Фармакогностичне дослідження видів роду Galium L. флори України

Перспективним для фітохімічних досліджень є рід Підмаренник - Galium L., родина Маренові - Rubiaceae Juss. У світовій флорі налічується близько 600 видів підмаренників, у флорі України - більше 40 видів.

Дослідження БАР роду Підмаренник носить несистематичний характер. За даними наукових першоджерел відомо, що у надземній частині підмаренників накопичуються іридоїди, кумарини, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, дубильні речовини, сапоніни; у кореневищах з коренями - антраценпохідні групи алізарину.

Підмаренники застосовують у народній медицині та гомеопатії як протизапальні, репаративні, в'яжучі та кровоспинні засоби; при захворюваннях печінки та нирок; нервових захворюваннях, які супроводжуються підвищеною збудливістю центральної нервової системи: істерія, епілепсія, конвульсії у дітей; проявляють гіпотензивну та протипухлинну активність; як антибактеріальні засоби при сепсисі; зовнішньо - при захворюваннях шкіри.

Широкий спектр БАР та застосування підмаренників у терапії багатьох патологій вказують на необхідність комплексного дослідження роду Galium L. з метою визначення видів, які можуть бути сировинними джерелами БАР.

Виходячи з цього, актуальним є фармакогностичне, морфолого- та хемотаксономічне, фітохімічне та фармакологічне дослідження видів роду Galium L. флори України та створення на їх основі субстанцій різної спрямованості фармакологічної дії.

Сировину заготовляли у фазу повного цвітіння на території Харківської, Івано-Франківської областей та АР Крим влітку 2007-2012 рр.

Встановлення видової тотожності зразків підмаренників проведено при консультативній допомозі кандидата біологічних наук, доцента кафедри ботаніки та екології рослин ХНУ ім. В.Н. Каразіна Ю. Г. Гамулі.

У таблицю-матрицю морфолого-таксономічного дослідження внесено 243 генеративні і вегетативні морфологічні ознаки та проаналізовано 7533 позитивні та негативні стани ознак; розраховано коефіцієнти парної та групової спорідненості, за якими побудовано дендрограму роду Підмаренник флори України за загальними морфологічними ознаками (рис.1).

Рис. 1 Дендрограма видів роду Підмаренник флори України за загальними морфологічними ознаками

Примітка: Platy - секція Platygalia DC.; Eugal - секція Eugalium DC.; Apar - секція Aparine; Leiog - секція Leiogalia DC.; Xanth - секція Xanthogalia DC.; Pseudoap - секція Pseudoaparine; Aspere - секція Aspere; Cru - секція Cruciatae DC.

Встановлено, що рід поділяється на 6 гілок або груп. В основі роду знаходяться 5 видів секції Eugalium DC., які створюють узагальнену характеристику роду, а саме: листки парні, по 4-6, приквіткові верхні листки поодинокі; суцвіття - вузька, видовжена, рихла волоть; квітконос голий, розгалужений, довший за приквіткові листки; квітконіжка гола, тонка; квітки двостатеві, віночок від 3,5 до 4 мм у діаметрі, чотирилопатевий, лопаті довго-загострені, яйцевидні або довгасті, тичинок 4, стовпчик двороздільний знизу; плоди 1-1,3 мм довжиною, зрідка від 1,5 до 2,5 мм.

Від основної гілки відходить друга гілка із 7 видів секції Platygalia DC. Третя гілка складається з 4 видів секції Leiogalia DC.; гілка сформована 4 видами секції Xanthogalia DC., яка через перехідний вид G. verticillatum (43) секції Aspere DC. розгалужується на 2 гілки - п'яту гілку з 4 видів секції Aparine DC. та шосту гілку з 4 видів секції Cruciatae DС., одного - з секції Platygalia і одного - секції Pseudoaparine. На підставі вивчення дендрограми стає очевидною таксономічна незалежність видів G. dasypodum (7) та G. salicifolium (8); G. verum (30) та G. ruthenicum (27); G. tomentellum (26) та G. glabratum (31), самостійність яких є дискусійною. В цілому побудована дендрограма відповідає сучасній філогенетиці роду.

Рис. 2 Дендрограма видів роду Підмаренник за хімічними ознаками

Примітка: Platy - секція Platygalia DC.; Eugal - секція Eugalium DC.;Apar - секція Aparine; Leiog - секція Leiogalia DC.; Xanth - секція Xanthogalia DC.; Pseudoap - секція Pseudoaparine

Хемотаксономічне дослідження проведено серед 9 видів роду, які належать до 6 секцій: секція Platygalia DC.: G. dasypodum (7), G. salicifolium (8); секція Eugalium DC.: G. carpaticum (11), G. pseudomollugo (13); секція Xanthogalia DC.: G. ruthenicum (27), G. verum (30); секція Leiogalia DC.: G. uliginosum (37); секція Aparine DC.: G. aparine (38); секція Pseudoaparine Lange.: G. tenuissimum (42).

Як маркери використовували фенольні сполуки і терпеноїди.

Проаналізовано 1278 позитивних та негативних станів хімічних ознак. Побудована дендрограма видів роду Підмаренник за хімічними ознаками показує розділення континууму на 2 незалежні гілки (групи) (рис. 2).

Хімічний профіль роду характеризується наявністю дигідроактинідіоліду, гіперозиду, гексагідрофарнезилацетона, рутину, сквалена, які виявлені у 8 видах. Розділення роду на 2 групи за хімічними ознаками пояснюється особливостями терпеноїдного складу сировини: група, яку утворено G. dasypodum (7), G. salicifolium (8); G. carpaticum (11), G. verum (30) і G. aparine (38), характеризується наявністю ліналоолу, гераніолу, б- та г-терпінену, 1,8-цинеолу, борнеолу, б- та в-пінену, карену, п-цимену та евгенолу. Гідроксикоричні кислоти 3-п-кумароїлхінна та 5-п-кумароїлхінна виявлені у 6 видах. Для кореневищ з коренями характерні антраценпохідні: рубіадин, луцидин та луцидин-3-О-в-примверозид. Кваліфікаційними (зустрічаються у двох видах досліджуваного континууму) хемо-ознаками роду є кислоти: кофейна, ферулова і неохлорогенова, скополетин, ксантопурпурин, 2-метилалізарин, луцидин-3-О-в-глюкопіранозид, 1-гідрокси-2-метилантрахінон, 2,2-диметилнафто[1,2-в]піран, 1-метилалізарин, лютеолін-7-арабінозилглюкозидо-4'-глюкозид, мірцен, цис- і транс-ліналоолоксид, сабінен, б-фарнезен, неролідол, фітилацетат, 5,6-епокси-в-іонон та п-цимен-б-ол.

На основі результатів морфолого- та хемотаксономічного вивчення, враховуючи розповсюдженість видів на території України, для комплексного дослідження вибрано 5 видів роду Підмаренник: п. справжній, п. верболистий, п. пухнастоногий, п. карпатський та п. несправжньом'який. Для подальшої стандартизації сировини визначено анатомо-діагностичні ознаки 5 перспективних видів (табл. 1).

Таблиця 1

Порівняльна характеристика основних анатомо-діагностичних ознак трави досліджуваних видів підмаренників

У досліджуваних об'єктах ідентифіковано амінокислоти, карбонові кислоти, гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди, окиснювані поліфеноли, іридоїди, сапоніни, хлорофіли, каротиноїди.

Розділ 3. Визначення вмісту біологічно активних сполук у траві досліджуваних видів підмаренників та встановлення основних показників якості сировини. Виділення та ідентифікація індивідуальних БАР. Встановлено вміст БАР первинного та вторинного метаболізму в траві підмаренника справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого, п. карпатського та п. несправжньом'якого. Ідентифіковано та визначено вміст 6 макро- та 9 мікроелементів. Встановлено, що сировина відповідає вимогам ДФУ щодо вмісту важких металів. Титриметричними методами визначено вміст кислоти аскорбінової, органічних кислот у перерахунку на кислоту яблучну та окиснюваних поліфенолів. Методом абсорбційної спектрофотометрії визначено вміст гідроксикоричних кислот у перерахунку на кислоту хлорогенову (л=525 нм, за ДФУ, 1.3) та флавоноїдів (для трави п. карпатського - у перерахунку на цинарозид (л=390 нм), для інших видів - у перерахунку на рутин (л=405 нм). Методом ВЕРХ ідентифіковано та встановлено вміст 22 амінокислот, з них 9 - незамінних; вперше методом хромато-мас-спектрометрії досліджено компонентний склад ефірних олій сировини (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст основних БАР у досліджуваних видах підмаренників

Примітка: трава 1 - п. справжнього; 2 - п. верболистого; 3 - п. пухнастоногого; 4 - п. карпатського; 5 - п. несправжньом'якого

У ефірній олії досліджуваних видів ідентифіковано та визначено вміст 161 сполуки, які представлені ароматичними сполуками, терпеноїдами (монотерпеноїди, сесквітерпеноїди, дитерпеноїди, тритерпеноїди), стероїдними та гетероциклічними сполуками, вищими аліфатичними вуглеводнями та їх похідними, жирними кислотами та їх похідними. Найвищій вміст терпеноїдів та ароматичних сполук встановлено у надземній частині п. справжнього (7200,26 мг/кг та 2962,00 мг/кг, відповідно) та п. верболистого (4057,00 мг/кг і 215,2 мг/кг, відповідно); найменший - у траві п. пухнастоногого (9,7 мг/кг та 2,6 мг/кг, відповідно). Стероїдні сполуки кампестерол та г-ситостерол ідентифіковано тільки в ефірній олії трави п. пухнастоногого (4,77 мг/кг), що уособлює цей вид. Терпеноїди ліналоол, борнеол, б-терпінеол, в-іонон, сквален та гексагідрофарнезилацетон є найбільш поширеними компонентами ефірних олій досліджуваних видів підмаренників. За допомогою хроматографічних методів аналізу - ПХ, ТШХ, препаративної хроматографії з трави досліджуваних видів підмаренників виділено 14 речовин - 7 флавоноїдів, 4 гідроксикоричні кислоти, 2 кумарини та 1 іридоїд (табл. 3).

Таблиця 3

Фізико-хімічні характеристики деяких БАР, виділених з досліджуваних об'єктів

Примітки: 1 - етилацетат Р - кислота мурашина безводна Р - вода Р (10:2:3); 2 - розчин 150мл/л кислоти оцтової Р; 3 - хлороформ Р (після попереднього імпрегнування хроматограми сумішшю формамід Р - спирт 96 % (1:3)

Методом ВЕРХ досліджено фенольні сполуки трави п. справжнього, п. пухнастоногого та п. карпатського; хромато-мас-спектрометричним методом у траві п. справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого та п. карпатського досліджено ароматичні та фенолкарбонові кислоти.

Вперше з трави п. справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого, п. карпатського та п. несправжньом'якого виділено та ідентифіковано апігенін та лютеолін; з трави п. верболистого, п. пухнастоногого, п. карпатського та п. несправжньом'якого - умбеліферон; з трави п. справжнього і п. верболистого - кемпферол; з трави п. справжнього, п. пухнастоногого і п. несправжньом'якого - кверцетин; з трави п. несправжньом'якого - скополетин. З трави п. справжнього вперше виділено та ідентифіковано кислоту неохлорогенову, лютеолін-7-О-диглюкозид, ізокверцитрин; з трави п. верболистого - кофейну та неохлорогенову кислоти, кверцитрин та ізокверцитрин; з трави п. пухнастоногого - ферулову та неохлорогенову кислоти, кверцитрин та ізокверцитрин; з трави п. карпатського - кислоту ферулову, лютеолін, цинарозид, лютеолін-7-О-галактозид, кверцитрин, ізокверцитрин та рутин; з трави п. несправжньом'якого - кофейну та ферулову кислоти, кверцитрин; з трави 4 видів: п. справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого та п. карпатського - бензойну, фенілоцтову та ванілінову кислоти; з трави п. верболистого, п. пухнастоногого та п. карпатського - кислоту саліцилову.

Апігенін, лютеолін-7-О-галактозид, бензойна та фенілоцтова кислоти не були описані для роду Підмаренник у доступних для нас наукових джерелах.

З трави п. справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого, п. карпатського та п. несправжньом'якого виділено та ідентифіковано 21 речовину - 1 ароматичну та 3 фенолкарбонові кислоти, 4 гідроксикоричні кислоти, 2 кумарини, 10 флавоноїдів, 1 іридоїд.

Враховуючи обмежений ареал розповсюдження п. карпатського (ендем Східних Карпат), неоднозначність поглядів систематиків на таксономічну незалежність п. несправжньом'якого та вміст БАР, для подальшого дослідження нами було вибрано 3 види - п. справжній, п. верболистний та п. пухнастоногий.

Розділ 4. Розробка технологічних параметрів одержання субстанцій з рослинної сировини. Дослідження їх компонентного складу та визначення основних показників якості. Розробка проектів методик контролю якості рослинної сировини та субстанцій. Розроблено технологічні схеми одержання ліпофільних комплексів трави п. справжнього - «Галофілін», вихід 3,09%, трави п. верболистого - «Вербенол», вихід 4,52% та трави п. пухнастоногого - «Галіканд», вихід 6,89%. Розроблено технологію одержання фенольних комплексів (екстрагент етилацетат - 96% спирт) з попередньо знежиреної трави п. справжнього - «Галіверин», вихід 14,90%, п. верболистого - «Феносаліцин», вихід 6,84% та п. пухнастоногого - «А-фунг», вихід 7,00%.

Вміст основних БАР у ліпофільних та фенольних комплексах, одержаних за розробленими технологіями, наведено у табл. 4 та 5, відповідно.

Розрахунок суми хлорофілів у ліпофільних комплексах проводили за рівнянням Вінтерманс та Де Мотс (використовуючи коефіцієнти перерахунку на хлорофіли а і b); каротиноїдів - за рівнянням Веттштейна (у перерахунку на в-каротин); у фенольних комплексах вміст гідроксикоричних кислот визначали у перерахунку на кислоту хлорогенову (л=525 нм); флавоноїдів - для комплексу «А-фунг» у перерахунку на кверцетин (л=420 нм), для інших фенольних комплексів - на рутин (л=405 нм).

Таблиця 4

Вміст основних БАР у ліпофільних комплексах

Таблиця 5

Вміст основних БАР у фенольних комплексах

Розроблено технологічні параметри одержання екстракту сухого «ВСС-Т», вихід - 13,93% та очищеного поліфенольного комплексу - екстракт сухий
«ОПК-Т» (вихід - 15,09%) трави підмаренника справжнього. Методом абсорбційної спектрофотометрії визначено вміст гідроксикоричних кислот у перерахунку на кислоту хлорогенову (л=525 нм) та флавоноїдів у перерахунку на рутин (л=405 нм). У екстракті «ВСС-Т» вміст гідроксикоричних кислот - 10,12±0,35%, флавоноїдів - 3,77±0,11%; у екстракті «ОПК-Т» - 9,93±0,32% та 3,54±0,12%, відповідно.

За результатами морфологічних, анатомо-діагностичних та фітохімічних досліджень розроблено проект МКЯ «Підмаренника справжнього трава».

Згідно вимог ДФУ нами рекомендовано стандартизувати сировину за морфолого-анатомічними ознаками, результатами ТШХ, показниками втрати в масі при висушуванні, загальної золи, вмісту домішок і, оскільки, трава п. справжнього позиціонується як сировина для одержання гепатопротекторних засобів - за вмістом гідроксикоричних кислот та флавоноїдів.

Розроблено проекти МКЯ «Підмаренника справжнього трави екстракт сухий «ВСС-Т»», «Підмаренника справжнього трави екстракт сухий «ОПК-Т».

Субстанції нами запропоновано стандартизувати за розчинністю, результатами ТШХ, показниками втрати в масі при висушуванні, загальної золи, вмісту домішок і за вмістом гідроксикоричних кислот та флавоноїдів.

Розділ. 5. Фармакологічне вивчення субстанцій. Дослідження антимікробної, протигрибкової активності, гострої та субхронічної токсичності комплексів «Галофілін», «Вербенол», «Галіканд», «Галіверин», «Феносаліцин» та «А-фунг» проведено на базі ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України» у лабораторії біохімії мікроорганізмів та поживних середовищ при консультативній допомозі наукового співробітника Н. В. Кашпур. Дослідження антимікробної та протигрибкової активності проводили методом дифузії в агар (метод «колодязів»). Комплекси використовували у вигляді 5%-вих розчинів спиртових 96%. Рівень антибактеріальної та протигрибкової активності комплексів оцінювали за діаметром затримки зон росту мікроорганізмів (мм). Відповідно до рекомендацій ВООЗ для оцінки активності комплексів використовували тест-штами Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Proteus vulgaris ATCC 4636, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Bacillus subtilis АТСС 6633, Candida albicans АТСС 885/653 (табл. 6). Визначено ступені цих видів активності.

Встановлено, що тест-штам S. aureus є високочутливим до досліджуваних комплексів. Високу чутливість до комплексів «Галіканд» та «А-фунг» проявили штами P. vulgaris та C. albicans; до екстракту «Галофілін» високочутливим є штам B. subtilis.

Таблиця 6

Антимікробна та протигрибкова активність ліпофільних та фенольних комплексів

Примітка: * - затримка росту мікроорганізмів відсутня

Вивчено протигрибкову активність комплексів по відношенню до 10 штамів грибів роду Candida та 7 тест-штамів грибів, які не належать до роду Candida.

Виражену антифунгальну активність по відношенню до грибів роду Candida проявляють комплекси трави підмаренника пухнастоногого «Галіканд» та «А-фунг».

До комплексу «Галіканд» тест-культури грибів роду Candida є достатньо- та високочутливими - діаметри зон затримки росту становлять від 24 до 33 мм; чутливість досліджуваних штамів до комплексу «А-фунг» варіює - діаметри зон затримки росту знаходяться в межах від 15 до 33 мм.

Визначено кореляційні зв'язки між вмістом основних БАР у комплексах та рівнем їх антимікробної і протигрибкової активності. Кореляцію між вмістом основних БАР у ліпофільних комплексах «Галофілін», «Вербенол», «Галіканд» та рівнем їх протигрибкової активності по відношенню до грибів роду Candida представлено на рис. 3.

Рис. 3 Кореляція між вмістом основних БАР у комплексах «Галофілін», «Вербенол», «Галіканд» та рівнем їх протигрибкової активності по відношенню до грибів роду Candida

Отримані результати свідчать про те, що антифунгальна активність ліпофільних комплексів вірогідно обумовлена сумою терпенових сполук та жирних кислот.

Кореляцію між вмістом основних БАР у фенольних комплексах «Галіверин», «Феносаліцин» та «А-фунг» і рівнем їх антимікробної та протигрибкової активності наведено на рис. 4.

Рис. 4 Кореляція між вмістом основних БАР у комплексах «Галіверин», «Феносаліцин» та «А-фунг» і рівнем їх антимікробної та протигрибкової активності

Встановлені коефіцієнти кореляції вказують на те, антимікробна активність фенольних комплексів може бути обумовлена сумою фенольних сполук; протигрибкова - вмістом аліфатичних спиртів, терпенових спиртів, стероїдних спиртів, жирних кислот та сумою спиртів.

За результатами вивчення гострої токсичності субстанцій встановлено, що ліпофільні та фенольні комплекси відносяться до VI класу токсичності - відносно нешкідливі речовини.

Вперше досліджено гепатопротекторну активність екстрактів сухих
«ВСС-Т» та «ОПК-Т» трави підмаренника справжнього. Дослідження проводились на базі ІФМУ при консультативній допомозі професора А. О. Клименка та доцента В. М. Іваночко. Встановлено, що екстракти сухі при гострому токсичному тетрахлорометановому ураженні печінки проявляють гепатопротекторну активність, яка практично не поступається препарату порівняння «Силібор». Активність екстракту «ОПК-Т» перевищує гепатопротекторну активність екстракту «ВСС-Т».

Вивчення гострої токсичності екстрактів сухих «ВСС-Т» та «ОПК-Т» проведено на базі ІФНМУ при консультативній допомозі професора А. О. Клименка та професора Я. С. Гудивок. Екстракти «ВСС-Т» та «ОПК-Т» належать до V класу токсичності - практично нетоксичні речовини.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та практичне вирішення наукової задачі, яка полягає у пошуку нових джерел БАР серед представників роду Підмаренник - Galium L. флори України шляхом комплексного фармакогностичного дослідження.

За результатами морфолого-таксономічного дослідження 31 виду та хемотаксономічного дослідження 9 видів роду Підмаренник флори України вирішено ряд дискусійних питань у систематиці роду та встановлено перспективні види як джерела БАР. Досліджено БАР у сировині 5 видів; з трави п. справжнього, п. верболистого та п. пухнастоногого отримано ліпофільні та фенольні комплекси, з трави п. справжнього отримано екстракт сухий та очищений поліфенольний комплекс; встановлено антибактеріальну та протигрибкову активність ліпофільних та фенольних комплексів, досліджено гепатопротекторну активність екстракту сухого та очищеного поліфенольного комплексу трави п. справжнього; розроблено проекти МКЯ трави п. справжнього та субстанцій з трави п. справжнього.

1. На основі нумеричних методів таксономії з використанням програмного забезпечення Excel проведено морфолого-таксономічне дослідження 31 виду підмаренників - проаналізовано 7533 позитивні та негативні стани вегетативних та генеративних ознак; проведено хемотаксономічне дослідження 9 видів - проаналізовано 1278 позитивних та негативних станів хімічних ознак, як маркери використовували фенольні сполуки та терпеноїди. За результатами морфолого- та хемотаксономічного дослідження встановлено ієрархічну підпорядкованість видів роду Підмаренник флори України; підтверджено самостійність дискусійних таксонів - G. dasypodum Klokov та G. salicifolium Klokov; G. verum L. та G. ruthenicum Willd.; G. tomentellum Klokov та G. glabratum Klokov; визначено перспективні види.

2. Вперше у траві 5 видів роду Підмаренник ідентифіковано та визначено вміст 22 амінокислот, 43 карбонових кислот, 6 макро- та 9 мікроелементів. Вивчено компонентний склад ефірних олій - ідентифіковано та встановлено вміст 161 компоненту. Встановлено вміст кислоти аскорбінової, органічних кислот, окиснюваних поліфенолів; гідроксикоричних кислот, флавоноїдів; визначено суму хлорофілів та каротиноїдів.

3. Встановлено анатомо-діагностичні ознаки трави підмаренника справжнього, п. верболистого, п. пухнастоногого, п. карпатського та п. несправжньом'якого.