Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Изучение элементов “скрытого” метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

03.00.03 - Молекулярная биология

Сычева Елена Викторовна

Москва, 2008 г.

Работа выполнена в лаборатории №3 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.В. Стойнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С. Миронов ФГУП “ГосНИИгенетика”

кандидат биологических наук С.В. Беневоленский Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Ведущая организация: Институт общей генетики им Н.И. Вавилова РАН

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути “скрытого” метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [D'Ari & Casadesus, 1998]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование “ненужных” путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться “скрытые” метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.

Мы столкнулись с явлением “скрытого” метаболизма при конструировании на основе E. coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AHAS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата - предшественника изолейцина.

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина.

К настоящему времени в клетках E. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-3-кетобутират-КоА-лигаза (Kbl) [Aronson et al., 1989], и анаэробная деградация до пропионата [Helinger et al., 1998] (Рис. 1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и AckА. Другие пути деградации треонина в клетках E. coli к настоящему времени не охарактеризованы.



Рис. 1. Метаболизм L-треонина в E. coli

Tdh - треониндегидрогеназа, Kbl - 2-амино-3-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA - треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - синтазы ацетогидроксикислот; TdcB - треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутиратформиатлиаза, Pta - фосфотрансацетилаза, AckА, TdcD - пропионаткиназы.

аэробный метаболизм треонин кетобутират

Цели и задачи работы. Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО “АГРИ” и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках E. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата.

В процессе работы решались следующие задачи:

- изучение путей аэробной деградации треонина в клетках E. coli;

- идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в E. coli;

- создание коллекции экспрессионных кассет, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из E. coli и Мethylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот;

- исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;

- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в клетках E. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе изучена аэробнaя деградация L-треонина, однородно меченного изотопами ¹⁴С и ¹³C, в модельном штамме E. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Показано, что в клетках E. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот E. coli и M. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN E. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Получен штамм E. coli с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках E. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология”, посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, ноябрь-декабрь 2006 г.) и на смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО “АГРИ” (Москва, июнь 2004 г., июнь 2007 г.).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО “АГРИ” и Секции Учёного Совета ФГУП “ГосНИИГенетика” 30 октября 2007 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано семь печатных работ, из них две в отечественном журнале, четыре тезисных сообщения в материалах научной конференции и одна патентная заявка.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ___ листах машинописного текста, включая ___ рисунков и ___ таблиц. Работа состоит из введения, списка используемых сокращений, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит ___ источников, в том числе ___ на русском языке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение деградации треонина в модельном штамме ITP290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию

Конструирование модельного штамма ITP290-3 и изучение конверсии треонина в изолейцин в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA^IleR

Для изучения возможных путей деградации треонина нами был сконструирован модельный штамм ITP290-3. В качестве родительского штамма был использован треониновый продуцент TDH7KmS/pРRT614, который содержал на плазмиде pРRT614 структурные гены треонинового оперона thrA442BC под контролем P_R промотора фага , а также ген температурочувствительного репрессора фага - cI857, и имел хромосомную мутацию в гене tdh, предотвращающую деградацию треонина по пути дегидрирования.

Для создания условий регулируемой экспрессии треониндезаминазы в штамм TDH7KmS/pРRT614 была интегрирована экспрессионная кассета mini-Mu::P_lac-lacI-ilvA^IleR, которая содержала под контролем Plac промотора ген лактозного репрессора (lacI) и ген ilvA^IleR, кодирующий биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию. Это позволяло путем изменения концентрации индуктора лактозного оперона изопропилтиогалактозида (IPTG) плавно регулировать или полностью блокировать активность треониндезаминазы в ходе культивирования клеток. Для интеграции данной кассеты использовалась плазмида pMDv4ilvA (Рис. 2) (любезно предоставлена к.б.н. Бирюковой И.В., ЗАО “АГРИ”).

Рис. 2. Структура плазмиды pMDv4ilvA

Измерение удельной активности треониндезаминазы в клетках штамма HB101, несущего плазмиду pMDv4ilvA, подтвердило, что в условиях репрессии гена ilvA^IleR активность треониндезаминазы была достаточно низкой (на уровне штамма HB101). При добавлении индуктора активность фермента значительно увеличивалась (более чем на три порядка) и не ингибировалась изолейцином (Табл. 1).

Таблица 1. Удельная активность треониндезаминазы (ТД) в клетках штаммов HB101 и HB101/pMDv4ilvA

Штамм	Генотип	Уд. акт. ТД, нмоль/мин мг*
		без IPTG	IPTG
		без Ile	Ile, 2мМ	без Ile	Ile, 2мМ
HB101	ilvA	2.0	1.3	НО	НО
HB101/pMDv4ilvA	ilvA, Plac-lacI-ilvAIleR	1.0	0.6	3000	3117

Удельную активность ТД измеряли в грубых экстрактах клеток, выращенных в условиях индукции IPTG (1мМ) и без индукции. Так как штамм HB101 содержит ген ilvA дикого типа, кодирующий ТД, чувствительную к изолейцину, а плазмида pMDv4ilvA содержит ген ilvA^IleR, кодирующий ТД, устойчивую к изолейцину, измерение проводили как в отсутствие, так и в присутствии изолейцина (2мМ) в пробах; НО - не определяли.

Клетки штамма ITP290-3 в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR накапливали в культуральной жидкости только треонин, а в условиях экспрессии гена ilvA^IleR - изолейцин, 2-аминобутират и не накапливали треонин (Табл. 2, опыт 1). Таким образом, штамм ITP290-3 являлся удобной моделью для изучения путей деградации треонина в условиях экспрессии биосинтетической треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию.

Анализ накопления изолейцина клетками штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR показал отсутствие полного превращения треонина в изолейцин, причем деградация треонина была существенной (Табл. 2, опыт 1). Можно было бы предположить, что подобный результат связан не с деградацией треонина, а со снижением его синтеза в условиях сверхэкспрессии гена ilvA^IleR. Для проверки этого предположения мы индуцировали экспрессию гена ilvA^IleR уже после того как в клетке синтезировалось значительное количество треонина (Табл. 2, опыт 2), но и в этом случае не наблюдали полной конверсии накопленного треонина в изолейцин. Сходные результаты были получены и в случае добавления в среду экзогенного треонина (Табл. 2, опыт 3).

Таким образом, анализ продуктов, накапливаемых штаммом ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR, показал отсутствие полной конверсии как вновь синтезируемого, так и экзогенного треонина в изолейцин. Мы предположили, что неполное превращение треонина в изолейцин связано с деградацией 2-кетобутирата, который образуется из треонина под действием биосинтетической треониндезаминазы, в путях, отличных от биосинтеза изолейцина.

Для проверки этого предположения мы определили некоторые продукты, которые штамм ITP290-3 накапливает в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR и в условиях экспрессии гена ilvA^IleR при добавлении экзогенного треонина, т.е. в условиях избытка 2-кетобутирата (Табл. 3).

Таблица 2. Продукты ферментации, накапливаемые штаммом ITP290-3 в условиях регулируемой экспрессии треониндезаминазы

N опыта	Добавки*	Время культиви-рования, ч	ОП, 540 нм	Продукты ферментации**, мM
				Thr	Ile	2-АБ
1.	-	24	13.7	151.1	1.0	1.0
	IPTG	24	3.6	1	15.2	4.8
2.	-	7	4.7	42.8 (5.1 г/л)	1.0	1.0
	IPTG через 7 ч	24	5.2	1.0	13.0	7.8
3.	IPTG, Thr (47.8 мМ)	24	8.2	1.0	21.3	5.8

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), IPTG добавляли до конечной концентрации 1мМ;

** 2-AБ - 2-аминобутират.

Оказалось, что в условиях репрессии гена ilvA^IleR кроме треонина штамм накапливал небольшое количество пропионата, который обычно токсичен для клеток E. coli (Табл. 3). При индукции гена ilvA^IleR в условиях добавления экзогенного треонина уровень синтеза пропионата существенно увеличивался и происходило накопление 2-кето-3-метилвалерата (КМВ) - предшественника изолейцина, и 2-аминобутирата (2-АБ) - продукта аминирования 2-кетобутирата изолейцин-валиновыми аминотрансферазами.

Таблица 3. Некоторые продукты ферментации, накапливаемые штаммом ITP290-3 в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR (опыт 1) и в условиях экспрессии гена ilvA^IleR (опыт 2).

N опыта	Добавки*	Продукты ферментации, мМ
		Thr	Ile	Пропионат	КМВ	2-АБ
1.	-	151.1	<1.0	4.5	<1.0	<1.0
2.	Thr, IPTG	<1.0	21.3	32.4	4.6	5.8

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с добавками треонина (47.8 мМ) и IPTG (1мМ), либо без добавок.

Мы предположили, что пропионат мог быть как продуктом деградации 2-кетобутирата, который образуется из треонина под действием треониндезаминазы, так и изолейцина (Рис. 3). Деградация 2-кетобутирата представлялась нам наиболее вероятным путем синтеза пропионата, так как клетки E. сoli не способны катаболизировать углеродный скелет изолейцина, в частности, использовать его в качестве единственного источника углерода для роста. Для экспериментальной проверки данных схем мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом ¹⁴С, в штамме ITP290-3.



Рис. 3. Возможные пути синтеза пропионата в штамме ITP290-3

Анализ продуктов деградации треонина, однородно меченного изотопом ¹⁴С, в штамме ITP290-3

Деградация треонина изучалась нами путем анализа меченых продуктов утилизации L-[U-¹⁴C]треонина. С этой целью штамм ITP290-3 культивировали в среде с немеченой глюкозой в качестве источника углерода в присутствии L-[U-¹⁴C]треонина и немеченого треонина (5.7 г/л) в условиях репрессии и дерепрессии гена ilvA^IleR. Определение суммарной радиоактивности культуральной жидкости штамма ITP290-3, проведенное на разных этапах ферментации, показало, что в процессе ферментации происходило уменьшение суммарной радиоактивности культуральной жидкости, по-видимому, за счет выведения ¹⁴C-метки с летучими соединениями, главным образом, с ¹⁴CO₂ (Рис. 4). Можно видеть, что в условиях индукции треониндезаминазы количество метки, выводимой с летучими соединениями, было на 24 больше, чем в отсутствие индукции.

	Рис. 4. Изменение концентрации 14C-меченных атомов в культуральной жидкости штамма ITP290-3 в ходе ферментации в отсутствие экспрессии гена ilvAIleR и в условиях экспрессии гена ilvAIleR

Мы провели количественный анализ распределения ¹⁴С-метки в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Оказалось, что только 38% ¹⁴С-метки, введенной с L-[U-¹⁴C]треонином, включалось в изолейцин, 5% метки включалось в 2-аминобутират, 34% составила потеря метки с летучими соединениями (Рис. 5). Таким образом, в условиях данного эксперимента нам удалось идентифицировать 43% меченых продуктов утилизации L-[U-¹⁴C]треонина. Для идентификации остальных продуктов деградации треонина мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом ¹³C, в штамме ITP290-3 с помощью ЯМР-спектроскопии. Все ЯМР-спектры были накоплены, обработаны и проанализированы в лаборатории спектрального анализа ИБХ РАН.



Рис. 5. Распределение ¹⁴C-меченных атомов в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR

Анализ продуктов деградации L-¹³C-треонина методом ЯМР-спектроскопии

Треонин, однородно меченный изотопом ¹³C, был получен путем культивирования треонинового продуцента TDH7KmS/pРRT614 в среде, содержащей D-[U-¹³C]глюкозу в качестве единственного источника углерода. В ¹H-ЯМР-спектре L-¹³C-треонина были обнаружены характерные сигналы протонов -CH группы при 4.28 м.д., -CH группы при 3.1 м.д. и -CH₃ группы при 1.35 м.д. (рис. не приводится). Интересно отметить, что C атом полученного L-¹³C-треонина был в меньшей степени обогащен изотопом ¹³C по сравнению с C и C атомами. Так, для C и C атомов соотношение изотопов ¹²C/¹³C составило 0.11, а для C атома - 0.20. Такая неоднородность мечения треонина, полученного микробиологическим способом из D-[U-¹³C]глюкозы, вероятно, связана с тем, что при образовании C атома оксалоацетата (и соответственно треонина) в фосфоенол-пируваткарбоксилазной реакции происходит ассимиляция не только меченого ¹³CO₂, выделяемого в реакциях декарбоксилирования, но и ¹²CO₂ из окружающей среды (Рис. 6).

Для изучения деградации L-¹³C-треонина мы проводили ферментацию штамма ITP290-3 в среде с немеченой глюкозой в присутствии L-¹³C-треонина (2 г/л) и немеченого треонина (8 г/л) в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR и в условиях экспресcии ilvA^IleR.

Рис. 6. Образование треонина из ¹³C-фосфоенолпирувата (PEP) и ¹²CO₂ Ppc - фосфоенолпируваткарбоксилаза (EC 4.1.1.31)

Продукты ферментации анализировали методами одномерной гомоядерной и двумерной (2D) гомо- и гетероядерной ЯМР-спектроскопии, которые в настоящее время широко применяются в исследованиях метаболических потоков, так позволяют проследить за метаболизмом ¹³C-меченных соединений [Szyperski et al., 1992, London et al., 1999].

На Рис. 7 приведены ¹H-ЯМР-спектры культуральной жидкости штамма ITP290-3 в условиях репрессии гена ilvA^IleR (спектр I) и в условиях экспресии гена ilvA^IleR (спектр II). В отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR в ¹H-ЯМР спектре культуральной жидкости были обнаружены сигналы от протонов треонина и пропионата. В случае экспрессии гена ilvA^IleR в ¹H-ЯМР спектре наблюдали сигналы, соответствующие протонам пропионата, 2-кетобутирата, 2-аминобутирата, пирувата, треонина и ацетата.

	Рис. 7. 1H-ЯМР-спектры культуральной жидкости штамма ITP290-3, выращенного в условиях репрессии гена ilvAIleR (спектр I) и в условиях дерепрессии гена ilvAIleR (спектр II). Указаны сигналы, соответствующие протонам пропионата (1a, 1b), 2-кетобутирата (2a, 2b), треонина (3a, 3b, 3c), пирувата (4), aцетата (5), 2- аминобутирата (2-АБ) (6).

Общее содержание изотопа ¹³С в продуктах ферментации было определено из одномерных ¹³С-спектров. Суммарная потеря ¹³С-меченых атомов в ходе ферментации в условиях экспрессии гена ilvA^IleR была на 21% больше, чем в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR. Эти результаты хорошо согласуются с данными по убыли метки в процессе утилизации L-[U-¹⁴C]треонина (Рис. 4).

Мы провели анализ количественного распределения ¹³С-метки в основных веществах-метаболитах в условиях индукции треониндезаминазы (Табл. 4). Большая часть изотопа ¹³С обнаруживалась в пропионате (41% от суммарного количества ¹³C-метки в идентифицированных соединениях). Можно видеть, что в условиях данного опыта L-¹³C-треонин метаболизировался не полностью. Кроме того, среди меченых продуктов деградации L-¹³C-треонина был идентифицирован норвалин (количество метки в нем не определялось), возможный путь его синтеза будет рассмотрен в Разделе 4 автореферата.

Tаблица 4. Относительное содержание изотопа ¹³C в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях индукции гена ilvA^IleR

Вещество	13 C*
Изолейцин	1.00
Пропионат	4.16
Треонин	2.10
2-Кетобутират	2.00
2-Аминобутират	0.62
2-Кето-3-метилвалерат	0.26
Пируват	0

*суммарное содержание изотопа ¹³C в изолейцине принято за 1.

На данном этапе работы по характеру включения изотопа ¹³С в молекулу пропионата мы проверяли два возможных пути его образования, приведенные на Рис. 8.

Рис. 8. Возможные пути образования пропионата и 2-аминобутирата: путь 1 - пропионат образуется из 2-кетобутирата (2-КБ), путь 2 - пропионат образуется из изолейцина; - ¹³С-атомы, - ¹²С-атомы

В том случае, если пропионат образуется из L-¹³C-треонина, однородно меченого по всем четырем атомам углерода, то включение изотопа ¹³С произойдет во все атомы углерода пропионата (Рис. 8, схема 2). Если же пропионат образуется из изолейцина, селективно меченного изотопом ¹³С, то C и C атомы пропионата будут немечеными, так как в молекуле изолейцина они происходят из немеченого пирувата (Рис. 8, схема 2).

Для экспериментальной проверки данных схем был накоплен и проанализирован 2D ¹H-¹³C-COSY спектр культуральной жидкости штамма ITP290-3, выращенного в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Фрагмент ¹H-¹³C-COSY спектра и срезы для кросс-пиков изолейцина и треонина по ¹³C-направлению представлены на Рис. 9.

Низкая интенсивность и отсутствие расщепления сигналов С и C² атомов изолейцина свидетельствовали о природном содержании изотопа ¹³С (около 1%) в ядрах данных атомов, что подтверждало их образование из немеченого пирувата. То, что сигнал С атома изолейцина имел форму дублета, указывало на включение изотопа ¹³С в ядро данного атома и на его взаимодействие только с одним атомом ¹³С, а именно, со связанным с ним атомом углерода карбоксильной группы. Характер расщепления сигналов C и C¹ атомов изолейцина свидетельствовал о включении изотопа ¹³С в ядра данных атомов и указывал на взаимодействие между ними. Таким образом, анализ спектра подтвердил селективность мечения изолейцина изотопом ¹³С.

Характер расщепления сигналов C, С и C атомов треонина подтверждал включение изотопа ¹³С во все атомы углерода треонина (Рис. 9). То, что сигнал С атома треонина имел форму дублета дублетов, указывало на неэквивалентность связанных с ним С атома углерода и атома углерода карбоксильной группы. То, что С атом треонина давал в спектре триплет, а не дублет дублетов, свидетельствовало об эквивалентности связанных с ним C и C атомов углерода.

Сигнал С атома пропионата в ¹H-¹³C-COSY спектре имел форму дублета, что указывало на включение изотопа ¹³С в ядро данного атома и на его взаимодействие со связанным с ним С атомом углерода (Рис. 10). То, что С атом пропионата давал в спектре дублет дублетов, свидетельствовало о неэквивалентности связанных с ним С атома углерода и атома углерода карбоксильной группы. Таким образом, характер расщепления сигналов C и C атомов пропионата указывал на включение изотопа ¹³С во все атомы углерода пропионата. Это означает, что пропионат был продуктом аэробной деградации однородно меченного треонина, а не изолейцина, селективно меченного изотопом ¹³C.

Характер включения углерода ¹³С в молекулу 2-аминобутирата свидетельствовал о том, что 2-аминобутират также являлся продуктом деградации L-¹³C-треонина (Рис. 10).

Рис. 10. Срезы ¹H-¹³C-COSY спектра по оси ₁ для кросс-пиков пропионата и аминобутирата (-AВ).

Таким образом, на данном этапе работы мы показали, что в аэробных условиях в клетках E. coli может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, и первым этапом этого пути является превращение треонина в 2-кетобутират, которое осуществляет биосинтетическая треониндезаминаза.

Изучение ферментов аэробного пути метаболизма треонина в пропионат

На втором этапе работы мы попытались идентифицировать ферменты, которые отвечают за дальнейшее превращение 2-кетобутирата в пропионат. Из литературных источников известно, что в анаэробно растущих клетках E. coli 2-кетобутират декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА пируватформиатлиазой (PflB) и формиатлиазой кетокислот (TdcE), которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. Мы предположили, что в аэробном метаболизме 2-кетобутирата в пропионат в E. coli принимают участие пируватоксидаза и пируватдегидрогеназный комплекс, так как известно, что 2-кетобутират может служить их альтернативным субстратом in vitro [Chang et al., 2000, Bisswanger et al., 1981].

Влияние амплификации и инактивации гена poxB на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватоксидаза может принимать участие в деградации 2-кетобутирата, мы изучили влияние амплификации гена poxB на уровень накопления пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. С этой целью данный штамм трансформировали плазмидой pBR322-poxB, несущей ген poxB под собственной регуляцией. Как следует из Таблицы 5, амплификация гена poxB привела к снижению уровня накопления изолейцина (в 2 раза), а также значительно увеличила уровень накопления пропионата (в 3 раза) и препятствовала накоплению 2-кетобутирата. Таким образом, амплификация пируватоксидазы усилила деградацию 2-кетобутирата в пропионат.

Таблица 5. Влияние амплификации гена poxB на уровень накопления изолейцина, пропионата и 2-кетобутирата в штамме ITP290-3

Штамм	ОП540	Продукты ферментации, г/л*
		2-Кетобутират	Изолейцин	Пропионат
ITP290-3	8.1	2.9	2.3	2.4
ITP290-3/pBR322	6.5	5.3	1.5	2.1
ITP290-3/pBR322-poxB	5.3	0.1	0.7	6.8

Далее мы изучили влияние инактивации гена poxB на синтез пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Для этого хромосомную делецию гена poxB переносили в штамм ITP290-3. Видно, что инактивация гена poxB не оказала заметного влияния на уровень накопления пропионата и изолейцина в штамме ITP290-3 (Табл. 6).

Следовательно, несмотря на то, что амплификация пируватоксидазы усиливает деградацию 2-кетобутирата в пропионат, очевидно, что этот путь деградации 2-кетобутирата не является единственным и ключевым.

Таблица 6. Влияние инактивации гена poxB на уровень накопления пропионата и изолейцина в штамме ITP290-3

Штамм	ОП540	Продукты ферментации, г/л*
		Пропионат	Изолейцин
ITP290-3	6.3	2.6	1.2
ITP290-3poxB	6.8	2.6	1.3

*Среда содержала глюкозу (4%), треонин (5.7 г/л), IPTG (1мМ).

Влияние инактивации гена aceE на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватдегидрогеназный комплекс (PDHC) может принимать участие в деградации 2-кетобутирата, мы изучили влияние инактивации гена aceE, кодирующего E1p субъединицу PDHC, на уровень синтеза пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Для этого в штамм ITP290-3 трансдукцией фагом P1 вводили хромосомную делецию гена aceE. Полученный в результате штамм ITP290-3aceE для роста на минимальной среде нуждался в добавлении ацетата.

Как следует из Таблицы 7, штамм ITP290-3aceE в условиях экспрессии гена ilvA^IleR не накапливал пропионат и ацетат, а уровень накопления 2-кетобутирата увеличился на 30% по сравнению с исходным штаммом. Это означает, что инактивация E1p субъединицы пируватдегидрогеназного комплекса блокировала превращение 2-кетобутирата в пропионат.

Таблица 7. Влияние инактивации гена aceE на накопление пропионата в штамме ITP290-3

Штамм	Ацетат	ОП540	Продукты ферментации, г/л*
			2-Kетобутират	Ацетат	Пропионат
ITP290-3	-	6.3	4.4	0.8	2.6
ITP290-3	+	6.0	4.3	1.1	2.0
ITP290-3aceE	+	4.8	5.8	0.1	0.1

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с добавками треонина (5.7 г/л), IPTG (1мМ) и (если указано) ацетата натрия (0.4%).

Таким образом, полученные данные позволяют нам сделать вывод о том, что основную роль в аэробной деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Очевидно, что он осуществляет превращение 2-кетобутирата в пропионил-КоА, который, по-видимому, метаболизируется в пропионат фосфотрансацетилазой (Pta) и пропионаткиназой (AckA) (Рис. 11).

Пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, однако в отсутствие сверхэкспрессии ее вклад в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Деградацию 2-кетобутирата в пропионат можно считать примером “скрытого метаболизма”, который обусловлен повышением уровня 2-кетобутирата в клетке в результате сверхэкспрессии гена ilvA^IleR, что приводит к его утилизации пируватдегидрогеназным комплексом.

Рис. 11. Возможные пути метаболизма 2-кетобутирата в клетках E. coli

PDHC - пируватдегидрогеназный комплекс, PflB, TdcE - пируватформиатлиазы, AHAS I, III - синтазы ацетогидроксикислот I и III, IlvE - трансаминаза В, AvtA - трансаминаза С, PoxB - пируватоксидаза, Acs - ацетил-КоА-синтаза, PrpC - метилцитратсинтаза, PrpD - 2-метилцитратдегидратаза, AcnB - аконитаза В, PrpB - 2-метилизоцитратлиаза, ОА - оксалоацетат. Реакции метилцитратного цикла обозначены пунктирными стрелками

Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле

Известно, что у E. coli и S. typhimurium существует еще одна ферментная система, способная осуществлять метаболизм пропионил-КоА - метилцитратный цикл, в котором пропионил-КоА окисляется до пирувата (Рис. 11) [Textor et al., 1997, London et al., 1999, Brock et al., 2002]. Однако у E. coli данный цикл функционирует только после длительной адаптации клеток к росту на пропионате, поэтому клетки E. coli дикого типа не используют пропионат в качестве источника углерода [Horswill et al., 1999].

Для того чтобы выяснить, может ли в клетках штамма ITP290-3 происходить утилизация пропионил-КоА в пируват ферментами метилцитратного цикла одновременно с его превращением в пропионат под действием Pta и AckA, мы проанализировали рост этого штамма на пропионате как единственном источнике углерода. Однако нам не удалось отобрать клоны, растущие на пропионате.

Полученный результат находится в хорошем соответствии с данными по анализу распределения изотопа ¹³С в продуктах деградации L-¹³С-треонина в штамме ITP290-3, согласно которым ¹³C-атомы отсутствовали как в пирувате (Табл. 3), так и в C и C2 атомах изолейцина (Рис. 9). Следовательно, метилцитратный цикл, преобразующий пропионил-КоА в легко утилизируемый пируват, по-видимому, не активен в условиях проведенного эксперимента.

Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот

В первой части нашей работы было показано, что в клетках E. coli может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, если отсутствует эффективная утилизация 2-кетобутирата синтазами ацетогидроксикислот (AHAS). Поэтому при создании промышленно значимого продуцента изолейцина для предотвращения возможной деградации 2-кетобутирата необходимо было согласовать экспрессию ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы и синтаз ацетогидроксикислот. С этой целью нами был получен набор экспрессионных кассет, содержащих гены AHAS из E. coli и M. methylotrophus (Табл. 8).

Таблица 8. Сконструированные экспреcсионные единицы, содержащие гены синтаз ацетогидроксикислот из E. coli и M. methylotrophus

Сконструированные экспрессионные единицы	Цель	Интеграция в хромосому
PivbL-ilvG603M	Увеличение экспрессии AHAS II в стационарной фазе роста	+
PthrА-att-thrA442B-ilvBN	Координация экспрессии AHAS I и треониновых генов	+
PilvIH-ilvIH Mme	Исследование неохарактеризованной AHAS из M. methylotrophus	+
PR-ilvIH Mme		-

В E. coli охарактеризованы три изофермента синтаз ацетогидроксикислот (AHAS I - продукт генов ilvBN, AHAS II - продукт генов ilvGM, и AHAS III - продукт генов ilvIH), которые отличаются по ферментативным свойствам - субстратной специфичности и ингибированию валином. Известно, что в клетках E. coli дикого типа функционируют только два изофермента - AHAS I и AHAS III, которые подвержены ингибированию валином. Для экспрессии устойчивой к валину AHAS II, которая обладает наибольшим сродством к 2-кетобутирату, необходимо наличие мутации в гене ilvG, восстанавливающей трансляционную рамку этого гена [Lawther et al., 1982].

Для удобства клонирования генов AHAS на основе штамма E. coli K-12 ВКПМ-7 (или В7) нами были получены штаммы B7?ilvIH - с делецией ilvIH оперона, B7?ilvBN?ilvIH - с делецией ilvBN и ilvIH оперонов, и B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH - с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот.

Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона

В нашей лаборатории ранее был получен штамм-продуцент изолейцина 44-3-15, который содержит в хромосоме несколько копий кассеты mini-Mu::PR-ilvGValR71MEDA7434, обеспечивающей эффективную экспрессию ферментов, необходимых для биосинтеза изолейцина и валина. Определение удельной ацетолактатсинтазной (АЛС) активности в штамме 44-3-15ilvBNilvIH с делециями генов, кодирующих AHAS I и AHAS III, на разных этапах культивирования показало, что суммарная и особенно валин-устойчивая АЛС активность значительно снижалась на поздней логарифмической стадии роста. Мы предположили, что это связано главным образом с низкой стабильностью AHAS II.

Для проверки данного предположения мы определили время полужизни AHAS II для штамма 44-3-15, которое оказалось очень низким и составило 50 минут, тогда как время жизни треониндезаминазы составило 105 минут. Такое различие в стабильности этих ключевых ферментов биосинтеза изолейцина может привести к активации альтернативных путей утилизации 2-кетобутирата в ранней стационарной фазе роста клеток и накоплению продуктов его деградации.

С целью увеличения экспрессии AHAS II в стационарной фазе роста клеток оперон ilvG603M был клонирован в составе интегративного вектора pMIV-5JS под контролем регуляторной области ilvBN оперона, поскольку по данным DNA-array анализа, выполненного для штамма-продуцента изолейцина, уровень транскрипции этого оперона увеличивается в стационарной фазе роста (к.б.н. Птицын Л.Р., ЗАО “АГРИ”). Полученная в результате плазмида pMIV-PivbL-ilvGM была использована для введения кассеты mini-Mu::attR-cat-attL-PivbL-ilvG603M в хромосому штамма 44-3-15, что привело к увеличению уровня удельной валин-устойчивой активности ацетолактатсинтазы в стационарной фазе роста на 60%. Однако возможности дальнейшего увеличения активности AHAS II в клетках ограничены, так как было показано, что фермент в высоких концентрациях способен агрегировать. В связи с этим, для увеличения активности AHAS нам представлялось целесообразным амплифицировать AHAS I и AHAS III.

Клонирование генов AHAS I в составе оперона PthrA-att-thrA442B

Для того чтобы можно было усилить в клетке одновременно и синтез треонина, и утилизацию 2-кетобутирата, гены AHAS I были клонированы в составе интегративной плазмиды pMT17, несущей гены синтеза треонина thrA442BC под контролем промотора треонинового оперона с удаленным аттенуатором, фланкированные attL- и attR-сайтами фага Mu. В ходе конструирования фрагмент гена thrC плазмиды был заменен фрагментом ДНК, содержащим структурные гены ilvBN оперона. Полученная в результате экспрессионная кассета mini-Mu::PthrA-att-thrA442B-ilvBN была интегрирована в хромосому штамма B7ilvBNilvIH.

Оказалось, что уровень удельной ацетолактатсинтазной активности в клетках штамма B7ilvBNilvIH att-thrA442B-ilvBN, содержащего в хромосоме кассету mini-Mu::PthrA-att-thrA442B-ilvBN, был в четыре раза выше, чем в клетках штамма B7ilvIH, содержащего в хромосоме ilvBN оперон под собственной регуляцией (Табл. 9). Таким образом, нами была получена кассета, которая обеспечивала эффективную экспрессию ilvBN генов с промотора треонинового оперона совместно с генами thrA442B.

Таблица 9. Результаты измерения удельной АЛС активности в штаммах E. coli

Штамм	AHAS в хромосоме	Уд. акт. АЛС, нмоль/мг мин
B7ilvBNilvIH	нет	<0.1
B7ilvIH	PivbL-ilvBN	4.0
B7ilvBNilvIH att-thrA442B-ilvBN	mini-Mu::PthrA-att-thrA442B-ilvBN	16.1

Клонирование генов AHAS из M. methylotrophus

Известно, что клетки M. methylotrophus устойчивы к валину. Кроме того, в геноме этих бактерий обнаружена только одна открытая рамка считывания, гомологичная большой субъединице AHAS III E. coli. Поэтому с целью поиска гомологов устойчивых к валину AHAS из других организмов оперон ilvIH, кодирующий синтазу ацетогидроксикислот M. methylotrophus, был клонирован в составе интегративных векторов pMIV-5JS (под собственной регуляцией) и pM17 (под контролем PR промотора фага ). Полученные в результате плазмиды pMIV5JS-ilvIHMme и pM17-PR-ilvIHMme обеспечивали рост штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH на минимальной среде в присутствии 1 г/л валина. Таким образом, мы показали, что экспрессия генов AHAS из M. methylotrophus в E. coli может осуществляться не только с PR промотора, но и с нативного промотора.

Определение АЛС активности в штамме B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, несущем плазмиду pMIV5JS-ilvIHMme, показало, что AHAS M. methylotrophus подвержена ингибированию валином, но профиль ингибирования отличен от AHAS III E. coli (Рис. 12). Можно видеть, что для AHAS M. methylotrophus снижение относительной АЛС активности на 50% наблюдалось при добавлении 20 мМ валина, тогда как для AHAS III E. coli - при добавлении 0.05 мМ валина.

Впоследствии было установлено, что устойчивость клеток M. methylotrophus к валину связана не с валин-устойчивостью AHAS, а с отсутствием у этих бактерий систем транспорта разветвленных аминокислот в клетку (к.б.н. Йомантас Ю.В., ЗАО “АГРИ”).

Некоторые из полученных на данном этапе работы конструкций использовались при создании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Рис. 12. Ингибирование AHAS M. methylotrophus (А) и AHAS III E. coli (В) валином. Удельная АЛС активность в клетках в отсутствие валина принята за 1;

Изучение образования норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма E. coli, дефектного по AHAS

Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH

Еще одним примером “скрытого” метаболизма 2-кетобутирата, с которым мы столкнулись в рамках этой работы, оказался синтез неканонических аминокислот норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH - производном штамма E. coli K-12 В7, в котором делетированы все гены, кодирующие изоферменты AHAS. Данный штамм является ауксотрофом по изолейцину и валину, но не требует добавления лейцина для роста на минимальной среде, поскольку лейцин синтезируется из продукта дезаминирования валина - 2-кетоизовалерата (Рис. 13).

Мы обнаружили, что штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH при культивировании в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) в отсутствие лейцина накапливал в культуральной жидкости вещества, которые методом ВЭЖХ-МС были идентифицированы как норвалин и норлейцин [Новикова и др, 2006]. Содержание норлейцина и норвалина в культуральной жидкости было определено методом ОФ-ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием (Табл. 10). Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы для штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH составил около 5%.

Таблица 10. Накопление норвалина и норлейцина клетками штаммов E. coli B7 и B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH*

Штамм	Добавки**	Норвалин, г/л	Норлейцин, г/л
B7	-	<0.1	<0.1
B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH	Ile, Val	0.9	1.9

* Клетки растили в среде состава: глюкоза (60 г/л), (NH₄)₂SO₄ (18 г/л), K₂HPO₄·3H₂O (2 г/л), MgSO₄·7H₂O (1 г/л), CaCO₃ (25 г/л), тиамин (0.02 г/л);

** Изолейцин добавляли до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л.

Механизм образования норвалина и норлейцина впервые был предложен для Serratia marcesсens [Kisumi et al., 1976]. Полагают, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата и 2-кетовалерата, соответственно, в так называемом “пути удлинения кетокислот” (Рис. 13). Ферменты данного пути - изопропилмалатсинтаза (IPMS, продукт гена leuA), изопропилмалатизомераза (IPMI, продукт генов leuCD) и изопропилмалатдегидрогеназа (IPMD, продукт гена leuB) в норме осуществляют удлинение углеродной цепи 2-кетоизовалерата на одну метиленовую группу с образованием 2-кетоизокапроата - предшественника лейцина. Известно, что IPMS S. marcesсens способна использовать в качестве субстрата не только 2-кетоизовалерат, но и с другие кетокислоты, в частности, 2-кетобутират и 2-кетовалерат. Продукты реакции метаболизируются IPMI и IPMD, которые также обладают широкой субстратной специфичностью. В результате из 2-кетобутирата в первом цикле “пути удлинения кетокислот” образуется 2-кетовалерат, который превращается в 2-кетокапроат во втором цикле этого пути. Аминирование 2-кетовалерата и 2-кетокапроата аминотрансферазами IlvE, AvtA или TyrB приводит к образованию норвалина и норлейцина, соответственно.



Рис. 13. Предполагаемая схема биосинтеза норлейцина и норвалина в S. marcesсens и E. coli

Pyr - пируват

Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что у E. coli, так же, как и у S. marcesсens, синтез норвалина и норлейцина осуществляется в пути биосинтеза лейцина [Bogosian et al., 1989]. Полученные нами данные по накоплению норвалина и норлейцина клетками штамма E. coli с блокированной функцией AHAS также подтверждают предполагаемый механизм. По-видимому, в условиях роста клеток в среде с низкой концентрацией валина (100 мг/л) в отсутствие лейцина уровень 2-кетоизовалерата, а значит и лейцина, в клетке снижен, что вызывает дерепрессию leuABCD оперона, а отсутствие AHAS приводит к значительному увеличению уровня 2-кетобутирата в клетке. В этих условиях IPMS вместо 2-кетоизовалерата может использовать 2-кетобутират, который находится в избытке, что приводит к образованию норвалина и норлейцина.

Известно, что норвалин и норлейцин относятся к антиметаболитам и ингибируют рост клеток E. coli дикого типа. Однако можно видеть, что штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH накапливает данные аминокислоты в количествах, превышающих их минимальные ингибирующие концентрации (Табл. 11). Мы предположили, что данное явление связано с тем, что в процессе ферментации в условиях сверхсинтеза норвалина и норлейцина накапливаются мутации, приводящие к устойчивости клеток к данным аминокислотам.

Таблица 11. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) норвалина и норлейцина для штаммов E. coli

Штамм	МИК норвалина, г/л	МИК норлейцина, г/л ...

Страница:

•  1 
•  2 

автореферат "Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот" скачать

Подобные документы

• Мониторинг внутриклеточного протеасомо-опосредованного гидролиза белков в физиологических условиях с применением ДНК-кодируемой резоруфин-лигазы

  Протеасомо-опосредованный гидролиз белков. Функции и синтез липоевой кислоты в Escherichia coli. Использование LplA-лигазы в биохимических исследованиях. Методы работы с бактериями Escherichia coli. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.
  
  курсовая работа [1,1 M], добавлен 23.01.2018
  

• Влияние комплекса аминокислот на процессы пищеварения у перепелов

  Обеспечение максимальной продуктивности перепелов. Повышение активности пищеварительных ферментов содержимого слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки птиц. Положительное влияние лизина, метионина и треонина на переваримость питательных веществ корма.
  
  статья [24,5 K], добавлен 25.02.2015
  

• Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот

  Бактериальные штаммы. Условия адаптации. Получение штаммов - продуцентов аминокислот, адаптированных к максимальным концентрациям 2Н2О в среде. Изучение ростовых характеристик M. flagellatum. Секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий.
  
  статья [1,2 M], добавлен 23.10.2006
  

• Аэробные энергетические процессы

  Деление организмов на аэробов и анаэробов. Распространенность аэробного дыхания в мире прокариот. Ингибиторы дыхания и состав дыхательной цепи у прокариот. Эволюция путей аэробного метаболизма. Бесхлорофильный фотосинтез без электрон-транспортной цепи.
  
  контрольная работа [730,3 K], добавлен 26.07.2009
  

• Характеристика ферментов

  Классификация, свойства, строение и номенклатура ферментов. Факторы, влияющие на их активность. Характеристика представителей гликозидазы, аептидгидролазы. Изучение особенностей метаболизма, анаболизма и катаболизма. Исследование структуры кофермента.
  
  презентация [594,2 K], добавлен 25.12.2014
  

• Биологическая характеристика Escherichia coli

  Общее описание кишечной палочки, ее морфологические, культуральные, биохимические свойства, антигенная структура, токсинообразование. Оценка резистентности и патогенности. Лабораторная диагностика заболеваний, принципы их лечения и профилактика.
  
  курсовая работа [219,1 K], добавлен 24.09.2014
  

• Превращение микроорганизмами соединений углерода

  Анализ возможных путей расщепления глюкозы. Определение составляющих и принципа функционирования аэробного метаболизма. Процессы образования органических кислот и биотрансформации исходных субстратов, отличных от углеводов по своей химической природе.
  
  реферат [3,3 M], добавлен 09.06.2015
  

• Аэробное дыхание микроорганизмов

  Понятие дыхания как физиологического процесса, обеспечивающего нормальное течение метаболизма организмов. Виды дыхания микроорганизмов. Химизм аэробного дыхания. Достоинства и недостатки дыхания кислородом. Появление аэробного дыхания в процессе эволюции.
  
  реферат [391,8 K], добавлен 11.06.2014
  

• Исследование изменений метаболизма эритроцитов донорской крови после взятия ее из организма

  Процессы энергетического метаболизма и основные энергетические параметры эритроцитов. Выяснение условий, при которых может происходить переход метаболизма эритроцитов из одной устойчивой точки в другую. Анализ строения и функций гемоглобина, эритроцитов.
  
  дипломная работа [3,5 M], добавлен 17.10.2012
  

• Изучение ферментов

  Определение ферментов как специфических белков, присутствующих во всех живых клетках биологических катализаторов. Пространственность структурной молекулы ферментов, процесс биосинтеза оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.
  
  контрольная работа [13,5 K], добавлен 27.01.2011
  

• Свободные аминокислоты нервной системы

  Содержание, локализация и транспорт аминокислот. Метаболизм дикарбоновых аминокислот и глутамина. Компартментализация метаболизма аминокислот. Глицин и пути его обмена, серосодержащие аминокислоты. Ароматические аминокислоты нервной ткани и их метаболизм.
  
  курсовая работа [1,7 M], добавлен 26.08.2009
  

• Изучение потребностей прокариот в питательных веществах

  Минеральные соли, соединения углерода, азота, кислорода, водорода, серы, фосфора, как источники основных биогенных химических элементов, необходимых для построения, функционирования и метаболизма прокариотической клетки. Факторы роста микроорганизма.
  
  курсовая работа [298,4 K], добавлен 23.01.2015
  

• Энергетический метаболизм микроорганизмов

  Общие понятия об обмене веществ и энергии. Анализ потребностей прокариот в питательных веществах. Типы метаболизма микроорганизмов. Сравнительная характеристика энергетического метаболизма фототрофов, хемотрофов, хемоорганотрофов и хемолитоавтотрофов.
  
  курсовая работа [424,3 K], добавлен 04.02.2010
  

• Микоплазмы: представители, особенности строения и метаболизма, систематика

  Общие сведения о микоплазмах как разновидности одноклеточных паразитических микроорганизмов. Паразитические особенности микоплазм, распространенность и способы борьбы. Особенности строения и метаболизма. Систематика и таксономия: филогенетический подход.
  
  курсовая работа [200,6 K], добавлен 03.04.2017
  

• Взаимодействие неаллельных генов

  Неаллельные гены как гены, расположенные в различных участках хромосом и кодирующие неодинаковые белки. Комплементарность: понятие, примеры. Доминантное и рецессивное взаимодействие неаллельных генов. Понятие о кумулятивной и некумулятивной полимерии.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 07.12.2013
  

• Культивирование, выделение, очистка и идентификация продуцентов биомассы

  Культивирование продуцентов биомассы: теоретические основы, принципы. Выделение продуцентов биомассы. Схема аппаратурного оформления процесса фильтрации на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем. Особенности процесса высаливания ферментных препаратов.
  
  дипломная работа [712,2 K], добавлен 23.12.2012
  

• Взаимосвязь обменов в организме. Патохимия сахарного диабета

  Основные стадии метаболизма: анаболическая и катаболическая. Расчет уровня глюкозы в крови как индикатора состояния углеводного метаболизма. Алиментарная и эмоциональная гипергликемия. Липидный и азотистый обмен в организме. Патохимия сахарного диабета.
  
  курсовая работа [649,5 K], добавлен 07.06.2012
  

• Изучение возможности применения метода амплитудного анализа лазерного излучения для изучения плотности микробных популяций и закономерностей их роста в различных условиях

  Метод светорассеяния в изучении микробных популяций, использование установки для регистрации светорассеяния. Анализ зависимости светорассеяния популяций Staphilococcus aureus и Esherichia coli в питательном бульоне с добавками и физиологическом растворе.
  
  лабораторная работа [38,5 K], добавлен 02.08.2013
  

• Технологія біосинтезу амінокислот

  Дослідження штамів мікроорганізмів. Використання мутантів мікроорганізмів. Промисловий синтез амінокислот. Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти, лізину, метіоніну, треонина, ізолейцину та триптофану. Ход реакцій і блокуванням етапів синтезу.
  
  реферат [34,9 K], добавлен 25.08.2010
  

• Биотехнологический способ получения меченого стабильными изотопами липид-транспортирующего белка чечевицы (Lens culinaris)

  Липид-транспортирующие белки растений в диагностике и терапии аллергических заболеваний. Создание гипоаллергенных аналогов LTP, перспективы вакцинации. Химическая трансформация клеток E.coli. Расщепление гибридного белка, масс-спектрометрический анализ.
  
  дипломная работа [1,8 M], добавлен 16.07.2013
  

Другие документы, подобные "Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот"

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам