий из среды до 17% кобальта, который может быть использован в биотехнологиях очистки промышленных сточных вод от солей кобальта/никеля. Штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), стимулирующий рост ячменя и препятствующий аккумуляции никеля в растительной биомассе, можно использовать при разработке биопрепарата для защиты растений, выращиваемых на почвах с загрязнением никелем до 5 ПДК. Полученные устойчивые к никелю/кобальту ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут использоваться при разработке технологий очистки промышленных сточных вод, а также в качестве нового поколения биопрепаратов для защиты/стимуляции роста растений или биоремедиации почв со смешанным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и солями никеля/кобальта. Штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтвержден патентом РФ на изобретение №2396339.

Апробация материалов работы

Основные результаты диссертации были представлены на 9 конференциях: «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в ХIХ?ХХI веках», Всероссийская конференция, 14?19 июня 2001, Санкт-Петербург; Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология 2003», 22?26 сентября 2003 г., Сочи; 1-я Международная геоэкологическая конференция. Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, 30?31 октября 2003 г., Тула; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, научно-практическая конференция, 18?19 ноября 2005, Наукоград Пущино; 4^th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; 11 International symposium on Microbial Ecology - ISME-11, Vienna, Austria, August 20?25, 2006; 2^nd International Conference «Rhizosphere», August 25?31, 2007, Montpellier, France; 4^th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16?18, 2007, Colchester, England.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 6 статей, 2 главы в книгах, 9 тезисов, 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц и 22 рисунка. Библиография насчитывает 231 наименование, из них 47 отечественных и 184 зарубежные работы.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

Устойчивые к тяжелым металлам бактерии выделяли из ризосферы растений, образцов почвы и промышленных сточных вод. В работе также использовали штаммы Comamonas из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино), ризосферные штаммы Pseudomonas и фитопатогенные грибы коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН (Пущино).

Культивирование бактерий проводили при 28°С на среде LB (Маниатис и др., 1984) и трис-минеральной среде (ТМС) (Мergeay et al., 1985). В качестве источника углерода и энергии добавляли глюкозу, глютамат натрия или нафталин. Соли металлов: CoCl₂ 6H₂O, NiCl₂ 6H₂O, CdSO₄ 8H₂O, ZnSО₄ 7H₂O, K₂CrO₄ добавляли в среду до конечных концентраций 0.005?10 мМ.

Конъюгационный перенос плазмид осуществляли согласно (Dunn and Gunsalus, 1973). Трансконъюгантные штаммы Pseudomonas отбирали на ТМС, содержащей 0.5 мМ кобальта или 1?2 мМ никеля.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли методом щелочного лизиса (Birnboim and Doly, 1979).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы «Hybide» (Великобритания) в 20?50 мкл смеси по протоколу фирмы-производителя «Fermentas» (Литва). В ПЦР использовали разработанные нами праймеры, фланкирующие структурные гены оперона устойчивости к кобальту/никелю cnr плазмиды pMOL28 из C. metallidurans CH34: cnrCB P_f2350 (5'tgaaacaggtgatctcctcgttcc3') и P_r4850 (5' tcggcacagattctgtcaggcgt3'), cnrA P_f4800 (5'gtggactcgcaaactcatgcttcc3') и P_r8050 (5'ccgctgagaatgctctcgatcat3'). Использовали протоколы проведения ПЦР: для амплификации генов с плазмиды pMOL28 (контроль) : 1 цикл ? 96С 1 мин; 25 циклов ? 95С 30 с, 55С 40 с, 72С 2 мин 40 с; 1 цикл ? 72С 3 мин; для амплификации генов с плазмиды pBS501: 1 цикл ? 96С 1 мин; 2 цикла ? 96С 40 с, 42С 40 с, 72С 2 мин 40 с; 25 циклов ? 95С 30 с, 55С 40 с, 72С 2 мин 40 с; 1 цикл ? 72С 3 мин.

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI, HindIII, BamHI, PstI, SmaI проводили согласно протоколу, рекомендованному фирмой_производителем («Fermentas», Литва).

Включение радиоактивной метки в рестрикционные фрагменты ДНК осуществляли с помощью Decalabel^TM DNA labeling kit («Fermentas», Литва) по протоколу фирмы-изготовителя. В качестве зондов использовали [³²P]-меченые фрагменты клонированных оперонов устойчивости czcCBAD, cnrXYHCBA, nccCB (плазмиды любезно предоставлены доктором Д. Нисом (D.H. Nies, Institute of Microbiology, Halle, Germany). Мечение ампликонов осуществляли во время ПЦР, добавляя в реакционную смесь [бP³²]dATP. ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методике, описанной (Sambrook et al., 2001).

Для амплификации и секвенирования фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальные праймеры (Lane, (1991). ПЦР-фрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, USA), используя набор реагентов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Beckman Coulter, USA). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК анализировали с помощью пакетов программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov) и CLUSTAL W (http://www.genebee.msu.su/clustal). Построение филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR), реализованным в пакете программ TREECON (Van de Peer et al., 1994).

Солюбилизацию поверхностных белков проводили 5 М хлоридом лития согласно методу (Lortal et al., 1992) с модификациями. Электрофорез белков проводили согласно (Laemmli, 1970).

Концентрацию кобальта в бактериальных клетках, выращенных в присутствии 0.25?2 мМ хлорида кобальта, определяли с помощью пламенной атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе AAS-5100/Zeeman (Perkin-Elmer).

Ультратонкие срезы клеток бактерий готовили согласно методике (Reynolds, 1963) и просматривали в электронном микроскопе JEM 100B («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, а негативно контрастированные клетки - при 60 кВ.

Удельные активности ферментов нафталиндиоксигеназы (Dua and Meera, 1981), салицилатгидроксилазы (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974), катехол-2,3-оксигеназы (Hegeman, 1966), катехол-1,2-оксигеназы (Feist and Hegeman, 1969) определяли в бесклеточных экстрактах клеток, выращенных в ТМС на нафталине (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля и без металла, на UV_160А спектрофотометре (Shimadzu, Япония). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (Kalb and Bernlohr, 1977).

Концентрацию нафталина в среде определяли с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS-2 C18, Supelco (США). Разделение проводилось в градиенте: 1% уксусная кислота: (0?100%) метанол в течение 10 мин. Процент деградации нафталина определяли, учитывая его естественное испарение в контроле - среда с нафталином (1 г/л) без бактерий.

Вегетационные эксперименты, моделирующие загрязнение никелем, проводили в течение 4 недель на станции искусственного климата «Биотрон» (ФИБХ). Семена ярового ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (10⁸ клеток/мл) штаммов P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г субстрата (торф : песок, 3 : 1 (pH 6.2)). Хлорид никеля вносили в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг. Через 2 недели определяли титр бактерий в ризосфере (КОЕ/см корня), в конце эксперимента массу растений и концентрацию никеля в корнях и надземной части растения. Эксперименты проводили в 8-кратной повторности.

Концентрацию никеля в растительных образцах определяли спектрофотометрически (СФ-26, =470 нм) с диметилглиоксимом в присутствии окислителя йодида калия согласно методике (Алимарин и Иванов, 1987). Концентрацию никеля рассчитывали в мг/кг сухой массы растений.

Вегетационные эксперименты, моделирующие смешанное загрязнение ПАУ и никелем проводили в течение 4 недель с естественным световым и температурным режимами. Семена сорго сорта «пищевое» и ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (10⁸ клеток/мл) штаммов-деструкторов ПАУ P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г серой лесной почвы (рН 7.05). В качестве загрязнителей в почву вносили нафталин (1 г/кг) в варианте с сорго или смесь ПАУ (нафталин (1 г/кг) и фенантрен (0.2 г/кг)) в варианте с ячменем. Почву увлажняли раствором сульфата никеля (конечная концентрация 400 мг/кг). Через 4 недели определяли титр ризосферных бактерий и массу растений. Эксперименты проводились в 3_ кратной повторности.

Результаты и обсуждение

1. Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку, кадмию

На первом этапе работы проводили поиск бактерий, устойчивых к никелю, кобальту, цинку и кадмию, в ризосфере (1) дикорастущих растений заповедника (г. Владивосток), (2) культурных злаков, выращиваемых на сельскохозяйственной почве (г. Краснодар) и (3) диких злаков, собранных на заводской территории автозавода «СеАЗ» (г. Серпухов). Оказалось, что у ризосферных псевдомонад уровень устойчивости к никелю и цинку не превышал 2?3 мМ, кобальту ? 0.5 мМ, кадмию ? 0.2 мМ (кроме бактерий из 3 группы, которые были устойчивы к 2 мМ кадмия). Поэтому поиск высокорезистентных бактерий был продолжен в техногенно-загрязненных источниках: в почвах с территории нефтеперерабатывающего завода (г. Нижнекамск) и пробах промышленных сточных вод «Горьковского металлургического завода» (г. Нижний Новгород). Только в последних пробах были обнаружены бактерии, устойчивые к высоким концентрациям никеля/кобальта (3?8 мМ), цинка (3?5 мМ) и кадмия (2?3 мМ) (табл. 1).

Последующая задача состояла в обнаружении в этих бактериях плазмид, содержащих функциональные детерминанты устойчивости к тяжелым металлам, для переноса в известные штаммы PGPR Pseudomonas. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости у бактерий, является быстрый экспорт тяжелых металлов с помощью мембранной помпы. Известны три типа оперонов, которые детерминируют этот механизм устойчивости: cnrXYHCBAT (Co^r/Ni^r), czcCBADRSNI (Co^r/Zn^r/Cd^r) (Mergeay et al., 1985) и nccCBAYXHN (Ni^r/Co^r/Cd^r) (Schmidt and Schlegel, 1994). Фрагменты этих оперонов были использованы в качестве зондов для поиска гомологичных систем среди отобранных 42 штаммов со средним уровнем устойчивости к нескольким металлам. В табл. 1 представлены результаты положительной гибридизации, выявленные у 13 штаммов.

Таблица 1. Результаты гибридизации ДНК колоний выделенных устойчивых штаммов с зондами czcCBAD, cnrXYHCBAT и ncсСB

Примечания: ¹ На основании морфо-физиологических признаков изолят отнесен к Pseudomonas sp.; ² н.о. - не определен до рода; ³ изолят W28 (лабораторный номер BS501(pBS501)) в дальнейшем идентифицирован как Comamonas testosteroni. Штаммы, выделенные из ризосферы (R), почвы (S), воды (W). ⁴ В скобках указана максимальная концентрация металла (мМ) в среде LB, при которой наблюдается рост штамма. (?) Отсутствие сигнала, (+) сильный, (±) слабый сигналы гибридизации.

Как видно из табл. 1, у пяти ризосферных и почвенных псевдомонад выявлена гомология с зондом czcCBAD, однако эти штаммы были чувствительны к никелю и не содержали плазмид. У восьми штаммов, выделенных из сточной воды, выявлены сигналы гибридизации с зондами czcCBAD (3 штамма), ncсСB (2 штамма) и одновременно с двумя зондами cnrXYHCBAT/ncсСB (3 штамма). Только в этой группе бактерий обнаружены 5 плазмидосодержащих штаммов.

2. Характеристика детерминанты устойчивости к кобальту/никелю в штамме Comamonas testosteroni BS501(pBS501)

2.1 Плазмидная локализация

Наибольший интерес для дальнейших исследований представлял выделенный из пробы сточной воды штамм W28, (лабораторный номер BS501(pBS501)) устойчивый к 5 мМ кобальта, 5 мМ никеля и 2 мМ цинка. В штамме обнаружена плазмида pBS501 размером около 65 т.п.н. (рис. 1, дорожка 1), которая передавалась при конъюгации в чувствительные штаммы P. putida BS394 и W340 с частотой 10-⁶ и обеспечивала устойчивость только к 2 мМ кобальта и никеля. Из данных Таблицы 1 видно, что при гибридизации ДНК колоний штамма BS501(pBS501) были выявлены 2 сигнала - сильный с зондом cnr и слабый с зондом ncc. Однако, гибридизация EcoRI-, HindIII- и SalI-фрагментов рестрикции ДНК pBS501 с этими зондами выявила только один положительный сигнал с опероном cnrXYHCBA, локализованным на плазмиде pMOL28.

Рис. 1. Электрофорез плазмидных ДНК из штаммов: (1) W28 (BS501(pBS501)) (65 т.п.н.), (2) W29 (90 т.п.н.); маркерные плазмиды: (3) pMG18 (102 т.п.н.), (4) pBS216 (85 т.п.н.), (5) pULB113 (68 т.п.н.).

2.2 Идентификация штамма BS501(pBS501)

До настоящего времени обнаружены только три плазмиды, содержащие функциональные детерминанты устойчивости: pMOL28 (cnr) и pMOL30 (czc) в Cupriavidus metallidurans CH34 (Mergeay et al., 1985) и pTOM9 (ncc) в C. metallidurans 31a (Schmidt and Schlegel, 1994). Плазмида pBS501 (65 т.п.н.) в отличие от pMOL28 (180 т.п.н.), значительно меньшего размера и не детерминирует устойчивость к хромату и ртути. Поэтому несомненный интерес представляло выяснение таксономического положения штамма BS501(pBS501). По совокупности морфологических, физиолого-биохимических признаков и по результатам сравнительного анализа последовательности гена 16S рибосомальной РНК штамм BS501(pBS501) отнесен к роду Comamonas (класс Betaproteobacteria, порядок Burkholderiales, семейство Comamonadaceae), и идентифицирован как Comamonas testosteroni (рис. 2). В бактериях рода Comamonas описаны плазмиды, несущие гены биодеградации толуолсульфоната, сульфобензоата, хлоро- и нитробензенов, фталатов и других токсичных ксенобиотиков (Tralau et al., 2001; Wu, et al., 2006). Хотя в геномах бактерий порядка Burkholderiales выявлены последовательности, гомологичные cnr и ncc (Stoppel and Schlegel, 1995), их исследование не проводилось, и плазмиды, контролирующие устойчивость к двухвалентным катионам, в Comamonas до настоящего времени не были обнаружены.

Рис. 2. Положение штамма Comamonas testosteroni BS501(pBS501) на филогенетическом дереве порядка Burkholderiales (класс Betaproteobacteria) на основании последовательности гена 16S рРНК. Масштаб (0.01) соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON.

Праймеры, фланкирующие структурные гены cnrCB и cnrA оперона cnr плазмиды pMOL28, были использованы в ПЦР с плазмидной ДНК pBS501. Различия, обнаруженные в спектре и размерах ампликонов, свидетельствуют о том, что исследуемая детерминанта отличается от оперона cnr (рис. 3а, дорожки 4, 5). В то же время, положительная гибридизация с зондами cnrCB (рис. 3б, дорожка 4) и cnrA (рис. 3в, дорожка 5) указывает на их значительную гомологию.

Рис. 3. Выявление гомологии детерминанты устойчивости к кобальту/никелю плазмиды pBS501 с ³²Р-меченными ампликонами cnrCB (б) и cnrА (в). (а) Электрофореграмма: 1 ? HindIII; 2 и 3 ? ампликоны cnrCB и cnrА, соответственно, с плазмиды cnrXYHCBA:pSUP202 («+» контроли); 4 и 5 ? ампликоны «cnrCB» и «cnrА», соответственно, с плазмиды pBS501.

2.3 Индукция устойчивости к кобальту/никелю

Экспрессия оперона cnr в C. metallidurans CH34 индуцируется катионами кобальта и никеля (Schmidt and Schlegel, 1994). Предварительное выращивание инокулята штамма C. testosteroni BS501(pBS501) при 10?200 мкМ никеля или кобальта с первых часов обеспечивало быстрый рост культуры в среде, содержащей 2 мМ кобальта или никеля (рис. 4, кривые 1, 2), тогда как в вариантах без индукции наблюдалась продолжительная лаг-фаза (4?6 ч) (рис. 4, кривая 3). Из рисунка видно, что катионы цинка и кадмия не являются индукторами устойчивости (рис. 4, кривые 4 и 5).

Рис. 4. Влияние индукции системы устойчивости катионами тяжелых металлов на рост C. testosteroni BS501(pBS501) в присутствии 2 мМ никеля. Инокулят выращивали при: (1) 20 мкМ Ni, (2) 50 мкМ Со, (4) 200 мкМ Zn, (5) 50 мкМ Cd, (3) без индукции.

2.4 Устойчивость цитоплазматической мембраны клеток исходного штамма C. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта P. putida BS394(pBS501) к воздействию кобальта

С помощью метода электроориентационной спектроскопии (ЭОС) (Мирошников и др., 1986) показано, что цитоплазматическая мембрана (ЦМ) клеток C. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта P. putida BS394(pBS501), инкубированных в присутствии 50?200 мкМ кобальта, подвергается лишь незначительному повреждению. Так, при 100 мкМ кобальта для клеток C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida BS394(pBS501) величина /_к, характеризующая степень повреждения ЦМ, составила ?0.130.05 и ?0.150.05, соответственно, тогда как для чувствительного штамма P. putida BS394 /_к = ?0.480.2. После мягкой обработки клеток штамма C. testosteroni BS501(pBS501) трипсином степень повреждения его ЦМ при воздействии 100 мкМ кобальта увеличивалась до ?0.540.1, что может указывать на наличие защитных белков на поверхности клеток C. testosteroni BS501(pBS501). С поверхности клеток штаммов C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida BS394(pBS501) 5 М хлоридом лития солюбилизировались белки массой около 49, 40 и 32 кДа, которые отсутствовали у чувствительного штамма P. putida BS394 (рис. 5). Обнаруженные белки оказались близки по массе белкам, кодируемым сnr-опероном из C. metallidurans CH34: CnrC (44 кДа), CnrB (40 кДа) и CnrT (37 кДа) (Liesegang et al., 1993).

Рис 5. Электрофореграмма белков, солюбилизированных 5 М хлоридом лития с поверхности клеток устойчивых штаммов, в 9% ПААГ-ДСН: (1) белковые маркеры (кДа), (2) P. putida BS394, (3) C. testosteroni BS501(pBS501), (4) P. putida BS394(pBS501).

Измерения ЭОС клеток проводились при 20С через 15 мин после внесения в бактериальную суспензию кобальта. Поэтому обнаруженные поверхностные белки могли участвовать в процессах экспорта катионов тяжелых металлов из клеток исследуемых устойчивых бактерий, однако не исключено также их участие в биосорбции и иммобилизации металлов.

3. Характеристика штаммов PGPR Pseudomonas, содержащих плазмиду pBS501

3.1 Получение устойчивых вариантов PGPR

Плазмида pBS501 с помощью конъюгации была перенесена в ризосферные штаммы P. aureofaciens BS1393, P. fluorescens 38a и P. chlororaphis PCL1391. С частотой 10^?4?10^?5 получены трансконъюганты, в которых плазмида стабильно сохраняется в неселективных условиях, как минимум, в течение 10 пассажей и обеспечивает повышение устойчивости к кобальту (0.5?2.0 мМ) от 5 до 20 раз, и никелю (1.0?2.5 мМ) от 2 до 10 раз (табл. 2).

Таблица 2. Уровни устойчивости к тяжелым металлам штаммов Pseudomonas и Comamonas в трис-минеральной среде с глютаматом натрия или глюкозой

3.2 Супрессия фитопатогенов и продукция индольных соединений ризосферными штаммами в присутствии кобальта/никеля

Исходные ризосферные штаммы являются продуцентами фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и противогрибных антибиотиков - феназинов (P. aureofaciens BS1393), пиолютеорина (P. fluorescens 38a) и феназинкарбоксамида (P. chlororaphis PCL1391). Известно о положительном влиянии микромолярных концентраций тяжелых металлов на синтез ИУК (Belimov et al., 2000, Белимов, 2008) и некоторых антибиотиков (Slininger and Jackson, 1992; Chin-A-Woeng et al., 1998 Duffy and Defago, 1999). В настоящей работе показано, что в культуральной среде устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501), выращенных в присутствии 2 мМ никеля или кобальта, концентрация индольных соединений (1.6?2.0 мкг/мг биомассы) в 1.5?2 раза выше по сравнению с чувствительными вариантами.

В ходе работы выявлено, что большинство видов фитопатогенных грибов родов Fusarium, Rhizoctonia или Geumanomyces обладает более высоким уровнем устойчивости к кобальту и никелю, чем исследуемые ризосферные бактерии. Однако ризосферные штаммы, содержащие плазмиду pBS501, при совместном выращивании с различными видами перечисленных фитопатогенов, подавляли рост грибов в присутствии 2 мМ кобальта или никеля, в отличие от исходных штаммов. На рис. 6 показан пример супрессии Fusarium oxysporum устойчивыми штаммами P. aureofaciens BS1393(pBS501), P. fluorescens 38a(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501) (1?3) при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля. В то же время чувствительные варианты BS1393 (4) и 38a (5) слабее подавляли рост гриба, а штамм PCL1391 (6) зарастал грибным мицелием.

Рис. 6. Супрессия Fusarium oxysporum ризосферными штаммами при совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля: (1) P. aureofaciens BS1393(pBS501), (2) P. fluorescens 38a(pBS501), (3) P. chlororaphis PCL1391(pBS501); (4) BS1393, (5) 38a, (6) PCL1391.

3.3 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами

На основе штамма P. aureofaciens BS1393 разработан и широко применяется биопрепарат для защиты и стимуляции роста растений «Псевдобактерин-2» (Боронин, Кочетков, 1995). В связи с загрязнением почв тяжелыми металлами необходимо было выяснить возможность использования устойчивого варианта BS1393(pBS501) на загрязненных почвах. Было показано, что при выращивании P. aureofaciens BS1393(pBS501) и C. testosteroni BS501(pBS501) в среде, содержащей от 0.25 до 2 мМ хлорида кобальта, в клетках штаммов увеличивалось содержание кобальта (табл. 3).

Таблица 3. Аккумуляция кобальта штаммами C. testosteroni BS501(pBS501) и P. aureofaciens BS1393(pBS501)

Из данных табл. 3 видно, что ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) аккумулировал в 3?6 раз больше металла по сравнению со штаммом C. testosteroni BS501(pBS501). При концентрации кобальта в среде до 0.5 мМ через 18 часов роста в биомассе ризосферного штамма наблюдалась максимальная аккумуляция ? до 17%. При субингибирующей концентрации металла в среде (2 мМ) его аккумуляция понижалась до 7%. Штамм C. testosteroni BS501(pBS501), имеющий более высокий уровень устойчивости (5 мМ), аккумулировал не более 4%.

3.4 Локализация кобальта в клетках

На поверхности клеток устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) (рис. 7а) и C. testosteroni BS501(pBS501) (рис. 7б), выращенных в присутствии кобальта, обнаружены электронно-плотные гранулы и кристаллиты, соответственно.

Рис. 7. Ультратонкие срезы клеток P. aureofaciens BS1393(pBS501) (а), C. testosteroni BS501(pBS501) (б), P. aureofaciens BS1393 (в), выращенных в присутствии 2 мМ кобальта, и P. aureofaciens BS1393(pBS501) (г), выращенных в среде без кобальта. Стрелками указаны электронно-плотные структуры в виде гранул (а, в) и кристаллитов (б). Шкала 0.5 мкм.

В чувствительном штамме P. aureofaciens BS1393 гранулы были обнаружены не только на поверхности клеток, но также в цитоплазме и периплазматическом пространстве клеток (рис. 7в), что может объясняться отсутствием у данного штамма системы вывода токсичных катионов. Возможно, что гранулы в клетках P. aureofaciens BS1393 и BS1393(pBS501) представляют собой конгломераты связанных с кобальтом клеточных метаболитов, например, сидерофоров, феназиновых производных или экзополисахаридов, которые синтезируются во время роста штаммов. В пользу этого предположения свидетельствует отсутствие гранул после инкубации отмытых клеток в среде с кобальтом, хотя в этом случае клетки накапливали до 2 мкг Со/мг биомассы.

4. Ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем

Известно, что соли никеля более токсичны для растений, чем соли кобальта (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Поэтому в вегетационных экспериментах c растениями ячменя исследовали способность штамма P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищать растения от аккумуляции никеля. Никель вносили в торфосмесь в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг, что согласно гигиеническим нормативам соответствует примерно 2.5, 5 и 10 ПДК валового содержания никеля. Предварительные эксперименты показали, что при данных концентрациях никель оказывает негативное влияние как на рост ячменя, так и на численность бактерий в ризосфере.

При загрязнении 235 мг никеля/кг торфосмеси (2.5 ПДК) устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обладал численным преимуществом в ризосфере ячменя по сравнению с бесплазмидным вариантом P. aureofaciens BS1393. Через 2 недели роста растений численность устойчивого штамма в ризосфере (6.210⁸ КОЕ/см корня) была на два порядка выше численности чувствительного штамма BS1393 (5.410⁶ КОЕ/см корня). Очевидно, это преимущество и обеспечило бульшую стимуляцию роста растений (рис. 8).

Рис. 8. Развитие растений ячменя при уровне загрязнения никелем 2.5 ПДК (1, 3, 4); 1 - растения без инокуляции; 3 и 4 - растения инокулированы штаммами P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501), соответственно; 2 - растения без инокуляции, выращенные в чистом субстрате.

При сравнении массы инокулированных и контрольных растений было показано, что даже в условиях загрязнения никелем чувствительный штамм P. aureofaciens BS1393 обеспечивал увеличение массы корней в 2.5 раза и надземной части растений на 30%. Однако устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) более эффективно стимулировал рост растений: обеспечивал прирост массы корней в 4.5 раза и надземной части растений на 48% (табл. 4). В среднем общая масса растения, инокулированного P. aureofaciens BS1393(pBS501), была на 40% больше массы растения, инокулированного P. aureofaciens BS1393. При этом плазмидосодержащий штамм, по сравнению с исходным штаммом, обеспечивал двукратное увеличение массы корней и на 14% ? надземной части растений.

Таблица 4. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 235 мг Ni/кг торфосмеси (2.5 ПДК)

Помимо стимулирующего эффекта на растения, инокуляция семян ячменя устойчивым штаммом способствовала снижению токсического воздействия никеля на растения и уменьшению аккумуляции металла в растительных тканях. Как видно из данных табл. 4, в корнях растений, инокулированных плазмидосодержащим штаммом, концентрация никеля (108 мг никеля/кг сухой массы растений), была в 3 раза меньше, чем в корнях растений, инокулированными исходным штаммом (330 мг никеля/кг массы растений). В надземной части растений содержание никеля было сравнимо при обоих вариантах инокуляции (80?100 мг никеля/кг массы растений) (табл. 4). Поскольку в ризосфере растений численность устойчивого штамма была значительно выше численности чувствительного, возможно, именно это способствовало большей иммобилизации никеля бактериями и уменьшению концентрации свободных катионов в зоне всасывания корней.

При загрязнении 470 мг никеля/кг торфосмеси (5 ПДК) через 2 недели роста растений было отмечено уменьшение численности интродуцированных бактерий в ризосфере (до 10⁵ КОЕ/см корня) и отсутствие стимулирующего влияния на массу растений (табл. 5). Однако, даже при такой низкой численности клеток содержание никеля в корнях растений, инокулированных штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS501) (1110 мг никеля/кг массы растений), было на 30% меньше, чем в растениях, инокулированных исходным штаммом (1490 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5).

Таблица 5. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию никеля в растениях при содержании 470 мг Ni/кг торфосмеси (5 ПДК)

В надземной части растений, инокулированных как устойчивым, так и чувствительным штаммами, содержание никеля было одинаковым (160 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5). Однако, как видно из рис. 9, штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищал растения от токсического воздействия никеля. При инокуляции устойчивым штаммом количество растений с признаками хлороза (обесцвечивания листьев) на протяжении 4-х недель роста увеличивалось не так стремительно (от 7 до 50%), как при инокуляции исходным штаммом (от 20 до 80%) или в вариантах без инокуляции (от 17 до 80%) (рис. 9).

Рис 9. Влияние инокуляции семян ячменя ризосферными штаммами P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501) на развитие хлороза у растений, выращенных при загрязнении 470 мг Ni/кг субстрата.

При загрязнении 940 мг никеля/кг торфосмеси (10 ПДК) численность штаммов через 2 недели роста была очень низкой (3.2-4.7 10² КОЕ/см корня), и ризосферные бактерии не стимулировали рост растений. Только в течение первой недели роста устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивал защиту растений от токсического действия никеля (29% пораженных растений), в то время как 65% растений, инокулированных чувствительным штаммом, имели признаки хлороза.

5. Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Pseudomonas-деструкторы ПАУ

5.1 Получение двухплазмидных штаммов

Одним из перспективных подходов для биоремедиации почв со смешанными загрязнениями тяжелыми металлами и органическими токсикантами является применение устойчивых к тяжелым металлам штаммов-деструкторов (Weyens et al., 2010, 2011). В настоящей работе плазмида pBS501 с помощью трансформации была перенесена в штаммы P. aureofaciens BS1393, P. chlororaphis PCL1391 и P. fluorescens 38a, содержащие природную плазмиду биодеградации нафталина/фенантрена pBS216. В полученных трансформантах визуализированы две плазмиды размером около 65 и 85 т.п.н., соответствующие по размеру pBS501 (65 т.п.н.) и pBS216 (85 т.п.н.) (рис. 10).

Рис. 10. Электрофореграмма тотальной ДНК в 0.8% агарозном геле: (1) pBS216; (2) pBS501; двухплазмидные штаммы (3) BS1393(pBS216,pBS501); (4) PCL1391(pBS216,pBS501), (5) 38a(pBS216,pBS501).

Кроме того, наличие гена cnrA плазмиды pBS501 и гена nahAc нафталинового оперона плазмиды pBS216 в полученных рекомбинантных штаммах подтверждалось с помощью ПЦР, результаты которой представлены на рис. 11.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 11. Электрофореграмма результатов ПЦР гена cnrA (а) и nahAc (б): (2) BS1393(pBS216,pBS501), (3) PCL1391(pBS216,pBS501), (4) 38a(pBS216,pBS501); (а) (1) «-» контроль BS1393(pBS216), (5) «+» контроль cnrXYHCBA:pSUP202; (б) (1) «+» контроль BS1393(pBS216), (5) «-» контроль BS1393(pBS501; М - маркер.

Уровни устойчивости к кобальту и никелю при росте реципиентных штаммов на нафталине не превышали 50 и 100 мкМ, соответственно. У трансформантов P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) уровни устойчивости повышались в 4-8 раз к кобальту и в 2-4 раза к никелю и составили 200-400 мкМ, однако были ниже, чем уровни устойчивости штаммов, выращенных на глюкозе или глютамате, (табл. 2).

5.2 Активность ключевых ферментов биодеградации нафталина

Известно, что тяжелые металлы ингибируют ферменты клеточного метаболизма, в том числе и специфические оксигеназы (Sandrin, 2003). При выращивании полученных нами рекомбинантных штаммов на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля, вплоть до стационарной фазы роста сохранялись высокие активности ключевых ферментов биодеградации нафталина нафталиндиоксигеназы, салицилатгидроксилазы, катехол-2,3-диоксигеназы, кодируемых плазмидой pBS216, и катехол-1,2-диоксигеназы, кодируемой хромосомой штаммов (табл. 6). Из данных, представленных в табл. 6, видно, что у чувствительных штаммов BS1393(pBS216) и PCL1391(pBS216) активности исследуемых ферментов понижались почти на порядок, а в штамме 38a(pBS216) не регистрировались.

Таблица 6. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов, выращенных до стационарной фазы роста на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля

Примечания: н.о. - активность не определяется. НО ? нафталиндиоксигеназа, СГ ? салицилатгидроксилаза, К2,3О ? катехол-2,3-диоксигеназа, К1,2О ? катехол-1,2-диоксигеназа.

Ранее ингибирующее влияние никеля и цинка на деградацию хлоробифенилов исследовали при высокой плотности культуры устойчивых штаммов-деструкторов (Springael et al., 1993). В настоящей работе влияние никеля (100 мкМ) на биодеградацию нафталина (1 г/л) оценивалось во время роста культуры с низкой плотностью заражения (10⁷ КОЕ/мл), при этом нафталин и...