Частота мейотического нерасхождения хромосом у мужчин с нарушением репродукивной функции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Частота мейотического нерасхождения хромосом у мужчин с нарушением репродукивной функции

03.02.07 - Генетика

Гордеева Е.Г.

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна

Официальные оппоненты:

Бахарев Владимир Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник лаборатории репродуктивной генетики

Ревазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник отдела гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Хромосомные нарушения являются одной из главных причин аномалий развития эмбриона или плода. Приблизительно 30-50% случаев ранних доимплантационных потерь, около 30% случаев спонтанных абортов в течение первого триместра беременности и 6% случаев мертворождений или случаев младенческой смертности обусловлены наличием хромосомных аномалий (ХА) в клетках эмбриона/плода (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004; Лебедев И.Н., 2012). Наиболее высокие частоты встречаемости хромосомных заболеваний среди новорожденных характерны для трисомий по хромосомам 13, 18, 21, X и Y. В целом, среди новорожденных частота встречаемости конституциональных ХА составляет приблизительно 0,8-1% (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004).

Этиологическими факторами развития хромосомной патологии у потомства являются геномные и хромосомные мутации, которые приводят к изменению числа или структуры хромосом. Большинство трисомий по хромосомам в регулярной форме имеют гаметическое происхождение (Кулешов Н.П., 1979), поэтому исследование частоты встречаемости мужских и женских гамет с различными вариантами анеуплоидии является актуальной задачей современной биологии и медицины.

В гаметогенезе у человека естественным образом происходит формирование числовых и структурных ХА. К настоящему времени получены свидетельства того, что у здоровых женщин и у здоровых фертильных мужчин могут быть обнаружены гаметы с хромосомным дисбалансом (Guttenbach M. et al., 1997b). Однако вклад материнского и отцовского происхождения различных вариантов ХА в структуру причин ранней эмбриональной смертности и многих синдромальных форм хромосомной патологии у потомства не является одинаковым (Hunt P.A., Hassold T.J., 2002). По данным R.H. Martin частота нерасхождения хромосом в оогенезе в I-ом мейозе и во II-ом мейозе составляет приблизительно 20%, тогда как частота мейотического нерасхождения хромосом в сперматогенезе составляет приблизительно 1-2% (Martin R.H., 2008a).

В течение последних десятилетий в ряде исследовательских работ показано, что частота мейотического нерасхождения хромосом (или хроматид) в гаметогенезе у человека значительно варьирует в зависимости от группы хромосом, особенностей их структуры, и в зависимости от стадии мейоза, в течение которой произошла ошибка сегрегации хромосом (Abruzzo M.A., Hassold T.J., 1995; Hassold T.J., Hunt P.A., 2001; Hassold T.J. et al., 2007). При некоторых формах нарушения сперматогенеза частота мейотического нерасхождения хромосом может превышать референсные значения более чем в 3 раза (Martin R.H., 2007).

Применение методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) помогает решить проблему деторождения в ряде случаев мужского и женского бесплодия. Тем не менее, использование методов ВРТ увеличивает риск передачи генных и хромосомных мутаций, формирующихся de novo в ходе гаметогенеза у одного из родителей. Немаловажным является и то, что использование ВРТ для наступления беременности увеличивает риск по развитию хромосомной патологии эмбриона, которая не приводит к летальному исходу и ее наличие у плода совместимо с живорождением (Bonduelle M. et al., 2002). Данное обстоятельство указывает на необходимость исследования хромосомного набора зрелых мужских гамет при различных формах патозооспермии, в том числе в случаях наличия числовых и структурных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции.

Цель исследования

Целью настоящей работы являлась оценка частот встречаемости сперматозоидов с различными вариантами анеуплоидии у мужчин с нарушениями репродуктивной функции и патозооспермией, в том числе у мужчин с числовыми и структурными ХА.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом 46,XY.

2. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди пациентов с различными формами патозооспермии из супружеских пар с бесплодием и/или отягощенным акушерским анамнезом, а также в случаях наличия хромосомной патологии у эмбриона/плода или в случаях рождения ребенка с хромосомной патологией.

3. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с числовыми и структурными ХА.

4. С помощью FISH-метода провести анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку или числовое нарушение хромосом, у мужчин со структурными или числовыми ХА в соматических клетках организма.

5. Оценить состояние сперматогенеза у пациентов с различными формами патозооспермии и/или с конституциональными ХА методом количественного кариологического анализа незрелых половых клеток из эякулята.

Научная новизна: для нескольких групп пациентов с нарушением репродуктивной функции неясной этиологии проведена оценка частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y. Всего обследовано 89 мужчин. Проведен FISH-анализ мейотического расхождения хромосом 13 и 14 у 6-и носителей Робертсоновской транслокации der(13;14)(q10;q10). А также проведен FISH-анализ мейотического расхождения X- и Y-хромосом у мужчин с числовыми аномалиями половых хромосом в регулярной и мозаичной формах и у мужчин со структурными аномалиями половых хромосом. В том числе FISH-анализ мейотического расхождения X- и Y-хромосом проведен у мужчины с Y-аутосомной реципрокной транслокацией t(Y;21)(q11.2;q22.3).

В настоящей работе впервые проведен FISH-анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку, у мужчины с реципрокной транслокацией t(1;11)(q44;q21). Также впервые проведен FISH-анализ частоты встречаемости в сперматозоидах рекомбинантных хромосом у мужчины с перицентрической инверсией хромосомы 18 при кариотипе 46,XY,inv(18)(p11.23q21.1).

Настоящее исследование позволило расширить представление о механизмах формирования ХА в гаметогенезе у мужчин и получить представление о мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку, у мужчин с редко встречающимися в общей популяции вариантами числовых и структруных ХА.

Научно-практическая значимость работы: на основании собственных результатов исследования и результатов, представленных в литературных источниках, сформированы клинические группы пациентов, для которых рекомендовано проведение FISH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией. Эти рекомендации и приведенные в настоящей работе оценки риска передачи потомству сверхчисленных хромосом или дополнительного хромосомного материала отцовского происхождения при некоторых вариантах конституциональных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции могут быть использованы в ходе медико-генетического консультирования и при подготовке к проведению процедур ЭКО/ИКСИ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором, с дисомией по хромосомам 13, 18 и 21, частота встречаемости сперматозоидов c XX, XY и YY дисомией среди мужчин с нормальным мужским кариотипом 46,XY и нормозооспермией в среднем составляет 0,37%, 0,11%, 0,05%, 0,20%, 0,04%, 0,17% и 0,06%, соответственно.

2. Тяжелые формы нарушения сперматогенеза, умеренная или тяжелая форма олигоастенотератозооспермии у мужчин с нарушением репродуктивной функции, сопровождаются повышенной частотой мейотического нерасхождения хромосом.

3. Хромосомы 21, X и Y в большей степени, чем хромосомы 13 и 18, предрасположены к мейотическому нерасхождению в гаметогенезе у мужчин.

4. FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией может быть использован как метод определения доли зрелых мужских половых клеток со специфическим хромосомным дисбалансом.

Апробация работы: основные результаты диссертационной работы представлены на международной конференции «Хромосома 2009» в 2009 г. (г. Новосибирск), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), на IX научной конференции «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» в 2011 г. (г. Томск), на V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» в 2012 г. (г. Санкт-Петербург), на первом национальном форуме «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» в 2012 г. (г. Ростов-на-Дону).

Личный вклад автора в проведении исследования: основная часть исследований выполнена автором лично. Автором сформулированы цель и задачи настоящего исследования, определены критерии отбора пациентов для исследования, сформированы выборки обследуемых пациентов, самостоятельно проведена лабораторная работа с привлечением методов молекулярно-цитогенетического анализа. Автором разработаны модификация метода флуоресцентной гибридизации на препаратах (FISH) сперматозоидов человека и визуальный метод анализа анеуплоидии гамет. Автором лично подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, проведен статистический анализ полученных результатов. Формулировка выводов и написание рукописи настоящей работы выполнены автором самостоятельно.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.

Структура и объем работы: диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 311 источников, из них 45 отечественных и 266 зарубежных авторов. Работа изложена на 206 листах машинописи. Текст содержит 26 рисунков и 24 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы обследуемых пациентов сформированы из мужчин, обратившихся в лабораторию генетики нарушений репродукции ФГБУ «МГНЦ» РАМН по поводу бесплодия в браке, отягощенного акушерского анамнеза у супруги, случаев рождения детей с хромосомной патологией или по поводу клинического обследования с целью планирования деторождения. Препараты ПК 89 мужчин в возрасте от 24-х до 54-х лет (в среднем 35±7 лет) послужили материалом для проведения исследования. Контрольную группу составили 11 мужчин: 10 мужчин в статусе доноров спермы и один мужчина с нормозооспермией, с нормальным мужским кариотипом (46,XY) и подтвержденной фертильностью. Мужчины с олигоастенотератозооспермией (OAT) различной тяжести (27 человек) составили 1-ю группу. Мужчины с астенотератозооспермией (AT) (28 человек) составили 2-ю группу. Мужчины с конституциональными ХА, числовыми и структурными ХА, (23 человека) и с различными формами патозооспермии составили 3-ю группу. Для проведения ретроспективного анализа частот встречаемости конституциональных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции использовали архивные данные медицинских карт пациентов.

Анализ кариотипа по лимфоцитам периферической крови проводили по обще-

принятой методике, используя GTG-дифференциальное окрашивание (Захаров и др., 1982). Спермиологический анализ (СА) эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1999). Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (ККА НПК) проводили на препаратах ПК из эякулята по методу, предложенному проф. Л.Ф. Курило (Патент на изобретение №2328736, 2007 г.). Молекулярно-цитогенетический анализ мужских ПК проводили по методике, предложенной Martin и соавторами (Martin R.H. et al., 1993). Непосредственно нами оптимизирована методика предобработки сперматозоидов в растворе дитиотреитола для деконденсации хроматина головок сперматозоидов.

Для каждого пациента проводили молекулярно-цитогенетический анализ ПК по пяти хромосомам с использованием двух- и трехцветной FISH. Для двухцветной FISH использовали смесь локус-специфичных ДНК-зондов на хромосомы 13 и 21: LSI 13, локус гена ретинобластомы RB-1, 13q14, Spectrum Green, LSI 21, локусы D21S259, D21S341, D21S342, 21q22.13-q22.2, Spectrum Orange. Трехцветную FISH проводили со смесью ДНК-зондов, специфичных к альфа-сателлитным последовательностям центромерного и прицентромерного гетерохроматина хромосом 18, X и Y: CEP 18, локус D18Z1, 18p11.1-q11.1, Spectrum Aqua, CEP X, локус DXZ1, Xp11.1-q11.1, Spectrum Green, CEP Y, локус DYZ3, Yp11.1-q11.1, Spectrum Orange (Abbott Molecular Vysis Inc., U.S.A).

Для анализа мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в перестройку, у мужчин с конституциональными ХА проводили индивидуальный подбор ДНК-зондов. Использовали критерии молекулярно-цитогенетического анализа ПК, разработанные Williams и соавторами (Williams et al., 1993). Репрезентативность выборки определена согласно статистическому обоснованию величины выборки при исследовании редких событий, предложенной Плохинским (Биометрические методы, 1975).

Статистический анализ проводили в программе БИОСТАТ (Glantz S.A., 1999). Для проверки гипотезы о связи двух переменных использовали критерий Пирсона. Для анализа сопряженности значений частот сперматозоидов с ХА использовали t-критерий Стьюдента. Для сравнения частот сперматозоидов с ХА использовали критерий Манна-Уитни. Значение p<0,05 выбрано как статистически значимое.

Для выявления корреляции между частотой сперматозоидов с ХА, концентрацией сперматозоидов, долей сперматозоидов с поступательной подвижностью или долей сперматозоидов с нормальной морфологией проводили регрессионный анализ в программе STATISTICA 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр и частота встречаемости числовых и структурных хромосомных аномалий среди мужчин с нарушением репродуктивной функции

По данным ретроспективного анализа среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии частота встречаемости конституциональных ХА составила 10% (рис. 1). Всего обследовано 2074 пациента за период с 1989 г. по 2011 г..

Рис. 1. Частота встречаемости конституциональных ХА среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии.

Спектр ХА среди мужчин с бесплодием представлен следующими вариантами ХА:

Среди мужчин с конституциональными ХА наиболее часто встречающимися хромосомными нарушениями являлись регулярная форма дисомии по X-хромосоме и мозаичные формы гоносомных аномалий и полисомий по половым хромосомам. Другими часто встречающимися хромосомными нарушениями среди мужчин с бесплодием являлись сбалансированные структурные ХА: Робертсоновские транслокации с вовлечением хромосом 13 и 14, реципрокные транслокации аутосом и инверсии аутосом.

У мужчин со структурными ХА выявлена гетерогенность проявлений нарушения сперматогенеза (Гордеева Е.Г. и др., 2010). Cреди мужчин с Робертсоновскими транслокациями (RobТ) степень нарушения сперматогенеза варьировала от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до AT, при этом у одного мужчины (код пациента A8) выявлена нормозооспермия при направительном диагнозе - привычное невынашивание беременности. Среди мужчин с реципрокными транслокациями аутосом и инверсиями аутосом степень нарушения сперматогенеза варьировала также от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до AT и тератозооспермии (T).

Частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X, Y у мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом 46,XY

В качестве референсных значений частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y в настоящей работе приняты значения частот сперматозоидов с анеуплоидией, полученные для 11-и здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,XY). Всего проанализировано 113 340 сперматозоидов. Результаты FISH-анализа представлены в табл. 1 и 2. Полученный широкий разброс значений (R) частот сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и Y, свидетельствует о наличии межиндивидуальных различий по частоте ошибок мейотического расхождения хромосом. Наиболее высокие значения частот исследованных вариантов ХА в мужских половых клетках при нормозооспермии характерны для гоносомных анеуплоидий - 0,56%, для диплоидного хромосомного набора - 0,37%, и для дисомии по хромосоме 21 - 0,2% (Гордеева Е.Г. и др., 2011).

Оценка состояния сперматогенеза и частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X, Y у мужчин с нарушением репродуктивной функции при различных формах патозооспермии

Выбор пациентов для исследования происходил случайным образом, поэтому среди обследуемых мужчин выраженных форм мономорфной тератозооспермии с характерным одним типом морфологических аномалий сперматозоидов ни в одном случае не выявлено. Первую и вторую группу обследуемых составили мужчины с наиболее часто встречающимися сочетанными формами патозооспермии - с AT и OAT различной тяжести, во всех случаях при проведении СА согласно рекомендациям ВОЗ (1999) у пациентов была выявлена полиморфная тератозооспермия в сочетанной форме (WHO, 1999). Среди обследованных у 35-и из 56-и мужчин выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены профазы I мейоза. Ассоциации между наличием признаков частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены профазы I мейоза, и повышенной частотой встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у обследованных мужчин мы не выявили.

В ходе работы FISH-методом проанализировано 270 894 сперматозоида. Средние по группам значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y представлены в табл. 1 и 2. В контрольной группе и во всех группах обследованных пациентов мы наблюдали межхромосомные вариации частот сперматозоидов с анеуплоидией, в среднем значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 и с дисомией по половым хромосомам превосходят значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13 и 18, соответственно.

Среди пациентов в 1-й и во 2-й группе, как и в контрольной группе, наблюдался широкий разброс значений (R) частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и Y.

Табл. 1. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13 и 21 (%) у мужчин с нормозооспермией, AT и OAT различной тяжести.

* - статистически значимые отличия (p<0,05).

Частоты встречаемости сперматозоидов с гаплоидным хромосомным набором и с XY дисомией имели статистически значимые отличия от частот встречаемости сперматозоидов с XX и YY дисомией также среди всех обследованных пациентов (p<0,05). Частоты встречаемости сперматозоидов с вариантом диплоидного хромосомного набора 46,XY не имели статистически значимых отличий от частот встречаемости сперматозоидов с вариантами диплоидного хромосомного набора 46,XX и 46,YY (p=0,055).

В среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нарушением репродуктивной функции и патозооспермией превосходит частоту встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,XY). В зависимости от степени нарушения сперматогенеза и от формы патозооспермии частота встречаемости анеуплоидных гамет может превосходить референсные значения в 1,5-3 раза и более (рис. 2).

При выполнении анализа полученных результатов каждую форму патозооспермии, олигозооспермию, астенозооспермию и тератозооспермию рассматривали как самостоятельную или отдельную качественную или количественную характеристику состояния сперматогенеза у пациентов, изменение

Табл. 2. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 18, X и Y (%) у мужчин с нормозооспермией, AT и OAT различной тяжести.

* - статистически значимые отличия (p<0,05).

аномалия хромосома репродуктивный

которой может быть связано с изменением уровня анеуплоидий сперматозоидов. Таким образом, мы провели корреляционный анализ между изменением уровня анеуплоидий в зрелых мужских гаметах, диплоидных ПК и между изменениями показателей СА: концентрации сперматозоидов, доли сперматозоидов с поступательной подвижностью и доли морфологически нормальных сперматозоидов.

В среднем высокую частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией мы наблюдали при снижении концентрации сперматозоидов, при олигозооспермии различной тяжести.

Регрессионный анализ показал, что характер изменения частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией при снижении концентрации сперматозоидов в эякуляте может быть достаточно точно описан гиперболической (или степенной) функцией (r = -0,64, p<0,01), но не линейной (r = -0,36, p<0,01) (рис. 3).

* - статистически значимые отличия (p<0,05).

Рис. 2. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нормозооспермией (N), AT и OAT.

У пациентов с тяжелыми формами нарушения сперматогенеза при концентрации сперматозоидов ниже 10 млн/мл (OAT II-III) в среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y выше на один порядок, чем среди здоровых мужчин с нормозооспермией (Гордеева Е.Г. и др., 2013). Наиболее высокие уровни анеуплоидии сперматозоидов характерны для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии, при концентрации сперматозоидов ниже 1 млн/мл.

Не выявлено сильной взаимосвязи повышения уровня анеуплоидии сперматозоидов и диплоидных ПК и снижения поступательной подвижности сперматозоидов (r = -0,29, p=0,02). Корреляционная зависимость доли морфологически нормальных сперматозоидов и частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией также достаточно слабая (r = -0,29, p=0,02).

На основании проведенной работы мы полагаем, что высокая частота мейотического нерасхождения хромосом в большей степени сопряжена с изменением такого показателя СА, как концентрация сперматозоидов в эякуляте.

Рис. 3. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди мужчин с нормозооспермией, c различными формами патозооспермии и нормальным мужским кариотипом 46,XY. Даны уравнения регрессии и показана обратная зависимость изменения частоты сперматозоидов с анеуплоидией и изменения концентрации сперматозоидов. Коэффициент корреляции Пирсона (линейная функция) r = -0,36, (степенная функция) r = -0,64.

Частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у мужчин с хромосомной патологией у потомства

Среди мужчин из 2-й группы условно выделена подгруппа пациентов с отягощенным акушерским анамнезом у супруги, со случаями хромосомной патологии у эмбриона/плода или новорожденного. В этой подгруппе у двух мужчин с ХА у потомства обнаружены повышенные частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией. У мужчины (код пациента 63), с отметкой в анамнезе у супруги о беременности плодом с кариотипом 47,+21, частота сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 составила 0,68%, тогда как частоты сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13, 18, X и Y не превышали референсных значений. У пациента (код пациента 62), отца ребенка с синдромом Дауна, выявлены повышенные частоты встречаемости сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21, с XY дисомией и с диплоидным хромосомным набором, которые составили 0,42%, 0,58%, и 3,19%, соответственно (Гордеева Е.Г. и др., 2013).

Оценка состояния сперматогенеза и частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X, Y у мужчин с конституциональными хромосомными аномалиями

Нарушения сперматогенеза, различные формы патозооспермии и признаки частичного блока сперматогенеза на стадии профазы I мейоза выявлены у 84% мужчин с различными вариантами сбалансированных структурных ХА: у мужчин с RobT, у мужчин с реципрокными транслокациями и инверсиями хромосом. В сравнении с этими данными, только у 63,3% мужчин с патозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,XY) обнаружены признаки частичного блока сперматогенеза.

FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y проведен для 20 мужчин с конституциональными ХА из 3-й группы: для 5 мужчин с RobT c вовлечением хромосом 13 и 14, для 9 мужчин со сбалансированными реципрокными транслокациями аутосом - t(1;3)(p21;q24), t(7;13)(p13;q14), t(2;15)(q21;q22), t(1;11)(q44;q21), t(7;15)(q32;q24), t(2;11)(p22.3;p15.5), t(1;22)(q32;q13), t(1;4)(p22;q35), t(11;18)(q25;q21), для 2-х мужчин с инверсиями аутосом - inv(18)(p11.23;q21.1), inv(7)(q21;q32), для носителя хромосомы 13 с делецией неустановленного при цитогенетическом анализе хромосомного района, del(13)(q?), для носителя Y-хромосомы с перицентрической инверсией, 46,XY,Yqh+,inv(Y)(p11.2q11.23), в случае низкоуровневого мозаицизма по гоносомам у пациента с кариотипом mos47,XXY[3]/46,XY[97] и в случае регулярной формы дисомии по Y-хромосоме. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин со структурными ХА (18 человек) и с различными формами патозооспермии представлены в табл. 3.

Согласно результатам FISH-анализа, частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 21, X и Y в подгруппе с OAT и XA не имели статистически значимых отличий от значений в 1-й группе (p>0,05). Частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 21, X и Y в подгруппе с AT, T и XA не имели статистически значимых отличий от значений во 2-й группе (p>0,05). Полученные результаты указывают на то, что при наличии хромосомной перестройки в соматических клетках организма частота мейотического нерасхождения хромосом 21, X и Y не изменяется и соответствует частоте мейотического нерасхождения этих хромосом у мужчин при патозооспермии и при нормальном мужском кариотипе (46,XY).

Табл. 3. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и Y среди пациентов с различными формами патозооспермии при нормальном кариотипе (46,XY) из 1-й и 2-й групп и при структурных ХА из 3-й группы.

* - для групп пациентов с конституциональными ХА частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 18 не отражены в таблице, поскольку широкий разброс значений частот сперматозоидов с анеуплоидией по данным хромосомам обусловлен тем, что FISH-анализ проведен с использованием ДНК-зондов комплементарных к районам хромосом, которые вовлечены в ХА.

Анализ мейотической сегрегации хромосом у мужчин с конституциональными хромосомными аномалиями

Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в Робертсоновскую транслокацию der(13;14)(q10;q10)

FISH-анализ мейотической сегрегации хромосом 13 и 14 проведен для 6-и мужчин с дериватной хромосомой der(13;14)(q10;q10). Результаты исследования представлены в табл. 4. В среднем по группе частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 составила приблизительно 13±6%. Наиболее высокие значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 характерны для мужчин с тяжелой формой OAT (коды пациентов 69, 72, выделены серым в табл. 4). Полученные значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 согласуются со значениями других авторов. По данным C. Roux и соавторов (2005) и других исследователей в среднем частота сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 у мужчин с RobT составляет 10-15% (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004; Roux C. et al., 2005). Это существенно меньшая доля ПК с хромосомным дисбалансом, чем предполагалось исходя из теоретических оценок частоты ошибок мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в RobT.

Табл. 4. Анализ мейотической сегрегации хромосом 13 и 14, вовлеченных в Робертсоновскую транслокацию, для пациентов из 3-й группы. FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 проведен с ДНК-зондами LSI 13, локус гена ретинобластомы RB-1, 13q14, Spectrum Green, TelVysion 14q, локус D14S1420, tel 14q, Spectrum Orange.

Столь малая доля зрелых ПК с хромосомным дисбалансом у носителей Робертсоновских транслокаций, которая не совпадает с ожидаемым соотношением 1:1 анеуплоидных гамет и гамет с нормальным хромосомным набором, может быть объяснена только при условии существования в сперматогенезе механизмов естественного отбора, направленного против ПК с хромосомным дисбалансом (Brugnon F. et al., 2010).

Полученные результаты FISH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 у мужчин с RobT свидетельствуют о наличии риска по передаче потомству сверхчисленных хромосом 13 и/или 14, который по нашим оценкам составляет приблизительно 13%.

Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в транслокацию t(1;11)(q44;q21)

Для мужчины со сбалансированной реципрокной транслокацией с вовлечением хромосом 1 и 11 проведен FISH-анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку.

За консультацией по поводу рождения ребенка с врожденными пороками развития и случая беременности плодом с МВПР обратился мужчина в возрасте 33-х лет. Цитогенетическое исследование хромосом на препаратах из культуры лимфоцитов периферической крови мужчины позволило установить наличие сбалансированной реципрокной транслокации t(1;11)(q44;q21). При двухкратном проведении СА с разницей в один год у мужчины установлена АТ. При анализе анамнестических данных мужчины в первом случае отмечено рождение недоношенного семимесячного ребенка с задержкой психомоторного развития, у девочки установлен кариотип 46,XX,der(1)t(1;11)(q44,q21)pat. Ребенок умер в младенчестве. Во втором случае у плода на 24-25-й неделе беременности обнаружены УЗ-маркеры хромосомной патологии плода, при анализе хромосом на препаратах из культуры лимфоцитов пуповинной крови с помощью дифференциального GTG-окрашивания выявлена также несбалансированная транслокация отцовского происхождения, кариотип 46,XY,der(1)t(1;11)(q44;q21)pat.

Наиболее высокие значения частот встречаемости ПК с сегментной анеуплоидией по хромосомам 1 и 11 соответствовали типу мейотической сегрегации хромосом - совместная I. В среднем частота встречаемости сперматозоидов с хромосомным набором 23,-11,+der(11) и 23,-1,+der(1) составила 23,4% и 15,3% (табл. 5). Нормальный или сбалансированный хромосомный набор обнаружен в среднем в 53,8% ПК у пациента. Долю сперматозоидов с другим типом мейотической сегрегации хромосом составили 7,5% ПК.

Анализ частоты встречаемости рекомбинантных хромосом в сперматозоидах у пациента с перицентрической инверсией хромосомы 18, inv(18)(p11.23q21.1)

Для пациента с перицентрической инверсией inv(18)(p11.23q21.1) с помощью FISH-метода проведена оценка частоты встречаемости сперматозоидов, несущих рекомбинантную хромосому 18 (Гордеева Е.Г. и др., 2012).

Табл. 5. Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в реципрокную транслокацию t(1;11)(q44;q21) (код пациента 78). FISH-анализ выполнен с использованием ДНК-зондов CEP 11, локус D11Z1, 11p11.11-q11, Spectrum Aqua, TelVysion 11q, локус D11S1037, tel 11q, Spectrum Orange, TelVysion 1p, локус CEB108/T7, tel 1p, Spectrum Green.

Проведенный FISH-анализ показал, что частота встречаемости сперматозоидов с сегментной анеуплоидией по хромосоме 18 составляет 3,1% (табл. 6). Мы полагаем, что данное значение является фактическим значением риска формирования при оплодотворении зиготы с рекомбинантной хромосомой 18.

Табл. 6. Частота встречаемости сперматозоидов с рекомбинантной хромосомой 18 в эякуляте у пациента с инверсией inv(18)(p11.23q21.1) (код пациента 75, контрольный препарат № 1). FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с сегментной анеуплоидией по хромосоме 18 выполнен с использованием ДНК-зондов TelVysion 18q, локус VIJyRM2050, tel 18q, Spectrum Orange, CEP 18, локус D18Z1, 18p11.1-q11.1, Spectrum Aqua.

Анализ мейотической сегрегации X- и Y-хромосом у мужчин с числовыми или структурными аномалиями половых хромосом

Для 5-и мужчин (из 3-й группы) со структурными или числовыми аномалиями половых хромосом в соматических клетках организма проведен FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 18, X и Y. Анализ проведен для пациента с низкоуровневым XXY/XY мозаицизмом и AT (код пациента 87), для пациента с азооспермией и синдромом Клайнфельтера при регулярной форме дисомии по X-хромосоме (код пациента 86), для мужчины с регулярной формой дисомии по Y-хромосоме и умеренной формой OAT (код пациента 85), для мужчины с перицентрической инверсией inv(Y)(p11.2q11.23) и АТ (код пациента 89), для мужчины с реципрокной транслокацией с вовлечением Y-хромосомы и хромосомы 21 при азооспермии (код пациента 88). У всех 5-и пациентов частота встречаемости сперматозоидов с некоторыми вариантами анеуплоидии по X и Y-хромосомам превосходила референсные значения, полученные для контрольной группы.Табл. 7. Частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по X и Y-хромосомам у п...