Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

B7

0.06

0.3

B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH

0.06

0.3

B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH*

0.06

0.3

*Штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, отобранный после ферментации в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л).

Определение минимальных ингибирующих концентраций норвалина и норлейцина для штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, отобранного после ферментации в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) показало, что он не имеет фенотипа устойчивости к норвалину и норлейцину (Табл. 11). Следовательно, наше предположение оказалось неверным. Столь высокий уровень продукции данных аминокислот штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH возможно связан с тем, что в процессе ферментации активируются системы их транспорта из клетки.

Подтверждение предполагаемого механизма биосинтеза норвалина и норлейцина

Для подтверждения предполагаемого механизма биосинтеза неканонических аминокислот мы изучили влияние различных факторов на накопление норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH (Табл. 12). Из представленных данных видно, что добавление лейцина в среду культивирования предотвращало образование неканонических аминокислот вследствие ингибирования активности IPMS и репрессии leuABCD оперона. Аналогичный эффект наблюдался при добавлении валина в концентрации 500 мг/л, что обусловлено увеличением уровня 2-кетоизовалерата в клетке. Введение в штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH плазмиды pMIV-P_ilvIH-ilvIH, несущей гены AHAS III, восстанавливало утилизацию 2-кетобутирата и также предотвращало образование норвалина и норлейцина. Можно видеть, что амплификация лейцинового оперона дикого типа путем введения в штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH плазмиды pBR-leuABCD (любезно предоставлена Сливинской Е.А., ЗАО “АГРИ”) приводила к двукратному увеличению уровня накопления норлейцина. Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы в данном случае составил около 8%.

Таблица 12. Продукция норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH и его производными

* Клетки растили в среде, содержащей 6% глюкозы, изолейцин добавляли до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л, лейцин - 100 мг/л;

** Валин добавляли до конечной концентрации 500 мг/л.

Интересно отметить, что делеция гена ilvA, блокирующая образование 2-кетобутирата из треонина, не оказывала существенного влияния на накопление норвалина и норлейцина. Это указывает на то, что, в отсутствие треониндезаминазы, 2-кетобутират синтезируется не из треонина, а из пирувата ферментами биосинтеза лейцина (Рис. 13). Такой альтернативный путь образования 2-кетобутирата используется в некоторых организмах для треонин-независимого биосинтеза изолейцина [Howell et al., 1999, Xu et al., 2004].

Таким образом, полученные результаты согласуются с предложенной Кисуми схемой биосинтеза неканонических аминокислот.

Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками E. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Для дополнительного доказательства того, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, мы изучили образование этих аминокислот из 2-кетобутирата покоящимися клетками штаммов с различным уровнем экспрессии leuABCD оперона: штамма B7 - с опероном leuABCD дикого типа; штаммов с усиленной экспрессией leuABCD оперона - B7 cat-P_L-leuABCD, содержащем лейциновый оперон под контролем P_L промотора фага , и B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD, в котором ген leuA^G479C, кодирующий IPMS, устойчивую к ретроингибированию, а также остальные гены биосинтеза лейцина находились под контролем P_L промотора фага ; и штамма B7leuA, в котором ген leuA был делетирован (Табл. 13). Об уровне экспрессии leuABCD оперона судили по уровню активности IPMS.

Таблица 13. Образование норвалина (Nva) и норлейцина (Nle) покоящимися клетками E. coli с различным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Результаты проведенного опыта показали, что покоящиеся клетки штамма дикого типа накапливали норвалин только в присутствии экзогенного 2-кетобутирата, а делеция гена leuA блокировала образование норвалина. Наибольший уровень синтеза норвалина и норлейцина наблюдался для клеток штаммов с высоким уровнем активности IPMS, в особенности для штамма B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD c IPMS устойчивой к ретроингибированию. Необходимо отметить, что покоящиеся клетки штаммов B7 cat-P_L-leuABCD и B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD накапливали норвалин и норлейцин даже в отсутствие 2-кетобутирата, что можно объяснить их образованием из внутриклеточного пирувата.

Кроме того, как видно из Таблицы 13, покоящиеся клетки штаммов, имеющих функционально активные AHASы, при добавлении 2-кетобутирата предпочтительнее накапливают норвалин, тогда как в клетках штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH с блокированной функцией AHAS преимущественно образуется норлейцин (Табл. 10). Возможно, это связано с тем, что в клетках, имеющих функционально активные AHASы, уровень 2-кетоизовалериата выше, чем в клетках штамма, дефектного по AHAS, при добавлении валина в концентрации 100 мг/л. Поэтому 2-кетовалерат преимущественно вступает в реакцию аминирования с образованием норвалина, а не взаимодействует с IPMS, что приводит к образованию норлейцина.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что норвалин и норлейцин у E. coli действительно образуются из 2-кетобутирата в пути биосинтеза лейцина. Синтез этих неканонических аминокислот штаммом E. coli с блокированой функциией синтаз ацетогидроксикислот обусловлен увеличением уровня 2-кетобутирата в клетке, что в условиях дерепрессии лейцинового оперона приводит к утилизации 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков семейства изопропилмалатсиназ

К настоящему времени в базе данных Pfam [http://pfam.sanger.ac.uk] имеются сведения об аминокислотных последовательностях 742 ферментов, относящихся к семейству изопропилмалатсинтаз. Единственным ферментом этого семейства, для которого был выполнен рентгеноструктурный анализ (РСА) является IPMS M. tuberculosis [Koon et al., 2004]. На основании данных РСА для данного фермента была установлена трехмерная структура и определены аминокислотные остатки, которые участвуют в формировании активного центра и сайта связывания лейцина. Биохимические свойства IPMS E. coli к настоящему времени не изучены, однако известно, что фермент имеет высокую степень гомологии с IMPS Salmonella thyphimurium (E-value 3e-180, идентичность - 92%, программа protein-protein BLAST), которая может использовать в качестве альтернативных субстратов 2-кетобутират и пируват in vitro [Kahlhaw et al., 1969].

Сравнение аминокислотных последовательностей IPMS M. tuberculosis, E. coli и S. thyphimurium показало, что, несмотря на низкую степень гомологии ферментов (E-value 9e-19, идентичность - 28%, программа PSI-BLAST), аминокислотные остатки, которые, по данным РСА, взаимодействуют с 2-кетоизовалериатом в центре связывания субстрата - Arg-80, Asp-81, Glu-218, Thr-254, His-285, His-287, His-379 и Tyr-410 [Koon et al., 2004], у данных микроорганизмов идентичны (Рис. 14). Следует отметить, что, по данным РСА, консервативные аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра, не взаимодействуют с ²-CH₃-группой молекулы 2-кетоизовалерата. Эта особенность, очевидно, объясняет широкую субстратную специфичность фермента.

Интересно отметить, что консервативные аминокислотные остатки регуляторного домена IPMS M. tuberculosis - Tyr-554, Ala-558 и Ala-565 (Рис. 14), взаимодействуют с -CH₃-группами молекулы лейцина [Koon et al., 2004]. Такое строение регуляторного центра IPMS обусловливает специфичность фермента в отношении ингибирования лейцином и неспособность близких по структуре разветвленных аминокислот, а также неканонических аминокислот норвалина и норлейцина, ингибировать его активность.

Таким образом, учитывая консервативное строение центра связывания кетокислоты у изопропилмалатсинтаз, можно предположить, что IPMS E. coli, подобно IPMS S. thyphimurium, имеет широкую субстратную специфичность и может использовать 2-кетобутират и пируват в качестве акцепторов ацетильной группы.

Рис. 14. Выравнивание аминокислотных последовательностей IPMS E. coli, S. thyphimurium и M. tuberculosis (программа ClustalW). Нумерация остатков дана по последовательности IPMS M. tuberculosis. Аминокислотные остатки, участвующие в образовании активного центра, выделены жирным шрифтом и серым цветом. Аминокислотные остатки, входящие в регуляторный центр, выделены серым цветом.

Для того чтобы выяснить, является ли образование неканонических аминокислот общим свойством других огранизмов, способных к синтезу лейцина, мы провели сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 57 бактериальных белков семейства IPMS. Эти белки были выбраны по базе данных Pfam по наличию двух функциональных доменов: C-концевого регуляторного LeuA-домена и N-концевого HGML-подобного каталитического домена, по принципу максимального удаления друг от друга на филогенетическом дереве. С целью оценки консервативности положения аминокислотных остатков в полипептидной цепи с помощью программы BioEdit был проведен расчет энтропии Шеннона для этих белков. Данный подход широко применяется при поиске каталитически важных остатков активного центра на основе анализа аминокислотных последовательностей ферментов [Sander et al., 1991].

Энтропия Шеннона для i-положения в аминокислотной последовательности (H_i) рассчитывается с использованием величины P_ij (вероятность встречи j-аминокислоты в этом положении):

H_i = -P_ijlnP_ij

^j

Для консервативных аминокислотных остатков значение H_i стремится к нулю. Таким образом, аминокислотные остатки в положениях, соответствующих значениям H_i, близким к нулю, являются консервативными для анализируемого семейства белков.

На Рис. 15 в графическом виде представлен расчет значений функции Шеннона для различных остатков в последовательностях 57 ферментов, принадлежащих к семейству изопропилмалатсинтаз. Нумерация аминокислотных остатков дана для IPMS Aspergillus fumigatus. Оказалось, что для 25 аминокислотных остатков энтропия Шеннона стремится к нулю, значит, они являются консервативными для анализируемых белков семейства IPMS. Среди консервативных аминокислот обнаружены остатки, которые, согласно данным РСА, взаимодействуют с кетокислотой в активном центре IPMS M. tuberculosis - Arg-80, Asp-81, Thr-254, His-285, His-287 и His-379. Кроме того, консервативными оказались аминокислотные остатки - Glu-317 и Arg-318, которые, по данным РСА, необходимы для связывания ацетил-КоА с ферментом [Koon et al., 2004]. Остальные консервативные остатки не участвуют в образовании активного центра и, по-видимому, обеспечивают стабильность третичной структуры белка.

Рис. 15. Значения величины энтропии Шеннона для различных аминокислотных остатков в последовательностях 57 белков семейства IPMS (программа BioEdit). Выделены остатки, входящие, по данным РСА, в активный центр IPMS M. tuberculosis. Для этих остатков указан номер в последовательности IPMS M. tuberculosis и в скобках приведены значения H_i.

Таким образом, сравнение аминокислотных последовательностей 57 ферментов семейства изопропилмалатсинтаз на основе величин энтропии Шеннона свидетельствует об аналогичной организации активного центра IPMS и остальных ферментов из этого семейства. В связи с этим, можно предположить, что образование норвалина и норлейцина может происходить не только у E. coli, но и в других организмах, у которых активный центр IPMS устроен подобным образом.

ВЫВОДЫ

1. Изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами ¹⁴C и ¹³C, в штамме E. coli ITP290-3 с контролируемой экспрессией устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазы. Обнаружено, что при сверхэкспрессии данного фермента в аэробных условиях в клетках E. coli происходит превращение 2-кетобутирата, образовавшегося из треонина, в пропионат и 2-аминобутират.

2. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

3. Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот E. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперонов ilvG603M и ilvBN E. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией.

4. Показано, что в клетках E. coli с блокированной функцией синтаз ацетогидроксикислот в условиях дерепрессии генов биосинтеза лейцина происходит утилизация 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, что приводит к образованию неканонических аминокислот норвалина и норлейцина.

5. Получен штамм E. coli, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы. Данный штамм можно рассматривать как потенциальный продуцент норвалина и норлейцина.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

1. Сычева Е.В., Стойнова Н.В., Саврасова Е.А., Козлов Ю.И., Бочаров Э.В., Соболь А.Г., Арсеньев А.С. “Аэробный катаболизм треонина в штамме Escherichia coli с биосинтетической треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию”. // Биотехнология. 2003. №4, стр. 22.

2. Сычева Е.В., Стойнова Н.В., Бочаров Э.В., Козлов Ю.И. “Новый путь аэробной деградации треонина в E. coli”. // Материалы 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2003, стр. 380.

3. Стойнова Н.В., Сычева Е.В., Преображенская Е.С., Новикова А.Е., Матросов Н.Г. “Способ получения непротеиногенных аминокислот с использованием бактерии семейств Enterobacteriaceae, в которой все синтазы ацетогидроксикислот инактивированы”. Патентная заявка РФ №2004127011 от 10.09.2004, дата приоритета 10.09.2004.

4. Сычева Е.В., Стойнова Н.В., Новикова А.Е., Матросов Н.Г. “Биосинтез норвалина и норлейцина в штамме E.coli, дефектном по AHAS”. // Материалы Международной школы-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология”, посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. Москва-Пущино, 2006, стр. 86.

5. Сычева Е.В., Ямпольская Т.А., Преображенская Е.С., Новикова А.Е., Матросов Н.Г., Стойнова Н.В. “Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками Escherichia coli”. // Микробиология. 2007. №6, стр. 1-8.

6. Сычева Е.В., Ямпольская Т.А., Новикова А.Е., Матросов Н.Г., Стойнова Н.В. “Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками E. coli”. // Материалы IV Международного конгресса “Биотехнология: состояние и перспективы развития”, Москва, 2007, стр. 100.

7. Сычева Е.В., Ямпольская Т.А., Новикова А.Е., Матросов Н.Г., Стойнова Н.В. “Изучение сверхсинтеза неканонических аминокислот клетками Escherichia coli”. Материалы 3-ей Международной конференции “Фундаментальные науки - медицине”. Новосибирск, 2007, стр. 177.

Размещено на Allbest.ru