Экспрессионный профиль микрорнк при меланоме кожи и меланоцитарных новообразованиях кожи

МикроРНК являются короткими некодирующими РНК (длина - приблизительно 22 нуклеотида), действующими как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов. МикроРНК кодируются в геноме и транскрибируются, в основном, РНК-полимеразой II как первичные микроРНК (pri-miRNA), длина которых приблизительно составляет 1000 нуклеотидов (Desgagneetal., 2017). Это происходит интергенетически - из их собственного промотора, или интрагенетически - посредством коэкспрессии с собственным, кодирующим белок - «хозяин» геном. Затем первичные микроРНК расщепляются микропроцессорным комплексом (Drosha/DGCR8), превращаясь в предшественники микроРНК (pre-miRNA), которые экспортируются в цитоплазму клетки Exportin5- RanGTP системой. Предшественники микроРНК подвергаются второму расщеплению Dicer/TRBP комплексом, высвобождая микроРНК дуплекс - микроРНК-3р/ микроРНК-5р. МикроРНК дуплекс взаимодействует с Argonaute-протеинами (AGO1-4), этот процесс осуществляется по АТФ-зависимому механизму, с привлечением шаперонового комлекса протеинов теплового шока HSC70 и HSP90. В результате формируется pre-miRNA-индуцированный сайленсинг-комплекс (RISC). Только одна из двух нитей микроРНК становится частью зрелого RISC -комплекса, вторая подвергается деградации. То, какая нить станет «гидом» и сохранится, а какая превратится в «пассажира» и исчезнет, зависит от целого ряда факторов. К этим факторам относятся тип клеток, стадия процесса, особенности заболевания. Таким образом, будет выбрана либо микроРНК-3р, либо микроРНК-5р (Guoetal., 2017; Moszynska etal., 2017).

Как правило, биологической функцией микроРНК является репрессия синтеза протеинов посредством взаимодействия с 3? нетранслирующим регионом (UTR) таргетной мРНК, основанного на комплементарности нуклеотидов 2-8 микроРНК. Вследствие этого взаимодействия ингибируется трансляция мРНК и осуществляется промоция секвестрации мРНК в процессинговые тельца или деградации мРНК. Тем не менее, известно, что микроРНК способны взаимодействовать с функциональными сайтами мРНК, стимулируя трансляцию генов (Lietal., 2017).

В то время как у единичной микроРНК может быть несколько генов-мишеней (эти гены часто функционально связаны, но это не является обязательным условием), единичная мРНК может обладать множеством связывающих сайтов для одной или различных микроРНК. Расположенные рядом в мРНК два сайта связывания могут действовать синергично, осуществляя посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов (Chenetal., 2017).

Несмотря на то, что микроРНК играют ключевою роль в негативной регуляции синтеза белков, появляется информация об их участии в регуляции других важных биологических процессов. В частности, обнаружено, что микроРНК регулируют стабильность ядерных транскриптов, например, мРНК, длинных некодирующих РНК (pri-miRNA). МикроРНК способны индуцировать эпигенетические альтерации в специфических промоторах генов. Существует предположение, что данные молекулы могут модулировать альтернативный сплайсинг в ядерном компартменте. Несколько микроРНК обладают способностью выступать в качестве лигандов для Толл-подобных рецепторов - рецепторов, которые распознают определенные структурные компоненты бактерий, вирусов и грибков, а также активируют клеточный иммунный ответ и принимают важное участие в реакциях врожденного иммунитета (Derghaletal., 2017).

Устойчивая концентрация зрелых микроРНК в клетках зависит от строго регулируемых транскрипции, созревания и распада этих молекул. Существует предположение, что в клетке должно находиться около 100 копий зрелых микроРНК для того, чтобы осуществилась биологически значимая репрессия транскрипции генов. Следовательно, регуляция концентрации микроРНК в клетке является крайне важной в контроле их регуляторных функций. В целом, транскрипция микроРНК контролируется специфическими факторами транскрипции и такими эпигенетическими механизмами, как метилирование ДНК и модификация гистонов. Подобно кодирующим белки генам, определенные микроРНК проявляют тканеспецифический экспрессионный паттерн, поддерживая свою роль как в клеточной дифференцировке, так и развитии тканей и органов. Эффективность процессинга микроРНК может регулироваться посредством различных посттрансляционных модификаций структур, отвечающих за созревание данных молекул (Drosha, DGCR8, Dicer, TRBP, AGO) (Naraharietal., 2017).

Известно, что сами микроРНК тоже могут подвергаться посттрансляционным модификациям, таким как РНК-редактирование, метилирование, уридилирование, аденилирование. Таким образом, модулирование стабильности и процесса разрушения микроРНК осуществляется не только посредством формирования комплексов, например, с Ago-белками или действием специфических нуклеаз, но и в результате вышеупомянутых модификаций (Sunetal., 2017).

МикроРНК обладают высокой стабильностью в клетках и плазме крови, составляющую более 24 часов, этот показатель вариабелен для различных микроРНК. Данные молекулы обнаружены, практически, во всех биологических жидкостях, включая цереброспинальную жидкость, слезы, слюну, грудное молоко, амниотическую жидкость, мочу. Высокая стабильность микроРНК подчеркивает их значимость как потенциальных неинвазивных биомаркеров при различных заболеваниях. В плазме крови существуют различные структуры, которые осуществляют функцию транспортировки микроРНК и защищают их от деградации под действием ферментов. К числу таких структур относятся экзосомы, микровезикулы, апоптотические тельца, РНК-связывающие протеины (AGO2, нуклеофозмин 1), липопротеины высокой, средней и низкой плотности (Estevesetal., 2016).

МикроРНК принимают важное участие в регуляции как физиологических, так и патологических процессов. Выявлено, что они являются центральными регуляторами метаболизма липопротеинов и гомеостаза холестерина. Показано, что липопротеины высокой плотности (ЛПВП) осуществляют транспортировку и доставку микроРНК в клетки, что позволило сформулировать новую теорию об эндокриноподобной межклеточной коммуникации, медиаторами которой являются ЛПВП. Возможно, это является одной из причин выраженных кардиопротективных свойств данных липопротеинов (Desgagneetal., 2017). С другой стороны, установлено, что микроРНК могут стимулировать такие патологические процессы в сердце, как фиброз, гипертрофия, нарушения ангиогенеза. Это играет решающую роль в развитии таких врожденных заболеваний сердца, как гипопластический синдром левых отделов сердца, тетрада Фалло, дефекты межжелудочковой перегородки, синдром Холта-Орама. При врожденных сердечных заболеваниях выявлена дисрегуляция следующих микроРНК: miR-133, miR-208, miR-195, miR-1, miR-378, miR-17-92. В развитии гипертрофии принимают участие miR-1, miR-195, miR-208, miR-378; в развитии фиброза - miR-133, miR-1, miR-195, miR-208; в нарушениях ангиогенеза - miR-378, miR-17-92 (Hoelscher etal., 2017).

Важную роль микроРНК играют при инфаркте миокарда (ИМ). В основе развития ИМ лежит гибель кардиомиоцитов. Существует три варианта клеточной гибели при ИМ: некроз, апоптоз и аутофагия. Установлено, что при инфаркте миокарда активаторами апоптоза являются miR-320, miR-122, miR -153, Oxi- miR-184, блокаторами - miR-93, miR-7a/b, miR-138, miR-142-3р, miR-613; активаторами некроза - miR-103/107, miR-2861, miR-874, блокаторами - miR-155, miR-30b, miR-873; активаторами аутофагии - miR-325, miR-145, блокатором - miR-188-3р (Sunetal., 2017).

МикроРНК принимают участие в регуляции углеводного обмена. Например, miR-21a-5p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-93-5p контролируют экспрессию транспортера глюкозы GLUT4, определяя, таким образом, количество глюкозы, поступающей в мышечную и жировую ткани (Estevesetal., 2017).

Показано, что miR-103, miR-488 принимают участие в регуляции сигнального пути меланокортина в центральной нервной системе, что может быть важным в механизмах развития целого ряда заболеваний, в том числе ожирения, связанного с нарушениями выработки лептина (Derghal etal., 2017).

MiR-126, miR-107, miR-21 принимают участие в контроле экспрессии протеинов, обеспечивающих межклеточные взаимодействия, что может быть важным при инициации и прогрессировании процесса канцерогенеза (Zhuangetal., 2016).

1.3 Роль микроРНК в регуляции канцерогенеза

Канцерогенез является типовым патологическим процессом, при котором нарушение регуляции экспрессии генов имеет принципиально важное значение. МикроРНК способны воздействовать на все события, рассматриваемые в рамках опухолевой прогрессии, включая рост опухоли, инвазию, метастазирование, ангиогенез. Значимость микроРНК при различных злокачественных новообразованиях доказана как изменением их экспрессии, так и дисрегуляцией экспрессии мРНК-мишеней при том или ином онкологическом заболевании (Oliveto etal., 2017; Takahashi etal., 2017). Так, установлено, что miR17-92 обладает проонкогенным эффектом при В-клеточной лимфоме, мелкоклеточном раке легких, раке кишечника и желудка; miR-21 - при раке молочной железы, раке кишечника и легких, глиобластоме; miR-106 - при раке желудка, колоректальном раке; miR-10b - при раке молочной железы; miR-191 - при колоректальном раке и раке молочной железы. К числу микроРНК, обладающих онкосупрессивным действием относятся let-7 - при раке легких и лимфоме Биркитта; miR-15a, miR16-1 - при хроническом лимфолейкозе, раке предстательной железы и мезотелиоме; miR-29 - при раке легких и молочной железы; miR-34a - при раке предстательной железы, мезотелиоме, гепатоцеллюлярной карциноме; miR-126 - при раке легких и молочной железы. Существуют микроРНК, обладающие как проонкогенным, так и антионкогенным действием: miR-24 - при раке молочной железы и глиоме; miR-125 - при раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, меланоме, остеосаркоме, раке яичников; miR-155 - при лимфоме, раке молочной железы, меланоме, раке яичников и желудка; miR-221/222 - при глиобластоме, гепатоцеллюлярной саркоме, раке молочной железы (Oliveto etal., 2017).

Подобно кодирующим белки генам, miR-гены могут подвергаться метилированию, хромосомным амплификациям, делециям, транскрипционной активации. Генетические альтерации могут воздействовать на структуры, задействованные в процессе синтеза и созревания микроРНК, инициировать конформационные изменения сайтов связывания, влиять на процессинг микроРНК и их посттранскрипционное редактирование. Действие дисрегулированных микроРНК как стимуляторов роста опухоли или онкосупрессоров основано на их способности подавлять экспрессию генов-онкосупрессоров или, наоборот, онкогенов соответственно. Ингибирование или стимуляция обладающих способностями инициировать или супрессировать рост злокачественных опухолей микроРНК модулирует пролиферацию опухолевых клеток, рост опухолевого узла, формирование метастазов и выживаемость клеток. В целом, экспрессия микроРНК спсобных подавлять гены-супрессоры опухолевого роста при развитии злокачественных новообразований усиливается, а экспрессия микроРНК с онкосупрессивными свойствами, мишенями которых являются онкогены - снижается (Zhengetal., 2017).

Существует множество сигнальных путей, играющих ключевую роль в развитии злокачественных новообразований, в регуляции которых принимают участие микроРНК. К числу таких сигнальных путей относится GPCR- сигналинг. GPCR - большое семейство рецепторов, сопряженных с G-белком. Это трансмембранные рецепторы, вовлеченные в регуляцию подвижности клеток, роста, клеточной дифференцировки. Установлено, что при многих типах злокачественных новообразований экспрессия этих рецепторов усиливается. Существует мнение, что микроРНК являются молекулами, повышающими экспрессию GPCR-рецепторов, инициируя процесс канцерогенеза (Nohata etal., 2017).

Метастазирование опухоли является одной из главных особенностей злокачественного новообразования, появление новых опухолевых очагов в организме - показатель прогрессии заболевания. В большинстве случаев именно метастазы являются причиной неблагоприятного исхода болезни. Установлено, что микроРНК принимают участие в регуляции процесса метастазирования. Показано, что miR-10b является промотором миграции и инвазии опухолевых клеток при раке молочной железы. Сайленсинг miR-10b редуцирует инвазию клеток глиомы посредством супрессии TP53, PAX6, NOTCH1 и HOXD10 (Zhou etal., 2015). Известно, что кластер miR-17-92 часто амплифицирован при различных злокачественных новообразованиях. Высокая экспрессия члена этого кластера miR-19a/b выявлена в тканях рака желудка и достоверно ассоциирована со способностью к метастазированию. miR-19a/b осуществляет промоцию миграции, инвазии и метастазирования клеток рака желудка, воздействуя на MXD1, антагониста c-Myc. Экспрессия miR-135b повышается при немелкоклеточном раке легких. Эта микроРНК является промотором инвазии и метастазирования, воздействуя на регуляцию сигнального пути Hippo. miR-362-5p высокоэкспрессирован при гепатоцеллюлярной карциноме, уровень экспрессии коррелирует с прогрессией заболевания. Ингибирование miR-362-5p в клетках карциномы подавляет как миграцию, инвазию и пролиферацию invitro, так и рост опухоли и метастазирование invivo (Zhengetal., 2017; Zhou etal., 2015).

Тем не менее, существуют микроРНК, являющиеся негативными регуляторами клеточной инвазии. Так, выявлена, выраженная down-регуляция miR-34a и miR-34c при раке молочной железы. Восстановление экспрессии данных микроРНК ингибирует клеточную миграцию и инвазию invitro и приводит к редукции дистальных метастазов в легких за счет прямого воздействия на Fra-1 (Gozuaciketal., 2017). Андроген -регулируемая miR-135a ингибирует миграцию и инвазию клеток рака предстательной железы, напрямую воздействуя на мишени - ROCK1 и ROCK2 (Baumgartetal., 2017; Vanacoreetal., 2017).

Усиление экспрессии miR-137 приводит к подавлению инвазивных свойств клеток колоректального рака (Guoetal., 2017).

Выявлено устойчивое снижение экспрессии miR-1 в клетках первичного рака предстательной железы, снижение экспрессии этой микроРНК было еще более выраженным в тканях метастазов. Являясь супрессором роста данной опухоли, miR-1 воздействует на структуру F-актина, блокируя способность опухолевых клеток к инвазии и формированию филоподий (Vanacoreetal., 2017).

Разрушение и ремоделирование экстрацеллюлярного матрикса - ключевые шаги на пути к инвазии окружающих тканей опухолевыми клетками. Тенасцин С и ряд других протеинов внеклеточного матрикса, например, периостин и остеопонтин, играют важную роль в ремоделировании опухолевого метастатического микроокружения. Снижение экспрессии miR-335 у пациентов с раком молочной железы способствует появлению метастазов и снижает показатели выживаемости пациентов. Восстановление экспрессии этой микроРНК подавляет миграцию клеток, инвазию и метастазирование за счет воздействия на тенасцин С и SOX4 (Zhou etal., 2015; Gaoetal., 2017).

Снижение экспрессии miR-29c выявлено при назофарингеальных карциномах и в некоторых случаях злокачественных новообразований легких. Оказалось, что мишенями этой микроРНК являются несколько генов, кодирующих ряд протеинов внеклеточного матрикса, включая коллагены и ламинин г1. Эти протеины ассоциируются со снижением способности опухолевых клеток к инвазии и метастазированию. Таким образом, микроРНК являются важными регуляторами ремоделирования внеклеточного матрикса при инвазии опухолевых клеток в процессе развития злокачественного новообразования (Inamuraetal., 2017).

Эпителиально-мезенхимальный переход является типичным сценарием для многих опухолевых клеток. В результате опухолевые клетки становятся более подвижными и приобретают устойчивость к апоптозу. Тем не менее, стало известно, что некоторые опухолевые клетки, независимо от ЭМТ-перехода, способны к коллективной миграции, называемой коллективно-амебоидным переходом. Показано, что miR-34 и miR-200 принимают участие в регуляции как эпителиально-мезенхимального, так и коллективного переходов опухолевых клеток, а miR-21 вовлечена только в регуляцию коллективно-амебоидного перехода. Получены данные, что miR-124 регулирует стабильность и трансляцию мРНК интегрина в1, модулируя межклеточную адгезию опухолевых клеток вовремя коллективной инвазии (Gozuaciketal., 2017; Zhou etal., 2015).

Деструкция сосудистого эндотелия является ключевым условием успешной инравазации опухолевых клеток, miR-105, секретируемая клетками ряда метастазирующих опухолей, является промотором метастазирования в результате прямого воздействия на белок плотных контактов ZO-1, что приводит к деструкции сосудистых эндотелиальных барьеров. Супрессия miR-21 при метастазирующих опухолях молочной железы и кишечника приводит к снижению инвазивных свойств опухолевых клеток и уменьшению метастазов в легких. Это обусловлено прямым воздействием на гены-онкосупрессоры TPM1, PDCD4, Maspin, miR-520c/miR-373 снижают инвазию опухолевых клеток, действуя посредством регуляции сигнальных путей NF-кB and TGF-в (Wang etal., 2017).

MiR-105 способствует не только разрушению сосудистых эндотелиальных барьеров в области первичной опухоли, но и деструкции плотных контактов эндотелиальных клеток в других органах, что необходимо для экстравазации. miR-155 тоже способствует экстравазации опухолевых клеток, воздействуя на аннексин-2, клаудин-1, компоненты адгезии DOCK-1 и синтенин-1 (Zhou etal., 2015; Kumaretal., 2017).

Существуют микроРНК, являющиеся промоторами метастатической колонизации органов. Например, miR-122, воздействуя на пируваткиназу, ингибирует захват глюкозы нормальными клетками, делая ее более доступной для опухолевых (Homami etal., 2016).

МикроРНК влияют на опухолевое микроокружение в процессе развития метастазов. Например, miR-34a может снижать продукцию хемокина CCL22, который обеспечивает рекрутинг Т-лимфоцитов, что способствует формированию важного свойства опухолевых клеток - способности ускользать от иммунного ответа организма (Oliveto etal., 2017).

Таким образом, микроРНК играют важную роль в формировании метастазов, что особенно важно для злокачественных заболеваний с быстрым развитием метастазирования, к числу которых относится и меланома.

1.4 МикроРНК в меланомогенезе

Меланома кожи - злокачественное новообразование с высокой степенью гетерогенности. Среди лиц со светлой кожей частота меланомы ежегодно увеличивается (Wernlietal., 2016). На ранней стадии меланома излечима, но прогноз пациентов с метастатической меланомой неблагоприятен. (Greenleeetal., 2000; Rigeletal., 2000). В последние годы все большее значение в патогенезе меланомы и развитии устойчивости к лекарственной терапии при меланоме стали придавать эпигенетическим нарушениям, в частности - изменениям экспрессии микроРНК (Fattoreetal., 2017].

Анализируя микроРНК, вовлеченные в развитие и прогрессию меланомы, установлено, что miR-211 является одной из микроРНК, экспрессия которых наиболее значительно различается в нормальных меланоцитах и клетках первичной меланомы. Эктопическая экспрессия miR-211 в клеточных линиях первичной меланомы приводит к выраженному ингибированию роста и инвазии опухолевых клеток. Это позволило сделать предположение, что в нормальных условиях данная микроРНК в меланоцитах функционирует как опухолевый супрессор. Вывлено, что miR-211 кодируется регионом шестого интрона TRPM1, гена, являющегося предполагаемым супрессором способности клеток меланомы к метастазированию. Показано, что экспрессия TRPM1 и miR-211 контролируется MITF, регулятором развития и функций меланоцитов. Возможно, активность TRPM1 и MITF как опухолевых супрессоров, медиируется, по крайней мере, частично, miR-211 (Aftabetal., 2014; Chen, 2017; Bennettetal., 2013). Идентифицировано несколько генов-мишеней miR-211, включая Runt-связанный фактор транскрипции 2 (RUNX2), рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2R),TGF-бета рецептор 2 (TGFBR2),thePOU-содержащий фактор транскрипции BRN2, ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов 5 (NFAT5). Установлено, что клетки меланомы, в которых значительно уменьшена экспрессия miR-211, обладают повышенными способностями к инвазии. И наоборот, линии опухоли, в которых установлена высокая экспрессия miR-211, обладают низким инвазивным потенциалом, независимо от уровня экспрессии меластатина, способного блокировать формирование опухолевых узлов (Sarkaretal., 2015; Russoetal., 2016).

Таким образом, miR-211 играет одну из ключевых ролей в инвазивности и прогрессии меланомы. Для того, чтобы выявить патогенетический базис этих свойств данной микроРНК, были тщательно изучены меланома-специфические гены, регулирующие метастазирование и проведен поиск соответствий между этими генами и генами-мишенями miR-211. Выявлены 6 совпавших генов: IGF2R, NFAT5, TGFBR2, FBXW7, ANGPT1, IGFBPS, VHL. Нокдаун этих генов обладал идентичным эффектом на способность к инвазии клеток меланомы, как и up-регуляция miR-211. Позже был идентифицирован еще один ген, являющийся мишенью для miR-211 - NUAK1. Оказалось, что этот ген играет важную роль в способности клеток меланомы к адгезии, при снижении экспрессии miR-211 экспрессия NUAK1активируется, что проявляется в промоции адгезии (Leeetal., 2014).

Еще одной микроРНК, обладающей онкосупрессивными свойствами при меланоме является miR-196a. Используя высокопроизводительный профайлинг экспрессии микроРНК в клеточных линиях и образцах ткани, показано, что при развитии меланомы экспрессия данной микроРНК значительно снижена. Стимуляция экспрессии miR-196aдостоверно снижает способность опухолевых клеток к инвазии. HOX-C8, кадгерин-11, кальпонин-1, остеопонтин были идентифицированы как мишени miR-196a.

Down-регуляция miR-196a приводит к гиперэкспрессии HOX-C8, в результате происходит стимуляция сигнального пути основного фактора роста фибробластов (bFGF), повышение экспрессии фактора транскрипции ETS-1 и костного морфогенетического белка 4 (BMP-4), играющих важную роль в прогрессии меланомы. miR-193b тоже обладает свойствами опухолевого супрессора, воздействуя на циклин D1.

Следует подчеркнуть, среди факторов, моделирующих эффект воздействия микроРНК на их мишени, достаточно значимым является скорость распада той или иной микроРНК. Эта скорость может варьировать от нескольких минут до нескольких дней (Aftabetal., 2014).

Известно, что гипоксия воздействует на микроокружение всех опухолевых клеток, включая и клетки меланомы. Существует предположение, что один из эффектов гипоксии при меланоме - усиление способности опухолевых клеток ускользать от иммунного контроля за счет репрессии антигенов и белков, необходимых для эффективного иммунного ответа. Установлено, что гипоксия, действуя через гипоксия-индуцибельный фактор б (HIF1-б), стимулирует экспрессию ряда микроРНК. К числу этих микроРНК относится miR-210. Уменьшенная экспрессия miR-210 в клеточных линиях меланомы способствует лизису опухолевых клеток антиген-специфичными Т-лимфоцитами. Наказано, что гены PTPN1, HOXA1, TP53I11, являющиеся мишенями miR-210, и, предположительно, осуществляющие медиацию иммуносупрессивного ответа, вовлечены в иммунную регуляцию и инициацию меланомогенеза (Fattoreetal., 2017).

Установлено, что miR-34a/c принимает участие в регуляции иммунного ответа в клетках меланомы. Эта микроРНК контролирует экспрессию лиганда для рецептора естественных киллеров ULBP2. Рецептор естественных киллеров NKG2D осуществляет раннюю детекцию развития опухолей, в том числе и меланомы (Tanakaetal., 2013).

Эктопическая экспрессия miR-30b и miR-30 усиливает способность клеток меланомы к метастазированию, способствуя повышению иммунносупрессивных свойств микроокружения. Это осуществляется через гликозилированный протеин GALNT7 и повышенный синтез иммуносупрессивных молекул, например - asIL-10, что привлодит к редукции активации и рекрутинга иммуннокомпетентных клеток. GALNT7 - гликозилированный протеин, а изменения паттерна гликозилирования ассоциируются с опухолевой прогрессией (Aftabetal., 2014).

Установлено, что экспрессия miR-9 достоверно снижена в метастазирующих меланомах по сравнению с первичными меланомами. Повышение экспрессии этой микроРНК в летках меланомы приводит к значительному снижению пролиферации опухолевых клеток и подавлению их миграционных способностей. Это сопровождается снижением полимеризации F-актина и подавлением активности ГТФ-аз, вовлеченных в ремоделирование цитоскелета. Гиперэкспрессия miR-9 повышает экспрессию Е-кадгерина и инициирует супрессию сигнального пути NF-кB1-Snail1, что, в конечном итоге, приводит подавлению роста и метастазирования меланомы (Liuetal., 2012).

Показано, что miR-25, принимающая участие в регуляции роста клеток при различных злокачественных новообразованиях, играет роль и в меланомогенезе. Экспрессия miR-25 достоверно повышена в клетках меланомы. Подавление экспрессии miR-25 вызывает супрессию инвазивных свойств и пролиферативной активности клеток меланомы. Dickkopf-связанный белок 3 (DKK3) является мишенью данной микроРНК, up-регуляция которого частично обусловливает онкогенных эффект miR-25 в клетках меланомы. Эктопическая экспрессия miR-25 индуцирует аккумуляцию в-катенина в ядре и ингибирует активность фактора 4 Т-лимфоцитов (TCF4) а также экспрессию c-Myc и Cyclin D1. Таким образом, miR-25 является промотором пролиферации и инвазии клеток меланомы (Huoetal., 2016).

Выявлено, что экспрессия miR-365 значительно снижена в клеточных линиях злокачественной меланомы, снижение уровня экспрессии коррелирует с развитием метастазов, стадией заболевания и выживаемостью пациентов. Эктопическая экспрессия miR-365 ингибирует пролиферацию и метастазирование опухолевых клеток как invitro, так и invivo. Доказано, что нейтрофилин 1 (желатиназа-ассоциированный липокалин нейтрофилов, NRP1) является прямой мишенью этой микроРНК. Нейтрофилин1 относится к группе мультифункциональных нетирозинкиназных рецепторов, лиганд которого - А изоформа сосудистого фактора роста эндотелия. NRP1 активирует, по крайней мере, три сигнальных пути, ассоциированные с промоцией эпителиально-мезенхимального перехода - TGF-в, Hh и HGF/cMet. Стимуляция экспрессии miR-365 ингибирует эпителиально-мезенхимальный переход в клетках меланомы (Baietal., 2015).

Показано, что экспрессия miR-625 достоверно снижена в клетках меланомы с высоким инвазивным потенциалом. Эктопическая экспрессия данной микроРНК приводит к подавлению пролиферации, миграции и инвазивных свойств клеток меланомы. Одной из потенциальных мишеней miR-625 является SOX2. SOX2 - фактор транскрипции эмбриональных стволовых клеток, играющий важную роль в эмбриональном развитии и самообновлении эмбриональных стволовых клеток. Данный фактор транскрипции способен осуществить репрограммирование различных соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые. SOX2 ингибирует апоптоз, активируя MAP4K4-Survivin сигнальный путь, индуцирует развитие метастазов, способствуя эпителиально-мезенхимальному переходу за счет воздействия на WNT/ в-катенин-сигналинг(Fangetal., 2017).

Установлено, что уровень экспрессии miR-205 достоверно снижается в последовательности: доброкачественный невус - первичная меланома - метастазирующая меланома. Стимуляция экспресcии этой микроРНК в клетках меланомы приводит к нарушению клеточной подвижности и миграции, при этом происходит снижение полимеризации F-актина. При гиперэкспрессии miR-205 происходит супрессия мРНК и белка гена ZEB2. Данный ген кодирует фактор транскрипции, содержащий цинковые пальцы. Одновременно с этим происходит повышение экспрессии Е-кадгерина и блокада эпителиально-мезенхимального перехода (Liuetal., 2012).

МикроРНК могут быть использованы для дифференциальной диагностики различных типов меланомы. Показана достоверная корреляция между экспрессией семи микроРНК: miR-142-3p, miR-486, miR-214, miR-218, miR-362, miR-650 и miR-31 и акрально-лентигинозной меланомой. В 25% случаев у пациентов с акрально-лентигинозной меланомой выявлялась KRAS-мутация, сниженная экспрессия miR-137 достоверно ассоциировалась с данным генетическим вариантом акрально-лентигинозной меланомы (Chen, 2017)

Таким образом, микроРНК могут оказывать как онкогенный, так и онкосупрессивный эффекты при меланоме, а поиск новых микроРНК, являющихся потенциальными диагностическими маркерами или потенциальными мишенями для терапевтического воздействия и исследование механизмов, лежащих в основе их влияния на меланомогенез, является перспективным для решения задач экспериментальной и клинической медицины.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на базе кафедры патологической физиологии им. проф. В. В. Иванова ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого. Утверждено локальным этическим комитетом (протокол №59 от 2 декабря 2014г).

Биоптаты больных меланомой кожи и доброкачественных меланоцитарных новообразований кожи были получены из КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Возраст пациентов с меланомой составлял от 35 до 81 года. Мужчины составляли 56%, женщины - 44%. Клинико-морфологические формы меланомы кожи представлены в Таблице 1.

Таблица 1 - Клиническая характеристика биоптатов больных меланомой кожи

Возраст пациентов с доброкачественными меланоцитарными невусами составлял от 29 до 55 лет. У двух пациентов невусы были на лице, а у одного был невус на груди (Таблица 2).

Таблица 2 - Характеристика биоптатов доброкачественных меланоцитарных невусов

Процентное содержание мишеневой ткани в каждом образце оценивали на гистологическом срезе с помощью окрашивания гематоксилином и эозином с последующей визуализацией на световом микроскопе. Образцы с меланомой кожи были отобраны с процентным содержанием опухолевой ткани не менее 70%. По такому же принципу были отобраны образцы с невусами.

Образцы тканей, полученные от больных меланомой кожи и доброкачественных меланоцитарных новообразований кожи, были подвергнуты фиксации 10% раствором формальдегида и заключены в парафин по стандартной методике. Диагноз был выставлен сертифицированным патологоанатомом в Красноярском краевом патологоанатомическом бюро. После фиксации образцы хранили в архиве патологоанатомического бюро при комнатной температуре на срок до 5 лет.

Для исследования роли микроРНК-4286 в патогенезе меланомы кожи была выбрана человеческая культура клеток меланомы кожи BRO, которая обладает более быстрым ростом клеток. Данная культура была получена из ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН (г. Новосибирск).

2.1 Выделение РНК