Молекулярно-генетична та функціональна характеристика мембранних транспортерів, залучених до регуляції соле- і посухостійкості у рослин та детоксифікації арсену

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. На відміну від тварин, рослинні організми не мають здатності рухатися і таким чином уникати несприятливих умов для існування. У природі рослини постійно зазнають дії стресових факторів навколишнього середовища. Вплив різноманітних абіотичних стресів може негативно впливати та суттєво пригнічувати ріст, розвиток та продуктивність рослин. Головними чинниками таких типів стресів є засолення, посуха, вплив важких металів та металоїдів. Усі ці вищезазначені стресові чинники є надзвичайно важливою проблемою для сільського господарства, бо можуть суттєво знижувати врожаї сільськогосподарських рослин у всьому світі. Окрім того, близько 1 млрд. людей Землі страждають від недостатнього вмісту білків, вуглеводів та жирів у своєму харчуванні. Ще 1 млрд. населення планети зазнає негативного впливу через дефіцит важливих мінеральних елементів у повсякденному раціоні та забруднення їжі токсичними сполуками внаслідок діяльності людини чи природних факторів. Слід зазначити, що глобальні потреби людства у продуктах харчування зростуть на 40% до 2030 р. Тому існує велика потреба світового сільського господарства та інших галузей економіки у покращенні солестійкості та посухостійкості рослин, їхнього мінерального складу, мінімізації накопичення токсичних сполук у тканинах за допомогою молекулярної селекції, редагування геному чи інших геномних технологій для подальшого використання цих агрокультур на деградованих чи непридатних для землеробства ґрунтах (Rockstrцm et al., 2009; Connor, 2008; Conway, 2012).

Ріст та розвиток рослин, як і продуктивність рослинництва, залежать від багатьох факторів, але головними із них є наявність водних ресурсів та неорганічних елементів живлення, низький рівень засолення та відсутність важких металів і металоїдів (Foley et al., 2011; Mueller et al., 2012; Сampbell et al., 2013; Van Hoorn et al., 2006). Транспортні протеїни, або транспортери, розташовані в мембранах клітинних структур, є одними з головних детермінантів для подальшого використання у покращенні водного та мінерального балансів рослин. Цей важливий тип білків відповідає не тільки за транспорт поживних речовин та посухостійкість рослин, а і бере участь у забезпеченні ширшого спектру фізіологічних функцій. Слід зазначити, що мембранні транспортні протеїни виконують важливі функції у механізмах стійкості рослин до дії багатьох типів абіотичного стресу, а саме надмірного засолення ґрунтів і забруднення токсичними мінеральними сполуками. Варто додати, що у зв'язку з глобальними змінами клімату збільшення тривалості та кількості періодів посухи буде неупинно зростати разом з виснаженням водних ресурсів багатьох регіонів світу та навіть Східної Європи (Сampbell et al., 2013). Продуктивність сільського господарства в умовах надмірного засолення, посухи та забруднення токсичними сполуками може бути потенційно збільшена за рахунок використання мембранних транспортерів у технологіях створення нових сільськогосподарських культур з підвищеними показниками стійкості до вищезазначених стресів.

Людська діяльність та природні процеси вивільнення токсичного металоїду арсену внаслідок ерозії спричиняють накопичення останнього у воді та ґрунті, що призводить до акумулювання цього елемента у рослинах та споживання його з продуктами харчування рослинного походження (Finnegan et al., 2012). Мембранні транспортери активно залучені у процеси поглинання та транспорту цього металоїду в рослинах. Тому вивчення транспорту арсену та ідентифікація ключових транспортерів цього процесу є надзвичайно важливим для подальшого запобігання накопичення та вивільнення цього токсичного елемента з рослинних тканин чи фіторемедіаційних заходів.

Розуміння процесів поглинання, перерозподілу та накопичення у рослинному організмі головних моновалентних іонів та металоїдів, а саме Na+ та К+, сполук арсену, є важливою складовою для з'ясування механізмів підтримання іонного гомеостазу, соле- та посухостійкості рослин, виведення токсичних сполук, мінімізації навантаження мінеральних добрив на ґрунти. Тому вивчення молекулярної природи цих процесів та функцій ключових мембранних транспортних протеїнів дасть змогу суттєво розширити та доповнити існуючі уявлення про мінеральний транспорт, механізми регуляції сольового та осмотичного стресів, підтримки іонного гомеостазу та інших важливих метаболічних і фізіологічних процесів у рослинах.

Зв'язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у Державній установі «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» у відділах геноміки та молекулярної біотехнології та рослинних харчових продуктів та біофортифікації у період з 2006р. по 2015р. у рамках бюджетної теми «Вивчення молекулярно-генетичних та клітинних механізмів стійкості рослин до абіотичних та біотичних факторів для покращення їхніх адаптивних властивостей до несприятливих умов навколишнього середовища» (2012-16 р.р., номер держреєстрації 0112U001597), проекту «Вивчення молекулярно-клітинних основ транспорту мінеральних сполук до різних типів клітинних вакуолей» цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій» (2010-14 р.р., № 0110U004663) та проекту «Вивчення ролі та молекулярно-клітинної природи мембранних калієвих каналів з ячменю та рису в процесах підтримки мінерального гомеостазу, осмотичного шоку та водного стресу» цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України «Молекулярні та клітинні біотехнології для потреб медицини, промисловості та сільського господарства» (2015-20 р.р., № 0115U005200).

Мета та завдання дослідженнь. Метою роботи було провести молекулярно-генетичний аналіз та здійснити функціональну характеристику мембранних транспортерів мінерального обміну та їхньої ролі у підтриманні осмотичного та іонного гомеостазу з метою підвищення посухо- та солестійкості рослин, а також у механізмах транспорту та детоксифікації сполук арсену.

1. Дослідити функціональні молекулярно-генетичні характеристики та фізіологічну роль мембранного транспортеру родини НКТ2;1 із ячменю у процесах солестійкості та перевірити гіпотезу підвищення солестійкості ячменю шляхом посилення накопичувального фенотипу цієї рослини;

2. Провести філогенетичний аналіз відомих та потенційних білків протонно-натрієвих обмінників родини NHX і з'ясувати функції деяких представників протонно-натрієвих обмінників родини NHX ячменю в умовах сольового стресу;

3. Здійснити кладистичний аналіз потенційних білків калієвих каналів родини ТРК рослинного походження та здійснити функціональну характеристику двопорового калієвого каналу родини ТРК - AtTPK1 з A. thaliana, а також з'ясувати його роль у регуляції гомеостазу калію, осмотичного шоку та інших фізіологічних процесах;

4. Охарактеризувати функції білків каналів родини ТРК рису - OsTPKa та OsTPKb, - встановити їхню роль для росту та розвитку рослин, зокрема в умовах сольового стресу, дефіциту води чи калію;

5. Встановити клітинну локалізацію каналів OsTPKa та OsTPKb рису та визначити, які елементи послідовності та структури ТРК-каналів із рису відповідають за органельну адресацію;

6. Здійснити експериментальну перевірку механізмів та шляхів внутрішньоклітинного транспорту білків OsTPKa та OsTPKb з ендоплазматичного ретикулюму до органел призначення;

7. Охарактеризувати клітинну локалізацію білків калієвих каналів родини ТРК з тютюну, а саме білків NtTPK1a та NtTPK1b;

8. З'ясувати деякі функціональні характеристики представників білків калієвих каналів родини ТРК з A. thaliana та рису шляхом комплементації мутантної лінії E. coli LB2003 з дефектами у системі поглинання калію;

9. Визначити ролі представників білкових транспортерів родини НКТ, ТРK та NHX у моделі транспорту моновалентних катіонів у рослинах;

10. Провести транскрипційне профілювання генів фосфатних транспортерів Medicago truncatula з метою з'ясування молекулярно-генетичних умов для транспорту сполук фосфору та арсену;

11. З'ясувати механізми транспорту сполук арсену у рослинах за допомогою аквапоринів підродини NIP та дослідити можливості використання гетерологічних мембранних систем видалення арсеніту ACR3 у рослинах для посилення стійкості до впливу цього металоїду.

Об'єкт дослідження: транспорт мінеральних сполук та As за допомогою мембранних транспортних білків та їхня роль у регуляції іонного та осмотичного гомеостазу, сольового стресу, фітотоксичних ефектів.

Предмет дослідження: молекулярна організація, функціональна спеціалізація, фізіологічна роль мембранних транспортних протеїнів рослин, а саме білків родин HKT, NHX, ТРК, PT та підродини NIP, в умовах сольового та осмотичного стресів, дефіциту калію та мембранної системи видалення арсеніту ScACR3 дріжджів в умовах дії сполук на основі арсену.

Методи дослідження: молекулярно-генетичні (виділення та електрофоретичний аналіз ДНК та РНК, отримання кДНК, ПЛР, ПЛР у реальному часі, макроарей-аналіз, клонування фрагментів ДНК, сайт-направлений мутагенез, створення генів химерних білків, рестрикційний гідроліз ДНК, секвенування, трансформація бактерій плазмідами, рекомбіназне клонування на основі Gateway системи, біотехнологічні (культивування рослин in vitro, створення генетичних конструкцій, генетична трансформація рослин, рослинних клітин, дріжджів і мутантів бактерій), біохімічні (визначення вмісту іонів та As за допомогою фотометрії у полум'ї та HPLC-ICP-MS), мікроскопічні (електронна та конфокальна мікроскопія), фізіологічні (оцінка кондуктивності продихів, відносний приріст рослин, виділення ксилемного соку), біоінформатичні (робота з базами даних, філогенетичний аналіз, комп'ютерний аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей, робота з різноманітними веб-ресурсами) та методи статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено функції білкового транспортеру ячменю HvHKT2;1. Встановлено, що цей транспортний протеїн відповідає і за транспорт іонів Na+, i за транспорт іонів К+. Продемонстровано його участь у механізмах солестійкості рослин шляхом завантаження ксилемного соку Na+ та ретранслокації цих іонів із коренів до тканин пагонів.

Відповідно до результатів кладистичного аналізу вперше показано появу нової клади для NHX-транспортерів, до якої належить AtNHX3.

Вперше проведено функціональну характеристику білка вакуолярного калієвого каналу AtTPK1. З'ясовано роль цього каналу у транспорті іонів К+ між вакуолями та цитоплазмою. Продемонстровано участь цього транспортного білка в процесах регуляції осмотичного шоку, русі продихових клітин, проростанні насіння та підтримці гомеостазу К+.

Вперше клоновано, охарактеризовано та визначено клітинну локалізацію білків каналів родини ТРК, а саме білків OsTPKa та OsTPKb. Вперше показано різну вакуолярну спеціалізацію рисових білків калієвих каналів родини ТРК, а саме OsTPKa та OsTPKb. Вперше знайдено канал родини ТРК, а саме OsTPKb, що локалізується у тонопласті протеїнових вакуоль. Також з'ясовано механізми різної вакуолярної адресації для цих мембранних транспортних білків. Встановлено амінокислотні послідовності у C-кінці білка OsTPKb, що відповідають за його локалізацію у тонопласті протеїнових вакуоль. Продемонстровано роль білків OsTPKa та OsTPKb у підтримці калієвого гомеостазу рослин, сольовому та осмотичному стресах. Показано важливу роль білка OsTPKb у процесах формування насіння та індивідуального розвитку рослини. Вперше продемонстровано можливість доставки білків OsTPKb до протеїнової вакуолі без залучення апарату Гольджі.

З'ясовано здатність деяких інших представників білків калієвих каналів з A. thaliana, а саме білків AtTPK2, AtTPK3, AtTPK5, проводити іони К+ шляхом експресії генів вищезгаданих каналів у мутантній лінії кишкової палички LB2003, де відсутні системи транспорту К+. Виявлено різницю у клітинній локалізації двох представників білків каналів родини ТРК тютюну NtTPK1a та NtTPK1b. Проведено узагальнення та кладистичний аналіз усіх потенційних білків родини ТРК рослинного походження.

Вперше досліджено роль аквапоринів родини NIP у транспорті арсену. Ідентифікований нами аквапорин AtNIP7;1 є першим рослинним транспортним протеїном, що демонструє здатність транспорту сполук арсену у тривалентній формі рослинами A. thaliana. Вперше застосовано підхід експресії гетерологічного гена, що кодує систему видалення арсену у дріжджів, для зменшення накопичення та виведення цього токсичного металоїду з рослин.

У результаті теоретичного узагальнення експериментальних досліджень запропоновано модель внутрішньоклітинного транспорту та органельної адресації двопорових калієвих каналів. Окрім того, була запропонована модель транспорту іонів Na+/K+ у рослинах за участі мембранних транспортних протеїнів, зокрема родини HKT, TPK, NHX. На основі наших експериментальних досліджень значно доповнена та розвинена модель транспорту сполук на основі As у рослинах.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть використовуватись для проведення подальших досліджень процесів мінерального живлення, механізмів соле- та посухостійкості, з'ясування механізмів транспорту та міграції сполук арсену чи інших токсичних елементів у рослинах. Запропонований алгоритм та дизайн експериментів може бути використаний і для інших напрямків дослідження молекулярної природи механізмів транспорту мінеральних елементів, металоїдів та інших сполук, метаболізму та формування адаптивних відповідей і у рослинах, і в інших типах живих організмів.

Результати досліджень уже застосовуються у навчальному процесі у спецкурсі для студентів 1 року магістратури «Внутрішньоклітинний транспорт та секреція» та можуть бути використані при розробці курсів лекцій для підготовки фахівців із клітинної біології, генетичної інженерії, генетики та геноміки, фізіології і біохімії рослин та у агрономії.

Отримані результати та запропоновані у роботі підходи будуть корисними для біотехнологічного покращення рослин шляхом генетичної інженерії чи редагування їхніх геномів. Також вони мають наукову і практичну цінність для молекулярної селекції рослинних культур з низьким вмістом арсену, покращеними показниками посухо- і солестійкості та рівня калію. Результати роботи та застосовані принципи можна використовувати для фіторемедіації та рекультивації земель, а також біофортифікації продуктів харчування.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є завершеною науковою працею, що була виконана відповідно до розроблених автором теоретичних напрацювань та практичних підходів. Здобувач самостійно розробив концепцію дисертаційної роботи. Постановку наукових завдань дисертаційної роботи, подальшу інтерпретацію отриманих даних було здійснено безпосередньо автором роботи. Здобувачем самостійно проведено обробку літературних джерел, розроблено структуру дисертації, зроблено та оформлено рисунки і таблиці. Автор сформулював головні положення та висновки, викладені у дисертації. Основна частина роботи була виконана безпосередньо здобувачем. У цілому у проведенні досліджень та аналізі й узагальненні результатів частка автора складає близько 85%. Під час проведення досліджень автор користувався консультаціями та практичною допомогою Франца Маатхауса (Йоркський університет, Великобританія), Жана-Чарльза Існера (Університет міста Бристоль, Великобританія), професора Едгара Пайтера (Університет Мартіна Лютера, Галле, Німеччина). При розробці структури та концепції дисертаційної роботи здобувач користувався консультаціями доктора біологічних наук, професора, академіка НАН України Ярослава Борисовича Блюма.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи були представлені на XIV Міжнародному семінарі з біології рослинних мембран (Валенсія, Іспанія, 2007), з'їзді наукових груп з дослідження транспорту в рослинах Товариства експериментальної біології (Манчестер, Великобританія, 2008), щорічному з'їзді Товариства експериментальної біології (Глазго, Великобританія, 2009), семінарі дослідницьких груп із вивчення зернових культур (Норвіч, Великобританія 2010), IX Європейському з'їзді з геноміки рослин (Стамбул, Туреччина, 2011), І конференції молодих вчених «Биология растений и биотехнология» (Біла Церква, 2011), III Міжнародному симпозіумі «Intracellular Signaling and Bioactive Molecular Design» (Львів, 2012), VII конференції Європейської організації науки про рослини (EPSO) (Порто Хелі, Греція, 2013), І науковій онлайн-конференції та ІІ конференції молодих вчених «Plant Biology and Biotechnology» (Київ, 2013), Міжнародному симпозіумі клітинної біології разом з IV Українським конгресом клітинної біології (Ужгород, 2014), X Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Чернівці, 2015).

1. Матеріали та методи досліджень

солестійкість абіотичний мембранний ячмень

Плазмідні вектори. Для клонування генів інтересу і подальшої трансформації протопластів, агробактеріальної трансформації рослин та інфільтрації листя тютюну використовували бінарні вектори системи pGreen/pSoup (Roger et al., 2000) та pART7/pART27 (Gleave, 1992). Для трансформації ячменю використовували генетичну конструкцію на основі вектору pBract214 (http://www.bract.org). Для трансформації рослин тютюну генами протонно-натрієвих обмінників родини NHX використовували генетичну конструкцію на основі вектору pGWB2 (Nakagawa et al., 2009). Для трансформації мутантної E. сoli лінії LB2003 використовували конструкції на основі вектору pQE-32 (Qiagen). Трансформацію дріжджових клітин здійснювали конструкцією на основі вектору pYES2 (Thermo Fisher Scientific).

Бактеріальні штами. Для клонування та маніпуляцій із плазмідною ДНК використовували штам E. coli DH5б (Ausubel et al., 1994). Для ампліфікацї плазмідних Gateway-векторів застосовували штам DB3:1, що є стійким до дії продукту гена ccdB (Bernard et al., 1992). Мутантний штам E. coli LB2003 (?trkA kup1 (trkD1) ?kdpABC5 rpsL metE thi rha gal) для проведення експериментів використовували для комплементації експресії генів білків ТРК-каналів (Schlцsser et al., 1995). Для агробактеріальної трансформації рослин були використані штами A. tumefaciens AGL1 та GV3101 (Lazo et al., 1991; Van Larebeke et al., 1974).

Рослинний матеріал. Для досліджень використовували рослини Arabidopsis thaliana (L.) екотипу Columbia (Col-0) та Т-ДНК мутантної лінії tpc1-2 (Peiter et al., 2005). Для пошуку та ідентифікації Т-ДНК інсерційних мутантів використовували лінії з Європейського центру насіння A. thaliana (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC, Нотінгем, Великобританія), а саме: SALK_122287 та SALK_012572 для NIP5;1; SALK_146323 для NIP6;1; NIP7;1 SALK_057023, SALK_042590 та SAIL_1165_G05 для NIP7;1. Дві лінії A. thaliana для ідентифікації Т-ДНК інерційних мутантів для AtTPK1, а саме: SAIL167A03 та SALK146903, були отримані з Інституту Солка (Salk Institute, Ла-Хойя, США) (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress). Насіння маркерної лінії A. thaliana ?-TIP-GFP було люб'язно надано Ж.-М. Ноехаусом з Університету міста Невшатель (Швейцарія).

Насіння рису Oryza sativa (L.) Japonica сорту Nipponbare були отримані з Міжнародного інституту рису (International Rice Research Institute (IRRI), Лос-Банос, Філіппіни). Мутантна лінія для OsTPKb із вставкою ретранспозону Tos 17 (NF6453) була отримана з центру дослідження геному рису RGRC (Японія, https://tos.nias.affrc.go.jp). Інша мутантна лінія для OsTPKb зі вставкою T-ДНК (PFG_2D-41178.R) була замовлена в центрі POSTECH Універститету міста Поханг (Pohang University of Science and Technology, Південна Корея).

У деяких експериментах використовували рослини ячменю Hordeum vulgare (L.) сорту Golden Promise та рослини тютюну Nicotiana tаbacum (L.). У дослідженнях транскрипційного профілювання генів фосфатних транспортерів використовували рослини Medicago truncatula cv. Jemalong A17.

Лінії дріжджів. У роботі викориcтовували наступні мутантні лінії дріжджів: acr3Д (Wysocki et al., 1997), fps1Д (Wysocki et al., 2001) та батьківський штам W303-1A (MATa {leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 ybp1-1}), що брався як контроль в усіх експериментах (Veal et al., 2003).

Методики роботи з культурами E. coli. Бактеріальні клітини E. coli вирощували при 37°C на середовищі ЛБ (1% пептон; 0,5% дріжджовий екстракт; 0,5% NaCl чи KCl (для LB2003), pH 7,4) на шейкері при 225 об/хв чи твердому середовищі ЛБ із додаванням 1,5%-ного агару. Для довготривалого зберігання бактеріальних клонів та штамів до 700 мкл нічної рідкої культури E. coli додавали 300 мкл гліцерину та зберігали при -80°C. З рідкої культури E. coli готували компетентні клітини та проводили трансформацію хімічним методом (Green et al., 2012).

Виділення плазмідної ДНК. Плазмідну ДНК виділяли за допомогою лужного методу (Green et al.,. 2012) та з використанням наборів QIAprep spin Miniprep kit, QIAprep spin Midiprep Kit (Qiagen) відповідно до рекомендацій компанії виробника.

Умови культивування та методи роботи з A. tumefaciens. Агробактеріальні клітини вирощували на рідкому середовищі ЛБ з додаванням 10 мкг/мл ріфампіцину та 50 мкг/мл гентаміцину для штаму GV3101 чи 20 мкг/мл ріфампіцину та 50 мкг/мл ампіциліну для штаму AGL1 при 28oC та 250 об/хв на шейкері. Для селекції трансформованих бактерій до ЛБ середовища додавали 50-100 мкг/мл канаміцину. Для довготривалого зберігання нічну культуру агробактерії заморожували при -80°C у 30%-му розчині гліцерину). З рідкої культури A. tumefaciens готували електрокомпетентні клітини та проводили електропорацію згідно методу (Wise et al., 2006) за допомогою Gene pulserTM (BioRad, США), розмір кювети - 20 мм (BioRad, США). Параметри електропорації були наступними: 2500 В, 25 мкФ, 200 Ом.

Умови культивування та методи роботи з рослинним матеріалом. Рослини N. tabacum та A. thaliana дикого типу (Col-0), мутантної лінії tpc1-tpk1та маркерної лінії дельта-TIP-GFP пророщували з насіння та культивували в тепличних умовах при 22oC та світловим періодом 14 год. Рослини віком 8 тижнів використовували із для дослідження транзієнтної експресії.

Для проведення деяких фізіологічних тестів з цілісними рослинами насіння A. thaliana (Col-0) дикого типу, інсерційних мутантних ліній та трансформантів з гіперекспресією AtTPK1 (TPKox) стерилізували у 5%-му розчині гіпохлориду натрію та висівали в чашки Петрі з твердим агаризованим середовищем (Gobert et al., 2007).

Для вивчення впливу сполук As на рослини до агаризованого середовища культивування додавали додатково K3AsO4 (AsV) або As2O3 (AsIII) у різних концентраціях та інкубували протягом 2 тижнів (Ali et al., 2012). При культивуванні рослини на рідкому гідропонному середовищі до середовища додавали K3AsO4 (AsV) чи As2O3 (AsIII) у декількох концентраціях та поміщали проростки A. thaliana віком 3 тижні та інкубували протягом 14 днів (Ali et al., 2012).

В експериментах з вивчення стійкості рослин до осмотичного стресу, впливу K+ та ролі абсцизової кислоти у процесах закриття продихів та проростання насіння до агаризованого поживного середовища додавали KCl, манітол чи абсцизову кислоту у різних концентраціях (Gobert et al., 2007).

Насіння рису та ячменю пророщували у стерильних умовах при 28oC, вологості 100% у темряві протягом 5 днів. Проростки з насіння переносили у пластикові контейнери об'ємом 8 л, що містили штучно аероване гідропонне поживне середовище для подальшого культивування та проведення експериментів з оцінки фізіологічних функцій білків двопорових каналів родини ТРК рису чи HvНКТ2;1-транспортера ячменю (Mian et al., 2011). Регенеровані після трансформації рослини тютюну переносили на рідке гідропонне середовище Хогленда для подальшої адаптації та проведення експериментів із сольовим та осмотичним стресами (Ісаєнков та ін., 2015).

Рослини M. truncatula вирощували відповідно до методики, описаної у роботі Грюнвальда та ін. (Grunwald еt al., 2009). Для колонізації коренів M. truncatula мікоризними грибами субстрат для вирощування рослин змішували у співвідношенні 1:10 з комерційними інокулюмами грибів (Grunwald еt al., 2009).

Трансформація рослин. Трансформацію A. thaliana проводили за допомогою методу занурення квіток (floral dip) у бактеріальну суспензію (Clough et al., 1998). З кожної трансформованої рослини збирали сухе насіння, стерилізували та висівали у чашки Петрі з твердим середовищем, що містило половинний набір солей МС (Murashige et al., 1962) та 100 мг/л канаміцину для селекції трансформованих рослин. Насіння стратифікували холодом (4oC) протягом 2 днів, далі пророщували за нормальних умов освітлення (50-100 мікроЕйншейнів) протягом 7-10 днів. Потенційні трансформанти переносили у горщики з ґрунтом для подальшого вирощування та аналізу.

Для отримання трансгенних рослин рису сорту Nipponbare калюс, отриманий зі зрілих зернівок, був протрансформований за допомогою A. tumefaciens штаму AGL1 згідно методики (Vain еt al., 2004)). Агробактеріальну трансформацію ячменю проводили у Центрі Джона Іннеса, місто Норвіч, Великобританія (Tingay еt al., 1997). Генетичну трансформацію тютюну здійснювали методом спільного культивування сегментів листків асептичних рослин з рідкою агробактеріальною культурою (Ісаєнков та ін., 2015). Агроінфільтрацію листя N. tаbacum проводили з використанням штаму A. tumefaciens GV3101 (Bendahmane еt al., 2002;. Reisen еt al., 2007).

Виділення та трансформація протопластів. Протопласти алейронового шару зернівок рису в стадії дозрівання виділяли відповідно до роботи (Hay еt al., 2007). Виділення та трансформацію протопластів етильованих однотижневих паростків рису та ячменю проводили відповідно до методики (Bart еt al., 2006). Виділення та трансформацію протопластів мезофілу A. thaliana проводили відповідно до роботи (Abel еt al., 1994).

Обробка рослинних клітин брефелдіном А. Листя тютюну обробляли розчином брефелдіну А через 2 дні після інокуляції агробактерією за допомогою інфільтрації розчину у зону трансформації (Isayenkov et al., 2011).

Сегрегаційний аналіз рослинних трансформантів. Насіння, зібране з трансформованих рослин A. thaliana (покоління Т0), висівали у чашки Петрі з селективним антибіотиком (канаміцин чи гігроміцин залежно від типу конструкції). Зі стійких до антибіотика рослин збирали насіння і знову висівали на середовище з селективним антибіотиком (покоління Т1). Насіння знову збирали та висівали на середовище із селективним антибіотиком окремо для кожної батьківської рослини. Спостерігалося розчеплення 1:3, де 1/3 частина насіння втрачала стійкість до селективного агента. Насіння (покоління Т2) зі стійких до антибіотика рослин знову відбирали та висівали на середовище для селекції окремо для кожної рослини. Насіння рослин, що демонстрували 100% стійкість до антибіотика, відбирали як потенційні гомозиготні лінії для подальшого ПЛР аналізу.

Селекцію ячменю проводили шляхом занурення листя у тверде середовище, що містило гігроміцин, від кожної трансформованої лінії рослин. Такий аналіз проводили і для покоління Т1, і для покоління Т2, що дозволило ідентифікувати дві гомозиготні лінії. При роботі з трансформантами рису, що мали стійкість до канаміцину, переважно працювали з гетерозиготними лініями рослин.

Виділення загальної геномної ДНК з рослин. Загальну ДНК виділяли з рослин рису та ячменю за допомогою ЦТАБ-методу з деякими модифікаціями (Isayenkov et al., 2015). Загальну ДНК виділяли з рослин A. thaliana за допомогою DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) відповідно до рекомендацій компанії-виробника.

ПЛР аналіз трансгенних рослин. Для визначення рослин A. thaliana з надекспресією AtTPK1 відбирали рослини поколінь Т2 та Т3, що пройшли селекцію у присутності канаміцину, та проводили ПЛР аналіз (Gobert et al., 2007).

Для аналізу рослин рису, трансформованих генами білків OsTPKa або OsTPKb, проводили ПЛР аналіз за допомогою праймерів, специфічних до послідовностей 35S промотора та кодуючих послідовностей OsTPKa та OsTPKb: 35S_for GCATGGGGATGAGGTTTTTA; OsTPKa_rev CTGAGCAGATTGTGCTAG чи OsTPKb_rev ACGCAGGGAAGGCGGCGGGT. Програма ПЛР ампліфікації мала наступні параметри: 95oC 4 хв; 40 циклів: 95oC 30 с, 56oC 30 с, 72oC 60 с; 72oC 10 хв.

Для перевірки трансгенної вставки у геномній ДНК ячменю, трансформованого ДНК конструкцією з геном HvHKT2;1 на основі вектору pBRACT214, проводили ПЛР з парою праймерів, специфічних до Т-ДНК бінарного вектора (Mian et al., 2011). Для ідентифікації трансгенних рослин A. thaliana, трансформованих ScACR3, проводили ПЛР аналіз з парою праймерів, специфічних до цього гена (Ali et al., 2013).

Ідентифікація гомозиготних мутантних ліній дослідних рослин. Ідентифікацію гомозиготних мутантів A. thaliana лінії SALK146903 (майбутня гомозиготна лінія tpk1-1) та SAIL167A03 (майбутня гомозиготна лінія tpk1-2) проводили відповідно до методики (Gobert et al., 2007). Для ідентифікації NIP-мутантів використовували лінії рослин A. thaliana SALK_122287 та SALK_012572 (nip5;1); SALK_146323 (nip6;1); SALK_057023, SALK_042590, SAIL_1165_G05 (nip7;1). Ідентифікацію та подальший аналіз проводили відповідно протоколу, описаного у роботі (Isayenkov et al., 2008). Гомозиготні OsTPKb-мутанти рису були ідентифіковані шляхом ПЛР аналізу для двох незалежних ліній, а саме Tos17 інсерційної лінії NF6453 та лінії PFG_2D-41178.R з вставкою Т-ДНК (Isayenkov et al., 2015).

Виділення загальної РНК з рослин. Виділення загальної РНК з рослинного матеріалу проводили за допомогою TRIsol (Thermo Fisher Scinetific) або RNeasy Plant Mini kit (Qiagen) відповідно до інструкцій виробника. Загальну РНК дріжджів виділяли за допомогою RNeasy Mini Kit (Qiagen) відповідно до протоколу, рекомендованого виробником. Загальну РНК бактерій виділяли з осаджених зразків бактеріальних трансформантів, оброблених ізопропилв-D-тіогалактозидазою (ІПТГ). РНК виділяли за допомогою NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel) відповідно до рекомендованого виробником протоколу. Якість та цілісність виділеної РНК визначалась спектрофотометрично та за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Концентрацію РНК у різних зразках вирівнювали до загальної величини.

Синтез кДНК. Для синтезу кДНК застосовували зворотну транскриптазу SuperScript® IIІ Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scinetific) та набір супутніх компонентів, а саме 100 мМ дитіотреітолу (ДТТ ), 10 мМ дНТФ (суміш нуклеозимдтрифосфамтів), оліго дТ18-22 та інгібітор РНКаз RNaseOUT™ (40 од./мкЛ) (Thermo Fisher Scinetific). Синтез кДНК проводили відповідно до інструкцій компанії-виробника.

Аналіз експресії генів у мутантних лініях рослин. Для підтвердження відсутності транскриптів генів, що мали мутацію, ЗТ-ПЛР аналіз проводили для відібраних попередньо гомозиготних ліній рослин. Для мутантних гомозиготних ліній tpk1-1 та tpk1-2 ЗТ-ПЛР аналіз проводили відповідно до методики, описаної у роботі Гобера та інш. (Gobert et al., 2007).

Для мутантних ліній nip7;1,nip6;1та nip5;1 у ПЛР-аналізі використували кДНК відповідно до кожної гомозиготної лінії та наступні пари праймерів: NIP5;1_for GGTAATGGTGATGGCTCCTC та NIP5;1_rev TTAACGACGAAAGCTCCTAAC; NIP6;1_for GATTCGAAGGGAAGAGGAATG та NIP6;1_rev TGGACCCAGTGTTCTTACAGG; NIP7;1_for GCACGGTCAAGAGTAGTCGAC та NIP7;1_rev TGTCAAAACTCCGATTATGGC. Для порівняння та загальної оцінки рівня транскриптів у цих кДНК матрицях паралельно проводили ПЛР для тих же зразків з праймерами, специфічними до гена актину 2, а саме AtAct2_for CTGGGATGATATGGAGAAGATCTGG та AtAct2_rev CCGTTGTGGTGAATGAGTAACCACG.

Для гомозиготних мутантних Ostpkb ліній ЗТ-ПЛР аналіз проводили відповідно до протоколу, описаного в роботі (Isayenkov et al., 2015).

Визначення рівня експресії привнесених генів у трансгенних рослинах. З трансгенних та контрольних рослин виділяли РНК та синтезували кДНК. У подальшому синтезовану кДНК трансгенних ліній рослин використовували для аналізу рівня експресії трансгенів за допомогою ПЛР.

Експресію гена AtTPK1 у трансгенних ліній рослин визначали відповідно до методики, описаної Гобером та інш. (Gobert et al., 2007). Рівень експресії ScACR3 аналізували згідно із протоколом, описаним у Алі та ін. (Ali et al., 2012). Рівень експресії OsTPKa у трансгенних лініях рису вимірювали за допомогою ПЛР у реальному часі (ABI-7900 sequence detection system), використовуючи реакційну суміш SYBR Green master mix (Applied Biosystems) (Isayenkov et al., 2015).

Для гомозиготних трансгенних ліній ячменю з надекспресією HvHKT2;1 проводили ПЛР аналіз з кДНК матрицею з трансгенних та контрольних рослин (Mian et al., 2011). Експресію HvNHX2 у рослинах тютюну визначали за допомогою ЗТ-ПЛР відповідно до протоколу, описаного Ісаєнковим та ін. (Ісаєнков та ін., 2015).

Транскрипційне профілювання генів деяких мембранних транспортерів. Рівень експресії HvHKT2;1 досліджували у різних тканинах рослин ячменю. Загальну РНК виділяли із коренів, стебла та листя 3-х тижневих паростків (Mian et al., 2011). У роботі також проводили експерименти із транскрипційним профілюванням генів деяких мембранних транспортерів у рослинах ячменю за умови впливу сольового чи осмотичного стресів. В експериментах оцінювали рівень транскриптів генів HvTPKb, HvTPKc, HvNHX4 та гена -тубуліну HvTub що був референтним (Ісаєнков та ін., 2015).

Приготування макроареїв та транскрипційне профілювання генів фосфатних транспортерів M. truncatula. Приготування зразків для макроареїв та аналіз експресійних профілів проводили відповідно методики, описаної Грюнвальдом та ін. (Grunwald еt al., 2009). Профілі експресії генів ключових фосфатних транспортерів перевіряли за допомогою ПЛР у реальному часі (Grunwald еt al., 2009).

Клонування та створення генетичних конструкцій. Для створення конструкцій для експресії генів, злитих з маркерним флуоресцентним білком на основі вектору pART7, були створені експресійні касети під контролем 35S промотора, що містили у собі кДНК EYFP або RFP. кДНК mEYFP та mRFP були ампліфіковані за допомогою ПЛР із специфічними праймерами, а саме EXFP_F-BamHI СGGGATCCATGAAAAGTAAAGGAGAAGA та EXFP_R-BamHI GCGGATCCTTTGTAGAGCTCATCCATGC, що також містили ДНК послідовність сайту розпізнавання рестриктази BamHI. Ампліфіковані ПЛР продукти mEYFP та mRFP були вставлені у pART7 вектор за допомогою BamHI рестрикції з подальшим лігуванням Т4 лігазою.

Клонування AtTPK1 та створення конструкції p35S-AtTPK1 для надекспресії AtTPK1 у рослинах A. thaliana було виконано колегами із Університету Потсдама відповідно до посилання (Czempinski et al., 2002). Послідовність кДНК AtTPK1 без стоп-кодону була вставлена у створений вектор pART7-EYFP за допомогою EcoRI/SmaI сайтів рестрикції. Ампліфікацію кДНК AtTPK1 без стоп-кодону проводили за допомогою наступної пари праймерів: TPK1EcoRI_ for GCGAATTCATGTCGAGTGATGCAGCTCG та TPK1SmaI_rev GCCCCGGGCCTTTGAATCTGAGACGTGG. Внаслідок клонування була створена конструкція для транзієнтної експресії химерного злитого гена AtTPK1:EYFP в протопластах. Для подальшого використання химерного злитого гена AtTPK1:EYFP у трансформації рослин касета для експресії цього химерного гена під контролем 35S промотора була вирізана із pART7 та вставлена у бінарний вектор pART27 за допомогою NotI сайту рестрикції. Створену конструкцію pART27-AtTPK1:EYFP використовували для агробактерільної трансформації рослин A. thaliana, зокрема комплементації мутантів лінії tpk1-1.

Клонування генів OsTPKa та OsTPKb проводили у бінарний вектор pGreen0179 (http://www.pgreen.ac.uk). Кодуючі послідовності кДНК OsTPKa та OsTPKb повної довжини ампліфікували за допомогою ПЛР з праймерами: OsTPKaXhoI_for GCCTCGAGATGGATGACAACAGCATT, OsTPKaSma1_rev GCCCCGGGCTGAGCAGATTGTGCTAG для OsTPKa, OsTPKb EcoRI_for GCGAATTCATGGCGGCCCTCGACCAA та OsTPKb SmaI_rev GCCCCGGGACGCAGGGAAGGCGGCG для OsTPKb. OsTPKa-фрагмент був вставлений у 35S промоторну касету плазміди pART7 за допомогою рестрикції ферментами XhoI та SmaI та лігування T4-ДНК лігазою (NEB). Промоторну касету із вбудованим у неї фрагментом кДНК OsTPKa вставляли у бінарний вектор pGreen0179 за допомогою ферменту рестрикції NotI та лігування T4-ДНК лігазою.

кДНК HvHKT2;1 та HvNHX2 клонували у бінарні вектори за допомогою технології Gateway. кДНК HvHKT2;1 повної довжини була ампліфікована за допомогою пари праймерів, що містили ділянки послідовностей, специфічні для ВР клонази. кДНК HvHKT2;1 була клонована у вектор pBract214 відповідно методики, описаної Міан та ін.. (Mian et al., 2011). Клон HvNHX2 був люб'язно наданий канд. біол. наук О. Бабаковим з Інституту фізіології рослин імені К. Тімірязєва (Москва, Росія). Кодуюча послідовність HvNHX2 без стоп-кодону довжиною 1639 пн була клонована у бінарний вектор pGWB2 згідно з протоколом, описаним Ісаєнковим та ін. (Ісаєнков та ін., 2015).

Клонування кодуючих послідовностей без стоп-кодонів OsTPKa, OsTPKb та HvTPK1 у pART7-EYFP/RFP проводили відповідно процедури, описаної Ісаєнковим та ін. (Isayenkov et al., 2011). Клонування кодуючих послідовностей кДНК генів калієвих каналів родини ТРК з тютюну проводили згідно протоколу, описаного Ісаєнковим та ін. (Ісаєнков та ін., 2014). Кодуюча послідовність без стоп-кодону г-TIP була клонована відповідно описаної процедури (Isayenkov et al., 2011). Для проведення транзієнтної експресії шляхом агроінфільтрації у клітинах мезофілу тютюну експресійна касета 35S-OsTPKa:EYFP із pART7-OsTPKa:EYFP була вирізана та вставлена у бінарний вектор pART27 за допомогою рестриктази NotI.

Сворення генетичних конструкцій та клонування дріжджового гена ScACR3 проводили для транзієнтної трансформації протопластів та агробактеріальної трансформації рослин згідно з протоколом, описаним Алі та ін. (Ali et al., 2014). Для трансформації та комплементації мутантів дріжджів була клонована та створена генетична конструкція із геном AtNIP7;1 (Isayenkov et al., 2010).

Для експресії генів калієвих каналів родини ТРК у мутантній лінії E. coli LB2003 було клоновано послідовності кДНК повної довжини AtTPK1, AtTPK2, AtTPK3, AtTPK5 та OsTPKa, OsTPKb та створені генетичні конструкції на основі вектора pQE-32 (Isayenkov et al., 2013; Ісаєнков та ін., 2015).

Створення генетичних конструкцій з химерними генами та сайт-направлений мутагенез. Генерація химерних генів була проведена за допомогою методу фосфорилювання кінців праймерів за допомогою Т4 полінуклеотидкінази згідно роботи Ісаєнкова та інших (Isayenkov et al., 2011). Конструкції, що кодують злиті із EYFP білки, а саме pART7-OsTPKa:EYFP, pART7-OsTPKb:EYFP та pART7-HvTPK1:EYFP, використовували для проведення сайт-направленого мутагенезу і створення точкових мутацій у деяких кодонах для заміни одної кислоти на іншу. pART7-OsTPKa:EYFP, pART7-OsTPKb:EYFP та pART7-HvTPK:EYFP конструкції використовували для генерації мутацій за допомогою набору QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) (Isayenkov et al., 2011).

Методи мікроскопії. Аналіз флуоресценції репортерних GFP/EYFP/RFP/CFP протеїнів, злитих із калієвими каналами родини ТРК з різних видів рослин, г-TIP та ?-TIP, ScACR3, AtPIP2;1, проводили за допомогою конфокальної скануючої мікроскопії (Zeiss LSM510 Meta, Німеччина). Оцінку колокалізації різних флуоресцентних білків проводили у режимі лямбда мікроскопу. Сигнали GFP, EYFP, RFP, CFP та автофлоуресценції, що були попередньо прописані та збережені, розділяли спектрально (unmix) за допомогою програмного забезпечення мікроскопу.

Для чіткого визначення типу клітинної органели, де спостерігається флуоресценція репортерних білків, а саме літичної вакуолі, протеїнової вакуолі чи ЕР, була застосована методика м'якого лізису протопластів. Флуоресценцію протопластів спостерігали через 18-24 год після трансформації. Протопласти зазнавали м'якого лізису за допомогою поступової заміни інкубаційного середовища розчином м'якого осмотичного шоку (10 мM EГTA, 10 мM EДTA, pH 8, та 180 мM сорбітол).

Морфологію алейронового шару тканин насіння, що формується, аналізували за допомогою електронної мікроскопії (Isayenkov et al., 2015).

Фізіологічні та біохімічні методи роботи з рослинами. Трансформовані та контрольні рослини віком 3-4 тижні у залежності від типу експерименту культивували протягом 2 тижнів на різних експериментальних середовищах. Використовували 5-6 рослин кожної лінії і для кожного типу середовища. Визначення відносного рівня приросту обраховували відповідно до методики Пуртера та Гарнієра (Poorter еt al., 1999). Оцінку проростання насіння рослин дикого типу (WT), двох мутантних ліній tpk1-1 та tpk1-2, трьох ліній рослин із надекспресією АtTPK1 проводили за методикою, описаною Гобером та ін. (Gobert еt al., 2007).

Визначення вмісту арсену. Оцінку рівня поглинання AsIII для паростків A. thaliana проводили відповідно до методики (Ali еt al., 2012). Загальний вміст As визначали в оброблених рослинних зразках за допомогою спектрометру Pye Unicam 701 ICP-OES spectrometer (Кембрідж, Великобританія) (Xu еt al., 2007). Визначення вмісту As у тканинах рослин, трансформованих ScACR3, проводили за допомогою високоефективної рідинної хроматографії разом з мас-спектрометрією з індуктивно-зв'язаною плазмою HPLC-ICP-MS (Agilent LC1100 series та Agilent ICP-MS 7500, Agilent Technologies, Санта Клара, Каліфорнія, США) (Li еt al., 2009). HPLC-ICP-MS аналіз проводили в науково-дослідному центрі Ротхамстед (Харпенден, Великобританія).

Визначення рівня поглинання AsIII клітинами дріжджів проводилось відповідно методики Висоцкі та ін. (Wysocki еt al., 2001).

Визначення вмісту Na+ та K+. Після двотижневого культивування рослин рису та ячменю на різних типах середовищ відбирали по 4 рослини для кожного типу стресу та контролю відповідно. Вміст Na+ та K+ у тканинах та ксилемному соці рослин визначали за допомогою фотометрії у полум'ї (Flame photometrу, Sherwood Scientific Ltd, Великобританія) (Maathuis, 2006; Mian et al., 2011).

Оцінка життєздатності протопластів. Оцінку життєздатності протопластів, ізольованих з трансгенних ліній A. thaliana, що експресують ScACR3, та рослин дикого типу проводили за допомогою барвника T-1824 (Evans Blue) (Ali еt al., 2012).

Оцінка продихової кондуктивності цілого листка. Швидкість відкриття продихів визнали за допомогою вимірювання газового аналізатору у інфрачервоному світлі (Infrared Gas Analyser, Li-Cor 6400 (LI-COR) Кембрідж, Великобританія) (Gobert еt al., 2007).

Методи роботи з дріжджовими клітинами. Трансформацію дріжджових клітин проводили відповідно до методики (Gietz еt al., 2007). Крапельний тест (Drop assay) проводили відповідно процедури, описаної Ісаєнковим та ін. (Isayenkov et al., 2008).

Оцінка росту та рівня поглинання K+ бактеріальними трансформантами штаму E. coli LB2003. Штам E. coli LB2003 трансформували вектором pQE32 (Qiagen) чи створеними конструкціями: QE32-AtTPK1, -AtTPK2, -AtTPK3, -AtTPK5, -OsTPKa, -OsTPKb. Оцінку росту бактеріальних клітин проводили відповідно методики (Isayenkov et al., 2013; Ісаєнков та ін. 2015). Оцінку рівня поглинання K+ бактеріальними трансформантами проводили за допомогою фотометрії у полум'ї (Flame photometrу, Sherwood Scientific Ltd) (Isayenkov et al., 2013; Ісаєнков та ін. 2015).

Методики біоінформатичного аналізу. Пошук рослинних гомологів білків протонно-натрієвих обмінників родини NHX, калієвих каналів родини ТРК та NIP-аквапоринів виконували за ключовими словами і на основі результатів BLASTp-сканування бази даних UniProt (SIB BLAST Network Service) з обмеженням за рослинами та GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (Korf, 2003; Wu et al., 2006). Методологія філогенетичного аналізу детально описана в роботах (Isayenkov et al., 2015; Ісаєнков та ін. 2015).

Статистична обробка даних. Усі експерименти проводили якнайменше для трьох незалежних повторів. Обробку даних досліджень проводили у програмі Microsoft Excel, статистичну вірогідність отриманих результатів оцінювали з використанням двовибіркововго t-критерію для залежних вибірок. Значення P<0,05 (іноді P<0,1) приймали як критерій достовірної різниці порівняно з контрольними значеннями.

2. Результати досліджень та їхнє обговорення

Роль мембранного транспортеру HvHKT2;1 у механізмах солестійкості та іонного балансу ячменю

Особливості експресії гена HvHKT2;1. Відповідно до результатів наших досліджень було продемонстровано, що HvHKT2;1 є Na+/K+ котранспортером. Аналіз рівня HvHKT2;1 транскриптів у трансформованих та контрольних рослинах проводили за допомогою ЗТ-ПЛР та ЗТ-ПЛР у реальному часі. Показано, що ген HvHKT2;1 переважно експресується у клітинах кортексу кореня, що свідчить на користь гіпотези про роль цього транспортера у поглинанні Na+ та/чи К+ з ґрунту (Schachtman et al., 1994; Golldack et al., 2002). Цікавим фактом є те, що рівень транскриптів цього гена зростав у коренях за умов дефіциту К+ та у пагонах за високої концентрації Na+ у середовищі. Отримані дані транскриптомного аналізу свідчать про участь цього транспортера у регуляції Na+/K+ гомеостазу на рівні рослини (рис. 1). Рівень експресії HvHKT2;1 у трансгенних лініях рослин (ОХ1 та ОХ2) був приблизно в п'ятнадцять разів вищий за контрольні лінії (WT1 та WT2) (рис. 1). Подальший аналіз профілю експресії HvHKT2;1 дозволив з'ясувати, що надекспресія цього гена призводить не тільки до збільшення загального рівня транскриптів у рослині, але також до появи експресії у клітинах центрального циліндра (рис. 1).

Ріст та поглинання Na+/K+ рослинами із гіперекспресією HvHKT2;1 в умовах сольового стресу. Відповідно до результатів наших експериментів рослини з надекспресією гена HvHKT2;1 (ОХ1 та ОХ2) демонструють вищі на 25-30% темпи росту, ніж контрольні (WT1 та WT2) при культивуванні на середовищах з високим вмістом Na+, а саме 50 мМ Na+ та 100 мМ Na+. Іншим цікавим відкриттям було збільшення вмісту K+ у пагонах при культивуванні рослин з надекспресією гена цього транспортера в умовах дефіциту даного елемента, що може свідчити про участь HvHKT2;1 у абсорбції K+ у коренях чи реабсорбції при екстремально низьких концентраціях цього елемента. Отже, цілком вірогідно, що HKT-транспортери можуть брати участь у поглинанні K+ коренями (рис. 2). Надекспресія HvHKT2;1 призводить до збільшення поглинання Na+ рослинами та підвищення концентрації цього токсичного іона в ксилемному соці та підсилення транслокації його у листя рослин при інкубації у присутності 50 чи 100 мM NaCl.

Рис. 1. Рівень транскриптів HvHKT2;1 в корені, стеблі та листі та різних умовах росту. (a) Рівень експресії HvHKT2;1 в корені, стеблі та листі за стандартних умов. (b) Рівень експресії HvHKT2;1 при культивуванні рослин з різними концентраціями Na+ та К+. (с) Рівень експресії HvHKT2;1 у трансгенних рослин та дикого типу. WT - дикий тип. ОХ - рослини із гіперекспресією HvHKT2;1. C - кортекс кореню, St - центральний циліндр

Рис. 2. Вміст Na+ та K+ у коренях та листі контрольних рослин та рослин із надекспресією HvHKT2;1, що вирощували на середовищах із різними концентраціями цих іонів. (a) без K+ (0 К). (b) без K+ із додаванням 50 мМ Na+ (0 К-50 Na+). (c) 2 мМ K+ із додаванням 50 мМ (2K-50Na). (d) 2 мМ K+ із додаванням 100 мМ Na+ (2K-100Na). Примітка: достовірна різниця між рослинами із надекспресією HvHKT2;1 (ОХ) та контрольними рослинами (WT) помічена зірочками

Цікаво, що така відповідь корелює із підсиленням стійкості рослин до впливу надмірного засолення (рис. 3). Отримані дані свідчать про те, що один із факторів, який обмежує солестійкість рослин ячменю, є транслокація Na+ у тканини пагонів, а не накопичення чи компартменталізація цього катіона в тканинах листя. Отже, надекспресія гена транспортера HvHKT2;1 призводить до підвищення стійкості рослин до сольового стресу за допомогою посилення накопичувального фенотипу рослин ячменю. Таким чином, гіпотеза про те, що HKT-транспортери можуть брати участь у поглинанні K+ коренями, заслуговує на увагу та подальші ретельні дослідження.

Рис. 3. Вміст Na+ та K+ у ксилемному соці контрольних рослин та рослин із надекспресією HvHKT2;1, що вирощували на середовищах з різними концентраціями Na+. (a) вміст K+. (b) вміст Na+. Примітка: достовірна різниця між рослинами із гіперекспресією HvHKT2;1 (ОХ) та контрольними рослинами (WT) помічена зірочками

Різноманіття транспортерів родини NHX та їхня роль у механізмах соле- та посухостійкості рослин

Філогенетичний аналіз протонно-натрієвих обмінників родини NHX рослинного походження. Для подальшого розуміння можливої участі транспортерів родини NHX у механізмах соле- та посухостійкості було проведено біоінформатичний пошук та відбір наявних потенційних послідовностей білків протонно-натрієвих обмінників родини NHX рослинного походження. Після вторинного аналізу повних послідовностей протонно-натрієвих обмінників родини NHX було відібрано 403 амінокислотні послідовності цих транспортних білків з різних видів рослин. Кладистичний аналіз відібраних послідовностей NHX-транспортерів вказує на існування 4 клад. 3 клади належать до NHX-транспортерів типу ІІ, а 1 клада містить протонно-натрієві обмінники типу І. Окрім того, варто зазначити, що в результаті кладистичного аналізу було показано появу нової клади, до якої належать протонно-натрієві обмінники родини NHX, подібні до AtNHX3 (рис. 4). У ході проведення кладистичного аналізу та подальшої класифікації виявлено неспівпадіння назв NHX-транспортерів у базах даних із типом клади та групи з маркерним типом, до якої насправді належать ці протонні обмінники.

Рис. 4. Результати кладистичного аналізу зведеної групи потенційних протонно-натрієвих обмінників родини NHX рослинного походження. Маркерами виділено представників типу NHX з A. thaliana, кладистичний алгоритм - зв'язування найближчих сусідів (N-J). Нова клада додатково виділена кремовим кольором

Роль протонно-натрієвих обмінників ячменю (HvNHX) у процесах солестійкості рослин. Одним із найперспективніших підходів покращення солестійкості рослин є застосування мембранних транспортерів моновалентних катіонів для депозитування токсичних іонів, зокрема Na+, у центральну вакуолю рослинної клітини. Тому було вирішено з'ясувати роль деяких представників вакуолярних NHX-транспортерів ячменю в механізмах соле- та посухостійкості рослин. Зазвичай рослини мають декілька ізоформ NHX. Було показано, що гіперекспресія чи експресія різних генів NHX-транспортерів у рослинах призводить до підвищення солестійкості (Apse еt al., 1999; Zhang et al., 2001; Barkla et al., 1995). Відомо, що геном ячменю кодує 4 транспортери родини NHX (An et al., 2007; Ershov et al., 2005). Слід зазначити, що ячмінь має високий рівень толерантності до засолення, тому використання протонно-натрієвих обмінників родини NHX із цієї рослини є досить перспективним. Нами було привнесено ген протонно-натрієвого обмінника ячменю HvNHX2 у геном тютюну. Внаслідок такої генетичної маніпуляції параметри солестійкості трансформантів значно підвищувались. Трансформовані рослини, що експресують HvNHX2, були здатні виживати на середовищі з 250 мМ NaCl протягом 4 тижнів (рис. 5). Така концентрація NaCl є летальною для рослин дикого типу. Отже, запропонований підхід підвищення солестійкості рослин шляхом експресії генів протонно-натрієвих обмінників родини NHX був успішно підтверджений проведеними експериментами.