Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Инверсия действия антиоксидантных веществ в модельных системах с металлозависимой индукцией свободно-радикального окисления липидов

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

03.00.04 - биохимия

Диб Х.Х.

Волгоград 2006

Работа выполнена на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор О.В. Островский

кандидат биологических наук,

В.Г. Зайцев

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор А.А. Озеров

доктор медицинских наук,

профессор В.Б. Бородулин

Ведущая организация: Воронежская государственная медицинская академия им. Бурденко.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Процессы свободно-радикального окисления (СРО) являются неотъемлемой составляющей существования аэробных организмов, включая человека и других млекопитающих [Valentine J.S. et.al. 1998, Aruoma O.I. 1998, Gulliver J.M., 2000]. С одной стороны, свободные радикалы кислорода и нерадикальные активные формы кислорода (АФК) необходимы для реализации многих важных физиологических функций, таких как участие в ферментативном катализе, регуляция внутриклеточных процессов, иммунный и адаптивный ответы [Davies K.J.A. et.al. 1995, Droge .W., 2002].

С другой стороны, АФК являются химически высокоактивными соединениями, легко вступающими в реакции с самыми разнообразными классами веществ. Поэтому многие биологически значимые компоненты организма (липиды, белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, углеводы, низкомолекулярные регуляторы различной химической природы) могут относительно легко подвергаться окислительной модификации, в том числе с последующим разрушением [Владимиров Ю.А. 1998, Droge W. 2002]. В результате избыточная продукция АФК, особенно в сочетании с недостаточностью компенсаторных возможностей защитной антиоксидантной системы (АОС) организма, способна приводить к развитию новых или усугублению предсуществующих патологических изменений в организме [Ланкин В.З. et.al. 2000, Ursini F. et.al. 1991]. Следовательно, повреждающее действие АФК может являться существенным фактором развития и прогрессирования заболеваний человека. Особенно важен тот факт, что интенсификация СРО и повышение уровня окислительных повреждений следует рассматривать в качестве неспецифического патологического процесса, сопровождающего практически любое заболевание [Владимиров Ю.А., 1998, Меньшикова Е.Б. и др. 1994, Dizdaroglu M. et.al. 2002, Halliwell B. et.al. 2001, Rock E. et.al 2000, Knight J.A. et.al 1992].

Хорошо известный факт выраженного дисбаланса между уровнем продукции АФК и функциональной активностью АОС, а также возможность повышения риска развития осложнений ряда заболеваний при более высокой интенсивности СРО являются основой теоретического обоснования предполагаемой пользы фармакологической коррекции избыточной интенсивности СРО у пациентов с различными заболеваниями с использованием ингибиторов СРО - антиоксидантов (АО) [Gulliver J.M. 2000, Aruoma O. 2000, Hyman M.A. et.al. 2005, Osawa T. et.al. 2005].

Тем не менее, на сегодняшний день, несмотря на обнадеживающие результаты экспериментальных исследований in vitro и in vivo, большинство завершенных к настоящему моменту клинических испытаний применения АО при различных заболеваниях продемонстрировали отсутствие положительного эффекта антиоксидантной терапии на клинические исходы либо даже привели к обнаружению неблагоприятных эффектов АО [Ricciarelli R. et.al. 2001, Brown B.G., Crowly J. 2005, Lonn E. et.at. 2005].

Одной из причин такого положения дел может являться относительно узкий спектр клинически применяемых АО, среди которых многие одновременно обладают и другими, порой более значимыми физиологическими эффектами. В частности, до сих пор одними из наиболее широко применяемых АО остаются токоферол [Бурлакова Е.Б. и др. 1998, Hyman M.A. et.al 2005, Urizzi P. et.al. 1998], аскорбиновая кислота и ретинол, которые в первую очередь являются витаминами с разнообразными регуляторными функциями в организме, и лищь во вторую - АО.

Поэтому важной и актуальной задачей является поиск и введение в клиническую практику новых видов АО [Halliwell B. et.al. 1995]. При этом основное внимание должно быть уделено поиску АО с минимальным набором дополнительных физиологических эффектов (кроме антиоксидантного действия), при этом желательно иметь в арсенале врачей как препараты с максимально широким действием на СРО, так и препараты с возможно более специфичным действием на определенные звенья этого процесса (перекисное окисления липидов - ПОЛ, окислительная модификация белков, повреждение нуклеиновых кислот и т.д) [Roger G., 2004, Halliwell B. et.al. 1990, Dizdaroglu M. et.al. 2002].

Другой видимой проблемой клинического использования АО является тот факт, что, в силу особенностей своих химических свойств, практически все АО способны при определенных условиях вместо подавления радикальных реакций вовлекаться в их дальнейшее развитие [Бурлакова Е.Б. и др. 1998; Зайцев В.Г. и др. 2000]. Таким образом, в зависимости от концентрации самого АО, концентрации и химической природы субстратов окисления, других физических или химических факторов АО могут проявлять либо антиоксидантное действие, либо прооксидантное, либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления АФК и скорость реакций СРО. К сожалению, на данный момент возможность потери антиоксидантного действия или её инверсии в прооксидантное действие практически не учитывается ни при клиническом использовании АО, ни при отборе новых перспективных агентов [Ланкин В.З. и др. 2000].

Одним из наиболее важных факторов, которые могут способствовать инверсии между анти- и прооксидантными свойствами веществ, является наличие в реакционной среде катионов металлов переходной валентности [Sakihama Y. et.al. 2002]. Важно отметить, что многие факторы, способные стимулировать инверсию свойств АО, наблюдаются в организме при тех или иных патологических состояниях, например, ацидоз, повышенное содержание несвязанных катионов переходных металлов (в первую очередь, железа и меди), усиленная продукция одновременно свободных радикалов и молекул в электронно-возбужденном состоянии и т.д.

При этом следует помнить, что влияние ионов металлов переменной валентности на действие антиоксидантов в экспериментах in vitro [Kuzmenko A.I. et.al. 2005], в экспериментах на изолированных клетках [Rock E. et.al. 2000, Oldenquist G. et.al. 1999, Jean-Marie F.R. 2001] и в экспериментах на животных может быть существенно и закономерно отличным, что не позволяет использовать в скрининговых целях тест-системы только одного уровня сложности структурной организации.

В то же время в условиях современной отечественной экономической ситуации наиболее экономически выгодной стратегией внедрения новых перспективных антиоксидантных препаратов может оказаться сочетание двух следующих подходов: во-первых, поиск перспективных соединений среди тех, что уже разрешены к практическому использованию по другим назначениям или в качестве биологически активных добавок, а во-вторых, корректная оценка эффективных концентраций используемых в настоящее время антиоксидантных препаратов, чтобы избежать инверсии эффектов.

Особенности антиоксидантного действия веществ определяются в первую очередь их химической природой [Halliwell B. 1990], поэтому для целенаправленного поиска АО с конкретными мишенями действия и определенными особенностями проявления антиоксидантных свойств желательно представлять себе среди каких классов веществ следует в первую очередь проводить скрининг.

В то же время на сегодня общепринятая классификация АО прямого действия отсутствует. Простейшая классификация основана на растворимости веществ в водной и липидной фазе и позволяет выделить две группы АО: гидрофильные и липофильные [Владимиров Ю.А. 1998]. Эта классификация позволяет оценить, в каких (липидных или водных) компартментах организма преимущественно будут концентрироваться и, соответственно, эффективно действовать те или иные АО. Однако эта классификация не позволяет группировать АО по механизму их действия.

Одним из наиболее хорошо изученных фенольных АО является «бутилированный гидрокситолуол» (BHT, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол, ионол). В большом количестве лабораторий изучались различные аспекты эффектов BHT в биологических и химических системах СРО [A Krasowska. et.al. 2001., E Fries. et.al. 2002]. Именно с использованием BHT (и токоферолов) были установлены основные закономерности поведения АО в биологических и искусственных мембранах [M.A Soobrattee. et.al. 2005.]. Дополнительным доводом для изучения BHT был тот факт, что это вещество является активным компонентом лекарственного препарата дибунола. В результате, BHT был выбран нами в качестве эталонного АО и вещества сравнения для остальных исследуемых соединений.

Одним из перспективных препаратов для изучения возможности его эффективного антиоксидантного действия представляется циквалон. С одной стороны, по своей структуре это соединение с желчегонными свойствами представляет собой бифенол с двумя высокоподвижными атомами водорода. Высокая липофильность молекулы циквалона позволяет ему легко встраиваться в структуру мембраны, где он теоретически может перехватывать липидные радикалы и тормозить пропагацию цепных реакций ПОЛ. И, наконец, недавно методами ЭПР была показана принципиальная возможность циквалона перехватывать супероксидный и гидроксильный радикалы [Urizzi P. et al. 1998]. Поэтому изучение возможности ингибирования процессов СРО in vitro и in vivo с помощью циквалона представляется вполне актуальной.

В рамках нашего исследования мы приняли решение изучить соответствующие свойства двух фенолкарбоновых кислот, широко распространенных в пищевых и лекарственных растениях, а именно, феруловой кислоты и изоферуловой кислоты.

Благодаря наличию в структуре молекулы феруловой кислоты углеродной цепи, содержащей двойную связь и гидроксильной группы в фенильном ядре, она легко вступает в свободно-радикальные реакции с образованием стабильного слабо реакционно-способного феноксильного радикала. Таким образом, феруловая кислота способствуя терминации цепных свободно-радикальных реакций, является высоко эффективной ловукой свободных радикалов [Дъяков А.А. 2004].

Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы научных исследований Волгоградского государственного медицинского университета «Изучение регуляции интенсивности свободнорадикальных процессов в репарации окислительных повреждений при различных изменениях внутренней среды и внешних воздействиях» при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 04-04-965.05 «Исследование инверсии антиоксидантных и прооксидантных свойств биологически активных соединений in vitro и in vivo»).

Цель настоящей работы

Целью исследования является оценка возможности инверсии действия антиоксидантов (дибунола, циквалона, фенолкарбоновых кислот) и выявление диапазона концентраций их эффективного антиоксидантного действия при моделировании металлозависимых процессов свободно-радикального окисления в экспериментах in vitro и in vivo.

Основные задачи работы

1. Изучить возможность и степень необходимости использования двух различных тест-систем свободно-радикального окисления, моделирующих различные типы реакций (свободно-радикальное окисление в гомогенной системе и перекисное окисление липидов в бислойных липидных мембранах), для скрининга химических соединений на наличие антиоксидантных свойств.

2. Оценить возможность инверсии эффекта лекарственных препаратов фенольной природы (дибунол, циквалон) и фенолкарбоновых кислот (феруловая и изоферуловая) с использованием модельных систем in vitro.

3. Отобрать по результатам тестов in vitro наиболее эффективные антиоксиданты и оценить их антиоксидантное действие с определением диапазона максимально эффективных концентраций на клеточной модельной системе перекисного гемолиза эритроцитов, индуцированного солями меди.

4. Изучить возможность снижения интенсивности процессов свободно-радикального окисления и уровень окислительных повреждений в организме крыс на фоне интоксикации солями меди при помощи наиболее эффективного антиоксиданта по результатам тестов in vitro и в клеточной модельной системе.

Научная новизна работы

Продемонстрирована необходимость применения при скрининге химических соединений на наличие антиоксидантных свойств комплексного подхода, который, с одной стороны, учитывает возможность проявления эффектов соединений на различные звенья процессов свободно-радикального окисления, а с другой,- обеспечивает оценку эффектов на различных структурных уровнях организации материи (молекулярном, клеточном, организменном).

Установлено, что одновременное использование тест-систем гемм_ зависимого окисления АБТС (моделирование свободно-радикального окисления в гомогенной водной системы) и спонтанного и индуцированного окисления липосом (моделирование перекисного окисления липидов в бислойных фосфолипидных мембранах) позволяет получить более полную информацию о выраженности антиоксидантных эффектов фенольных соединений и возможности проявления ими прооксидантного действия.

Показано, что антиоксидантная эффективность циквалона не уступает дибунолу, используемому в медицине в качестве антиоксидантного средства.

Впервые на модели медь-индуцированного окислительного стресса показано, что циквалон способен защищать клетки млекопитающих от окислительного повреждения. А также обнаружено, что циквалон способен более эффективно, чем дибунол, защищать эритроциты не только от перекисного окисления липидов, но и от образования метгемоглобина, вызванного солью меди.

Продемонстрировано, что циквалон может снижать интенсивность процессов свободно-радикального окисления и повышать функциональную активность антиоксидантной системы у крыс, в состоянии окислительного стресса вызванного субтоксической интоксикацией солями меди. Обнаружено, что введение циквалона животным оказывает защитный эффект и улучает биохимические показатели.

Практическая значимость работы

В результате исследования установлена значимость использования предложенного набора тест-систем различного уровня сложности (молекулярного, клеточного и организменного уровня организации) для скрининговой оценки эффективности антиоксидантного действия химических соединений на различные звенья процессов свободно-радикального окисления. Предложенный набор модельных систем одновременно с оценкой антиоксидантного действия веществ позволяет выявить возможность и условия инверсии антиоксидантных свойств в прооксидантные и установить диапазон эффективных концентраций антиоксидантов.

Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, кафедре фармацевтической химии и кафедре фармацевтической технологии и биотехнологии Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедрах биохимии и фармакологии Саратовского государственного медицинского университета и Астраханской государственной медицинской академии.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на научной конференции студентов и молодых учёных 62-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 19-23 апреля 2004 г.); на Всероссийском симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции»; (24-26 мая 2005 г.), на Российской национальной конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азот, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 26-30 сентября 2005 г.) и на конференции молодых учёных «Актуальные проблемы экспериментальной медицины» (Волгоград, 8-10 ноября 2005 г).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для адекватной оценки антиоксидантных веществ и выявления возможной инверсии действия химических соединений на процессы СРО следует использовать более чем одну тест-систему in vitro, например, модельную систему ПОЛ в липосомах и модельную систему гем-зависимого окисления АБТС.

2. Модельная клеточная система медь-индуцированного окислительного гемолиза, позволяет оценить условия проявления фенольными АО антиоксидантных и прооксидантных свойств и выявить зависимость инверсии антиоксидантного действия от концентрации веществ.

3. Индукция у лабораторных животных окислительного стресса острой интоксикацией солями меди, позволяет изучать вероятное защитное действие антиоксидантных препаратов.

4. Циквалон, используемый в медицине как желчегонное средство, обладает выраженной антиоксидантной активностью как в химических и клеточных тест-системах, так и в экспериментах на лабораторных животных, низкой склонностью к инверсии антиоксидантных эффектов и способностью защищать клетки не только от перекисного окисления липидов, но и от окислительного повреждения белков.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на (154) страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, трёх глав результатов собственных исследований, главы обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает (248) источника, из них (81) отечественных и (167) иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 47 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе были использованы следующие реактивы: бутилированный гидрокситолуол (BHT, ионол) производства “Merck” (Германия), изоферуловая кислота и циквалон были любезно предоставлены д.фарм.н., профессором А.В. Симоняном (кафедра технологии лекарственных форм Волгоградского государственного медицинского университета), феруловая кислота производства “Fluka” (Швейцария), купренил (пеницилламин) производства “Polfa” (Польша).

1. Влияние фенольных соединений (бутилированный гидрокситолуол - BHT, циквалон, феруловая кислота и изоферуловая кислота) на скорость реакций СРО in vitro проводили с использованием модифицированного АБТС-теста [Re R, et al. 1999] и модельной системы спонтанного и индуцированного ПОЛ липосом [Зайцев В.Г. и др. 2000, Зайцев В.Г. и др. 1998]. В липосомальной модельной системе изучали накопление продуктов ПОЛ в ходе спонтанного окисления (автоокисления без индукторов) и после индукции ПОЛ солями меди (ацетат и хлорид) и реактивом Фентона.

2. На клеточном уровне вызывали окислительный гемолиз эритроцитов крыс и человека инкубацией в водяном термостате при постоянной температуре 37⁰ С в присутствии солей меди в диапазоне 25-200 мкМ [Nishikawa T. et.al. 1997]. Кроме степени гемолиза в эритроцитах определяли содержание метгемоглобина [Cruz-Landeria A. et.al. 2002] и ТБК-реактивных продуктов ПОЛ [Андреева Л. 1988, Гаврилов В.Б. 1987].

Исследование эффектов циквалона и BHT на модели медь-индуцированного гемолиза эритроцитов в диапазоне концентраций: 0,002-0,02 мМ.

3. Опыты на модели стресса целого организма выполнены на (73) белых нелинейных крыс. Острый окислительный стресс вызывали солью меди (сульфата меди(II) пентагидрат) в дозе (1/6 ЛД₅₀) 5 мг/кг массы тела.

Для оценки состояния окислительно-антиоксидантного баланса организма в крови (гепариновая плазма, эритроциты) и образцах ткани (почек, печени и головного мозга) проводили определение активности ГП [Моин В.М. 1986], КТ [Королюк М. А. и др. 1988], СОД [Кюстюк В. А. и др. 1984], церулоплазмина, АОА [Re R. et al. 1999], содержания меди [Данилова Л.А. 2003].

4. В опытах на крысах, сравнивали защитный эффект фенольного соединения циквалона в дозе 5 мг/кг с влиянием купренила (препарат сравнения) в дозе 100 мг/кг массы тела.

Обработка результатов исследования проводилась с использованием встроенных функций программы МС Excel (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка, 95% доверительный интервал, медиана, персентили) и программы Stastitica 6,0 (StatSoft). В зависимости от результатов проверки вариационных рядов на нормальность (тест Шапиро-Уилка) и количества экспериментальных групп, использовались параметрические (t-тест Стдьюдента, дисперсионный анализ), либо непараметрические методы (Манна-Уитни или Краскела-Уоллеса).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

АБТС-тест основан на способности гемопротеинов катализировать по радикальному механизму окисление АБТС пероксидом водорода с образованием интенсивно окрашенного катион-радикала АБТС [Miller et al. 1993; Re R. et al. 1999]. Антиоксиданты, соответственно, способны подавлять окисление АБТС. В этой модельной системе представляется возможным оценить собственно антирадикальные эффекты исследуемых веществ.

АБ

В Г

Рис. 1. Кинетика гем-зависимого окисления АБТС в присутствии различных концентраций BHT (А), циквалона (Б), феруловой кислоты (В) и изоферуловой кислоты (Г).

Мы обнаружили, что в диапазоне концентраций от 2,63 до 105,26 мкМ (в реакционной среде) все четыре вещества (BHT, циквалон, феруловая и изоферуловая кислота) показали способность ингибировать свободно-радикальное окисление АБТС. При этом антирадикальное действие феруловой и изоферуловой кислоты было более слабым, чем у BHT и циквалона (рис.1).

Расчет значений константы ингибирования (K_i) окисления АБТС для изученных соединений показал, что циквалон и BHT имеют достоверно не отличающиеся величины константы ингибирования (K_i составила 2,92 ± 0,66 мкМ и 1,59 ± 0,98 мкМ, соответственно). С другой стороны, для изоферуловой кислоты рассчитанная величина K_i составила 59,21 ± 10,01 мкМ, что существенно выше, чем для BHT или циквалона.

Однако в модельной системе АБТС-теста феруловая кислота подавляет свободно-радикальные окислительные процессы гораздо более эффективно, чем изоферуловая кислота. Так, в концентрации 52,63 мкМ и 105,26 мкМ феруловая кислота полностью ингибировала окисление АБТС (степень ингибирования 98,2%), в то время как для BHT и циквалона такое ингибирование достигается уже при концентрации 52,63 мкМ. При концентрации 26,31 мкМ феруловая кислота подавляет окисление АБТС лишь на 57,1%, в то время как циквалон - на 76,9%, а BHT - на 79,3%.

Поскольку исследованные нами вещества обладают достаточно высокой степенью липофильности, в последующих опытах мы использовали модельную систему на основе лецитиновых липосом. Эта модельная система базируется на анализе накопления продуктов ПОЛ в ходе спонтанного или индуцированного ПОЛ липосом [Зайцев, Закревский, 2000] и позволяет приближенно оценить влияние исследуемых соединений на свободно-радикальные процессы, протекающие в бислойных липидных мембранах, близких по своей структуре и свойствам к клеточным мембранам.

АБ

В Г

Рис.2. Влияние BHT и циквалона (10 мкМ) на содержание ТБК-РВ в липосомах, подвергнутых окислению хлоридом меди (А), хлоридом меди вместе с пероксидом водорода (Б), ацетатом меди (В), и ацетатом меди вместе с пероксидом водорода (Г).

Мы обнаружили, что в липосомальной модельной системе достоверных отличий в эффективности антиоксидантного действия между циквалоном и BHT в концентрации 10 мкМ при индуцированном ПОЛ отсутствовали вне зависимости от способа инициации ПОЛ в липосомах (рис.2,3), в то время как при спонтанном окислении липосом циквалон более эффективно подавлял накопление ТБК-реактивных продуктов ПОЛ в сравнении с BHT.

А

Б

Рис. 3. Влияние различных концентраций циквалона на содержание ТБК-РВ в липосомах, подвергнутых автоокислению, через 6 ч (А) и через 24 ч после индукции ПОЛ (Б).



Рис. 4. Влияние BHT и циквалона (10 мкМ) на содержание ТБК-РВ в липосомах, подвергнутых спонтанному окислению.

Интересно, что зависимость АОА от концентрации циквалона наблюдается только при длительном протекании спонтанного ПОЛ (24 ч после индукции), но отсутствует через 6 ч после индукции автоокисления в мембране липосом (рис. 3). Аналогичную ситуацию наблюдали и при индуцированном ПОЛ.

Таким образом, полученные нами результаты показали, что в двух модельных системах, имитирующих различные звенья СРО, циквалон продемонстрировал антиоксидантное действие, сравнимое по своей эффективности, с антиоксидантным действием BHT. При этом ни BHT, ни циквалон не обнаружили значимого проокисдантного действия в тех или иных экспериментальных условиях. Следовательно, мы можем говорить об относительно низкой потенциальной склонности BHT и циквалона (в изученном диапазоне концентраций) к инверсии прооксидантного действия в модельных условиях in vitro.

Напротив, изучение свойств изоферуловой кислоты и изомерной ей феруловой кислоты на липосомальной модельной системе позволяет сделать вывод об очень низкой эффективности антиоксидантного действия феруловой и изоферуловой кислот в этих условиях (рис.5, 6).

А Б

ВГ

Рис.5. Влияние феруловой кислоты в концентрациях 0,01 мкМ (А), 0,1 мкМ (Б), 1 мкМ (В) и 10 мкМ (Г) на накопление карбонильных продуктов ПОЛ в липосомах в ходе окисления, индуцированного хлоридом меди(II).

Более того, оказалось, что в изученных концентрация, особенно в ситуации индуцированного ПОЛ, феруловая и изоферуловая кислоты в течение определенного периода развития процесса ПОЛ (1-3 час от момента инициации) не подавляют, а, наоборот, усиливают образование в липосомах продуктов ПОЛ в сравнении с контрольными образцами. То есть, на ранних стадиях протекания ПОЛ в бислойной мембране эти соединения проявляют достоверный прооксидантный эффект.

Возможно, что более слабый антиоксидантый эффект и большая склонность к инверсии эффектов может быть связана с меньшей липофильность феруловых кислот по сравнению с циквалоном и BHT. В соответствии с таким предположением молекулы, находящиеся внутри мембраны, с одной стороны, более эффективно способны перехватывать радикалы, образующиеся из липидов, и ослаблять пропагацию цепных реакций, а, с другой стороны, в большей степени защищены от непосредственного окисления компонентами инициирующей системы.

А Б

В Г

Рис.6. Влияние изоферуловой кислоты в концентрациях 0,01 мкМ (А), 0,1 мкМ (Б), 1 мкМ (В) и 10 мкМ (Г) на накопление карбонильных продуктов ПОЛ в липосомах в ходе окисления, индуцированного хлоридом меди(II).

антиоксидант радикальное окисление концентрация

Для моделирования окислительного повреждения клеток мы использовали индуцированный солями меди гемолиз эритроцитов. Анализ результатов экспериментов, выполненных в отсутствие антиоксидантов, подтвердил предположение о перекисном характере повреждения мембраны эритроцитов под действием солей меди. Мы обнаружили, что добавление солей меди, вызывает гемолиз, развивающийся во времени (рис.7) и зависящий от конечной концентрации Cu²⁺ в инкубационной среде (рис.8). Развитие медь-индуцированного гемолиза сопровождается накоплением в эритроцитах ТБК-реактивных продуктов ПОЛ (рис.9) и метгемоглобина (рис.10), зависимым от концентрации катионов меди в инкубационной среде образом.



Рис. 7. Индукция гемолиза эритроцитов крыс in vitro 200 мкМ хлоридом меди и 5 мМ пероксида водорода.

Рис. 8. Зависимость степени гемолиза крыс in vitro от концентрации хлорида меди в инкубационной среде.

Рис. 9. Индукция содержания малонового диальдегида в эритроцитах крыс в присутствии хлорида меди(II) в концентрации 200 мкМ.



Рис. 10. Зависимость содержания метгемоглобина в эритроцитах от концентрации хлорида меди, добавленного к суспензии отмытых эритроцитов.

Исследование эффектов циквалона и BHT на модели медь-индуцированного гемолиза эритроцитов показало, что оба соединения способны эффективно ингибировать гемолиз эритроцитов лишь в определенном ограниченном диапазоне концентраций: 0,002-0,02 мМ для циквалона и 0,02-0,2 мМ для BHT. При этом степень максимального ингибирования гемолиза была выше у циквалона (рис.11).

А)Б)

Рис. 11. Влияние циквалона (А) и дибунола (Б) на гемолиз эритроцитов крыс индуцированный 200 мкМ хлоридом меди. Приведены результаты за вычетом спонтанного гемолиза (в физ - растворе)

Интересно отметить, что как при снижении концентрации за пределы указанного диапазона, так и при дальнейшем её повышении степень гемолиза начинает возрастать, при определенных концентрациях антиоксидантов даже превышая гемолиз контрольных образцов. Очевидно, что при низких концентрациях антиоксидантов имеет место недостаточность перехвата образующихся первичных и промежуточных радикальных продуктов ПОЛ. В то же время, усиление гемолиза при более высоких концентрациях антиоксидантов, возможно, объясняется как накоплением феноксильных радикалов антиоксидантов с их вовлечением в развитие ПОЛ, так и непосредственным изменением свойств самого липидного бислоя мембраны в присутствии больших количеств липофильных веществ, в частности уменьшением его микровязкости и повышением текучести.

Анализ изменения биохимических характеристик эритроцитов показал, что эффекты изученных веществ на накопление метгемоглобина и ТБК обладают той же фазностью, что и их влияние на степень гемолиза эритроцитов: существует ограниченный диапазон эффективных концентраций, а при более высоких или более низких концентрациях эффективность исследованных антиоксидантов уменьшалась или даже полностью пропадала.

Нами было обнаружено, что циквалон обладает гораздо более выраженным защитным эффектом против метгемоглобинобразующего действия солей меди на эритроциты (рис.12). В концентрации 0,1-0,2 мМ циквалон вызывал практически полное подавление образование метгемоглобина в клетках, в то время как максимальный защитный эффект BHT не превышал 50%.

А

Рис. 12. Влияние циквалона (А) и дибунола (Б) на превращение гемоглобина в метгемоглобин в эритроцитах крысы in vitro после индукции СРО добавлением хлорида меди(II) до конечной концентрации 200 мкМ (непосредственно после добавления хлорида меди)

В отношении накопления в эритроцитах ТБК-реактивных продуктов ПОЛ эффективность циквалона и BHT была сравнимой, однако при большинстве изученных концентраций антиоксидантное действие циквалона, как и в случае гемоглобинообразования, было статистически достоверно более высоким (рис.13). Следует отметить, что в наиболее эффективных концентрациях оба антиоксиданта на фоне действия солей меди не просто нормализовали содержание ТБК-реактивных соединений, но и вызывали достоверное его снижения по сравнению с интактными эритроцитами. Кроме того, мы обнаружили, что циквалон имеет несколько более широкий диапазон эффективных концентраций, защищающих эритроциты от накопления ТБК-реактивных продуктов ПОЛ.

А) Б)

Рис.13. Влияние циквалона (А) и дибунола (Б) на содержание МДА в эритроцитах крысы in vitro при индукции СРО добавлением хлорида меди(II) до конечной концентрации 200 мкМ.

Таким образом, эксперименты на эритроцитах позволили нам сделать ряд существенных заключений. Во-первых, изученные фенольные липофильные антиоксиданты обладают определенным диапазоном эффективных концентраций, а в более высоких или более низких по отношению к этому диапазону концентрациях они перестают оказывать защитное действие и даже могут усиливать гемолиз эритроцитов. Во-вторых, циквалон оказался более эффективным антиоксидантом, препятствующим развитию реакций ПОЛ, чем BHT [Shertzer H.G. et.al. 1991]. И, наконец, в-третьих, в отличие от BHT, циквалон оказался способен эффективно защищать эритроциты от накопления в них нефункциональной окисленной формы гемоглобина - метгемоглобина.

Исследования процесса ПОЛ и антиоксидантной системы в моделях на целых организмах показали, что сульфат меди(II) пентагидрат в дозе 1/3 ЛД₅₀ (10 мг/ кг) приводил к гибели 20% животных через 1 сутки, 50% через 2 суток и 80% через 3 суток, поэтому проведение биохимических исследований было признано нецелесообразным. В то же время внутрибрюшинное введение сульфата меди(II) пентагидрат в дозе 1/6 ЛД₅₀ (5 мг/кг) в течение 3 суток не вызывало гибели животных. При этом концентрация меди(II) в печени, мозге, почках и в гемолизате эритроцитов повышалась на 223,7%; 26,6%; 14,6% и 15,9% соответственно по сравнению с контролем (рис. 14).

Циквалон (5 мг/кг внутрижелудочно) практически не влиял на концентрацию меди(II) в печени и в почках интактных животных, и снижал концентрацию меди(II) на 22,9%; 12,8% в мозге и в плазме крови соответственно.

Купренил (100 мг/кг массы тела, внутрижелудочно) достоверно снижал содержание меди(II) на 24,2% в мозге интактных животных и не проявлял эффект на содержание меди в печени, в почках и в плазме.

При интоксикации солями меди купренил достоверно снижал концентрацию меди в печени, в мозге и в плазме на 25%; 45,9%; 14,4% соответственно, по отношению к уровню меди у крыс, получавших только соль меди (рис 14).

На фоне интоксикации меди, обнаружено, что циквалон снижал содержание меди в мозге, в почках и в плазме на 40,9 %; 10,3%; 9,2% соответственно, по отношению к уровню меди у крыс, получавших только соль меди (рис 14).

А) Б)

Рис. 14. Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на содержание меди (мкМ/ г белка) в плазме (А) и в печени (Б) белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрата в дозе 5 мг/кг.

Интоксикация медью приводила к достоверному повышению сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) крыс на 178% от уровня контроля.

Введение циквалона интактным животным также приводило к достоверному повышению ССЭ (на 93%), в то время как купренил повышал ССЭ только на 28% (недостоверно, табл.5.4).

Совместное введение соли меди и циквалона приводило также к достоверному повышению ССЭ на 117%. Однако этот уровень был на 22% ниже (Р=0,006), чем у животных, получавших только соли меди, и сопоставим с эффектом собственно циквалона (табл.1).

В группе животных, получавших одновременно соль меди и купренил, ССЭ была также достоверно повышенной на 84%. Однако этот уровень статистически достоверно отличался (на 40 % ниже) от ССЭ животных, получавших только соли меди (табл.1).

Таблица 1.

Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрата в дозе 5 мг/кг (среднее значение стандартная ошибка).

	Контроль	Медь	Медь + циквалон	Циквалон	Медь + купренил	Купренил
M m	12,81,0%	35,61,8%	27,80,8%	24,81,2%	23,61,3%	16,42,5%
% контроля		278,0%	216,9%	193,5%	183,7%	128,0%
P		<0,001*	< 0,001*	< 0,001*	< 0,001*	0,233
В сопоставлении с группой с интоксикацией медью
%			78,0%		66,1%
P			0,006*		< 0,001*

*- различия достоверны с учетом поправки Бонферрони (P 0, 05)

Трехкратное введение животным пентагидрата сульфата меди в дозе 5 мг/кг достоверно повышало спонтанный гемолиз более чем в 6 раз (на 556,5% от уровня контроля).

Циквалон не оказывал выраженное влияние на устойчивость эритроцитов, в то время как введение только купренила приводило к значительному снижению стабильности клеток, повышая степень гемолиза до уровня на 698,6% большего, чем у интактных животных (табл.2).

На фоне интоксикации меди, циквалон трехкратно повышал уровень спонтанного гемолиза (на 202,9%) от уровеня контроля, однако был двухкратно ниже (Р=0,05), чем у животных, получавших только соль меди (табл.2). В то же время, у животных, получавших одновременно медь и купренил, степень спонтанного гемолиза не отличалась от уровня животных, получавших только медь.

Таблица .2.

Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на спонтанный гемолиз эритроцитов белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрата в дозе 5 мг/кг (среднее значение стандартная ошибка).

	Контроль	Медь	Медь + циквалон	Циквалон	Медь + купренил	Купренил
M m	1,2%0,4%	7,6%1,6%	3,5%0,7%	1,4%0,6%	7,9%1,6%	9,2%2,1%
% контроля		656,5%	302,9%	118,8%	685,5%	798,6%
P		0,008*	0,022*	0,786	0,008*	0,011*
В сопоставлении с группой с интоксикацией медью
%			46,1%		104,4%
P			0,05		0,886

* - различия достоверны с учетом поправки Бонферрони(P 0, 05)

Результаты исследования влияния двухвалентной меди на накопление продуктов перекисного окисления в плазме крови крыс приведены в табл.5.2. Обнаружено, что сульфат меди(II) пентагидрат 5мг/кг достоверно повышает содержание малонового диальдегида (МДА) на 45,7% от контроля.

Купренил и циквалон вызывали разнонаправленные изменения содержания МДА у интактных крыс (циквалон - повышение, купренил - понижение), однако эти изменения не были статистически достоверными.

В группе животных, получавших одновременно медь и циквалон, наблюдалось недостоверное повышение концентрации МДА, сопоставимое с животными, получавшими только циквалон (табл. 3). В то же время, на фоне интоксикации медью купренил снижал содержание МДА до уровня контроля.

Таблица .3.

Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на содержание МДА (мкМ/мл) в плазме белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди в дозе 5 мг/кг (среднее значение стандартная ошибка).

	Контроль	Медь	Медь + циквалон	Циквалон	Медь + купренил	Купренил
M m	9,01,8	13,22,6	10,72,2	10,62,2	9,52,0	5,91,2
% контроля		145,7%	118,9%	117,7%	105,4%	65,6%
P		0,05	0,563	0,586	0,862	0,194
В сопоставлении с группой с интоксикацией медью
%			81,6%		72,3%
P			0,498		0,301

* - различия достоверны с учетом поправки Бонферрони (P 0, 05)

Однако повышение концентрации меди сопровождалось выраженной реакцией со стороны системы антиоксидантной системы. Так активность каталазы после трехкратного введения сульфата меди достоверно повышалась на 27,9%; 30,6%; 21,1% в печени, в мозге и в почках соответственно. Активность КТ в гемолизате эритроцитов изменялась незначительно (5%), но статистически достоверно.

Совместное введение меди и циквалона вызывало достоверное повышение активности КТ на 60,5%; 61,6%; 40,8% в печени, в мозге и в почках соответственно (по сравнению с группой контроля). Активация фермента в этих тканях достоверно превышала уровень, достигаемый при воздействии только сульфата меди, на 16% - 25%. В гемолизате эритроцитов при этом активность фермента соответствовала уровню контроля, однако была незначительно (на 6%), но статистически достоверно ниже, чем у крыс, получавших только медь (рис 15).

Воздействие купренила на фоне интоксикации медью проявлялось в достоверном повышении каталазной активности на 94%, 74% и 39% соответственно в печени, мозге и почках (по сравнению с контролем), что на 51%, 33% и 15% превышало уровень активации, достигаемый при воздействии только меди (рис 15).

А)

Б)

В)

Рис.15. Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на активность каталазы (ед/ г белка/ мин) в печени (А), в мозге (Б) и в почках (В) белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрат в дозе 5 мг/кг.

При интоксикации сульфатом меди(II) активность глутатионпероксидазы (ГП) в печени в мозге и в гемолизате эритроцитов повышалась на 34,5%; 49,9%, 22,1% соответственно (рис.16).

Циквалон (5 мг/кг) достоверно увеличивал активность ГП на 27,9%; 40,5%; 16,4% в печени, мозге и почках животных соответственно (по сравнению с группой интактных животных) и практически не влиял на активность ГП в гемолизате эритроцитов.

В группе животных, получавших одновременно медь и циквалон, активность ГП повышалась на: 65,4% в печени; 134,4% в мозге; 57,7% в почках; 73,2% в гемолизате. Сопоставление активности ГП в органах животных данной группы, с активностью ГП в органах животных, получавших только медь(II), показывает, что циквалон достоверно увеличивает активацию фермента в печени, мозге, почках и в гемолизате на 23%; 56,3%; 75,6%; 41,8% соответственно (рис.16).

Под воздействием купренила активность ГП достоверно увеличивалась на 38,9% в печени, 24,4% в мозге; 53,1% в почках и 11,5%, в гемолизате эритроцитов. Совместное воздействие меди и купренила вызывало достоверное повышение активности ГП на 137,1% в печени; 169,6%в мозге; 188,1% в почках; 115,5% в гемолизате эритроцитов по сравнению с активностью у животных контрольной группы. Сопоставление активности ГП в тканях животных данной группы с активностью ГП в органах животных, получавших только медь, выявило достоверное повышение активности ГП в печени, мозге, почках и в гемолизате на 76,3%; 79,8%; 220,7%; 76,5% соответственно (рис.16).

А)

Б)

В)

Г)

Рис.16. Влияние циквалона и купренила на активность глутатионпероксидазы (мм/ г белка /мин) в гемолизате (А), в печени (Б), в мозге (В) и в почках (Г) белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрат в дозе 5 мг/кг

Результаты исследования влияния сульфата меди(II) пентагидрата на активность церулоплазмина плазмы крови приведены в табл.5.8 и на рис.17. Интоксикация приводила к значительному снижению (на 30%) активности данного белка.

Внутрижелудочное введение циквалона практически не влияло на активность церулоплазмина, в то время как у животных, получавших купренил, было выявлено 25% снижение активности (рис 17)

При совместном поступлении меди и циквалона активность церулоплазмина оказалась несколько пониженной (на 10,8% по сравнению с группой интактных животных), однако это снижение не носило статистически значимого характера. В то же время этот уровень был достоверно на 28% выше, чем в группе животных, получавших только медь (рис 17).

Совместное введение животным сульфата меди и купренила достоверно снижало активность церулоплазмина на 67,1%(по сравнению с группой интактных животных). Это значение было достоверно ниже (на 53%), чем у животных, получавших только медь (рис 17).



Рис.17. Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на активность церулоплазмина (ед/мл) в плазме белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрат в дозе 5 мг/кг.

При интоксикации медью наблюдались недостоверное изменение активности СОД во всех тканях.

Однако разнонаправленный эффект АОА зависит от ткани. Так АОА печени достоверно снижалась на 9,7%, в то время как в плазме крови повышалась на 15,6% по сравнению с уровнем у животных контрольной группы.

Циквалон достоверно снижал АОА в печени и достоверно повышал АОА в мозге и в почках. Однако в группе животных, получавших одновременно медь и циквалон эффект антиоксидантного действия достоверно снижался в печени (на 17%) и повышался в мозге и в плазме на (8,4%, 12,5% соответственно) по сравнению с контролем (рис. 18).

Купренил уменьшал АОА. В группе животных, получавших одновременно медь и купренил; эффект антиоксидантного действия достоверно уменьшался в плазме на 5,5% от контроля (рис. 18).



Рис. 18. Влияние циквалона (5 мг/кг) и купренила (100 мг/кг) на эффективность антиоксидантного действия белых беспородных крыс с интоксикацией сульфатом меди(II) пентагидрат в дозе 5 мг/кг.

Таким образом, было установлено что, медь вызывает повреждение клеточных мембран, и увеличивает концентрацию конечных продуктов ПОЛ. С другой стороны повышается активность антиоксидантных ферментов в тканях и эритроцитах.

По-видимому, активация антиоксидантной системы не достаточна для ограничения ПОЛ что, требует дополнительного применения антиоксидантов.

Применение фенольного антиоксиданта циквалона (5 мг/кг) или купренила (100 мг/кг) при интоксикации медью в субтоксической дозе показало достоверное защитное действие.

Циквалон и купренил увеличивали активность антиоксидантной системы крыс, повышая активность антиоксидантных ферментов в изученных тканях (КТ, ГП, СОД, церулоплазмин) и уменьшая содержание конечных продуктов ПОЛ в плазме, уменьшая ССЭ крыс. Однако при этом циквалон проявлял мало выраженное действие на содержание меди, и, напротив, купренил снижал концентрацию меди в изученных тканях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

АБТС-тест основан на способности гемопротеинов катализировать по радикальному механизму окисление АБТС пероксидом водорода с образованием интенсивно окрашенного катион-радикала АБТС. Антиоксиданты, соответственно, способны подавлять окисление АБТС. В этой модельной системе представляется возможным оценить собственно антирадикальные эффекты исследуемых веществ.

Поскольку исследованные нами вещества обладают достаточно высокой степенью липофильности, в последующих опытах мы использовали модельную систему на основе лецитиновых липосом. Эта модельная система базируется на анализе накопления продуктов ПОЛ в ходе спонтанного или индуцированного ПОЛ липосом и позволяет приближенно оценить влияние исследуемых соединений на свободно-радикальные процессы, протекающие в бислойных липидных мембранах, близких по своей структуре и свойствам к клеточным мембранам.

Мы обнаружили, что в липосомальной модельной системе достоверных отличий в эффективности антиоксидантного действия между циквалоном и BHT в концентрации 10 мкМ отсутствовали вне зависимости от способа инициации ПОЛ в липосомах. Интересно, что зависимость АОА от концентрации циквалона наблюдается только при длительном протекании спонтанного ПОЛ (24 ч после индукции), но отсутствует через 6 ч после индукции автоокисления в мембране липосом. Аналогичную ситуацию наблюдали и при индуцированном ПОЛ.

Таким образом, полученные нами результаты показали, что в двух модельных системах, имитирующих различные звенья СРО, циквалон продемонстрировал антиоксидантное действие, сравнимое по своей эффективности, с антиоксидантным действием BHT. При этом ни BHT, ни циквалон не обнаружили значимого проокисдантного действия в тех или иных экспериментальных условиях. Следовательно, мы можем говорить об относительно низкой потенциальной склонности BHT и циквалона (в изученном диапазоне концентраций) к инверсии прооксидантного действия в модельных условиях in vitro.

Напротив, изучение свойств изоферуловой кислоты и изомерной ей феруловой кислоты на липосомальной модельной системе позволяет сделать вывод об очень низкой эффективности антиоксидантного действия феруловой и изоферуловой кислот в этих условиях.

Более того, оказалось, что в изученных концентрациях, особенно в ситуации индуцированного ПОЛ, феруловая и изоферуловая кислоты в течение определенного периода развития процесса ПОЛ (1-3 час от момента инициации) не подавляют, а, наоборот, усиливают образование в липосомах продуктов ПОЛ в сравнении с контрольными образцами. То есть, на ранних стадиях протекания ПОЛ в бислойной мембране эти соединения проявляют достоверный прооксидантный эффект.

Возможно, что более слабый антиоксидантый эффект и большая склонность к инверсии эффектов может быть связана с меньшей липофильности феруловых кислот по сравнению с циквалоном и BHT. В соответствии с таким предположением молекулы, находящиеся внутри мембраны, с одной стороны, более эффективно способны перехватывать радикалы, образующиеся из липидов, и ослаблять пропагацию цепных реакций, а, с другой стороны, в большей степени защищены от непосредственного окисления компонентами инициирующей системы.

Для моделирования окислительного повреждения клеток мы использовали индуцированный солями меди гемолиз эритроцитов. Анализ результатов экспериментов, выполненных в отсутствие антиоксидантов, подтвердил предположение о перекисном характере повреждения мембраны эритроцитов под действием солей меди. Мы обнаружили, что добавление солей меди, вызывает гемолиз, развивающийся во времени. Развитие медь-индуцированного гемолиза сопровождается накоплением в эритроцитах ТБК-реактивных продуктов ПОЛ и метгемоглобина, зависимым от концентрации катионов меди в инкубационной среде образом.

Интересно отметить, что как при снижении концентрации за пределы указанного диапазона, так и при дальнейшем её повышении степень гемолиза начинает возрастать, при определенных концентрациях антиоксидантов даже превышая гемолиз контрольных образцов. Очевидно, что при низких концентрациях антиоксидантов имеет место недостаточность перехвата образующихся первичных и промежуточных радикальных продуктов ПОЛ. В то же время, усиление гемолиза при более высоких концентрациях антиоксидантов, возможно, объясняется как накоплением феноксильных радикалов антиоксидантов с их вовлечением в развитие ПОЛ, так и непосредственным изменением свойств самого липидного бислоя мембраны в присутствии больших количеств липофильных веществ, в частности уменьшением его микровязкости и повышением текучести.

Анализ изменения биохимических характеристик эритроцитов показал, что эффекты изученных веществ на накопление метгемоглобина и ТБК обладают той же фазностью, что и их влияние на степень гемолиза эритроцитов: существует ограниченный диапазон эффективных концентраций, а при более высоких или более низких концентрациях эффективность исследованных антиоксидантов уменьшалась или даже полностью пропадала.

Нами было обнаружено, что циквалон обладает гораздо более выраженным защитным эффектом против метгемоглобинобразующего действия солей меди на эритроциты. В концентрации 0,1-0,2 мМ циквалон вызывал практически полное подавление образование метгемоглобина в клетках, в то время как максимальный защитный эффект BHT не превышал 50%.

В отношении накопления в эритроцитах ТБК-реактивных продуктов ПОЛ эффективность циквалона и BHT была сравнимой, однако при большинстве изученных концентраций антиоксидантное действие циквалона, как и в случае гемоглобинообразования, было статистически достоверно более высоким. Следует отметить, что в наиболее эффективных концентрациях оба антиоксиданта на фоне действия солей меди не просто нормализовали содержание ТБК-реактивных соединений, но и вызывали достоверное его снижения по сравнению с интактными эритроцитами. Кроме того, мы обнаружили, что циквалон имеет несколько более широкий диапазон эффективных концентраций, защищающих эритроциты от накопления ТБК-реактивных продуктов ПОЛ.

...