Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя чумы из природных очагов разного типа
Исследование молекулярно-генетических свойств штаммов Y. pestis из разных природных очагов чумы Республики Казахстан. Анализ частоты встречаемости природных чумных бактериофагов, изучение их свойства. Изучение роли атипичных штаммов в эпизоотии чумы.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 16.08.2018 |
| Размер файла | 1,5 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
03.00.07 - микробиология
Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя чумы из природных очагов разного типа
Мека-Меченко Татьяна Владимировна
Республика Казахстан
Алматы, 2010
Работа выполнена в Казахском научном центре карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева
Научный консультант
доктор медицинских наук,
Атшабар Б. Б.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Котова А.А.
доктор медицинских наук,
профессор Ордабаев Ж. К.
доктор медицинских наук,
профессор Каральник Б. В.
Ведущая организация
Национальный центр биотехнологии РК г. Астана
Защита состоится 15 октября 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 09.01.01 при Казахском национальном медицинском университете имени С. Д. Асфендиярова по адресу: 050012, г. Алматы, ул.Толе би, 88.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова по адресу: 050012, г. Алматы, ул. Богенбай батыра, 151.
Автореферат разослан « » 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор А. К. Дуйсенова
1. Актуальность проблемы
В связи с возрастанием угрозы биотерроризма составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов. В этот список наряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга включен и чумной микроб (Inglesby T.V. et al., 2000). Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первого (наивысшего) класса опасности. Чума явилась причиной приблизительно 200 миллионов смертей на протяжении обозримой истории человечества. Восприимчивость человека к чуме чрезвычайно велика. Спорадические случаи болезни регистрируются ежегодно во многих странах мира. По данным ВОЗ в 2010 году было зарегистрировано 72 случая заболеваний людей чумой в мире: 55 - в Африке, 13 - в Азии, 4 - в Америке (Weekly epidemiological record, 2010). Ученых настораживают сообщения об антибиотикорезистентных природных штаммах возбудителя чумы (Galimand M. et al., 2006; Fricke W. F. et al., 2009). Биологическую опасность в Республике Казахстан представляют естественные резервуары Y. pestis. В Казахстане 40% от общей территории республики (1 млн. 60 тыс. кв. км), заняты природными очагами чумы с высоким эпидемическим потенциалом, при этом наблюдается тенденция к расширению границ очаговой по чуме территории (Сапожников В. И., 2005; Бекенов Ж. Е., 2009).
В профилактике чумы главенствующую роль играет действующая система эпидемиологического мониторинга. Важная роль в этой системе принадлежит микробиологической диагностике, предусматривающей идентификацию и типирование возбудителя. Нами принята во внимание необходимость усовершенствования существующих диагностических подходов идентификации и дифференциации чумного микроба как важной задачи медицинской микробиологии, решение которой является определяющей составной частью успешной борьбы с чумой.
Лабораторная диагностика чумы построена на детекции ее возбудителя Y. pestis и его дифференциации от других представителей рода Yersinia. Для этого в основном используются микробиологические, серологические и биохимические методы исследования. Перечисленные методики с успехом позволяют проводить анализ типичных штаммов возбудителя чумы. Однако нередко возникают проблемы детекции возбудителя чумы и его дифференциации от близкородственного возбудителя Yersinia pseudotuberculosis. Внедрение молекулярно-генетической методологии, направленной на изучение геномного полиморфизма возбудителя чумы, является одним из наиболее перспективных направлений в разработке этой проблемы (Трухачев А. Л. с соавт., 2006; Булгакова Е. Г. c соавт., 2008; Ерошенко с соавт., 2008).
Внедрение в мониторинг Y. pestis комплексного методического приема, включающего классические микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования не вызывает сомнения. Работа в этом направлении позволяет по-новому взглянуть на классификацию самого грозного представителя семейства Enterobacteriaceae и существенно расширяет диагностические возможности исследователя.
Современные молекулярно-генетические технологии, несомненно, расширили возможности ученых по исследованию чумы в плане изучения генотипа, но в Казахстане они практически не используются. До настоящего времени нет детальной генотипической характеристики штаммов чумного микроба, нет и методических руководств по молекулярно-генетическим методам для работников практического здравоохранения Республики Казахстан.
Многолетняя работа в очагах чумы и ежегодное выделение огромного количества штаммов в этих очагах привели к накоплению большого количества данных, анализ которых трудоемок и требует внедрения современных технологий. Существенно оптимизировало бы эту работу внедрение географической информационной системы (ГИС), что позволяет обрабатывать, пространственно отображать и анализировать информацию по свойствам штаммов, активности очагов. До сих пор эта технология при работе в очагах чумы в Казахстане не используется.
Всё это демонстрирует актуальность проведения углубленных исследований по чуме, и определяет цель и задачи исследований.
Цель исследования: комплексная оценка основных микробиологических и молекулярно-генетических характеристик чумного микроба как основы совершенствования лабораторной диагностики чумы.
В соответствии с целью исследования были определены следующие задачи:
1. Провести методами классической микробиологии мониторинг свойств штаммов чумного микроба, представляющих диагностическую ценность, определить стабильность этих свойств.
2. Исследовать молекулярно-генетические свойства штаммов Y. pestis из разных природных очагов чумы Республики Казахстан.
3. Изучить характеристики штаммов Y. pestis в зависимости от фазы эпизоотического процесса. Изучить роль атипичных штаммов в эпизоотии чумы.
4. Проанализировать частоту встречаемости природных чумных бактериофагов, выделить бактериофаги и изучить их свойства.
5. Провести анализ и обобщение экспериментальных исследований, относящихся к изучению вирулентности возбудителя чумы, обеспечивающих его персистенцию в природе на современном этапе.
6. Разработать оптимальную схему комплексной оценки свойств штаммов чумного микроба и тактику применения ПЦР (полимеразная цепная реакция) для эпизоотологического обследования очагов чумы.
7. Создать электронные карты пространственного распределения штаммов чумного микроба на территории Республики Казахстан с использованием ГИС - технологии в программе ArcGis 9.1 для целей эпидемиологического надзора за чумой.
Научная новизна
На основе примененного комплексного изучения фенотипических свойств и генетических характеристик впервые установлено, что циркулирующие в природных очагах Казахстана популяции чумного микроба генетически неоднородны и обладают существенным геномным полиморфизмом, что свидетельствует о необходимости комплексного подхода к изучению штаммов Y. pestis.
Методом гель-электрофореза в импульсном поле впервые установлена гетерогенность штаммов Y. pestis из разных природных очагов чумы Казахстана и тем самым показана необходимость использования ГЭИП для сравнительного анализа штаммов, изолированных из разных очагов чумы.
Впервые с помощью VNTR-анализа установлены генотипы штаммов Yersinia pestis, распространенных на территории Казахстана, построена дендрограмма генетических взаимоотношений штаммов, выделено 7 кластерных групп, что позволит определять происхождение штаммов, решать спорные вопросы идентификации, изучать популяционную структуру штаммов, различия в их генотипах и обнаружить участки, наиболее подверженные геномным перестройкам.
Изучены бактериофаги, изолированные из штаммов Y. pestis, что дополняет биологическую характеристику чумного микроба. Впервые установлено, что бактериофаги отличаются друг от друга по морфологическим свойствам, степени литической активности и специфичности, при этом гомологичны по результатам ПЦР.
Впервые обосновано применение ГИС технологий для целей микробиологического мониторинга Y. pestis.
Практическая значимость работы
1. Результаты исследования являются методологической основой комплексного микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга Yersinia pestis как составной части эпидемиологического надзора за чумой.
2. Использование различных методических приемов позволило в сравнительном аспекте и с большой достоверностью охарактеризовать основные биологические свойства штаммов чумного микроба из разных природных очагов Казахстана:
- установлены особенности белковых профилей штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов чумы Казахстана;
- для тестирования штаммов из природных очагов Казахстана на содержание основного белка капсульного антигена F1 внедрен метод Western blot;
- в результате скрининга плазмид выявлены особенности плазмидного состава штаммов чумного микроба из разных очагов чумы Казахстана;
- показана диагностическая информативность ПЦР тест-систем на основе видоспецифичных праймеров Y.pestis. Проведено сравнение эффективности ПЦР с традиционными методами лабораторной диагностики чумы.
- подтверждена возможность при помощи клеточных культур фибробластов цыплят дифференцировать вирулентные и слабовирулентные штаммы представителей рода Yersinia. Отмечены различия в кинетике и итоге взаимодействия с клеткой высоко вирулентных и менее вирулентных штаммов Y. pestis.
3. Внедрены ГИС технологии в микробиологический мониторинг Y. pestis.
По результатам работы получены патенты:
Патент РК № 34575. Штамм чумного микроба Yersinia pestis КА-7, используемый в качестве тест-объекта для генетических и микробиологических исследований Мека-Меченко Т.В., Некрасова Л.Е., Атшабар Б.Б. и др.; опубл.18.07.02.
2. Патент РК № 34567. Штамм чумного микроба Yersinia pestis КА-36, используемый в качестве тест-объекта для изучения внехромосомных элементов наследственности возбудителя чумы Мека-Меченко Т. В., Аракелян И. С., Атшабар Б. Б.; опубл.18.07.02.
В музее живых культур КНЦКЗИ создана и депонирована коллекция тест-штаммов Y. pestis № КА-7 (190), КА-34 (1798), КА-35 (1984), КА-36 (1969) для молекулярно-генетических исследований и коллекция чумных бактериофагов.
Разработаны и утверждены методические рекомендации: Руководство по изучению штаммов чумного микроба (Алматы, 2001) и Оптимальные средства и методы работы коллекций возбудителя чумы в противочумных учреждениях Республики Казахстан (Астана, 2009).
Составлены и рекомендованы к утверждению Ученым Советом КНЦКЗИ «Методические рекомендации по изучению штаммов чумного микроба молекулярно-генетическими методами»
Результаты исследования включены в программы курсов специализации и повышения квалификации (практические занятия и лекционный курс) специалистов противочумной службы и учреждений Госсанэпиднадзора по особо опасным инфекциям.
Молекулярно-генетические исследования внедрены в практику изучения штаммов чумного микроба.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Штаммы, циркулирующие в природных очагах чумы Казахстана, обладают стабильными фенотипическими признаками, в 1,2%±0,01% случаев встречаются штаммы с измененными свойствами. В 2,9±0,01% из культур чумного микроба были выделены бактериофаги.
2. Генетическое маркирование штаммов методом ПЦР позволило детализировать характеристику культур чумного микроба и идентифицировать атипичные штаммы. Выявлены несколько вариантов плазмидного профиля штаммов. Установлено сходство протеиновых профилей штаммов Y. pestis из различных очагов чумы Казахстана.
3. Методом гель-электрофореза в импульсном поле выявлен полиморфизм штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах Казахстана на фоне сходства их фенотипических признаков. VNTR -анализ позволил установить генотипы штаммов Y. pestis и выделить 7 кластерных групп.
4. Вирулентность казахстанских штаммов для лабораторных животных меняется в ходе эпизоотического процесса. Наиболее вирулентные штаммы циркулируют в разгар эпизоотии чумы. Подобрана модель клеток для создания тест-систем для определения вирулентности бактерий рода Yersinia.
5. Комплексная схема идентификации и молекулярного типирования штаммов Y. pestis, скрининговые ПЦР исследования при эпизоотологическом исследовании на чуму и использование ГИС для совершенствования микробиологического мониторинга Y. pestis.
Апробация результатов исследования
Материалы и результаты исследований доложены и обсуждены на:
Второй межгосударственной научно-практической конференции по взаимодействию государств-участников СНГ в области санитарной охраны территорий (Алматы, 2001); 44-ой ежегодной конференции по биологической безопасности «17th Anniversary of the American Biological Safety Conference»,(New Orleans, LA, USA, 2001); 8th International Symposium on Yersinia, Turku, Finland, 2002); 4ой Международной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных болезней» (Саратов, 2003); Научно-практическом совещании «Международное сотрудничество по надзору за чумой» (Алматы, 2004); Scientific conference of Establishments on struggle and studying of nature-foci infections (Ulanbaatar, Mongolia, 2005); 7ой Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков (Алматы, 2006); The first international congress of Central Asia infectious diseases (Bishkek, 2006); III съезде врачей и провизоров Казахстана «Конкурентоспособному Казахстану - здоровую нацию» (Астана, 2007); I международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты клинической микробиологии. Проблемы дисбактериоза (Алматы, 2007); 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Munich, Germany, 2007); International conference «Zoonotic infectious diseases and tourism» (Ulanbaatar, 2009); 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Helsinki, Finland, 2009); Biological Threat Reduction Program (BTRP) Science Review (Atlanta, 2009); The International conference «Current issues on Zoonotic Diseases» (Ulanbaatar, 2010); научных конференциях, семинарах КНЦКЗИ.
Внедрение результатов исследования в практику
1. Внедрена комплексная система микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга свойств штаммов чумного микроба.
2. Апробированы и рекомендованы для практического применения методы ускоренного определения антибиотикочувствительности.
3. Рекомендована тактика применения ПЦР при полевых исследованиях и изучении штаммов чумного микроба.
4. По результатам работы получены патенты: «Штамм чумного микроба Yersinia pestis КА-7, используемый в качестве тест-объекта для генетических и микробиологических исследований» (приоритет от 18.07.02); «Штамм чумного микроба Yersinia pestis КА-36, используемый в качестве тест-объекта для изучения внехромосомных элементов наследственности возбудителя чумы» (приоритет от 18.07.02).
5. В музее живых культур КНЦКЗИ создана и депонирована коллекция тест-штаммов Y. pestis № КА-7 (190), КА-34 (1798), КА-35 (1984), КА-36 (1969) для молекулярно-генетических исследований и коллекция чумных бактериофагов (37 штаммов).
6. Молекулярно-генетические исследования внедрены в практику изучения штаммов чумного микроба в КНЦКЗИ.
7. Составлены и утверждены методические рекомендации: Руководство по изучению штаммов чумного микроба (Алматы, 2001); Оптимальные средства и методы работы коллекций возбудителя чумы в противочумных учреждениях Республики Казахстан (Астана, 2009).
8. Составлены и рекомендованы к утверждению Ученым Советом КНЦКЗИ «Методические рекомендации по изучению штаммов чумного микроба молекулярно-генетическими методами».
9. Результаты, полученные в процессе выполнения работы, были использованы при составлении программ курсов повышения квалификации специалистов противочумной службы и учреждений Госсанэпиднадзора, при проведении практических занятий и лекционного раздела курсов специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям на базе КНЦКЗИ.
Публикации Основные результаты работы отражены в 67 работах (33 в отечественных и 34 в зарубежных), в том числе, в 2 монографиях, в 2 методических рекомендациях и 2 патентах.
Связь с планами научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена по плану Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций имени М. Айкимбаева в рамках целевых научно-технических программ: «Эпидемиологический надзор при карантинных и зоонозных инфекциях» (шифр 0.0226); «Снижение угрозы распространения карантинных и зоонозных инфекций» (шифр 0.0285); «Научные основы обеспечения биологической безопасности в Республике Казахстан по карантинным и зоонозным заболеваниям человека» (шифр 0.0389) и «Разработка научно-обоснованных предложений по совершенствованию эпидемиологического надзора за карантинными и зоонозными инфекциями в Республике Казахстан» (шифр 0.0464).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 231 странице компьютерного набора текста, состоит из введения, характеристики современного состояния проблемы, 6 разделов собственных исследований, заключения, списка использованных источников (320 наименований на русском и 175 - на иностранных языках). Работа иллюстрирована 64 таблицами и 51 рисунками.
2. Основная часть
Материалы и методы исследования
В работе использованы бактериологический, серологический и молекулярно-генетические методы исследований. Объектом исследований были штаммы чумного микроба, изолированные из разных источников в очагах чумы Казахстана, ближнего и дальнего зарубежья в период 1951 по 2008 гг.
В качестве контрольных штаммов использовали авирулентный лабораторный штамм Y. pestis А1122, изогенный штамм Y. pestis EV76, а также Y. pestis UT930, UT0938, NM0197 и штамм Y. pseudotuberculosis 1-А серовара, предоставленные лабораторией CDC, Форт Коллинз, США, вакцинный штамм Y. pestis EV76 линии НИИЭГ, используемый для производства вакцины чумной живой сухой EV, типичный по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам и штамм Y. pseudotuberculosis 2841 (1 серовара по Е. Талю) из музея живых культур КНЦКЗИ. Также использовали штаммы Y. pseudotuberculosis 9, 91, 34, 28, 72 из коллекции отдела биолого-технологического контроля, которые применяются для контроля специфической активности производственных серий чумных и псевдотуберкулезного диагностических бактериофагов.
Основные характеристики штаммов определяли в соответствии с «Руководством по изучению штаммов чумного микроба» (Некрасова с соавт., 2001). При генотипировании и определении некоторых фенотипических свойств руководствовались “Laboratory Manual of Plague Diagnostic Tests” (Chu et al., 2000).
В основу работы по поиску и изоляции чумных бактериофагов положены результаты работы Новосельцева с соавт., 1982; Сулейменова с соавт., 2004. При иммунофлюоресцентном исследовании применяли иммуноглобулины диагностические чумные люминесцирующие (ИДЧЛ) производства РосНИПЧИ «Микроб» и кроличью сыворотку против F1 Y. pestis, меченную флуоресцеинизотиоцианатом (FITC-labeled rabbit anti-conjugate), изготовленную в лаборатории CDC, США.
Биохимические свойства штаммов изучали с помощью стандартных пробирочных тестов (в бульоне с феноловым красным); на жидких и плотных средах Гисса с использованием в качестве индикатора бромтимолового синего и коммерческих миниатюризированных тест-систем API 20E и BIOLOG-GN2.
Способность к пигментсорбции определяли на синтетической среде с гемином Джексона-Берроуза (Некрасова с соавт., 2001) и на среде, с индикатором конго- красным (Chu et al., 2000).
Определение фибринолитической и коагулазной активности, изучение пестициногенности и чувствительности к пестицину 1, способности продуцировать фракцию 1, изучение потребности бактерий в ионах кальция при 37°С проводили в соответствии с «Руководством по изучению штаммов чумного микроба» (Некрасова с соавт., 2001).
Вирулентность штаммов изучали на модели зараженных белых мышей и морских свинок. Вирулентность исследуемых штаммов определяли по показателю LD50 (Ашмарин с соавт., 1962). Сравнительное изучение вирулентности проведено на трипсинизированной культуре клеток фибробластов цыплят, получение которых осуществляли по методике О.Г. Анджапаридзе с соавт., 1962.
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом с применением бумажных дисков с антибиотиками, методом Е-теста, HiComb™ MIC Test (ХайКомб МИК тест); методом ускоренной диагностики определения чувствительности микроорганизмов к химиопрепаратам в твердых питательных средах с глюкозой и индикаторами (Илюхин с соавт., 2007) и методом серийных разведений антибиотика.
Протеиновый профиль изучали по методу U. K. Laemmli, 1970.
Определение антигена F1 Y. pestis в иммуноблоте проводили по методу H. Towbin et al., 1979.
Изучение штаммов Y. pestis на присутствие в геноме плазмид проводили методом C. I. Kado and S. T Liu, 1981.
Для типирования изучаемых штаммов методом ПЦР ДНК выделяли, используя набор реактивов для экстракции ДНК «QIAamp DNA Mini Kit» производства фирмы QIAGEN, Promega (США).
Гель электрофорез в импульсном поле проводили по методу, описанному Joppa et al., 1992.
При проведении анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR) размеры ПЦР-продуктов анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. VNTR-анализ вели по 42 локусам, с таким же количеством пар праймеров. Для построения дендрограммы использовали программу PAUP версия 4.0b10.
Для определения генетической гомологичности чумных бактериофагов использовали метод ПЦР с праймерами бактериофагов из лаборатории СDС, Колорадо, США.
Для составления электронных карт распространения штаммов чумного микроба на территории Казахстана была использована географическая информационная система (ГИС) и программы ArcGIS 9.1, Arcmap. Система разработана на базе ГИС - платформы ArcView. Топографическая основа - электронные карты Казахстана М 1:500000.
Статистическая обработка
При анализе протеинограмм подсчитывали коэффициент подобия по формуле Жаккарда, используемой в нумерической таксономии бактерий (Ф. Герхард с соавт., 1984; Богословский с соавт., 1982).
При проведении анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR) аллельную частоту Р определяли отношением числа аллелей данного типа к общему числу аллелей исследуемого локуса. Степень вариабельности локуса оценивали путем расчета индекса полиморфизма (разнообразия) Нея по формуле DI=1-?Р2 с использованием программы Excel 2000. Для построения дендрограммы использовали программу PAUP версия 4.0b10.
Материалы подвергнуты обработке общепринятыми методами вариационной статистики. Статистическая обработка результатов исследований проведена на компьютере с помощью стандартной программы Excel-97 с определением средних величин, расчетом стандартных ошибок средних показателей, выявлением достоверности различий средних величин, с использованием критерия Стъюдента. Различия оценивались как достоверные при вероятности 95%, Р<0,05.
Объем, методы и материал исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Методы, материал и объем исследований
|
Методы |
Материал |
Количество определений |
|
|
1. Микробиологический анализ |
Биохимические тесты (пробирочные) 2500 штаммов |
25000 |
|
|
Биохимическая идентификация с помощью тест-систем 59 штаммов:API 20E и BIOLOG-GN2 |
9285 |
||
|
2. Фагорезистентность |
Чумные бактериофаги Покровской и Л-413С, псевдотуберкулезный бактериофаг. 2500 штаммов |
2500 |
|
|
фаг phiA1122 59 штаммов |
118 |
||
|
3. Иммунологические исследования |
Система реакций РНГА-РНАт (реакция непрямой гемагглютинации-реакция нейтрализации антител)2500 штаммов |
5000 |
|
|
МФА (метод флюоресцирующих антител) 657 штаммов |
775 |
||
|
4. Изучение потребности в аминокислотах |
2500 штаммов, 7 разновидностей теста |
17500 |
|
|
5. Изучение детерминант вирулентности |
2500 штаммов |
7000 |
|
|
6 Молекулярно-генетический анализ (ПЦР - полимеразная цепная реакция и мПЦР (мультилокусная ПЦР); протеиновый профиль; Western blot (Вестерн блот); плазмидный профиль |
622 штамма из очагов чумы Казахстана; 35 - из очагов чумы СНГ; 11 - из очагов чумы США ДНК 678 штаммов |
2672 |
|
|
PFGE (пульс-гель электрофорез в импульсном поле) и VNTR (анализ областей генома с вариабельным числом тандемных повторов) |
48 штаммов из очагов чумы Казахстана, 11 штаммов из очагов чумы США |
118 |
|
|
6. Исследовано на наличие бактериофагов |
1290 штаммов из очагов чумы Казахстана и СНГ |
1290 |
|
|
7 Изучены свойств бактериофагов: литическая и специфическая активность, ПЦР |
37 штаммов |
666 |
|
|
8 Изучена антибиотикочувствительность |
10 антибиотиков МИК (3 метода) |
25000 |
|
|
9 Изучение вирулентности штаммов на модели белых мышей |
657 штаммов, 2628 белых мышей |
10512 |
|
|
10 Сравнительное изучение вирулентности in vivo и in vitro |
373 штамма: Y. pestis - 168; Y. pseudotuberculosis - 80; Y. enterocolitica - 100; Y. kristensenii - 25; 1492 белых мыши |
5968 |
|
|
11 Анализ паспортных данных |
Паспорта штаммов (1951-2008 гг..) |
4882 шт. |
|
|
ВСЕГО |
112904 |
Результаты исследований и их обсуждение
Штаммы чумного микроба из природных очагов Республики Казахстан (Прикаспийский степной, Волго-Уральский песчаный и Среднеазиатский пустынный очаги чумы) в большинстве случаев имеют типичные фенотипические свойства. В 1,2+0,01% случаев зарегистрированы штаммы с измененными биохимическими свойствами по признаку ферментации сахарозы, глицерина, арабинозы, мальтозы, денитрифицирующей активности и пестициногенности (таблица 2). Как правило, выделение этих штаммов имеет нерегулярный характер. Исключение составляют атипичные по отношению к арабинозе (Ara-) штаммы, длительно циркулирующие в Прибалхашском автономном очаге чумы, при этом увеличивается ареал их распространения.
Таблица 2 - Процент встречаемости штаммов Y.pestis с измененными биохимическими свойствами в очагах чумы Казахстана
|
Очаг чумы |
Изучено штаммов |
Ферментация |
Den+ |
||||
|
Gly- |
Ara- |
Malt- |
Saсch+ |
||||
|
Среднеазиатский пустынный |
3966 |
0,2 |
0,6 |
0,3 |
1 штамм |
0,1 |
|
|
Волго-Уральский песчаный |
241 |
- |
- |
- |
- |
1 штамм |
|
|
Прикаспийский степной |
18 |
- |
- |
- |
- |
3 штамма |
Изучение потребности в аминокислотах при 28оС штаммов чумного микроба, циркулирующих в очагах чумы Казахстана, показало стабильную и типичную их приуроченность по признаку зависимости к определенным территориям.
Для изолированных в пустынных очагах чумы (Среднеазиатский пустынный и Волго-Уральский песчаный) штаммов, характерна потребность в метионине, треонине, цистеине и фенилаланине. Часть штаммов дополнительно нуждается в лейцине и аргинине. Для большинства штаммов из Прикаспийского степного очага чумы требуется три аминокислоты - метионин, треонин и цистеин (таблица 3).
Таблица 3 - Изучение потребности в аминокислотах при 28оС штаммов Y.pestis, изолированных в очагах Казахстана
|
Природный очаг чумы |
Изучено штаммов |
Процент штаммов, зависимых от: |
||||||
|
Cys- |
Met- |
Phe- |
Thr- |
Leu- |
Arg- |
|||
|
Среднеазиатский пустынный |
3966 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
4,3±0,2 |
3,9±0,1 |
|
|
Волго-Уральский песчаный |
241 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
5,8±0,5 |
- |
|
|
Прикаспийский степной |
18 |
100 |
83,3±12,2 |
22,2±2,5 |
88,8±8,4 |
1 штамм |
- |
Появление штаммов с измененной зависимостью в аминокислотах носит случайный характер. Циркуляция аргининзависимых (Arg-) штаммов не характерна для очагов чумы Казахстана. Однако, начиная с 1999 года, такие штаммы стали выделять в Прибалхашском автономном очаге чумы, при этом их количество к 2008 году стабильно увеличивалось более чем на 20% (таблица 4).
Таблица 4 - Выделение Arg- штаммов Y.pestis в Прибалхашском автономном очаге чумы в 1999-2008 гг..
|
Год |
Всего изолировано штаммов |
Количество Arg- штаммов |
|
|
1999 |
113 |
9 |
|
|
2000 |
78 |
2 |
|
|
2001 |
66 |
6 |
|
|
2002 |
179 |
15 |
|
|
2003 |
112 |
12 |
|
|
2004 |
142 |
12 |
|
|
2005 |
94 |
3 |
|
|
2006 |
45 |
29 |
|
|
2007 |
79 |
34 |
|
|
2008 |
85 |
40 |
Резистентных к антибактериальным препаратам штаммов чумного микроба, как среди коллекционных (музейных), так и среди свежевыделенных, обнаружено не было. Большинство изученных музейных штаммов чумного микроба чувствительны к стрептомицину (92%), гентамицину (94%), левомицетину (79%), тетрациклину (76%) и ципрофлоксацину (97%) (рисунок 1).
Рисунок 1 - Чувствительность к антибиотикам музейных штаммов Y. pestis
генетический чума бактериофаг штамм
Свежевыделенные штаммы чумного микроба из разных очагов чумы были чувствительными к пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, левомицетину (хлорамфениколу), стрептомицину (рисунок 2). По отношению к канамицину в 17,7 % случаев были выявлены штаммы с умеренной чувствительностью. Умеренно чувствительные штаммы встречались при изучении чувствительности к амикацину (13,3%); азитромицину (15,5%); рифампицину (28,8%), бензилпенициллину (26,6%) (рисунок 2).
Рисунок 2 - Чувствительность к антибиотикам свежевыделенных штаммов Y. pestis
В 2,9±0,01% из культур чумного микроба были выделены бактериофаги (37 бактериофагов). Количество бактериофагов у музейных и свежевыделенных оказалось примерно одинаковым, с небольшим преобладанием у свежевыделенных - 20 (54,1±12,5%) и 17 (45,9±11,5%) у музейных штаммов.
Наибольшее количество бактериофагов было выделено из штаммов Северо-Приаральского автономного очага чумы 17, Бетпакдалинском 4 и Мойынкумском 3 автономных очагах чумы. По 2 штамма бактериофагов выявлено в Гиссарском и Таласском очагах. По одному штамму бактериофагов обнаружено в Приаральско-Каракумском, Таукумском, Урало-Эмбенском, Устюртском, Зааральском, Прибалхашском, Сарыджазском автономных очагах. 1 бактериофаг также обнаружен в Каракумском очаге (Туркмения) (рисунок 3).
Штаммы чумного микроба, из которых были выделены фаги, обладали типичными для возбудителя чумы свойствами. Отмечены отличия по внешним признакам поражения бактериофагом. У 13,5+0,5% штаммов колонии были светлее обычного, далее к 5 суткам - почти прозрачные с характерной исчерченностью - «тающие» колонии. У 27,0+2,5% штаммов по всему газону роста были выявлены мелкие стерильные пятна диаметром 1,0 мм. У 59,5+15,5% штаммов через 24 часа инкубации при 28оС образовывались стерильные пятна, правильной округлой формы диаметром 2-2,5 мм. Через 2 суток пятна увеличивались до 3 - 9 мм (22 штамма).
В группе бактериофагов, выделенных из музейных штаммов чумного микроба, преобладают штаммы, изолированные от грызунов (72,2+20,5%). При работе со свежевыделенными штаммами характерной особенностью явилось то, что большая часть бактериофагов, была получена из штаммов, изолированных от эктопаразитов (54,1+12,9%) (рисунок 4).
Рисунок 3 - Процент бактериофагов, выделенных в разных очагах чумы
А - музейные штаммы Б - свежевыделенные штаммы
Рисунок 4 - Процент выделенных бактериофагов из штаммов Y. pestis, изолированных от грызунов и эктопаразитов
Наибольшее количество бактериофагов (20) было выделено из штаммов Y. pestis в период 1999-2005 гг.. с пиком их выделения в 2001 году - 18 (рисунок 5, причем 17 из них - в Северо-Приаральском автономном очаге чумы.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рисунок 5 - Количество бактериофагов, выделенных в разные годы
Изолированные штаммы бактериофагов, отличались друг от друга по морфологическим свойствам, степени литической активности и специфичности. Изучение штаммов бактериофагов в ПЦР показало их гомологичность, за исключением 2 штаммов бактериофагов из Прибалхашского и Мойынкумского автономных очагов. Собранная коллекция бактериофагов в перспективе может быть использована при поиске более чувствительного и специфичного диагностического фага для серийного производства.
Использование ПЦР и мультилокусной ПЦР с высокой специфичностью позволяет идентифицировать атипичные штаммы возбудителя чумы и повышает информативность лабораторных исследований. Штаммы чумного микроба из различных природных очагов исследовали в ПЦР с целью детекции видоспецифичного гена caf1, локализованного на плазмиде pFra и детерминирующего продукцию антигена F1(рисунок 6).
Размещено на http://www.allbest.ru/
1 - маркеры молекулярных масс; 2 - штамм Y. pestis А1122 (caf1+); 3 - штамм Y. psedotuberculosis (caf1-); 4-13 и 15 - штаммы Y. pestis № 2032, 1846, 396, 1690, 1894, 84, 88, 1204, 277, 316, 1710 (caf1+); 14 - штамм Y. pestis 1481(caf1-); 16 - отрицательный контроль.
Рисунок 6 - Электрофореграмма амплификации фрагмента гена caf1 возбудителя чумы
Полученные результаты были сопоставлены с фактом выявления F1-антигена всеми другими методами. Штаммы 1481 (Сарыджазский автономный очаг), 23, 1903 и 2010 (Прибалхашский автономный очаг), не содержащих в геноме ген caf1, не имели плазмиды pFra и не проявляли соответствующих фенотипических свойств, т. е. были F1- отрицательны при исследовании в РНГА, Western blot и МФА, за исключением штамма №1481, который реагировал с ИДЧЛ и давал флюоресценцию, вероятно за счет антигенов кодируемых плазмидами pPst, pCad (таблица 5).
Таблица 5 - Результаты обнаружения антигена F1 у штаммов Y. pestis из очагов чумы Казахстана различными методами
|
Природный очаг чумы |
Автономный очаг чумы |
Изучено штаммов |
Число положительных штаммов на F1 |
|||||
|
МФА |
РНГА |
Wes- tern blot |
плазмида pFra |
ген caf1 |
||||
|
Среднеазиатский пустынный |
Устюртский |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
|
|
Предустюртский |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
||
|
Северо-Приаральский |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
||
|
Приаральско-Каракумский |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
||
|
Мойынкумский |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
||
|
Таукумский |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
||
|
Прибалхашский |
123 |
121 |
119 |
119 |
119 |
120 |
||
|
Урало-Эмбенский |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
||
|
Мангышлакский |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
||
|
Кызылкумский |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
||
|
Зааральский |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
||
|
Бетпакдалинский |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
||
|
Волго-Уральский песчаный |
- |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
|
|
Прикаспийский степной |
Волго-Уральский степной |
25 |
24 |
25 |
25 |
25 |
25 |
|
|
Зауральский |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
||
|
Тянь-Шанский |
Сарыджазский |
7 |
7 |
6 |
6 |
6 |
6 |
|
|
Итого: |
622 |
619 |
617 |
617 |
617 |
618 |
Штамм Y. pestis № 2730 (Приэльбрусский автономный очаг) также не содержал в геноме ген caf1, не имел плазмиды pFra и не проявлял соответствующих фенотипических свойств, т. е. был F1- отрицателен при исследовании в РНГА, Western blot и МФА (таблица 6).
Таблица 6 - Результаты обнаружения антигена F1 Y. pestis различными методами у штаммов из очагов чумы СНГ
|
Природный очаг чумы |
Автономный очаг чумы |
Изучено штаммов |
Число положительных штаммов на F1, |
|||||
|
МФА |
РНГА |
Wes- tern blot |
плазмида pFra |
ген caf1 |
||||
|
Алайский |
- |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
|
Центрально-Кавказский |
Приэльбрусский |
5 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
|
|
Тувинский |
- |
5 |
5 |
5 |
5 |
4 |
5 |
|
|
Закавказский высокогорный |
- |
5 |
3 |
3 |
3 |
3 |
5 |
|
|
Гиссарский |
- |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
|
Горно-Алтайский |
- |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
|
Итого: |
35 |
32 |
32 |
32 |
31 |
34 |
||
|
Y. psedotuberculosis |
7 |
- |
- |
- |
- |
- |
Для молекулярного типирования возбудителя чумы методом ПЦР мы использовали и мультилокусную систему позволяющую выявлять фрагменты генов, соответствующих трем собственным плазмидам чумного микроба (pFra, pCad, pPst) и хромосомному гену 16S рРНК (CDC, USA) (рисунок 7).
Размещено на http://www.allbest.ru/
1 - маркеры молекулярных масс; 2, 3, 5-8 и 11 - штаммы Y. pestis, имеющие все четыре гена; 4, 9, 10 - штаммы Y. pestis, не имеющие pst-гена; 12 - отрицательный контроль
Рисунок 7 - Электрофореграмма амплификации продуктов мПЦР
Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в полиакриламидном геле, позволила установить, что универсальный праймер, мишенью в ПЦР у которого является рибосомный ген (16S рРНК), амплифицировал фрагменты гена у всех исследуемых культур чумного и псевдотуберкулезного микробов.
Мультилокусная система позволила также выявить фрагменты генов, соответствующих трем собственным плазмидам. Фрагмент амплифицируемый прямым и обратным праймерами Pst5/Pst3 не выявлен у штаммов Y.pestis, утративших плазмиду пестициногенности (pPst). У штаммов, не имеющих плазмиды (кальцийзависимости) pCad, соответствующие ампликоны в мПЦР не обнаружены (таблица 7).
Таблица 7 - Результаты мультилокусной ПЦР в сравнении с результатами плазмидного анализа
|
Природный очаг Чумы |
Автономный очаг чумы |
Изучено штаммов |
Плазмиды |
Гены |
||||||
|
pFra |
pCad |
pPst |
F1 |
Rep |
Pst |
EC |
||||
|
Среднеазиатский пустынный |
Устюртский |
25 |
25 |
25 |
21 |
25 |
25 |
21 |
25 |
|
|
Предустюртский |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
27 |
||
|
Северо-Приаральский |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
53 |
||
|
Приаральско-Каракумский |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
63 |
||
|
Мойынкумский |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
51 |
||
|
Таукумский |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
||
|
Прибалхашский |
123 |
119 |
122 |
122 |
120 |
122 |
122 |
123 |
||
|
Урало-Эмбенский |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
||
|
Мангышлакский |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
||
|
Кызылкумский |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
44 |
||
|
Зааральский |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
45 |
||
|
Бетпакдалинский |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
||
|
Волго-Уральский песчаный |
- |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
37 |
|
|
Прикаспийский степной |
Волго-Уральский степной |
25 |
25 |
25 |
24 |
25 |
25 |
24 |
25 |
|
|
Зауральский |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
18 |
||
|
Тянь-Шанский |
Сарыджазский |
7 |
6 |
7 |
7 |
6 |
7 |
7 |
7 |
|
|
Итого: |
622 |
617 |
621 |
616 |
618 |
621 |
616 |
622 |
||
|
Y. pseudotuberculosis |
7 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Амплификация в одной реакционной смеси фрагментов генов, локализованных на трех плазмидах Y. pestis, дает возможность составить представление об их потенциальной вирулентности и эпидемической значимости.
Проведено сравнительное изучение плазмидных профилей штаммов Y. pestis, циркулирующих в различных природных очагах, среди различных носителей и переносчиков, в пределах одного очага на протяжении длительного времени. Выявлено 6 вариантов штаммов Y. pestis, отличающихся по наличию плазмидных репликонов.
Скрининг штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах Казахстана показал преобладание типичного плазмидного профиля (110 kb, 70 kb, 9,5 kb), характерного для 95,2±12,5% штаммов (рисунок 8). Представляют интерес криптическая плазмида размером 45-50 kb штамма № 1969, выделенного от больного человека и плазмида с измененной массой 120 kb, что важно для дифференциации природных вариантов от созданных лабораторно путем введения дополнительных факторов вирулентности.
Размещено на http://www.allbest.ru/
1 - маркеры молекулярных масс; 2, 6, 7 - тип 12 (70 и 9,5 kb); 3, 5 - тип 13 (70 kb); 4 - тип 6 (110 и 70 kb); 8 - тип 14 (9,5 kb); 9 - тип 2 (110, 70, 45-50 и 9,5 kb); 10 - тип 1 (110, 70 и 9,5 kb).
Рисунок 8 - Электрофореграмма плазмидного профиля штаммов чумного микроба
Типичный плазмидный профиль также преобладал в популяциях чумного микроба, циркулирующего в природных очагах стран СНГ. Незначительные колебания молекулярной массы плазмиды pFra не носили характера выраженной закономерности.
Подтверждена возможность элиминации плазмид чумного микроба в процессе хранения при многократных пересевах штаммов на искусственные питательные среды и под воздействием других факторов, в результате чего изменяется их плазмидный состав и вирулентные свойства. Как видно на рисунке 9 и у музейных, и у свежевыделенных штаммов чаще всего элиминирует плазмида пестициногенности. Плазмида pFra чаще отсутствовала у музейных штаммов. У свежевыделенных штаммов не отмечено такого разнообразия вариантов элиминации плазмид, как - у музейных.
В целом, плазмидный состав штаммов чумного микроба из очагов чумы Казахстана был представлен вариантами:
1) типичный 110 kb, 70 kb, 9,5 kb и специфичный 120 kb, 70 kb, 9,5 kb;
2) атипичный:
- с дополнительной плазмидой 110 kb, 70 kb, 45-50 kb, 9,5 kb
- с отсутствием одной или нескольких плазмид:
110 kb, 70 kb
110 kb, 9,5 kb
110 kb
70 kb, 9,5 kb
70 kb
9,5 kb.
А - музейные штаммы Б - свежевыделенные штаммы
Рисунок 9 - Частота элиминации плазмид у штаммов чумного микроба
В процессе работы создана коллекция из 17 штаммов Y. pestis, отличающихся по плазмидному составу.
Простота выполнения и ограниченное время процедуры скрининга плазмид позволяют в достаточно короткие сроки получить характеристику исследуемых штаммов по плазмидному профилю.
Штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах Казахстана, имеют сходный протеиновый профиль, типичный для вида Y. pestis.
Клеточный экстракт всех изученных чумных микробов содержал набор белков с молекулярной массой в пределах от 17 до 103 kDa. Приблизительно 18 полипептидов выявлено в каждом из штаммов. Среди них - 7 белков с приблизительной молекулярной массой 90, 80, 64, 46, 38, 29 и 17 kDa преобладали в количественном отношении, являясь основными (мажорными) белками чумной клетки. Кроме того, в клеточной мембране Y. pestis присутствовали второстепенные (минорные) белки размером ~ 103, 100, 61, 43, 39, 35, 33, 28, 27, 25 и 20 kDa (рисунок 11).
Размещено на http://www.allbest.ru/
1-8 - штаммы Y. pestis из различных природных очагов Казахстана и типичным протеиновым профилем; 9 - штамм Y. pestis А1122 (США); 10 - маркер молекулярной массы
Рисунок 11 - Протеинограмма штаммов Y. pestis из природных очагов Казахстана и США
Степень подобия у казахстанских штаммов находится в диапазоне 94-100%, что указывает на высокую степень структурной близости клеточных мембран. Получен референс-спектр мембранных белков возбудителя чумы, циркулирующего в природных очагах Казахстана.
Результаты тестирования штаммов методом Вестерн-блота (рисунок 12) на наличие F1 были вполне закономерными и позволили обнаружить отсутствие антигена F1 у ряда штаммов, выделенных от переносчиков: по одному штамму из Сарыджазского и Прибалхашского автономных, Центрально-Кавказского природного очагов и 2 штамма из Закавказского высокогорного природного очага. У трех штаммов, выделенных от носителей, из Прибалхашского автономного очага, отсутствие капсульного антигена в иммуноблоте подтверждает их уникальность по этому признаку, известную по многим публикациям.
1 - маркеры молекулярных масс. Положительно реагирующие с анти-F1 сывороткой штаммы Y. pestis: 2 - штамм А1122 из США; 3, 5, 7, 9, 10 - из природных очагов Казахстана. Слабо реагирующие с анти-F1 сывороткой штаммы Y. pestis: 6, 8 - из природных очагов Казахстана. Не реагирующий с анти-F1 сывороткой штамм Y. pestis: 4 - штамм № 23 из Прибалхашского автономного очага.
Рисунок 12 - Иммуноблоты клеточных лизатов Y. pestis с кроличьей анти-F1 сывороткой и коньюгатом антикроличьих антител с щелочной фосфатазой
Результаты тестирования капсульного антигена методом Вестерн блота были сопоставимы с результатами серологического исследования штаммов в системе серологических реакций РНГА-РНАт.
Выявленный методом ГЭИП полиморфизм позволяет говорить о неоднородности штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах Казахстана на фоне сходства их некоторых фенотипических признаков. На рисунке 13 представлена диаграмма результатов изучения штаммов методом гель-электрофореза в импульсном поле.
Процент идентичности штаммов из автономных очагов Среднеазиатского пустынного природного очага, Волго-Уральского степного автономного очага, Волго-Уральского песчаного природного очага независимо от года изоляции составляет от 77,2 до 97,7%. Биотип изученных штаммов возбудителя чумы из этих географических регионов - mediaevalis. Исключение составляет штамм, изолированный из Устюртского автономного очага KZ993790, который обладает способностью к денитрификации и генетически близок (84,45%) к штамму KZ993831 из Тянь-Шанского природного очага (Сарыджазский автономный очаг) и по биохимическим свойствам штамм отнесен к биотипу antigua. Последние два штамма возбудителя чумы по генетической структуре более близки к штаммам из США (83,17%), в сравнении с другими штаммами, выделенными из очагов чумы Казахстана (77,16%) (таблица 8).
Рисунок 13 - Диаграмма результатов изучения идентичности штаммов Y. pestis из разных очагов Казахстана и США методом гель-электрофореза в импульсном поле
У штаммов из Сарыджазского автономного очага процент схожести относительно низкий (77,16%). Схожесть генетической структуры 12 штаммов, изолированных в США, варьирует от 88,79% до 100%. Относительно низкий процент идентичности штаммов, изолированных из очагов чумы Казахстана (77,16%-97,68%), зависит от неравнозначности участков с ландшафтно-эпизоотологической точки зрения, с характерными для каждого очага свойствами циркулирующих популяций возбудителя чумы.
Таблица 8 - Результаты изучения идентичности штаммов Y. pestis из разных очагов Казахстана и США
|
Очаги чумы, географические регионы изоляции штаммов |
Количество изученных штаммов |
Идентичность штаммов (%) |
|
|
1 |
2 |
3 |
|
|
Сарыджазский автономный очаг |
5 |
77,16±5,4 |
|
|
Волго-Уральский песчаный очаг |
4 |
86,43±7,2 |
|
|
Бетпакдалинский автономный очаг |
2 |
86,43±7,2 |
|
