Молекулярно-генетична та функціональна характеристика мембранних транспортерів, залучених до регуляції соле- і посухостійкості у рослин та детоксифікації арсену

До того ж, дослідження транскрипційного профілю генів, що кодують NHX-транспортери в рослинах ячменю, показало, що індукція експресії HvNHX4 відбувається через 24 години інкубації на поживному середовищі, що містить 500 мМ NaCl. Проте ніякої індукції експресії гена цього каналу не було відмічено при інкубації рослин в умовах водного стресу. Таким чином, HvNHX4 є можливим регулятором сольового стресу у рослин ячменю (рис. 6). Участь Na+/H+ NHX-обмінників у формуванні відповіді на дію сольового стресу була показана для багатьох представників цієї родини. Вірогідно, що HvNHX4 бере на себе роботу депозитування Na+ у вакуолю чи інші мембранні компартменти клітини і, відповідно, зменшує концентрацію цього катіона у цитозолі, де проходять важливі метаболічні процеси.

Рис. 5. Виживання рослин тютюну протягом 4 тижнів у присутності високих концентрацій NaCl (250 мM). Контроль або control (a, b) - контрольні рослини (без HvNHX2). HvNHX2ox(a) або nhx2 (b) - рослини, що експресують HvNHX2

Рис. 6. Результати ЗТ-ПЛР аналізу експресії генів HvNHX4 та HvTub у проростках ячменю за умов дії сольового та водного стресів через різний інтервал часу. (a) HvNHX4. (b) HvTub? ?c) Кількісний аналіз рівня експресії гена HvNHX4. М - маркер молекулярної маси ДНК. 500 мМ NaCl - сольовий стрес. PEG 4000 - водний стрес (середовище із додаванням поліетилегліколю 4000). 1 - контроль, 2 год; 2 - контроль, 8 год; 3 - контроль, 24 год; 4 - 10% ПEГ, 2 год; 5- 10% PEG, 8 год; 6 - 10% ПEГ, 24 год; 7 - 500 мМ NaCl, 2 год; 8 - 500 мМ NaCl, 8 год; 7 - 500 мМ NaCl, 24 год.

Роль двопорових калієвих каналів родини ТРК у рості та розвитку рослини і регуляції сольового та водного стресів.

Фізіологічна роль каналів родини ТРК є дуже різноманітною. Вони беруть участь у контролі гомеостазу калію і генерації тургорного тиску. Канали цієї родини задіяні у багатьох рослинних відповідях на дію абіотичних стресів.

Філогенетичний аналіз потенційних двопорових калієвих каналів родини ТРК рослинного походження. Для того щоб класифікувати та узагальнити філогенетичне різноманіття двопорових калієвих каналів родини ТРК, було проведено біоінформатичний пошук та кладистичний аналіз послідовностей потенційних білків ТРК-каналів. Після детального вивчення та відбору на основі вторинного аналізу доменної архітектури порових ділянок було відібрано 157 білків каналів родини ТРК різних видів рослин. Множинне вирівнювання вказує на високий рівень дивергенції серед послідовностей потенційних білків калієвих каналів родини ТРК. Унаслідок проведення кладистичного аналізу було виділено 4 клади білків ТРК - подібних послідовностей із чіткими ознаками та об'єднанням з дослідженими контрольними білками з A. thaliana.

Фізіологічна роль AtTPK1 та його клітинна локалізація. Геном A. thaliana містить п'ять генів, що кодують білки двопорових калієвих каналів родини ТРК. Найпоширенішим представником цієї родини є білок AtTPK1, що зустрічається у всіх типах клітин. Нами було показано, що цей канал міститься у тонопласті центральної літичної вакуолі. Отже, відповідний транспортний білок забезпечує транспорт К+ між цитоплазмою та вакуолею.

Рис. 7. Кондуктивність продихових клітин (a), ріст та вміст К+ (b) у мутантних лініях рослин (tpk1-1 та tpk1-2), дикому типі (WT) та рослинах із надекспресією AtTPK1. (a) Показники кондуктивності у контрольних умовах були: для tpk1-1 - 140+13 мкМ/м2/с; tpk1-2 - 133+12 мкМ/м2/с; WT - 124+10 мкМ/м2/с; TPKox - 115+11 мкМ/м2/с. (b) - рослини культивували на середовищах із високою (80 мМ) чи низькою (10 мкМ) концентрацією цього К+. Статистично відмінна різниця за допомогою Т-тесту позначена при Р<0,1(*)

Завдяки аналізу мутантних ліній рослин із втраченою функцією білка AtTPK1 та рослин з надекспресією відповідного гена була продемонстрована важлива роль цього каналу у закритті продихових клітин (рис. 7). Найповільніше закриття продихів спостерігалось для мутантних ліній рослин, швидкість закриття продихів у рослин із надекспресією білка AtTPK1 була вищою, ніж у рослин дикого типу. Під час експериментів було виявлено, що білок AtTPK1 бере участь у закритті продихів клітин шляхом вивільнення К+ із вакуолі. Таким чином, функція цього каналу також може впливати на водний статус рослин. Результати наших досліджень свідчать про негативний вплив високих та низьких концентрацій цього елемента на ріст проростків A. thaliana. Окрім того, значної різниці у вмісті К+ у тканинах дослідних рослин не було помічено. Отже, білок AtTPK1 не бере участі у поглинанні К+, проте є важливим для підтримки внутрішньоклітинного та міжклітинного гомеостазу К+. (рис. 7).

Рис. 8. Вплив АБК на проростання насіння в мутантних лініях рослин (tpk1-1 та tpk1-2), дикому типі (WT) та рослинах із надекспресією AtTPK1. Статистично відмінна різниця за допомогою Т-тесту позначена при Р<0,1(*) та P<0,05(**)

У ході аналізу проростання насіння мутантних ліній та рослин з надекспресією гена цього каналу була окреслена його роль. Відповідно до результатів експериментів насіння мутантних tpk1 ліній проростає повільніше, особливо при обробці АБК, у порівнянні з диким типом чи з рослинами з надекспресією даного гена (рис. 8). Отже, функція білка AtTPK1 є відносно незалежною від дії АБК. Цілком імовірно, що підсилення експресії гена AtTPK1 у клітинах рослин зародку та ендосперму потрібно для генерації тургорного тиску шляхом накопичення К+ у вакуолях, що є необхідною умовою росту клітин шляхом розтягування (Bethke et. al., 1998). Білок AtTPK1 також може брати участь у перерозподілі важливих поживних елементів поміж тканин насіння, що проростає. Під час аналізу приросту A. thaliana різних ліній в умовах осмотичного стресу було показано, що рослини мутантних ліній (tpk1-1 та tpk1-2) мають показники росту нижчі у порівнянні із рослинами дикого типу та TPK1ox (рис. 9). Проте рослини з надекспресією AtTPK1 демонстрували здатність рости в умовах осмотичного стресу набагато вищу, ніж WT та мутанті лінії рослин (рис. 9). Отримані результати свідчать про участь цього каналу у формуванні відповіді на дію осмотичного стресу. Іони К+ є одними із головних осмопротекторів у клітині. Отже, цілком імовірно, що вивільнення К+ із вакуолярних компартментів буде швидшим та інтенсивнішим у рослин із надекспресією гена цього каналу. Можливо, саме тому рослини з надекспресією цього гена мають ряд переваг при дії осмотичного стресу, ніж рослини дикого типу чи мутантних ліній. Таким чином, можна впевнено стверджувати, що білок AtTPK1 є калієвим каналом тонопласту центральної вакуолі та відіграє важливу роль у розподілі К+ всередині клітини і підтримці гомеостазу цього іону. Він має велике значення для функціонування продихових клітин, проростання насіння, росту клітин та протекції від наслідків осмотичного стресу.

Функціональна та фізіологічна характеристика двопорових каналів ТРК із рису. Геном рису кодує принаймні три ізоформи калієвих каналів родини ТРК, а саме OsTPKa, OsTPKb та OsTPKc. Білки OsTPKa та OsTPKb дуже подібні один до одного (63% ідентичності) та до AtTPK1 (50 чи 57% ідентичності). За таких показників подібності можна припустити, що у цих двох представників калієвих каналів ТРК рису будуть схожі фізіологічні функції та клітинна локалізація. Однак ці два білки мають значну різницю та функції і у локалізації, і у характері клітинної доставки до органели призначення. Відповідно до аналізу фенотипів мутантних ліній рису, що втратили функцію двопорового калієвого каналу OsTPKb, цей транспортний білок має дуже важливе значення для росту та розвитку рослин і формування насіння. Згідно з нашими спостереженнями дві незалежні мутантні лінії рису за геном OsTPKb мають набагато менший приріст біомаси у порівнянні з рослинами дикого типу та гетерозиготними рослинами (рис. 10). Відмічено часткову стерильність та порушення у формуванні насіння. У результаті електронно-мікроскопічного аналізу зернівок виявлено, що алейроновий шар у незрілому насінні мутантних рослин має морфологічні аномалії та характеризується відсутністю протеїнових вакуоль і деградованою структурою клітин (рис. 10). Отже, завдяки фенотиповому аналізу мутантів, що втратили білок двопорового каналу OsTPKb, було показано надзвичайно важливу роль цього білка для росту та розвитку рослини та формування насіння.

У ході експериментів із з'ясування ролі білків двопорових каналів родини ТРК у регуляції сольового та осмотичного стресів було виявлено, що підвищення експресії гена, який кодує білок калієвого канала OsTPKa у рисі, може суттєво покращити показники стійкості рослин до високих концентрацій солей, водного стресу та дефіциту калію. Рослини із надекспресією гена OsTPKa демонстрували кращий рівень росту, зменшення накопичення Na+ у своїх тканинах за умов сольового стресу та дефіциту калію (рис. 11). Окрім того, відповідно до результатів наших попередніх досліджень надекспресія OsTPKb у рослинах рису також спричиняє посилення стійкості рослин до дії сольового та осмотичного стресів. Згідно з даними, отриманими за допомогою онлайн-інструменту Genevestigator, сольовий та осмотичний стреси можуть бути індукторами експресії гена цього каналу. На відміну від OsTPKa трансформантів, характер відповіді рослин, трансформованих геном OsTPKb, дещо відрізнявся. Рослини, трансформовані геном OsTPK, демонструють дещо вищу стійкість у порівнянні з контрольними варіантами до помірного сольового стресу (50 мМ NaCl) (рис. 12). Можливим механізмом такого підвищення стійкості є покращення гомеостазу K+ рослин. Можна впевнено стверджувати, що надекспресія гена OsTPKa призводить до суттєвого підвищення показників посухостійкості рослин та зменшення вмісту цитотоксичного Na+ у пагонах (активних біосинтетичних тканинах). Цілком імовірно, що тканини трансгенних рослин з надекспресією генів OsTPKa та OsTPKb мають більший вміст іонів K+ у порівнянні з диким типом. Na+ є головним конкурентом K+.

Рис. 9. Ріст рослин мутантних ліній із надекспресією AtTPK1 та дикого типу в умовах осмотичного стресу, а саме в присутності сорбітолу у різних концентраціях 180 мМ та 200 мМ

Рис. 10. Фенотипи рослин (a) та структура алейронового шару незрілого насіння рису (b) дикого типу (Wt) та мутантних за геном OsTPKb ліній рису (mut). ал - клітини алейронового шару; в - вакуолі; я - ядра

Таким чином, рослини із надекспресією генів OsTPKa та OsTPKb, що мають покращений гомеостаз K+, будуть накопичувати у своїх тканинах суттєво меншу кількість цитотоксичного Na+. Імовірно, що білок OsTPKb відіграє важливу роль і при регуляції водного стресу, і при проростанні насіння та захисті його клітин від токсичного впливу Na+. За своїми показниками приросту в умовах сольового стресу, зазвичай, OsTPKb трансформанти мали індекси росту дещо вищі, ніж у рослин, трансформованих геном OsTPKa. Отже, у ході експериментів було виявлено, що трансформація рису генами білків калієвих каналів родини ТРК може суттєво підвищити показники соле- та посухостійкості рослин.

Рис. 11. Відносний приріст маси (a) та вміст іонів Na+ у тканинах (b) OsTPKa-трансформантів та контрольних рослин за умов дії різних типів стресів: К - нетрансформовані контрольні рослини, OsTPKaox - трансформанти із підвищеним рівнем експресії OsTPKa. Контроль - стандартне поживне середовище, 0 К+ - середовище без калію (дефіцит калію), 50мМ NaCl - середовище із додаванням 50мМ NaCl (сольовий стрес), 20% PEG - середовище із додаванням поліетилегліколю 4000 до кінцевої концентрації 20% (водний стрес), 0 К+ 50мМ NaCl - середовище без калію із додаванням 50мМ NaCl (сольовий стрес та дефіцит калію), 0 К+ - середовище без калію (дефіцит калію)

Підтримання високих концентрацій K+ у цитоплазмі щодо Na+ у рослинних тканинах може посилювати стійкість рослин до осмотичного та сольового стресів. Наші дані чітко демонструють, що надекспресія генів білків вакуолярних каналів родини ТРК рису знижує чутливість рослин до дефіциту K+ та покращує їхню стійкість до осмотичного та сольового стресів. Канали OsTPKa та OsTPKb є дуже подібними за своєю структурою, мають схожі біофізичні характеристики та активуються 14-3-3 білками. Проте, відповідно до результатів наших експериментів, ТРК-канали рису (OsTPKa та OsTPKb) локалізуються у вакуолях різних типів. Канал OsTPKa міститься у тонопласті літичної вакуолі, а мембрана малих протеїнових вакуоль має білок OsTPKb (рис. 13). Отже, отримані результати свідчать про те, що, незважаючи на високий рівень ідентичності і за нуклеотидною послідовністю, і за амінокислотною композицією, білки OsTPKa та OsTPKb мають різну не лише клітинну локалізацію, а і вакуолярну. Відповідно до результатів експериментів з колокалізацією OsTPKa та OsTPKb із маркерними білками протеїнових чи літичних вакуоль, а саме ?-TIP-GFP чи ?-TIP-EYFP, було чітко показано, що ці два калієві канали локалізуються у вакуолях різних типів (рис. 13). До того ж, для підтвердження результатів експериментів було також перевірено значення рН вакуолярного соку протопластів, трансформованих генами OsTPKa або OsTPKb. Канал OsTPKb локалізувався у мембранах малих вакуоль, що мали нейтральне значення рН. Проте вакуолярний сік компартментів, що містили білок OsTPKa, мав кисле середовище. Таким чином, всі результати проведених експериментів чітко свідчать про різницю у вакуолярній спеціалізації цих двох подібних за своєю структурою та біофізичними характеристиками транспортних білків. Слід зазначити, що транспорт мембранних білків, зокрема -TIP, до превакуолярних компартментів чи мембранних утворень, подібних до протеїнових вакуоль, може проходити безпосередньо з ендоплазматичного ретикулюму до органели призначення без залучення апарату Гольджі (Oufattole еt al., 2005).

Рис. 12. Відносний приріст маси в OsTPKb-трансформантах та контрольних рослинах за умов дії різних типів стресів: К - нетрансформовані контрольні рослини, OsTPKbox - трансформанти із підвищеним рівнем експресії OsTPKb. Контроль - стандартне поживне середовище, 0 К+ - середовище без калію (дефіцит калію), 50мМ NaCl - середовище із додаванням 50мМ NaCl (сольовий стрес), 20% PEG - середовище із додаванням поліетилегліколю 4000 до 20% кінцевої концентрації (водний стрес)

Рис. 13. Коекспресія OsTPKa та OsTPKb із маркерами для літичних та протеїнових вакуоль. (a) Колокалізація OsTPKb-RFP із д-TIP-GFP. (b) Коекспресія OsTPKa:RFP та д-TIP:GFP. (с) Коекспресія OsTPKb:RFP та г-TIP:EYFP. (d) Флуоресценція OsTPKb-EYFP та OsTPKa-RFP у протопластах мезофілу рису, котрансформованих конструкціями, що кодують ці білки Шкала = 5 мкм

Для того щоб з'ясувати, чи відбувається транспорт білків OsTPKa та OsTPKb до своїх органел призначення із залученням апарату Гольджі, було застосовано брефелдін А. Цей грибний антибіотик інгібує транспорт білків між ендоплазматичним ретикулюмом та апаратом Гольджі шляхом порушення мембранної цілісності апарату Гольджі. Вдалось з'ясувати, що брефелдін А суттєво впливає на характер локалізації білка OsTPKa та призводить до його локалізації у везикулярних структурах, подібних до протеїнових вакуоль. На відміну від OsTPKa, характер локалізації білка OsTPKb не змінювався при обробці протопластів брефелдіном А (рис. 14).

Рис. 14. Вплив брефелдіну А на клітинну локалізацію OsTPKa та OsTPKb у клітинах тютюну і протопластах рису та ячменю. (a) Флуоресценція OsTPKa:EYFP в епідермальних клітинах тютюну. Флуоресценція OsTPKa-EYFP в клітинах, оброблених брефелдіном А (bref). (b) Експресія OsTPKa:EYFP в протопластах рису. (с) Експресія OsTPKb:EYFP в протопластах рису. (d та е) Розподіл флуоресценції EYFP між літичними (LV) та протеїновими вакуолями (PSV) у контрольних і оброблених брефелдіном А трансформованих протопластах рису (d) та ячменю (е). Шкала = 5 мкм

Отже, результати експериментів свідчать про те, що транспорт білка OsTPKa відбувається із залученням систем апарату Гольджі, проте транспорт білка OsTPKb до протеїнових вакуоль може проходити без використання цієї органели. Клітинна локалізація білків дуже тісно пов'язана із їхніми функціональними характеристиками та залежить від типу і механізму клітинного транспорту цих білків до кінцевого пункту призначення. Для розуміння механізмів різної клітинної локалізації білків OsTPKa та OsTPKb нами було створено серію химерних протеїнів, що складаються з різних частин одного та іншого калієвого каналу. Застосування такого підходу дало змогу зрозуміти та ідентифікувати потенційну ділянку каналу, що відповідає за вакуолярне розпізнавання цих двох транспортних білків (рис. 15). Зокрема, було показано, що саме присутність цитозольного C-кінця білка OsTPKb у химерах є необхідною умовою для локалізації цих білків у протеїнових вакуолях. Подальші дослідження із заміною невеликих ділянок C-кінця білка OsTPKa на відповідну з білка OsTPKb показали, що ділянка С-кінця між двома коровими EF-мотивами надзвичайно важлива для подальшого вакуолярного розпізнавання цих двох білків.

Рис. 15. Клітинна локалізація OsTPKa-OsTPKb химерних білків у протопластах рису. Ліворуч - вторинна структура, що складається із доменів OsTPKa (синій колір) та із ділянок OsTPKb (зелений колір). LV - літичні вакуолі, PSV - протеїнові вакуолі, ER -ендоплазматичний ретикулюм. (a) Химера, що містить 50% OsTPKa та 50% OsTPKb. (b та c) Химери, що мають четвертий трансмембранний домен із С-кінцем OsTPKb (b) чи мають лише ділянку з С-кінцем OsTPKb (с). (d) Химера, де ділянка С-кінця OsTPKb була скорочена, але містила обидва EF-мотиви. Шкала = 5 мкм

Окрім того, було виявлено, що перший коровий EF-мотив в OsTPKa може бути задіяний у механізмах вивільнення білка з ендоплазматичного ретикулюму, а мутації у цьому регіоні призводять до затримки транспорту з цієї клітинної органели, але не викликають змін у адресації цього білка. Отже, можна зробити висновок, що амінокислотна послідовність між двома коровими EF-мотивами у С-кінці є важливим детермінантом вакуолярного розпізнавання. Згідно з результатами наших експериментів саме ділянка С-кінця між EF-мотивами є ключовою для вакуолярного розпізнавання та адекватної клітинної адресації цих калієвих каналів.

Рис. 16. Клітинна локалізація мутованих у C-кінці OsTPKa білків у протопластах рису. Орієнтовна позиція мутованого амінокислотного залишку OsTPKa позначена «блискавкою». LV - літичні вакуолі, PSV - протеїнові вакуолі, ER - ендоплазматичний ретикулюм. (a) Мутація OsTPKa V303L. (b) Мутація OsTPKa K326N. (с) Мутація OsTPKa N313S. (d) Подвійна мутація OsTPKa V303L та N313S. Шкала = 5 мкм

Для того щоб з'ясувати, чи існують у цій ділянці специфічні та унікальні амінокислотні залишки, які є важливими для вакуолярного розпізнавання, було проведено серію експериментів із застосуванням сайт-направленого мутагенезу для заміни амінокислотних залишків саме у цій області та інших важливих областях С-кінця. Мутовані гени калієвих каналів родини ТРК були експресовані в протопластах рису. Відповідно до отриманих результатів мутації у EF-мотивах не призводили до значних змін у локалізації химерних білків. У подальшому було проведено серію амінокислотних замін поза межами корових EF-мотивів, що були різними у білків OsTPKa та OsTPKb. При проведенні заміни валіну в позиції 303 на залишок лейцину в послідовності білка OsTPKa відбувалось часткове зміщення в клітинній локалізації. 65% протопластів містили цей мутантний білок у літичних вакуолях та близько 30% протопластів у протеїнових вакуолях (рис. 16). Отже, відповідно до результатів цих експериментів залишок лейцину у OsTPKb має важливе значення для органельної адресації. При заміні лужного лізину в позиції 326 на кислий аспарагін у послідовності OsTPKa також відбувались зміни у клітинній локалізації. Приблизно однакова кількість трансформованих протопластів демонструвала флуоресценцію або в літичних вакуолях, або в протеїнових. Заміна аспарагіну в положенні 313 на нейтральний серин також призводила до подібних змін у клітинній локалізації, а саме мутований білок розподілявся порівну між протеїновими та літичними вакуолями. Таким чином, вищезазначені амінокислотні заміни мали значний вплив на характер клітинної локалізації мутованих білків. Для підтвердження цього припущення ми також провели подвійну заміну амінокислот у С-кінці визначеної ділянки білка OsTPKa. Проведення подвійної амінокислотної заміни, а саме V303L та N313S, кардинально змінювало характер клітинної локалізації мутованого білка OsTPKa і призводило до його накопичення у тонопласті протеїнових вакуоль (рис. 16). Отже, в ході експериментів із застосуванням сайт-направленного мутагенезу були ідентифіковані три амінокислотні залишки, що суттєво впливають на характер клітинної локалізації та відповідають за органельну адресацію до протеїнових вакуоль. Заміни у послідовності білка OsTPKa валіну на лейцин у положенні 303, аспарарагіну на серин у положенні 313 та лізину на аспарагін у положенні 326 призводили до зміни у вакуолярній локалізації. Отже, лейцин у положенні 303, серин у положенні 313 та аспарагін у положенні 326 є головними детермінантами локалізації у протеїнових вакуолях. Біоінформатичний аналіз цієї ділянки послідовності вказує на те, що серин у положенні 313 може бути потенційним сайтом для фосфорилювання.

Клітинна локалізація представників двопорових калієвих каналів із тютюну. У рослин тютюну було знайдено два представники каналів родини ТРК. За іронією обидва представники цих каналів анотовані як NtTPK1. Для полегшення та запобігання непорозуміння ми застосували для них дещо інші назви, а саме NtTPK1а (GenBank accession № EU161633) та NtTPK1b (GenBank accession № AB353341). Функції, клітинна локалізація та фізіологічна роль цих каналів вивчені ще недостатньо. Слід також зазначити, що рівень транскриптів гена цього каналу зростає за умов дії сольового та осмотичного стресів. Функції та клітинна локалізація білка NtTPK1b залишаються майже зовсім невідомими. Нами було проведено клонування та створення химерних генів, які кодують ці канали, злиті із EYFP. Результати порівняння клітинних профілів флуоресценції цих химерних білків, злитих із EYFP, виявили різну вакуолярну спеціалізацію цих двох TPK-каналів з тютюну. Отримані дані підтверджують припущення інших авторів, що білок NtTPK1а міститься у тонопласті літичної вакуолі. Проте характер клітинної локалізації для білка NtTPK1b був зовсім іншим. Накопичення білка цього каналу спостерігалось у везикулярних структурах, подібних до протеїнових вакуоль (рис. 17). Отже, є велика доля вірогідності, що саме цей канал є специфічним для мембрани білкових вакуоль. Однак необхідно визначити реакцію рН цих малих везикулярних утворень, провести дослідження із ко-локалізації цього каналу з іншими маркерними білками для окремих клітинних структур.

Рис. 17. Клітинна локалізація білків NtTPK1a та NtTPK1b у протопластах A. thaliana. (a) Флуоресценція EYFP у протопластах, що були трансформовані плазмідними конструкціями NtTPK1a:EYFP та NtTPK1b:EYFP (b) Розподіл EYFP-флуоресценції NtTPK1a та NtTPK1b між різним клітинними структурами. ЕР - ендоплазматичний ретикулюм; Вез - везикули, ЛВ - літичні вакуолі. Шкала = 10 мкм

Формування функціональної системи транспорту К+ двопоровими калієвими каналами з A. thaliana та рису в мутантній лінії E. coli LBA2003. Характеристики деяких калієвих каналів родини ТРК інтенсивно вивчаються протягом останнього часу. Проте, на відміну від білка AtTPK1, функції багатьох білків калієвих каналів родини ТРК вивчені недостатньо, а у деяких випадках залишаються ще нез'ясованими. Для того щоб з'ясувати, чи можуть представники ТРК з A. thaliana (AtTPK 1, 2, 3, 4, 5) та рису (OsTPKа та OsTPKb) забезпечувати транспорт К+ в гетерологічних системах, було проведено експресію генів цих каналів у мутантній лінії E. coli LB2003, дефектної за системами поглинання цього іону (Trk та Kdp). Результати проведених досліджень свідчать про те, що білки ТРК-каналів рослин можуть формувати функціональні транспортні системи калію в штамі E. coli LB2003. При експресії генів двопорових каналів OsTPKa, OsTPKb та AtTPK1, 2, 5 у мутантній лінії E. coli ріст бактеріальної культури на середовищі із низьким вмістом калію відновлювався до рівнів росту дикого типу (рис. 18). При інкубації на середовищі з низьким вмістом цього іона чистий приток K+ у клітинах, що експресують AtTPK, був подібний до клітин, трансформованих пустим вектором, та втрата цього елемента складала близько 0,5 нмоль/год. Проте більшість бактеріальних культур з експресією генів каналів родини ТРК демонстрували позитивну динаміку у поглинанні цього елемента. Клітини з експресією AtTPK1 та AtTPK2 демонстрували рівень поглинання K+ дещо нижчий, ніж клітини дикого типу, трансформовані пустим вектором, а найвищий рівень поглинання цього елемента спостерігався для клітин, трансформованих AtTPK5, OsTPKa та OsTPKb.

Рис. 18. Ріст (a) та поглинання K+ (b) трансформованими клітинами E. coli дикого типу (Wt) та мутантного штаму LB2003 на середовищах із різним вмістом К+. Клітини дикого типу (WT-EV), мутант LB2003, трансформований пустим вектором (EV), та мутантні клітини, трансформовані конструкціями, що несуть AtTPK1, 2, 3, 5 та OsTPKa, OsTPKb, культивували на рідкому поживному середовищі, яке містило різні концентрації КCl. (b) Негативні значення означають втрату K+ бактеріальними клітинами

Варто також зазначити, що рівень притоку K+ у бактеріальних культурах, трансформованих генами білків OsTPKa, OsTPKb та AtTPK5, був вполовину нижчим, ніж у бактеріях дикого типу (рис. 18). Однак отримані нами результати чітко вказують на здатність більшості каналів родини ТРК із A. thaliana та білків OsTPKа та OsTPKb формувати функціональну та потужну систему транспорту калію в E. coli.

Роль фосфатних транспортерів у поглинанні AsV рослинами.

У ході еволюції рослини або не набули, або втратили функцію розпізнавання та специфічного транспорту AsV. Завдяки своїм подібним фізико-хімічним властивостям з фосфатами цей елемент потрапляє в тканини рослин за допомогою фосфатних транспортерів. Симбіотичне утворення гриба та рослини - арбускулярна мікориза - забезпечує до 80% рослинних потреб у фосфорі. У результаті проведених нами експериментів було з'ясовано, що симбіотичні гриби чітко індукують експресію гена лише одного фосфатного транспортера, а саме білка MtPT4. Проте існують деякі розбіжності у характері експресії інших генів фосфатних транспортерів у залежності від виду гриба. Зокрема, арбускулярні гриби трьох тестованих видів негативно регулюють експресію більшості генів фосфатних транспортерів, а саме білків MtPT1, 3, 5 та 6 для G. intraradices, MtPT3 та 6 для G. mosseae, MtPT1, 3, та 6 для G. rosea. Окрім того, відповідно до даних наших досліджень фосфатний транспортер MtPT5 є специфічним для кореневих волосків та епідермальних клітин і може відігравати важливу роль у безпосередньому поглинанні фосфатів, а, можливо, і AsV із ґрунту. Окрім того, згідно з результатами наших експериментів пригнічення експресії генів деяких фосфатних транспортерів, що можуть брати участь у транспорті As, можна досягнути шляхом колонізації рослин відповідним видом гриба-симбіонта.

Роль NIP-аквапоринів у транспорті сполук арсену в рослинах

NIP-аквапорини рослин можуть бути потенційною групою транспортерів, які беруть участь у двонаправленому транспорті AsIII. Мутанти A. thaliana, що втратили функцію деяких NIP-транспортерів, були проаналізовані за багатьма показниками, а саме поглинання та видалення As, міжтканинної транслокації та накопичення цього елемента у вакуолях. Результати наших досліджень вказують на те, що всі ці мутанти мають фенотип, асоційований із ефектами As. Таким чином, NIP-транспортери можуть брати участь у різних аспектах транспорту As у рослинах A. thaliana.

Рис. 19. Вплив експресії AtNIP7;1 у різних лініях дріжджів на поглинання та стійкість до As. (a) Експресія AtNIP7;1 у дріжджах дикого типу та мутантних лініях acr3Д чи fsp1Д підвищує чутливість до AsIII. (b) Експресія AtNIP7;1 у лінії acr3Д покращує стійкість дріжджів цієї лінії до AsV. (с) Експресія AtNIP7;1 у лінії fsp1Д зменшує рівнь поглинання As

Отримані нами результати свідчать на користь того, що аквапорин AtNIP7;1 може забезпечувати поглинання AsIII при експресії гена цього білка в різних генотипах дріжджів, а саме acr3Д (чутливий до As) та fps1Д (стійкій до As) (рис. 19). Наші дані також вказують на те, що білок AtNIP7;1 може пропускати AsIII і у зворотньому напрямку, таким чином покращуючи стійкість до AsV за допомогою зменшення рівня накопичення AsIII (рис. 19). Однак подальші результати досліджень функцій аквапорина AtNIP7;1 у рослин вказують на те, що ця ізоформа NIP не впливає на видалення тривалентної форми As з рослин, проте може відігравати важливу роль у накопиченні та транслокації цього елемента (рис. 20).

Обидві мутантні лінії A. thaliana nip7;1-1 та nip7;1-2 демонстрували значно кращі темпи росту у порівнянні із рослинами дикого типу при культивуванні на середовищі, що містило AsIII, але не AsV (рис. 20). Результати наших досліджень також свідчать про те, що втрата функції AtNIP7;1 у рослинах покращує стійкість A. thaliana до As та зменшує поглинання AsIII коренями. Отже, відповідно до даних наших експериментів, білок AtNIP7;1 бере участь у поглинанні AsIII рослинами.

Рис. 20. Аналіз приросту маси (a) та вмісту As (b, c, d) у мутантних лініях AtNIP7;1 та рослинах дикого типу A. thaliana (a). (b) Загальний вміст As у рослинах після вирощування на середовищах, що містили 7 мкM AsIII чи 100 мкM AsV. (c) Загальний вміст As у рослинах, що вирощували на гідропонному середовищі із 50 мкM AsIII протягом 6, 18 чи 40 годин. Значення різниці більше 5% позначене зірочками

Роль дріжджової системи ScACR3 видалення As у механізмах стійкості рослин до впливу цього металоїду.

Питання, чи мають вищі рослини активні системи видалення AsIII з клітин, залишається невідомим. Тому було вирішено провести трансформацію A. thaliana геном ScACR3 під контролем 35S промотора для оцінки можливості виведення As із рослин за допомогою дріжджової системи ScACR3. Для оцінки клітинної локалізації цього білка у клітинах рослин було проведено трансформацію протопластів A. thaliana конструкцією з химерним геном ScACR3:EYFP. Відповідно до отриманих нами результатів білок ScACR3 локалізується у плазматичній мембрані рослинної клітини (рис. 21).

Рис. 21. Локалізація ScACR3 у протопластах A. thaliana. (a) Протопласт у світлому полі. (b) Флуоресценція CFP маркера плазматичної мембрани AtPIP2;1-CFP. (c) Флуоресценція EYFP ScACR3-EYFP. (d) Накладання флуоресцентних сигналів від EYFP та CFP разом. Шкала = 10 мкм

Для того щоб оцінити, чи впливає на процеси росту рослин гетерологічна експресія ScACR3, була проведена трансформація рослин A. thaliana дикого типу (Col-0) та мутантної лінії nip7;1 (втрачена функція аквапорину AtNIP7;1) генетичною конструкцією, що несла цей ген (Isayenkov et al., 2008). Для кожного із цих типів трансформованих рослин було ідентифіковано декілька гомозиготних трансгенних ліній. Дві лінії були виявлені для рослин дикого типу (ACR-W1 та ACR-W2) та дві трансгенні лінії для мутантної групи nip7;1 (ACR-N1 та ACR-N2).

Рис. 22. Виживання (a) та вихід As (b) із протопластів контрольних та трансгенних ліній рослин, що зазнали дії AsIII (3,5 мM та 7 мM) чи AsV (190 мM). (b) Рівень As у зовнішньому середовищі через 6 годин після інкубацї на середовищі із 2 мM AsV. Різні літери зверху стовпчиків свідчать про достовірні різниці між різними рослинними групами (P < 0,05)

Рис. 23. Відносний приріст проростків A. thaliana контрольних та трансгенних ліній (ACR-W1, ACR-W2, ACR-N1 та ACR-N2) на середовищах, що містили чи 10 мкМ AsIII, чи 160 мкм AsV. (b) Ріст проростків дикого типу та трансгенної лінії ACR-W1 на середовищі із 10 мкМ AsIII. Різні літери зверху стовпчиків свідчать про достовірні різниці між різними рослинними групами (P < 0,05)

Для з'ясування ролі білка ScACR3 у стійкості клітин до впливу сполук As була проведена оцінка життєздатності протопластів та аналіз кількості As, виведеного із протопластів. Відповідно до наших даних протопласти з експресією гена ScACR3 мали вищі показники життєздатності та виводили As значно краще, ніж контрольні лінії. Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що експресія ScACR3 підвищує стійкість клітин до As. Цілком імовірно, що таке підвищення стійкості є результатом посилення виведення цього елемента в клітинах трансгенних ліній (рис. 22). Вплив експресії гена дріжджового транспортера ScACR3 на стійкість до впливу As також був оцінений на рівні цілого організму. У роботі було показано, що при інкубації рослин на середовищі у присутності 10 мкM AsIII темпи приросту трансгенних ліній рослин знижувались на 55% проти 70% у рослин дикого типу (рис. 23). Таким чином, було з'ясовано, що експресія гена дріжджової системи видалення AsІІІ в A. thaliana підвищує стійкість рослин до впливу As і на клітинному рівні, і на рівні організму в цілому. Цілком імовірно, що механізм такої стійкості полягає у тому, що збільшення виведення AsІІІ у апопласт та/чи зовнішнє середовище зменшує токсичне навантаження цього елемента на цитоплазму.

Рис. 24. Загальний вміст As у пагонах та коренях рослин дикого типу та трансгенних ліній A. thaliana, що інкубувались протягом 24 годин на гідропонному середовищі із 10 мкМ AsV. Загальний вміст As (нмоль/г) у пагонах та коренях трансгенних ліній (ACR-W1, ACR-W2, ACR-N1 та ACR-N2) разом з відповідними контрольними лініями (WT та nip7;1). Різні літери зверху стовпчиків свідчать про достовірні різниці між різними рослинними групами (P < 0,05)

Висновки

У роботі проведено комплексне дослідження та функціональна характеристика мембранних транспортних протеїнів рослин, які беруть участь у транспорті моновалентних іонів та металоїдів (As). Було продемонстровано участь цих мембранних транспортних білків у механізмах соле- та посухостійкості, іонного гомеостазу та детоксифікації. Розроблено модель транспорту іонів Na+/K+ у рослинах за участі мембранних транспортних протеїнів, зокрема родини HKT, TPK, NHX. Була доповнена та розвинена модель транспорту сполук на основі As в рослинних організмах. Запропоновано альтернативний механізм клітинної доставки OsTPK-білка до протеїнових вакуоль. Розроблено ефективні підходи для біотехнологічного та молекулярно-генетичного покращення важливих агрономічних та технологічних характеристик рослин, зокрема посухо- та солестійкості, збагачення на калій, зменшення або збільшення вмісту арсену.

1. Встановлено, що високі концентрації Na+ чи дефіцит K+ у зовнішньому середовищі призводять до підвищення рівня транскрипції гена Na+/K+-симпортера HvHKT2;1, що свідчить про участь цього транспортера у регуляції Na+/K+ балансу у рослин.

2. Продемонстровано, що білок HvHKT2;1 ячменю відіграє важливу роль у абсорбції чи реабсорбції K+ у коренях при дуже низьких концентраціях цього елемента. Надекспресія гена HvHKT2;1 у рослинах ячменю спричиняє транслокацію Na+ із коренів у пагони та листя, підвищує загальний вміст цього елемента в тканинах рослин та посилює накопичувальний фенотип ячменю, що призводить до підвищення солестійкості цих рослин.

3. У результаті кладистичного аналізу NHX-подібних послідовностей білків рослинного походження було продемонстровано існування чотирьох клад NHX-транспортерів. Виявлено нову кладу NHX-подібних послідовностей, до якої належить білок AtNHX3 з A. thaliana.

4. З'ясовано, що експресія гена протонно-натрієвого обміннику HvNHX2 ячменю в клітинах тютюну покращує солестійкість цих рослин. Одночасно індукція експресії гена протонно-натрієвого обмінника HvNHX4 ячменю відбувається за умови дії лише сольового, а не осмотичного стресу.

5. Встановлено, що білок AtTPK1 бере участь у вивільненні К+ з вакуолі продихових клітин і, відповідно, впливає на процес закриття продихів, що свідчить про участь цього каналу у регуляції водного гомеостазу рослини. Рослини з надекспресію гена AtTPK1 демонструють значно вищий рівень стійкості до дії осмотичного стресу, ніж рослини дикого типу та мутантних ліній, що вказує на участь даного каналу у регуляції осмотичного стресу.

6. Виявлено, що функціонування двопорового каналу AtTPK1 є відносно незалежним від дії абсцизової кислоти. Робота цього білка є важливою у забезпеченні процесу проростання насіння і може компенсувати результати негативного впливу абсцизової кислоти на процес проростання.

7. Підтверджено, що функціонування двопорового калієвого каналу OsTPKb є життєво важливим для росту та розвитку рослин. Виявлено, що цей двопоровий калієвий канал відіграє незамінну роль у процесах формування зернівок рису.

8. Показано, що надекспресія гена калієвого каналу OsTPKa у рослин рису призводить до покращення показників посухостійкості та зменшення накопичення Na+ у тканинах, проте посилення експресії OsTPKb покращує показники приросту рослин при дії сольового стресу сильніше, ніж при дії осмотичного стресу.

9. Встановлено різну вакуолярну локалізацію двопорових калієвих каналів рису, а саме OsTPKa та OsTPKb. Виявлено, що калієвий канал OsTPKb локалізується у тонопласті протеїнових вакуоль, у той же час локалізація білка OsTPKa є характерною для мембран центральних літичних вакуоль. Продемонстровано, що транспорт білка OsTPKb до протеїнових вакуоль може відбуватись безпосередньо з ендоплазматичного ретикулюму до органели призначення без залучення апарату Гольджі.

10. Доведено, що ділянка С-кінця між двома коровими EF-мотивами калієвих каналів OsTPKa та OsTPKb є надзвичайно важливою для подальшого вакуолярного розпізнавання цих двох білків. Заміни у амінокислотній послідовності цієї ділянки залишку валіну у положенні 303 на залишок лейцину, залишку аспарарагіну у положенні 313 на залишок серину та залишку лізину у положенні 326 на залишок аспарагіну призводять до зміни вакуолярної локалізації білка OsTPKa. Можна припустити, що фосфорилювання залишку серину у положенні 313 відіграє суттєву роль у його адресній доставці у протеїнові вакуолі.

11. Незважаючи на велику спорідненість двопорових калієвих каналів із тютюну, а саме NtTPK1а та NtTPK1b, до білка AtTPK1 для них характерна різна субклітинна локалізація. Білок NtTPK1b накопичується у везикулярних структурах, відмінних від «класичних» літичних вакуоль.

12. Продемонстровано, що більшість каналів родини ТРК із A. thaliana (білки AtTPK1, 2, 5) та два білки двопорових каналів із рису, зокрема OsTPKa та OsTPKb, можуть формувати функціональну та потужну систему транспорту калію у клітинах E. coli.

13. Виявлено, що аквагліцеропорин AtNIP7;1 із A. thaliana забезпечує транспорт тривалентної форми арсену (AsIII) через плазматичну мембрану та відіграє важливу роль у процесах поглинання цієї форми As у рослин.

14. Встановлено, що експресія гена, який кодує активну систему видалення AsІІІ із дріжджів - ScACR3, в A. thaliana підвищує стійкість рослин до впливу арсену і на клітинному рівні, і на рівні організму в цілому. ScACR3 підсилює здатність рослин видаляти As з тканин та сприяє його перерозподілу з коренів до пагонів.

15. У цілому можна зробити висновок, що рослинні мембранні транспортери мінеральних сполук є важливими функціональними компонентами регуляції іонного гомеостазу, осмотичного та водного стресів, а також процесів детоксифікації у рослин.

Література

1. Ісаєнков С.В. Трансформація рису генами калієвих каналів родини ТРК покращує показники приросту маси рослин в умовах сольового та водного стресів/ С. В. Ісаєнков, A. Міан, Ф. Й. М. Маатхаус // Доп. НАН України. - 2015. - № 12. - C. 104-111. (Здобувачем проведено створення генетичних конструкцій, трансформація рису, фізіологічні тести з оцінки швидкості росту та маси рослин у різних стресових умовах, написання тексту статті).

2. Isayenkov S.V. Phylogenetic diversity analysis of plant NHX Na+/H+ exchangers / S.V. Isayenkov, D.O. Samofalova // Наукові доповіді НУБіП України. - 2015. - V. 55, № 6.

3. Iсаєнков С.В. Експресія гена протонно-натрієвого обміннику ячменю в рослинах тютюну покращує показники солестійкості / С. В. Iсаєнков, О. Е. Краснопьорова, Я. Б. Блюм // Фактори експериментальної еволюції організмів. - 2015. - Т. 17. - C. 174-178. (Здобувачем проведено створення генетичних конструкцій, трансформація рослин тютюну, молекулярно-біологічний аналіз трансформантів, фізіологічні тести, написано статтю).

4. Isayenkov S.V. The expression of rice vacuolar TPK channels genes restores potassium uptake in E. coli mutant strain LB2003 / S. V. Isayenkov, F. J. M. Maathuis // Cytology and Genetics. - 2015. - T. 49, № 1. - С. 1-5. (Здобувачем проведено створення генетичних конструкцій, трансформацію E. coli, молекулярно-біологічний аналіз трансформованих клітин, фізіологічні тести з оцінки швидкості росту та аналізу вмісту калію, написання статті).

5. Isayenkov S.V. Molecular aspects of endosomal cellular transport / S. V. Isayenkov, A. S. Sekan, B. V. Sorochinsky, Ya. B. Blume // Cytology and Genetics. - 2015. - Т. 49, № 3. - С. 192-205. (Здобувачем проведено написання статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, порівняння результатів досліджень різних авторів із даними власних експериментів, розроблено модель транспорту білків та інших сполук у різні клітинні компартменти).

6. Isayenkov S.V. Phenotypic analysis of OsTPKb loss of function mutant rice lines / S. V. Isayenkov, A. Miam, F. J. M. Maathuis // Biotechnol. Acta. - 2015. - Т.8, № 4. - С. 122-127. (Здобувачем проведено ідентифікацію гомозиготних мутантних OsTPKb ліній, їхній молекулярно-біологічний та фенотиповий аналіз, підготування зразків насіння для електронної мікроскопії, написання статті).

7. Isayenkov S.V. The overexpression of gene encoding rice potassium channel -- OsТРКa increases the salt and drought tolerance of plants / S. V. Isayenkov, A. Miam, F. J. M. Maathuis // Biotechnol. Acta. - 2015 - Т.8, №2. - С. 78-83. (Здобувачем проведено створення генетичних конструкцій, трансформацію рису, молекулярно-біологічний аналіз трансформованих рослин, фізіологічні тести, аналіз накопичення іонів натрію в різних частинах рослин, написання статті).

8. Iсаєнков С.В. Експресiя генiв калiєвих каналiв родини ТРК та Na+/H+ обмiнника родини NHX ячменю за умов сольового та водного стресів / С. В. Iсаєнков, О. Е. Краснопьорова // Доп. НАН України. - 2015. - № 3. - C. 152-156. (Здобувачем проведено транскрипційний аналіз, дизайн експериментів, написання статті).

9. Ісаєнков С.В. Філогенетичний аналіз потенційних калієвих каналів родини ТРК рослинного походження / С. В. Ісаєнков, Д. О. Самофалова // Наукові доповіді НУБіП України. 2015. - Т. 51, № 2. - http://nbuv.gov.ua/j-pdf/Nd_2015_5/2.pdf. (Здобувачем проведено біоінформаційний пошук та відбір потенційних амінокислотних послідовностей транспортерів родини ТРК, опис структури цих протеїнів, узагальнення даних, написання статті).

10. Iсаєнков С.В. Клонування та особливостi клiтинної локалiзацiї калiєвих каналiв родини TPK iз тютюну / С. В. Iсаєнков, Ф. Й. М. Маатхаус // Доп. НАН України. - 2014. - № 10. - C. 154-160. (Здобувачем проведено клонування генів каналів родини ТРК із тютюну, створення генетичних конструкцій із геном маркерного білку GFP, виділення та трансформацію протопластів, конфокальна мікроскопія, написання статті).

11. Isayenkov S.V. Plant Vacuoles: Physiological Roles and Mechanisms of Vacuolar Sorting and Vesicular Trafficking / S. V. Isayenkov // Cytology and Genetics. - 2014. - Т. 48, № 2. - С. 127-137. (Здобувачем проведено написання статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, порівняння результатів досліджень різних авторів із результатами власних досліджень, розробку моделі внутрішньоклітинного транспорту білків до різних типів вакуоль та їхньої ролі у процесах життєдіяльності клітини рослин).

12. Ісаєнков С.В. Функціональна експресія генів вакуолярних калієвих каналів родини ТРК арабідопсису в мутантній лінії Escherchia coli LBA2003 / С. В. Ісаєнков, Ф. Й. М. Маатхаус // Доп. НАН України. - 2013. - № 7. - C. 146-150. (Здобувачем проведено клонування генів калієвих каналів із A. thaliana, створення генетичних конструкцій для трансформації E. coli, трансформація мутантної лінії E. coli, аналізу експресії трансгенів у трансформованих клітинах, проведення фізіологічних тестів, написання статті).

13. Ісаєнков С.В. Транспортні системи тонопласту рослинних вакуоль та їхнє потенційне застосування у біотехнології / С. В. Ісаєнков // Biotechnol. Acta. - 2013. - Т.6, № 3. - С. 9-22. (Здобувачем проведено написання статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, порівняння результатів досліджень різних авторів із даними власних експериментів, розробка моделі транспорту різноманітних сполук за допомогою протеїнових вакуоль, рекомендації щодо використання деяких мембранних транспортних протеїнів у біотехнології рослин, а саме у біофортифікації та фіторемедіації).

14. Isayenkov S.V. Arabidopsis thaliana vacuolar TPK channels form functional K+ uptake pathways in Escherichia coli / S. V. Isayenkov, F. J. M Maathuis // Plant Signal. Behav. - 2013. - V. 8, № 7. - e24665. (Здобувачем проведено клонування генів калієвих каналів із A. thaliana, створення генетичних конструкцій для трансформації мутантній лінії E. coli, трансформація лінії LB2003, молекулярно-біологічний аналіз трансформованих клітин, фізіологічні тести з оцінки швидкості росту культур, оцінка накопичення та поглинання іонів калію трансформованими культурами LB2003, написання тексту статті).

15. Ali W. Heterologous expression of the yeast arsenite efflux system ACR3 improves Arabidopsis thaliana tolerance to arsenic stress / W. Ali, J. C. Isner, S. V. Isayenkov, W. Liu, F.J. Zhao, F. J. М. Maathuis // New Phytol. - 2012. - V.194, № 3. - P.716 - 723. (Здобувачем проведено виділення та клонування гена ACR3 із дріжджів, створення генетичних конструкцій для експресії цього гена в рослинах, створення конструкції для експресії химерного ACR3:EYFP, трансформація рослин A. thaliana, проведення молекулярно-біологічного аналізу трансформованих рослин, виділення та трансформація протопластів, конфокальна мікроскопія, аналіз та інтерпретація даних).

16. Isayenkov S.V. Physiological and molecular aspects of salt stress in plants/ / S. V. Isayenkov // Cytology and Genetics. - 2012. - Т.46, № 5. - С. 302-318. (Здобувачем написано текст статті, проаналізовано та узагальнено літературні джерела, порівняно результати досліджень різних авторів із даними власних експериментів, розроблено модель транспорту іонів калію, натрію та хлору в тканинах рослин, запропоновано нові підходи щодо використання мембранних білків транспорту моновалентних іонів для покращення показників солестійкості рослин).

17. Isayenkov S.V. Membrane localisation diversity of TPK channels and their physiological role / S. V. Isayenkov, J. C. Isner, F. J. Maathuis // Plant Signal. Behav. -2011. - V.6. № 8. - P. 1201-1204. (Здобувачем проведено написання тексту статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, порівняння результатів досліджень різних авторів із даними власних експериментів, проведення філогенетичного аналізу каналів родини ТРК, біоінформаційний аналіз профілів експресії генів, що кодують ТРК канали рису, проведення конфокальної мікроскопії та експериментів з протопластами).

18. Mian A. Over-expression of an Na+- and K+-permeable HKT transporter in barley improves salt tolerance / A. Mian, R. J. Oomen, S. Isayenkov, H. Sentenac, F. J. Maathuis, A. A. Vйry // Plant J. - 2011. - V. 68, №3. - P. 468-479. (Здобувачем проведено клонування гена HvHKT2;1, створення генетичної конструкції для трансформації рослин ячменю, молекулярно-біологічний та генетичний аналіз трансформантів, аналіз експресії гена HvHKT2;1 у різних тканинах рослин за допомогою ЗТ-ПЛР та ЗТ-ПЛР у реальному часі, фізіологічні тести, аналіз вмісту іонів калію та натрію в тканинах рослин).

19. Isayenkov S.V. Rice two-pore K+ channels are expressed in different types of vacuoles / S. V. Isayenkov, J. C. Isner, F. J. M. Maathuis // Plant Cell. - 2011. - V. 23, №2. - P. 756-768. (Здобувачем проведено клонування генів OsTPKa, OsTPKb, HvTPK1, ?-TIP, створення генетичних конструкцій для трансформації клітин листя тютюну та протопластів, розробка протоколу виділення протопластів із алейронового шару насіння рису, сайт-направлений мутагенез, створення химерних генів та генетичних конструкцій на основі них, проведення конфокальної мікроскопії, агробактеріальна інфільтрація листя, експерименти із застосуванням брефелдіну А, аналіз та узагальнення даних, написання тексту статті).

20. Isayenkov S.V. Vacuolar ion channels: Roles in plant nutrition and signaling / S. Isayenkov, J. C. Isner, F. J. M. Maathuis// FEBS Lett. - 2010. - V. 584, №. 10. - P. 1982-1988. (Здобувачем проведено написання статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, порівняння результатів досліджень різних авторів із даними власних експериментіві та обговорення результатів власних експериментів).

21. Ali W. Arsenite transport in plants / W. Ali, S. V. Isayenkov, F. J. Zhao, F. J. M. Maathuis // Cell Mol. Life Sci. - 2009. - V. 66, № 14. - P. 2329-2339. (Здобувачем проведено написання тексту статті, аналіз літературних джерел та їхнє узагальнення, філогенетичний аналіз аквапоринів, розробка моделі транспорту арсену в рослинних організмах).

22. Grunwald U. Overlapping expression patterns and differential transcript levels of phosphate transporter genes in arbuscular mycorrhizal, Pi-fertilised and phytohormone-treated Medicago truncatula roots / U. Grunwald, W. Guo, K. Fischer, S. Isayenkov, J. Ludwig-Mьller, B. Hause, X. Yan, H. Kьster, P. Franken // Planta. - 2009. - V. 229, № 5. - P. 1023-1034. (Здобувачем проведено постановку експерименту, транскрипційне профілювання методом ЗТ-ПЛР у реальному часі та макрочипів, мічення кДНК радіоактивним фосфором P33, біоінформаційний аналіз отриманих даних).

23. Isayenkov S.V. The Arabidopsis thaliana aquaglyceroporin AtNIP7;1 is a pathway for arsenite uptake / S. V. Isayenkov, F. J. М. Maathuis // FEBS Lett. - 2008. - V. 582, № 11. - P. 1625-1628. (Здобувачем проведено клонування гена AtNIP7;1, молекулярно-біологічний аналіз мутантних ліній A. thaliana, створення генетичної конструкції для трансформації дріжджів, трансформація дріжджів, крапельний тест, аналіз вмісту арсену в клітинах дріжджів мутантних ліній, написання статті).