Закономерности формирования эндоэкологического статуса детей в условиях крупного промышленного города

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

закономерности формирования эндоэкологического статуса детей в условиях крупного промышленного города

03.02.08 - экология (биология)

Бакшеева Светлана Сергеевна

Красноярск - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Гребенникова Валентина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лесовская Марина Игоревна

доктор биологических наук, профессор Грязнева Татьяна Николаевна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Иванова Галина Валентиновна

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН

Защита состоится 23 сентября 2011 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 220.037.04. при ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» по адресу: 660049 г. Красноярск, проспект Мира, 90, телефон (факс) 8 (391) 227-86-52.

Отзывы (в двух экземплярах) с заверенными подписями просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 660049 г. Красноярск, проспект Мира, 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан « » августа 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор Демиденко Г.А.

Актуальность проблемы

В настоящее время в связи со все возрастающим вниманием к экологическим вопросам, обусловленным как неблагоприятным состоянием самой окружающей среды, так и стремлением ее улучшить, первостепенное значение приобретают вопросы комплексной эколого-гигиенической оценки состояния окружающей среды. Решение этих вопросов позволяет проводить сравнительное сопоставление регионов (районов, областей, малых населенных пунктов) между собой по всему комплексу экологических и гигиенических характеристик, выявлять экологически наиболее неблагоприятные территории, проводить картографирование, вырабатывать научно обоснованные рекомендации по оптимизации условий окружающей среды [Абалаков А.Д., 1999; Онищенко Г.Г., 2003]. Актуальность данной проблемы определяется тем, что загрязнение среды обитания приводит к широкому распространению экологически обусловленных заболеваний, угнетению иммунобиологической реактивности организма, нарушению репродуктивной функции [Римармук Г.В. и д.р., 1995; Гичев Ю.П., 2002; Долгов А.М., 2002; Веремчук Л.В., 2006; Крамарь В.О., 2008]. Особенно пагубно нарастающий антропогенный прессинг сказывается на состоянии здоровья детей [Лященко Я.Л., 1999; Кучма В.Р., 2002; Лысенко А.И., 2002; Масюк B.C., 2003].

Проблема «ребенок - окружающая среда» остается актуальной и на сегодняшний день. Детский контингент наиболее приемлем для подобного рода исследований, так как дети в меньшей степени, чем взрослые, подвержены внутригородской миграции, больше привязаны к территории проживания [Агаджанян Н.А., 1998]. В силу морфофункциональной незрелости ребенок отличаются повышенной чувствительностью к радиационным, химическим и биологическим загрязнениям окружающей среды [Эткина Э.И., 1992; Kilic S.S., 2000 et al.; Cassat J. E., 2006].

При изучении влияния антропогенных факторов окружающей среды на здоровье человека весьма актуальным является поиск неинвазивных методов для выявления данного воздействия. Исследования последних лет показали, что антропогенное воздействие на окружающую среду приводит не только к многочисленным негативным сдвигам в состоянии здоровья человека, но и к качественному и количественному изменению его микрофлоры [Бухарин О.В., 1997; Дерябин Д. Г., 2005; Крамарь В.О., 2008]. По мнению О.В. Бухарина, при оценке микроэкологических последствий химического загрязнения окружающей среды целесообразным является изучение уровня резидентного стафилококкового бактерионосительства. При этом изменения численности микроорганизмов или их индикаторных свойств могут рассматриваться как параметры, позволяющие тестировать интенсивность внешнего воздействия [Бухарин О.В., 1999].

В научной литературе сравнительно недавно появилось понятие «эндоэкологический статус». По мнению М.П. Захарченко (1995), эндоэкологический статус формируется под влиянием биотических и абиотических факторов окружающей среды. Под ним следует подразумевать энтероэкологию, включающую микрофлору и энтеральную среду, чужеродные образования экзо- и эндогенного происхождения биологической и химической природы, а также возможность организма противостоять чужеродным агентам, проявляющаяся прежде всего в иммунологическом и антиоксидантном отношении, изменении гомеостаза, составных элементов обмена веществ, всех уровней регуляции обменных процессов в организме [Захарченко М.П., 2007]. На наш взгляд, при изучении эндоэкологического статуса можно ограничиться характеристикой состояния тех констант организма, которые более информативно и объективно отражает воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды. Понятие эндоэкологический статус может включать в себя состояние микробиоценозов верхних дыхательных путей (резидентное стафилококковое бактерионосительство), определение резистентности и степень обогащения организма микроэлементами (молекулярный уровень взаимодействия «организм - окружающая среда»).

До настоящего времени эколого-биологические исследования эндоэкологического статуса детей в условиях крупного промышленного города Красноярска носят разрозненный, не системный характер. Отсутствие определения критериев уровня экологического благополучия зоны проживания ребенка, а так же выявление ранних изменений в организме на донозологическом уровне, с использованием неинвазивных методов, определили актуальность нашего исследования.

Цель исследования: определить закономерности формирования эндоэкологического статуса детей в условиях крупного промышленного города (на примере г. Красноярска)

Задачи исследования

1. Дать эколого-гигиеническую оценку состояния территории города Красноярска.

2. Провести микробиологический мониторинг распространенности резидентного стафилококкового бактерионосительства среди младших школьников, проживающих в городе Красноярске, в районах с различной антропогенной нагрузкой. Обосновать возможность использования микробиологических тестов в качестве маркеров антропогенного загрязнения окружающей среды.

3. Дать микроэкологическую характеристику микробиоценоза верхних дыхательных путей младших школьников, проживающих в городе Красноярске, в районах с различной антропогенной нагрузкой, путем изучения биологических, персистентных свойств S. aureus.

4. Оценить генетическое разнообразие штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих слизистую оболочку носа детей, находящихся в условиях техногенного прессинга.

5. Дать характеристику эндоэкологического статуса детей на основании изучения системы местного иммунитета слизистых оболочек и микроэлементного состава волос у младших школьников, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой г. Красноярска. Разработать критерии определения уровня экологического благополучия зоны проживания детей.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые дана характеристика микроэкологических нарушений в микробиоценозе верхних дыхательных путей клинически здоровых детей младшего школьного возраста, проживающих в городе Красноярске, в районах с разной антропогенной нагрузкой. Впервые проведена оценка генетического разнообразия штаммов Staphylococcus aureus, колонизирующих слизистую оболочку носа детей, находящихся в условиях техногенного прессинга г. Красноярска. Впервые проведено микроэкологическое картирование некоторых районах города Красноярска по резидентному стафилококковому носительству, которое дает представление об уровне «техногенного прессинга» в исследуемых районах. Впервые установлены критерии оценки эндоэкологического статуса детей младшего школьного возраста, проживающих в условиях разного техногенного загрязнения окружающей среды на основании определения изменений иммунологических свойств слизистых оболочек, микроэлементного состава волос, а так же уровня резидентного стафилококкового бактерионосительства.

В результате проведенных исследований изучены особенности формирования эндоэкологического статуса детей и разработаны критерии определения уровня экологического благополучия зоны проживания города Красноярска, что может быть аналитической основой донозологической лабораторной диагностики изменений состояния здоровья детского населения, в первую очередь, проживающих в экологически неблагоприятных районах.

ПОЛОЖЕНИЯ, выносимые на защиту

1. Среда обитания определяет микроэкологические нарушения в микробиоценозе верхних дыхательных путей у детей младшего школьного возраста, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой. Выделенные изоляты Staphylococcus aureus, приобретают селективные преимущества, способность длительно персистировать и противостоять механизмам защиты макроорганизма.

2. Микроэкологическое ранжирование районов города Красноярска по уровню резидентного стафилококкового бактерионосительства среди детей дает представление об уровне «техногенного прессинга» в районах исследуемой зоны.

3. Эндоэкологический статус организма ребенка в условиях разного уровня техногенной нагрузки определяется микроэлементным составом волос, состоянием местного иммунитета слизистых оболочек и степенью резидентного стафилококкового бактерионосительства.

Апробация результатов работы

По теме диссертации опубликовано 49 научных работ, в том числе одна монография, 13 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций (список наиболее важных из них в количестве 24 прилагается). Основные результаты исследований по теме диссертации доложены на: ХlV конференции стоматологов Красноярского края «Актуальные вопросы стоматологии» (Красноярск, 2002); 111 Краевой научно-практической конференции анестезиологов и реаниматологов посвященной памяти Р.Г. Алехиной «Современные проблемы анестезиологии и интенсивной терапии» (Красноярск, 2003); краевой научно-практической конференции, посвященной 20-летию кафедры лучевой диагностики и лучевой терапии ФПК и ППС «Современные проблемы лучевой диагностики» (Красноярск, 2003); Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2006); Краевой конференции, посвященной академику Б.С. Гракову «Актуальные вопросы медицины и новые технологии - 2006» (Красноярск, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Профилактическая медицина в России: истоки и современность» (Казань, 2009); Межрегиональной научно-практической конференции «Проблемы этнической и краевой патологии в свете реализации приоритетного национального проекта Здоровье» (Новокузнецк, 2009); XVI Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2009); 1Х Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2010).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа изложена на 280 страницах, иллюстрирована 44 таблицами, 30 рисунками, 2 фотографиями. Библиографический указатель включает 467 источников, в том числе 322 отечественных и 145 зарубежных.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность за консультативную, практическую и организационную помощь в работе над диссертацией научному консультанту д.м.н. профессору В.В. Гребенниковой, ректору КрасГМУ, д.м.н. профессору И.П. Артюхову, д.м.н. И.А. Шагиняну, д.м.н. профессору И.А. Новицкому, д.м.н. М.Ю. Чернухе, к.м.н. Л.Р. Аветисян, к.м.н. Е.Н. Анисимовой, к.б.н. Сарматовой Н.И.

Глава 1. Введение и аналитический обзор литературы

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования. В аналитическом обзоре представлен эколого-гигиенический анализ техногенного загрязнения окружающей среды в условиях крупного промышленного города [Агаджанян Н.А, 2001; Боев В.М. 2002; Гичев Ю.П. 2002; Онищенко Г.Г., 2002, 2003, 2008]. Рассмотрена и проанализирована возможность использования стафилококкового бактерионосительства в системе экологического мониторинга среды обитания человека [Бухарин О.В., 1996, 1999; Дерябин Д.Г., 2000, 2005]. Подробно дана характеристика эндоэкологического статуса человека в условиях неблагополучия окружающей среды [Захарченко М.П., 2003,2006].

Глава 2. Объекты и методы исследования

Исследования выполнялись в крупном промышленном центре Сибирского федерального округа в городе Красноярске. Изучение экологической ситуации города Красноярска проводилось в период с 2003 года по 2009 год и основывалось на документах предоставленных Управлением Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Красноярскому краю и Красноярским территориальным центром по мониторингу загрязнения окружающей среды. Для изучения закономерностей эндоэкологического статуса организма ребенка и влияние на его формирование условий окружающей среды были определены три района города, в основу разделения которых положен разный уровень антропогенного загрязнения воздушного бассейна, обусловленный неравнозначной концентрацией промышленных предприятий, особенностями планировки и метеоусловий. Первый район (Октябрьский) - является относительно экологически благополучным, на его территории отсутствуют промышленные предприятия, крупные автотранспортные развязки, ИЗА меньше 0,05 ед. Второй и третий районы (Кировский и Советский) - экологически неблагополучные. В число приоритетных загрязнителей атмосферы районов входят полициклические ароматические углеводороды, бенз-а-пирен, фтористые соединения. Во втором районе исследования ИЗА в исследуемые годы составляла от 10,33 до 19,17 ед., в третьем от 12,49 до 14,53 что, характеризуется как «высокий» и «очень высокий» уровень загрязнения. Всего было обследован 521 здоровый ребенок, в возрасте 7 - 10 лет. Обследование детей проводилось в осенне-зимние периоды с 2003 по 2009 годы. Так же объектом нашего исследования являлись штаммы S.aureus, выделенные от носителей. Всего было изучено 266 штаммов.

Выделение и идентификацию S.aureus проводили согласно приказам МЗ СССР № 720 и № 1230; определение принадлежности к виду S.aureus и изучение факторов патогенности штаммов проводили, используя стандартные методики, описанные в руководствах (Биргер, 1982). Биохимическую активность S.aureus изучали с помощью диагностического набора «STAPHYtest» (Lachema, Чешская республика). Персистентные свойства штаммов S.aureus - антилизоцимная, антикомплементарная и антиинтерфероновая активности проводили по методам О.В. Бухарина с соавт. (1999, 1992 г.г.) (исследование проводилось при поддержке НИИ клеточного и внутриклеточного симбиоза Уро РАН, директор института академик Бухарин О.В.). Чувствительность к антибиотикам изучали диско - диффузионным методом в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2.1890-04 МЗ РФ, 2004), с применением расширенного набора дисков («Биорад»). Исследование устойчивости к метициллину проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для приготовления основного раствора антибиотика использовали оксациллин («Биорад»). Генотипирование S.aureus проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, размером 10 нуклеотидов Sh1 (Short 1) - AATCGGGCTG (исследование проведено в лаборатории молекулярной эпидемиологии НИИ микробиологии и эпидемиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН, зав. лабораторией д.м.н. Шагинян И.А.)

Определение естественной колонизации буккального эпителия проводили по методу А.Н. Маянского с соавт. (1994 г.). Количественное определение секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в смывах со слизистой оболочки переднего отдела носа проводили с помощью набора «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) на комплекте оборудования для ИФА (Bio-Rad, США-Франция) (исследование проведено в клинической лаборатории ККБ № 1). Биохимические исследования: концентрацию общего белка ротовой жидкости определяли унифицированным биуретовым методом по конечной точке, реактивами фирмы «Vital Diagnostics» (Россия, кат. № В06.01), на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Photometer 5010» (Германия, Берингер Манхейм); измерение активности б-амилазы ротовой жидкости проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Photometer 5010» (Германия, Берингер Манхейм) унифицированным амилокластическим методом по Каравею, реактивами фирмы «Vital Diagnostics» (Россия, кат. № В11.01); активность щелочной фосфатазы ротовой жидкости определяли кинетическим методом, на биохимическом анализаторе «Hitachi-912» (фирмы Hoffman-La Rosh) с встроенным набором программ качества лабораторных исследований, по унифицированным методикам реактивами фирмы «'Rosh» (Швейцария). Биохимические исследования проведены в лаборатории кафедры КЛД ИПО КрасГМА (зав. кафедрой к.м.н. Анисимова Е.Н.).

Для определения микроэлементов в волосах у исследуемой группы детей использовали вольтамперический метод анализа. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных Statistica v 6.0. Поскольку по критерию Шапиро-Уилкса распределение носило нормальный характер, для описания качественных учетных признаков применяли среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего (М±m). Основываясь на равенстве дисперсий значимость различий определяли по критерию t-Стьюдента. Для качественных признаков рассчитывалась процентная доля, стандартная ошибка доли (Р±m), значимость отличий определялась по критерию ч2. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Глава 3. Микробиологическая характеристика биоценоза верхних дыхательных путей у детей города Красноярска, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой

Изучение таксономической структуры микробиоценоза слизистой оболочки переднего отдела носа является одним из важнейших этапов его микроэкологической характеристики. Проведенные микробиологические исследования показали, что у 87,1 % обследованных детей, проживающих в городе Красноярске, со слизистой оболочки переднего отдела носа высевались микроорганизмы рода Staphylococcus. Микробиоценоз верхних дыхательных путей у детей, проживающих в Октябрьском (экологически благополучный) районе более разнообразен и представлен 12 видами стафилококка, в Кировском и Советском районах количество встречаемых видов стафилококка значительно меньше - 6 и 4 соответственно. Распределение основных видов стафилококка по районам проживания детей представлено на рис.1.

Распространенность других коагулазоотрицательных культур стафилококка в зависимости от района выделения выглядит следующим образом. Во всех трех исследуемых районах на слизистой оболочке носа у детей из КОС преобладал s.saprophyticus, в Октябрьском районе данный вид стафилококка встречался в 4,9 %, в Кировском высевался у 8 % обследуемых и в Советском районе у 9,3 %. Кроме s.saprophyticus, в Октябрьском районе микробиоценоз верхних дыхательных путей у детей был представлен s.hyicus (4,9 %), s.capitis (3 %), s.xylosus (2 %), s.hemolyticus (1,5 %), s.caprae, s.simulans (1 %) и в менее 1 % случаев встречались s.warneri и s.cohnii. Микробиоценоз слизистой оболочки верхних дыхательных путей у детей, проживающих в Кировском районе был представлен s.hyicus (1,5 %) и s.warneri (0,7 %). В Советском районе микробиоценоз слизистой оболочки носа у детей был менее разнообразен и помимо s.saprophyticus из КОС другие виды не регистрировались.

Рис. 1. Основные виды стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа детей, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой

При изучении биологических свойств 266 штаммов S.aureus, было установлено, что во всех трех исследуемых районах города Красноярска преобладали культуры стафилококка, продуцирующие желтый пигмент (46,1 %, 31,4 % и 45,3 % соответственно); культуры S.aureus выделенные в Октябрьском экологически благополучном районе имели крупные размеры бактериальных клеток и средние объемы грозди, в Кировском и Советском экологически неблагополучных районах преобладали культуры мелкие в диаметре и имеющие средние (Кировский) и крупные (Советский) объемы грозди. 88,3 % изученных культур S.aureus, выделенных со слизистой оболочки носа детей являются адгезивными и высокоадгезивными (43,0±1,8 и 44,6±1,5, соответственно). При этом штаммы S.aureus обладающие адгезивной активностью выделялись как в экологически благополучном Октябрьском районе, так и в Кировском и Советском районах (рис. 2).

Анализ результатов изучения защитных факторов патогенности S.aureus выделенных со слизистых оболочек переднего отдела носа у детей, проживающих в городе Красноярске, показал, что ферменты плазмакоагулаза, лецитиназа и гемолитическая активность регистрировались у 100 % исследуемых культур золотистого стафилококка, вне зависимости от района выделения.

Рис.2. Адгезивные свойства стафилококков, выделенных от детей, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой

Продукция ферментов гиалуронидазы и лизоцима у культур стафилококка, выделенных со слизистой оболочки носа у детей, проживающих в Октябрьском районе наблюдалась у 21,0 и 63,2 % соответственно. Гиалуронидазной и лизоцимной активностью культуры стафилококка выделенные от детей, проживающих в Кировском районе обладали в 59,3 и 84,5 % случаев соответственно, в Советском районе таких культур было 75,0 % (гиалуронидаза) и 95,2 % культур продуцировали фермент лизоцим. Анализ результатов проведенных исследований показал, что стафилококки, выделенных со слизистой оболочки носа у детей, проживающих в Октябрьском районе, не продуцируют ферменты ДНК-аза и РНК-аза. Стафилококки, выделенные в Кировском и Советском районах более чем в 50 % имеют данные нуклеазы, причем 22,6 % изученных культур S.aureus имели оба фермента - ДНК-азу и РНК-азу. Изучив факторы патогенности S.aureus, выделенных со слизистой оболочки носа детей, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой, нами были проанализированы их корреляционные зависимости. Жесткая прямая связь была обнаружена между такими парами факторов, как гемолитическая активность и гиалуронидаза (r=1,0), гиалуронидаза - РНК-аза (=1,0), ДНК-аза - плазмакоагулаза (r=0,95). Прямую сильную связь показывало большинство оцениваемых пар факторов, исключение составили лизоцим и лецитиназа (r=0,2).

Возникновение, развитие и относительно длительное течение инфекционного процесса невозможно представить без существования устойчивости микроорганизма к иммунологическим защитным реакциям организма хозяина. Факторами, способствующими снижению резистентности макроорганизма, являются антилизоцимная, антикомплементарная и антиинтерфероновая активность микроорганизмов [Бухарин О.В., 2000, 2007; Красилова Е.В., 2003; Крамарь В.О., 2008]. В результате проведенных исследований установлено, что S.aureus, колонизирующие слизистые оболочки носа детей проживающих в экологически неблагополучных Кировском и Советском районах города имели более высокие персистентные характеристики. Показатели антилизоцимной активности стафилококков, выделенные от детей, проживающие в Октябрьском районе были минимальные (1,18±0,57мкг/мл) и достоверно отличались от таковых в экологически неблагополучных районах, p<0,05. Значения АЛА стафилококков, выделенных из Кировского и Советского районов статистически значимых отличий не показывали (2,49±0,76 и 2,8 ±0,61, соответственно). Среднее значение антиинтерфероновой активности у стафилококков, колонизирующих слизистые оболочки носа детей, проживающих в Октябрьском районе, была определена как 1,2±0,94 усл.ед., что было достоверно ниже, чем в Кировском и Советском районах и равнялась 5,1±2,15 и 5,3± 1,70 соответственно, р<0,05. Статистически значимых различий между Кировским и Советским районами установлено не было. Среднепопуляционная антикомплементарная активность изученных культур стафилококка была низкой и не превышала 10 усл.ед., составляя в Октябрьском районе 5,5±1,79 усл.ед., p<0,05, в Кировском и Советском районах - 9,5±2,07 усл.ед. и 8,03±3,01 усл.ед., соответственно.

С использованием метода корреляционного анализа была изучена сопряженность анализируемых признаков у культур стафилококка, выделенных в изучаемых районах. Анализ полученных данных показал, что максимальные коэффициенты корреляции между параметрами были обнаружены у стафилококков, выделенных в Октябрьском районе. Установлена зависимость средней силы между парами признаков: АЛА - АИА (r=0,61), АЛА - АКА (r=0,60) и АКА - АИА (r=0,62). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данная популяция стафилококка обладает умеренными персистентными характеристиками и отличается определенной стабильностью. В Кировском районе показатели взаимосвязи изученных признаков были низкими (от 0,38 до 0,44), что свидетельствует о случайных усилениях персистентных характеристик отдельных штаммов стафилококка. Для популяции стафилококков, выделенных со слизистой переднего отдела носа у детей, проживающих в Советском районе, установлена корреляция средней силы между признаками АЛА - АИА (r=0,52), АКА - АИА (r=0,42). Коэффициент АКА - АИА составил 0,12, что свидетельствует об отсутствии сопряженности между изучаемой парой признаков. Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии в Советском районе особых факторов, обуславливающих усиление антилизоцимной и антиинтерфероновой активности и не влияющих на антикомплементарную активность культур стафилококка.

Анализ изучения биохимической активности выделенных культур стафилококка показал, что оксидазо- и фосфотазоактивные штаммы чаще регистрировались в Кировском и Советском районах, тогда как в Октябрьском районе у культур стафилококка фосфотазная активность не регистрировалась вовсе, а оксидазной активностью обладали только 21 % (рис. 3).

1 - Октябрьский р-н 2 - Кировский р-н 3 - Советский р-н

Рис. 3. Частота встречаемости основных ферментов у S.aureus, колонизирующих слизистые оболочки носа у детей проживающих в разных районах г. Красноярска

Частота продукции орнитиндекарбоксилазы и аргининдекарбоксилазы встречалась у более чем 50 % культур выделенных в Советском районе (52 % и 55,8 % соответственно), чуть ниже эти показатели в Кировском районе - 45,3 и 47,7 % соответственно. В Октябрьском районе культуры стафилококка с орнитиндекарбоксилазной и аргининдекарбоксилазной активностью встречались редко (5,3 и 10,5 % соответственно). Такая же закономерность отмечалась по нитратредуктазам, которые чаще регистрировались у культур, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа у детей, проживающих в Кировском и Советском районах - 40,7 % и 45,2 % соответственно, в Октябрьском районе только у 10,5 % штаммов встречался данный признак.

Установлено, что культуры золотистого стафилококка выделенные со слизистых оболочек переднего отдела носа у детей, проживающих в Октябрьском районе обладали резистентностью только к четырем антибактериальным препаратам (пенициллин, эритромицин, доксициклин и левомицитин), тогда как в Кировском районе таким препаратов было 6 (пенициллин, эритромицин, гентамицин, доксициклин, левомицитин и Ко-тримаксазол), а в Советском таких препаратов было уже 7 (пенициллин, эритромицин, гентамицин, доксициклин, рифампицин, левомицитин и Ко-тримаксазол) (рис. 4).

B Октябрьском районе города популяция S.aureus проявляет большую однородность по чувствительности к антибактериальным препаратам по изучаемому признаку, тогда как штаммы выделенные в Кировском и особенно в Советском районах характеризуются значительной гетерогенностью и высокой резистентностью.

Рис.4. Распределение культур S.aureus по степени резистентности к антибиотикам в зависимости от района выделения

Частота обнаружения метициллинрезистентных стафилококков у детей г. Красноярска составляет в среднем 8,2±0,4 %, при этом наиболее часто они выделялись у школьников проживающих в Кировском и Советском районах города (8,1±0,38 и 12,5±0,31 %, соответственно). Следующим этапом работы было разделение культур стафилококка на штаммы с низким (МПК=31,25 мкг/мл), средним (МПК=62,5 мкг/мл) и высоким (МПК=500 и более мкг/мл) уровнем резистентности. Полученные результаты показали, что высокорезистентные S.aureus не встречались ни в одном из исследуемых районов города (рис. 5). Во всех исследуемых районах преобладали культуры золотистого стафилококка с низкой степенью резистентности к метициллину, так в Октябрьском районе таких культур было 100±0,7 %, в Кировском и Советском районах -71,4±3,4 и 61,5±3,5 %, соответственно, р<0,05. Умеренно резистентные к метициллину стафилококки вегетировали на слизистой носа у детей, проживающих в Кировском и Советском районах (28,6 и 38,5 %, соответственно) и совсем не встречались в Октябрьском районе.

1 - Октябрьский район; 2 - Кировский район; 3 - Советский район

Рис. 5. Распределение культур S.aureus по степени резистентности к метициллину в зависимости от района выделения

С использованием принципа нумерической обработки был расчитан индекс вирулентности для 23 метициллинрезистентных культур стафилококка, выделенных в изучаемых районах. В целом на слизистых оболочках носа младших школьников города Красноярска чаще вегетировали метициллинрезистентные стафилокококки, характеризующиеся низкой (47,8 %±3,6 %) и средней (43,5±2,9 %) степенью вирулентности. И только в Советском районе встречались (8,7 %) высоковирулентные штаммы золотистого стафилококка. Корреляционный анализ показал наличие взаимосвязи между уровнем резистентности к метициллину и значением индекса вирулентности (r=0,4), что дает основание предположить, что формирование устойчивости к антибиотикам происходит одновременно с изменением ряда биологических признаков, что в свою очередь способствует повышению вирулентных свойств микроорганизмов.

Генотипирование штаммов золотистого стафилококка проводили с целью субвидового типирования и определения степени генетического родства (выявление клональности) штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей - детей, проживающих в экологически неблагополучном районе. В результате генотипирования методом RAPD-ПЦР 20 штаммов S.аureus была получена электрофоретическая картина (рис. 6), на основе которых была построена дендрограмма (рис. 7). Установлено наличие 6 генотипов среди исследованных 20 штаммов S.aureus, 3 из которых включают 3 и более штамма (рис. 7), то есть штаммы, входящие в эти генотипы, выделяли из носа более 2-х детей, что говорит об их эпидемической значимости.

Рис. 6. RAPD-ПЦР штаммов S. aureus, выделенных от детей, проживающих в условиях техногенного прессинга

В 1-й генотип входили 8 штаммов под №№ 13, 18, 7, 9, 5, 4, 3, 1 (индекс генетического сходства - 1). В результате амплификации образовалось 9 ампликонов длиной от 300 до 1500 нп (нуклеотидные пары) и выше. У штаммов, относящихся ко 2-му генотипу (№№ 16, 17, 19, 11, 14), при изучении электрофоретических профилей выявлены 6 ампликонов, длиной от 400 до 1500 нп и выше (гомология 100 %). В 6-й генотип входили 4 изолята (№№ 6, 8, 10, 15), которые образовали по 6 ампликонов длиной от 500 до 1500 нп и выше. 5-й генотип выделяли только у двух детей. Общепринято, что если показатель степени генетического родства равен 0,8 и выше, то это характеризует высокую степень генетического сходства штаммов в исследуемой выборке. Если 0,6-0,8 - умеренно; 0,4-0,6 - низкий; если сравниваемые штаммы имеют показатель ниже чем 0,4, то фактически они являются генотипически не родственными.

Как следует из дендрограммы (рис.7) степень генетического родства у 1-го и 2-го генотипов составляет 85 % (т.е. высокая степень генетического родства), то есть большинство штаммов S.аureus (65 %) имеют высокую степень сходства штаммов, что говорит об их родственном происхождении и дает основание предположить наличие общего предка. При этом источником распространения золотистого стафилококка в данном детском коллективе, вероятно, был один из учащихся или учителей.

Рис. 7. Дендрограмма штаммов S. aureus

Глава 4. Микроэкологический мониторинг города Красноярска на основании изучения резидентного стафилококкового бактерионосительства у детей

Проведенные бактериологические исследования показали, что интенсивность бактерионосительства в изучаемых районах была неравнозначной. Установлено, что распространенность стафилококкового бактерионосительства в популяции детей г. Красноярска достаточно высока, так с максимальной частотой S. aureus выделяли в Кировском районе (63,2±1,4 %), чуть меньше - 56,8±1,7 % в Советском районе (р=0,3), а наименьший процент носительства зарегистрирован в Октябрьском районе (37,6±1,2 %, p<0,01 ). В целом по городу S. aureus было колонизировано 52,5 % обследуемых школьников. В ходе исследования было установлено, что плотность колонизации S.aureus зависела от района проживания ребенка. Так при оценке средней плотности колонизации золотистым стафилококком слизистых оболочек передних отделов носовых ходов школьников Кировского и Советского районов она составляла Lg 3,17±0,75 и Lg 3,14±0,92 КОЕ/см2, соответственно, р>0,05. По мере удаления от экологически неблагополучных районов плотность вегетирования золотистого стафилококка на слизистой оболочки носовых ходов детей достоверно снижалась. Так, у 29,2 % обследованных детей, проживающих в Октябрьском районе плотность колонизации S. aureus составляла 102КОЕ/см2 и у 37,6 % - 103КОЕ/см2 и выше, а средняя плотность колонизации слизистых оболочек у данной группы детей составляла Lg 2,43±0,68 КОЕ/см2, р>0,05.

Oбнаружено, что интенсивность обсеменения S. aureus слизистых оболочек верхних дыхательных путей у детей имеет тесную связь с экологией района проживания. Частота встречаемости и плотность бактериальной колонизации достоверно выше в тех районах города, где регистрируется наиболее неблагополучная экологическая обстановка.

Выделенные культуры S. aureus были дифференцированы на резидентные и транзиторные [Бухарин О.В., 1999]. Установлено, что в Кировском районе резидентными штаммами S. aureus было колонизировано 51,2±1,35%, в Советском 79,3±1,8 % бактерионосителей, а в Октябрьском 43,4±1,3 % (таб. 1). Анализ полученных результатов позволил по уровню резидентного бактерионосительства выделить районы с максимальной техногенной нагрузкой (Кировский и Советский - 32,3±1,5 и 25,1±1,3 %, соответственно) и район с наиболее благоприятной экологической обстановкой (Октябрьский - 11,4±0,9%).

Таблица 1.

Распространенность бактерионосительства S.aureus у детей, проживающих в районах с различной антропогенной нагрузкой

Итак, проведенные исследования позволили сделать вывод, о том, что наиболее экологически чистой зоной города в настоящее время является Октябрьский район, имеющий минимальный показатель резидентного бактерионосительства, значения которого было принято за фоновый уровень. По данным мониторинга территории г. Красноярска с использованием КРСБ, установлено, что для Октябрьского района минимальная величина коэффициента резидентного бактерионосительства - 1,0; для Кировского и Советского районов - 2,8 и 2,2 соответственно. Полученные нами данные показали, что интенсивное техногенное загрязнение атмосферного воздуха приводит к увеличению резидентного бактерионосительства S. aureus среди детского населения. Результаты исследования дают возможность ранжировать территорию города Красноярска по степени нарастания экологического неблагополучия: Октябрьский - Советский - Кировский районы. Установленные значения коэффициентов экологического благополучия показывают, что ни в одном из изученных районов города Красноярска экологическая ситуация не может быть расценена как критическая, но в Советском и особенно Кировском районе ее можно охарактеризовать как серьезную.

Глава 5. Характеристика эндоэкологического статуса детей в условиях техногенного прессинга

Полученные нами данные по оценке результатов определения активности щелочной фосфатазы в смешанной слюне детей свидетельствуют о зависимости района проживания обследуемого детского контингента. Из представленных данных на рис. 8 следует, что у детей, проживающих в Октябрьском районе, активность щелочной фосфатазы в смешанной слюне составляла 10,5±0,6 u/l. Активность щелочной фосфатазы в смешанной слюне у обследуемых детей Кировского и Советского районов, была повышена и составляла 15,7±0,3 u/l и 15,8±0,2 u/l соответственно, р< 0,001.

Примечание: *1-2, р<0,001; 1-3, р<0,001

Рис. 8. Зависимость активности щелочной фосфатазы в смешанной слюне, в зависимости от района проживания детей

Установлено, что уровень активности б-амилазы в ротовой жидкости обследованных детей, проживающих в районах с неблагоприятными экологическими условиями был достоверно ниже, чем у детей, проживающих в районе с меньшей антропогенной нагрузкой. Так, содержание б-амилазы в ротовой жидкости обследуемых детей, Октябрьского района равнялось 189,2 ± 0,2 (мг/(чхмл). У младших школьников Кировского района б-амилаза в ротовой жидкости присутствовала в концентрации 153,2 ± 2,1 (мг/(чхмл), а у детей Советского района содержание б-амилазы в ротовой жидкости не намного превышала и составляла 158,4 ± 1,3 (мг/(чхмл), р< 0,001 (рис. 9).

Примечание: *1-2, р<0,001; 1-3, р<0,001.

Рис. 9. Зависимость активности б-амилазы в смешанной слюне в зависимости от района проживания детей

Оценка результатов исследования концентрации общего белка в смешанной слюне детей (рис. 10), проживающих в экологически неблагополучных районах, позволила в основном отметить лишь тенденцию к повышению показателей уровня общего белка у детей Советского района 2,34±0,2 (г/л), по сравнению с обследованными детьми Кировского района 1,8±0,2 (г/л), р< 0,001.

Примечание: *1-2, р<0,001; 1-3, р<0,001.

Рис. 10. Зависимость концентрации общего белка в смешанной слюне в зависимости от района проживания детей

У детей, проживающих в экологически благоприятном Октябрьском районе, содержание общего белка в смешанной слюне равнялось 0,41 ± 0,10 (г/л). Следует отметить, что при определении концентрации общего белка в смешанной слюне выявлены статистически достоверные различия в зависимости от пола. Так, у мальчиков средние значения содержания общего белка в секрете ротовой жидкости равнялось 1,802 ± 0,7 (г/л), тогда как у девочек этот показатель составил 1,157 ± 0,09 (г/л), р< 0,001.

Анализ результатов исследования концентрации s IgA в смывах со слизистой оболочки верхних отделов дыхательных путей у школьников младших классов, проживающих в городе Красноярске показал, что происходит достоверное снижение его уровня у детей, проживающих в районах с антропогенной нагрузкой. Так, у обследуемых, проживающих в экологически благополучном Октябрьском районе, концентрация s IgA в смывах со слизистой носовой полости равнялась 3,01±0,02 (г/л), что соответствует норме для данной возрастной группы (2,99±0,3 (г/л)). У обследуемых детей, проживающих в Кировском и Советском районах, концентрация s IgA в смывах со слизистой носовой полости была практически в два раза ниже нормы и составляла 1,54±0,03 (г/л) и 1,60±0,02 (г/л), соответственно, р<0,001. При анализе индивидуальных различий в содержании s IgA в смывах со слизистой оболочки носа детей было установлено, что у обследуемых Кировского и Советского районов концентрация s IgA выше нормы не регистрировалась, тогда как в Октябрьском районе 18,0±0,4 % обследуемых имели этот показатель выше нормы (рис. 11).

Рис. 11 Концентрация и частота встречаемости s IgA в пределах возрастной нормы

У 78,3±0,6 % обследуемых детей Октябрьского района содержание s IgA в смывах со слизистой оболочки носа было в пределах возрастной нормы, в Кировском и Советском районах таких детей было в два и 2,5 раза меньше (35,4±0,3 % и 28,8±0,4 %, соответственно). В Кировском и Советском районах у обследуемых детей концентрация s IgA в смывах со слизистой оболочки носа ниже нормы наблюдалась у 64,6±0,7 % и 71,2±0,3 % соответственно, р<0,001, тогда как в Октябрьском районе таких обследуемых было всего лишь 3,7± 0,2 %. Следует отметить, что при определении концентрации s IgA в смывах со слизистой оболочки переднего отдела носа детей выявлены статистически достоверные различия в зависимости от пола. Так, у мальчиков среднее значение концентрации s IgA в смывах равнялось 2,055 ± 0,5 (г/л), тогда как у девочек этот показатель составил 2,18 ± 0,06 (г/л), р<0,001.

В ходе работы по определению содержания концентрации лизоцима в ротовой жидкости детей, проживающих в разных экологических условиях выявлено, что у обследуемых Кировского и Советского районов концентрация лизоцима в ротовой жидкости снижена, по сравнению с обследуемыми Октябрьского района. Так, у обследуемых детей, проживающих в экологически благополучном районе Октябрьском районе концентрация лизоцима в ротовой жидкости приближена к норме для данной возрастной группы (N=6,1±0,4 %) и составляла 6,02±0,03 %. В Кировском районе данный показатель неспецифической резистентности снижен практически в 1,5 раза и равнялся 4,04 %; у обследуемых детей Советского района концентрация лизоцима в ротовой жидкости так же была снижена и составляла 4,8 %. При анализе индивидуальных различий в содержании лизоцима в секрете ротовой жидкости обследуемых детей было установлено, что концентрация лизоцима выше возрастной нормы регистрировалась у 21,3±0,02 % обследуемых детей, проживающих в экологически чистом Октябрьском районе. В Кировском районе таких детей было всего 2,6±0,4 %, в Советском районе таких обследуемых детей не регистрировалось (рис. 12).

Рис.12 Концентрация и частота встречаемости лизоцима в секрете ротовой жидкости в пределах возрастной нормы

В Кировском и Советском районах у обследуемых детей концентрация лизоцима в секрете ротовой жидкости ниже нормы наблюдалась у 66,1±0,04 % и 69,3±0,02 % соответственно, р<0,001. Тогда как в Октябрьском районе таких обследуемых было всего лишь 1,9±0,2 %. Анализ данных по определению концентрации лизоцима в секрете ротовой жидкости показал, что только 1/3 обследуемых детей, проживающих в экологически неблагополучных районах, имела данный показатель в пределах возрастной нормы. В Кировском районе таких детей было зарегистрировано 31,3±0,07 %, а в Советском всего 30,7±0,03 %. В Октябрьском районе 76,8±0,03 % обследуемых имели показатель концентрации лизоцима в ротовой жидкости в пределах возрастной нормы. При определении концентрации лизоцима в ротовой жидкости детей выявлены статистически достоверные различия в зависимости от пола. Так, у девочек среднее значение концентрации лизоцима равнялось 5,019±0,06 %, у мальчиков этот показатель был ниже и составил 4,872 ± 0,6 %, р<0,001.

Анализ результатов определения индекса колонизации буккальных эпителиоцитов у школьников младших классов, проживающих в районах города с разной антропогенной нагрузкой показал, что происходит достоверное снижение показателей колонизационной резистентности слизистых оболочек (ИКБЭ) у детей, проживающих в районах с антропогенной нагрузкой. Так, у обследуемых детей Октябрьского района индекс колонизации букальных эпителиоцитов составлял 1,276±0,01 %, тогда как у обследуемых Кировского и Советского районов этот показатель не превышал единицы, т.е. был сниженным, 0,819±0,03 и 0,738±0,02 %, соответственно, р<0,001. Анализ результатов индивидуальных различий в группах по определению колонизационной резистентности слизистых оболочек (ИКБЭ) у обследуемых детей представлен на рис. 13.

Рис.13 Варианты показателя ИКБЭ у обследованных детей, в зависимости от района проживания

У обследованных детей Октябрьского района преобладал показатель ИКБЭ более 1,0 усл.ед. (77,3±0,02 %), что соответствует норме. На рисунке 14 показана высокая колонизация эпителиальных клеток ротовой полости «оральными стрептококками» у обследованных детей первой группы. Тогда как показатель ИКБЭ у обследуемых Кировского и Советского районов более 1,0 усл.ед., т.е. норма встречался всего у 18,2±0,004 % и 15,9±0,02 %, соответственно, р<0,001. Микроскопически данный результат представлен на рисунке 15. У детей, проживающих в условиях высокой антропогенной нагрузки, наблюдается достоверное снижение адгезивной способности оральных стрептококков на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта.

Рис.14. Высокая колонизация буккальных эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости оральными стрептококками (увел. 900)

Рис.15. Низкая колонизация буккальных эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости оральными стрептококками (увел. 900)

Оценивая результаты по изучению показателя ИКБЭ у детей Кировского и Советского районов необходимо отметить, что более половины (67,9±1,5 и 69,6±1,54 %, соответственно) обследованных имели низкий уровень адгезии нормальной микрофлоры (оральные стрептококки) на буккальных эпителиоцитах, 13,9±0,01 и 14,5±0,03 % - показатель колонизации буккальных эпителиоцитов был значительно снижен. Полученные нами данные по изучению адгезии нормальной микрофлоры (оральные стрептококки) на эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта (показатель ИКБЭ) у детей, проживающих в районах с разной антропогенной нагрузкой, подтверждают ранее проведенные исследования [Маянский, Абаджиди, 1999, 2004] о том, что интенсивность заселения буккальных эпителиоцитов оральными стрептококками подвержена изменениям и отражает общее состояние здоровья.

Анализ корреляционных связей между показателями местного иммунитета и биохимической активности слюны у детей города Красноярска выявил, что у детей, проживающих в экологически благополучном Октябрьском районе выявлена слабой силы корреляция между признаками S Ig A и ИКБЭ (r= 0,14; р<0,05); между ИКБЭ и щелочной фосфатазой (r= 0,21; р<0,01); между общим белком и щелочной фосфатазой (r= 0,17; р<0,05). А так же слабой силы обратная корреляция между S Ig A и щелочной фосфатазой (r= -0,19; р<0,01); между лизоцимом и щелочной фосфатазой (r= -0,27; р<0,001). Достоверной корреляционной связи между другими факторами системы местного иммунитета и биохимической активности слюны у детей Октябрьского района выявлено не было. Рассмотрение коэффициентов корреляции между показателями местного иммунитета и биохимической активности слюны у детей Кировского района (экологически неблагополучного) позволяет говорить о наличии связи прямой слабой степени у следующих признаков: ИКБЭ - S Ig A (r= 0,27; р<0,01), ИКБЭ - щелочная фосфатаза (r= 0,47; р<0,001), ИКБЭ - амилаза (r= 0,33; р<0,001), S Ig A - щелочная фосфатаза (r= 0,27; р<0,01), S Ig A - амилаза (r= 0,20; р<0,05), щелочная фосфатаза - амилаза (r= 0,43; р<0,01) и слабой силы обратная корреляция между лизоцимом и S Ig A (r= -0,19; р<0,05). Корреляционный анализ между показателями местного иммунитета детей и биохимической активностью слюны у детей, проживающих в экологически неблагополучном Советском районе, показал, что между следующими признаками отмечается связь слабой силы: ИКБЭ и S Ig A (r= 0,22; р<0,001); ИКБЭ и амилаза (r= 0,27; р<0,01); S Ig A и амилаза (r= 0,13; р<0,1); щелочная фосфатаза и амилаза (r= 0,13; р<0,01). Достоверных корреляций между другими факторами системы местного иммунитета и биохимической активности слюны у детей Советского района выявлено не было. Проведенный корреляционный анализ между показателями местного иммунитета детей и биохимической активностью слюны, проживающих в крупном промышленном городе Восточной Сибири - Красноярске, подтвердил, что имеются определенные достоверные корреляционные связи слабой и средней степени между химическим составом слюны, иммунологическими показателями слизистой оболочки и районом проживания.

Исследование содержания эссенциальных (медь, цинк) и токсичных (кадмий, свинец) микроэлементов в волосах детей исследуемых районов также позволило выявить определенные закономерности. Установлено, что у детей, проживающих в экологически неблагополучном районе, выявлен дефицит важнейшего незаменимого микроэлемента - меди и достоверное увеличение другого эссенциального микроэлемента - цинка - по сравнению с детьми первого района. Однако, эти изменения находятся в пределах референтных величин. Исследования содержания токсических микроэлементов (кадмия и свинца) в волосах детей свидетельствует о статистически достоверном их увеличении у детей экологически неблагополучного района исследования, хотя их уровень соответствует допустимым концентрациям (таб. 2).

микробиологический стафилококковый бактерионосительство щкольник

Таблица 2.

Содержание микроэлементов в волосах детей, в зависимости от района проживания

Для определения критериев экологического благополучия зоны проживания детей, разработан способ, основанный на суммировании девяти показателей (таб. 3). При этом каждый показатель оценивают в один балл. Повышение показателя более 5 баллов свидетельствует о низком уровне экологического благополучия, требующей отнесения детей, проживающих в этой зоне, в группу высокого риска возникновения экологически обусловленных заболеваний. Значения КЭБЗП от 4 до 3 баллов свидетельствует об умеренно экологически благополучной зоне проживания, требующей отнесения детей, проживающих в этой зоне, в группу незначительного риска возникновения заболеваний. Значение КЭБЗП от 0 до 2 указывает на экологически благополучную зону проживания, требующей отнесения детей, проживающих в этой зоне, в группу с отсутствием риска возникновения заболеваний.

Диагностика эндоэкологического статуса на основе определения резидентного стафилококкового бактерионосительства, состояния системы местного иммунитета слизистых оболочек, соприкасающихся с окружающей средой и микроэлементного состава организма приобретает важное значение в донозологической диагностике экологически обусловленных состояний.