Плазмидосодержащие ризосферные бактерии рода pseudomonas, устойчивые к кобальту/никелю и стимулирующие рост растений

Таблица 7. Биодеградация нафталина (1 г/л) ризосферными штаммами-деструкторами при культивировании в присутствии 100 мкМ никеля

5.3 Стабильность плазмид

Успешность использования штаммов, содержащих плазмиды с целевыми функциями, в полевых условиях зависит от стабильности этих плазмид. После 10 пассажей штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) в неселективных условиях стабильность обеих плазмид составила 50 и 35%, соответственно, тогда как в штамме P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) обе плазмиды сохранялись в 100% клеточной популяции.

6. Рекомбинантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение

В настоящей работе было показано, что устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) стимулирует рост растений, выращиваемых в условиях загрязнения никелем. Поэтому было важно выяснить, сохраняет ли эту способность двухплазмидный вариант этого штамма P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в условиях смешанного загрязнения ПАУ и никелем (см. Материалы и методы). Показано, что в отсутствие никеля численность как чувствительного BS1393(pBS216), так и устойчивого BS1393(pBS216,pBS501) штаммов в ризосфере сорго (при загрязнении нафталином) и ячменя (при загрязнении нафталином и фенантреном) была одинаковой (~10⁴ Ч КОЕ/см корня). При этом инокулированные растения имели бьльшую массу, чем растения без инокуляции (табл. 8).

Однако в условиях смешанного загрязнения численность устойчивого штамма-деструктора P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в ризосфере (2.4 Ч 10⁴ и 5.2 Ч 10⁵ КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно) была на порядок выше численности чувствительного штамма BS1393(pBS216) (4.0 Ч 10³ и 1.3 Ч 10⁴ КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно). При инокуляции семян устойчивым штаммом наблюдалось увеличение массы сорго и ячменя на 70 и 57%, соответственно, по сравнению с массой не инокулированных растений. Тогда как инокуляция чувствительным штаммом BS1393(pBS216) только на 25% увеличивала массу сорго и не стимулировала рост ячменя (табл. 8).

Таблица 8. Влияние вариантов P. aureofaciens BS1393 на массу растений, выращенных в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем

Сравнение растений с различными вариантами инокуляции показало, что штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает бульшую прибавку массы сорго (на 38%) и ячменя (на 54%) по сравнению с чувствительным штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS216).

Таким образом, результаты вегетационных экспериментов показали потенциальную возможность использования бактерий группы PGPR Pseudomonas, содержащих детерминанту устойчивости к кобальту/никелю cnr-типа, в качестве биопрепаратов для стимуляции роста и защиты растений при высоком уровне загрязнения никелем (до 5 ПДК), а также при смешанных загрязнениях никелем и полиароматическими углеводородами. Полученные в работе устойчивые ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут быть рекомендованы для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации почв при смешанных загрязнениях ПАУ и тяжелыми металлами.

Депонирование штамма. Штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2501 Д.

Выводы

1. Из различных загрязненных источников выделены и охарактеризованы штаммы бактерий, устойчивые к кобальту, никелю, цинку и кадмию. У бактерий рода Comamonas впервые обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Показано, что конъюгативная плазмида pBS501 в штамме, идентифицированном как Comamonas testosteroni, содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную оперону cnr из Cupriavidus metallidurans CH34.

2. Получены трансконъюгантные штаммы ризосферных бактерий P. aureofaciens, P. fluorescens, P. chlororaphis, содержащие плазмиду pBS501, способные к колонизации ризосферы, синтезу индольных соединений и супрессии фитопатогенов в присутствии высоких концентраций никеля/кобальта.

3. Трансконъюгантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501), растущий в присутствии 0.5 мМ хлорида кобальта, способен аккумулировать из среды до 17% кобальта, который локализуется на поверхности клеток в виде гранул.

4. В вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем (235 мг/кг субстрата), устойчивый к кобальту/никелю ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивает значительный прирост биомассы ячменя (до 40%) и двукратное снижение аккумуляции никеля в растениях, по сравнению с исходным чувствительным штаммом P. aureofaciens BS1393.

5. Сконструированы ризосферные штаммы P. aureofaciens, P. fluorescens, P. chlororaphis, содержащие две плазмиды - устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации ПАУ, способные полностью окислять нафталин в присутствии 100 мкМ никеля. Инокуляция семян ячменя и сорго штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает увеличение биомассы растений на 50-70% в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем.

Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. А.В. Сиунову, к.х.н. М.Г. Шляпникову, к.б.н. Н.Е. Сузиной, к.б.н. А.В. Лисову, вед. инж. ИБК А.Ю. Иванову, м.н.с. Т.О. Анохиной. Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. В.В. Кочеткову. Автор искренне признателен чл.-корр. РАН проф. А.М. Боронину за ценные советы, внимание и постоянную поддержку.

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ №02-04-48708; Программы фундаментальных исследований №13 РАН (проект 4.1.1.), проектов РНП №2.1.1.9321 и №2.1.1/4341; ФЦП ГК №02.512.11.2337, №02.740.11.0682, №02.740.11.0040, №14.740.11.0414, №43.073.1.1.2502; проектов МНТЦ №4033 и IPP ANL-72-0227-RU (DOE-IPP-CRDF RBO-10118).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Анисимова Л.А., Сиунова Т.В., Боронин A.M. Устойчивость к металлам грам-отрицательных бактерий, выделенных из почвы и сточных вод индустриальных регионов // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 5. С. 843-848.

2. Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Сиунова Т.В., Хасанова Л.А., Хасанова З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология. 1999. Т. 68, №3, С. 366-374.

3. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сузина Н.Е., Боронин А.М. Продукция феназиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas aureofaciens, содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю // Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 778-785.

4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Боронин А.М. Влияние ризосферных бактерий на аккумуляцию никеля растениями ячменя // Агрохимия. 2006. № 10. С. 80-84.

5. Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Машукова А.В., Кочетков В.В., Боронин А.М. Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации нафталина в присутствии кобальта/никеля // Микробиология. 2007. Т. 76. С. 212-218.

6. Боронин А.М., Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Сизова О.И. Изменение микробного сообщества ризосферных микроорганизмов под влиянием антропогенного загрязнения окружающей среды и интродукции в ризосферу плазмидосодержащих бактерий / Коллективная монография «Изменение окружающей среды и климата» в 8-ми томах. Т. 4. «Процессы в биосфере: изменения почвенно-растительного покрова и территориальных вод РФ, круговорот веществ под влиянием глобальных изменении климата и катастрофических процессов», Пред. ред. кол. Н.П. Лаверов, РАН.-М. ИФЗ РАН, 2008, С. 113?124.

7. Сиунова Т.В., Сиунов А.В., Кочетков В.В., Боронин А.М. cnr-подобный оперон в штамме Comamonas sp., кодирующий устойчивость к кобальту и никелю // Генетика. 2009. Т. 45, № 3, С. 336-341.

8. T.V.Siunova, T.O. Anokhina, O.I. Sizova, V.V. Kochetkov, A.M. Boronin. Impact of Plant Growth Promoting Rhizobacteria Pseudomonas in Phytoremediation Process / Handbook of Phytoremediation. Ed. by I.A. Golubev, 2011. Ch. 17, pp. 551?572.

Патент

Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Кочетков В.В., Боронин А.М. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв солями никеля. Патент РФ на изобретение №2396339. Приоритет изобретения 02.07.2008 г.

Тезисы

1. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Мордухова Е.А., Сизова О.И., Анохина Т.О., Балакшина В.В, Боронин А.М. Использование генетически модифицированных ризосферных бактерий рода Pseudomonas в фиторемедиации // Сб. тезисов конференции «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды». Пущино, 2001, С. 85?87.

2. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Балакшина В.В., Боронин А.М. Микробиологические аспекты биоремедиации техногенно-загрязненных территорий // Тезисы докладов. Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в ХIХ?ХХI веках». Санкт-Петербург, 14?19 июня 2001 г., С. 64?65.

3. Сизова О.И., Сиунова Т.В., Верниковская Д.И., Кочетков В.В., Боронин А.М. Использование природных и генетически модифицированных бактерий Pseudomonas aureofaciens для защиты растений и биоремедиации // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология 2003», Сочи, 22?26 сентября, 2003 г., С. 53?54.

4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Сизова О.И., Боронин А.М. Взаимодействие ризосферных бактерий и растений в почве, загрязненной никелем // 1-я Международная геоэкологическая конференция «Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами», Тула, 30?31 октября, 2003 г., С. 457?461.

5. Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Машукова А.В., Боронин А.М. Ризосферные штаммы бактерий рода Pseudomonas для фиторемедиации почв с комплексным загрязнением // Материалы 8-го международного семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2005», Пущино 18?19 ноября 2005 г., С. 143?145.

6. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M.. Plant-growth promotion rhizosphere Pseudomonas for phytoremediation of co-contaminated soils // 11 International Symposium on Microbial Ecology-ISME-11, Vienna, Austria, August 20?25, 2006. Book of abstracts, P. 351.

7. Negri M. C., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Zyakun A.M., Boronin A.M. Plasmid-Bearing Rhizosphere Pseudomonas for Enhanced Phytoremediation Performance // 4^th International Phytoremediation Conference, Denver, Colorado, September, 2007.

8. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M. Beneficial Rhizosphere Bacteria for Bioremediation of Oil-Contaminated Soils // 2^nd International Conference RHIZOSPHERE, Montpellier, France, August 25?31, 2007.

9. Boronin A.M., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Vinogradova E.V., Sokolov S.L. Plasmid Bearing Rhizosphere Bacteria Pseudomonas for Phytoremediation // International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS) - «What can microbiology and molecular biology offer oil industry?» Colchester, England, September 16?18, 2007.

Размещено на Allbest.ru