Культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro: цитогенетический анализ и образование тритерпеновых гликозидов и флавоноидов

Образование физиологически активных веществ, в том числе флавоноидов и сапонинов в культуре каллусных клеток in vitro. Определение генетической нестабильности каллусной культуры княжика сибирского и выделение цитотипов по числу и структуре хромосом.

Рубрика Биология и естествознание
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 24.11.2018
Размер файла 14,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Культура княжика сибирского (atragene speciosa weinm.) in vitro: цитогенетический анализ и образование тритерпеновых гликозидов и флавоноидов

В.Ю. Дорофеев, Р.А. Карначук, С.В. Пулькина, Е.В. Комлева, В.Б. Дубина, Ю.В. Медведева Биологический институт Томского государственного университета

Аннотация

Получена клеточная культура Atragene speciosa Weinm. in vitro. В культуре каллусных клеток in vitro показано образование физиологически активных веществ, в том числе флавоноидов и сапонинов. Впервые проведены цитогенетические исследования по изучению генетической изменчивости клеток в каллусе княжика сибирского: обнаружена генетическая нестабильность каллусной культуры и выделено несколько цитотипов по числу и структуре хромосом. Для клеток меристематического типа каллусной культуры показана изменчивость в числе хромосом.

Ключевые слова: Atragene speciosa Weinm.; клеточная культура; in vitro; тритерпеновые гликозиды; сапонины; флавоноиды; полиплоидия; анеуплоидия; структурные перестройки хромосом.

Abstract

Atragene speciosa Weinm. can be used as nootropic, adaptogenic, etc. remedy for treatment of some diseases. Biological features of this species do not allow its cultivation. Atragene speciosa cell culture in vitro has been received. Formation of physiologically active substances, including flavonoides and triterpenoid saponins was discovered in the cells callus culture in vitro. Genetic instability of callus culture and several cytotypes on chromosomes number and aberration structure are found.

Key words: Atragene speciosa Weinm.; cell culture; in vitro; triterpenoid glycosides (saponins); flavonoids; polyploides; aneuploides; chromosomes structure.

флавоноид каллусный клетка хромосома

В народной медицине Востока издавна для лечения широкого спектра заболеваний используется княжик сибирский (Atragene speciosa Weinm.) [1]. Современные исследования показали ноотропное, адаптогенное и антиоксидантное действие этого растения [2]. Основными группами веществ княжика сибирского, отвечающими за фармакологическую активность, являются тритерпеновые гликозиды, флавоноиды и производные фенилэтанола [3, 4]. Как показали исследования препаратов с ноотропным действием, полученных из растений, они по своей активности превосходят такой препарат ноотропного ряда, как пирацетам. При этом практически отсутствуют побочные эффекты, а стоимость растительных препаратов такого класса намного ниже синтетических.

Однако препятствием для разработки лекарственных растительных препаратов являются ограниченность или отсутствие запасов сырья, связанные с особенностями биологии вида. Atragene speciosa Weinm. - лиана, и в силу такой специфики затруднена ее интродукция. Остается возможность введения княжика сибирского в культуру клеток in vitro, что позволяет получать экологически чистое сырье круглогодично, независимо от климатических условий. В настоящее время для некоторых видов созданы клеточные культуры in vitro, способные к синтезу вторичных соединений, продуцентами которых являются целые растения [5, 6].

Объект и методики исследования

Объектом исследования явилась каллусная культура клеток княжика сибирского, полученная от разных эксплантов интактных растений, растущих в окрестностях Степановки (г. Томск). Получение и культивирование каллуса проводили на оптимизированных питательных средах Мурасиге-Скуга с добавлением гормонов 2,4-Д (2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (б-нафтилуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин) в разной концентрации. Выращивание проводили в темноте с продолжительностью субкультивирования 30-40 сут.

В культурах каллуса с 5-го по 10-й пассаж и 70-го пассажа анализировали накопление тритерпеновых гликозидов (сапонины) и флавоноидов спектрофотометрическим методом. Метод определения количественного содержания флавоноидов основан на процессе комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия (III). Использовали 200-300 мг сухой массы клеток каллуса. Экстракцию проводили трижды 50% этиловым спиртом на водяной бане в течение 30 мин. Далее проводили спектрофотометрическое измерение суммы флавоноидов [7]. Для количественного определения сапонинов использовали 1 г сухой массы каллусных клеток. Экстрагировали трижды горячим ацетоном. Измеряли оптическую плотность водного раствора осажденных аммиаком сапонинов на спектрофотометре СФ-46.

Каллусная культура 10-го пассажа княжика сибирского in vitro была проанализирована на цитогенетическую стабильность. Определение митотической активности каллуса проводили с помощью темпоральной фиксации по одному образцу каллусной культуры с 9 до 18 ч в спирт-уксусной смеси в течение 6 ч. Для цитогенетического анализа 31 образец каллусной культуры 10-го пассажа фиксировали в спирт-уксусной смеси (3:1) в течение 6 ч с предварительной обработкой в 0,1% р-ре колхицина в течение 3 ч. Материал хранился в 80% спирте при температуре +4єС. Окрашивание проводили ацетогематоксилином по Смирнову [8]. Анализ стадий клеточного цикла и числа хромосом проведен на временных давленых препаратах. В исследовании использованы клетки меристематического типа [9].

Результаты и обсуждение

В лабораторных экспериментах было получено от разных эксплантов несколько линий клеточной культуры Atragene speciosa Weinm. При длительном культивировании в клеточной культуре княжика сибирского на твердой среде образуются физиологически активные вещества, в том числе тритерпеновые гликозиды и флавоноиды (табл. 1). Их уровень растет, достигая 80% содержания сапонинов по отношению к листьям целого растения. Содержание флавоноидов в клетках 70-го пассажа составило около 40% также в сравнении с листьями интактного растения. Возможно, изменение уровня сапонинов и флавоноидов является результатом генетической изменчивости в культуре in vitro, в основе которой лежит изменение плоидности [10].

Таблица 1 Содержание биологически активных веществ в каллусной культуре Atragene speciosa Weinm.

№ пассажа

Биологически активные вещества, %

Сапонины

Флавоноиды

5

0,050 ± 0,002

Следы

6

0,060 ± 0,008

Следы

7

0,040 ± 0,005

0,040 ± 0,020

8

0,026 ± 0,005

0,070 ± 0,030

9

0,030 ± 0,004

0,090 ± 0,030

10

0,040 ± 0,004

0,070 ± 0,040

70 (20 сут)

0,100 ± 0,010

0,100 ± 0,050

70 (40 сут)

0,145 ± 0,016

0,178 ± 0,038

Примечание. Данные в таблице представлены в виде средней арифметической с ошибкой.

В литературе имеются сведения о кариотипе дикорастущего княжика сибирского [11-13]. В изученных природных популяциях Восточной и Западной Сибири, Тувы и Северо-Востока европейской части СССР, по литературным данным, вид представлен растениями с диплоидным числом хромосом 2n=16. В кариотипе выявлены метацентрические и субметацентрические хромосомы и одна пара акроцентрических хромосом. Для растений популяции в окрестности г. Томска в кариотипе отмечены две пары спутничных хромосом (субакроцентрическая и акроцентрическая пары) [13].

Авторами впервые проведены цитогенетические исследования по изучению генетической изменчивости клеток каллуса княжика сибирского. Известно, что при введении в клеточную культуру растительные клетки теряют генетическую стабильность и наблюдается формирование высокого уровня полиплоидии и анеуплоидии [14]. Одним из важных факторов, нарушающих генетическую стабильность в культуре клеток, являются гормоны питательной среды [15]. Значительную роль играет видовая специфика [16]. Некоторые виды сохраняют стабильность морфологии хромосом при длительном культивировании каллуса [17].

Для клеток меристематического типа каллусной культуры показана изменчивость в числе хромосом, которая проявилась в наличии клеток с диплоидным числом хромосом (2n = 16), полиплоидией, анеуплоидией и структурными перестройками хромосом (табл. 2). Клетки округлые с одним крупным ядром, занимающим 1/3 площади клетки. Показано, что максимум митотической активности приходился на 12-14 ч и составил в среднем около 4%.

В клетках 10-го пассажа преобладающими оказались тетраплоидные клетки (29,6%), частота клеток с исходным диплоидным числом хромосом и триплоидией составила 22,9 и 21,9% соответственно. В небольшом проценте клеток отмечаются пента-, гекса-, гепта-, окта- и новемхромосомные числа (от 1,0 до 4,4%). В этой группе наибольший процент составили клетки с гексаплоидным числом хромосом (таб. 2). Анеуплоидия обнаружена в 10,8% клеток, в основном встречается гипердитриплоидия. Клетки со структурными перестройками хромосом отмечены в 3,1%. Наблюдалось преобладание гипертетраплоидных клеток с ацентрическими фрагментами, а гипо- и гипердиплоидия с дицентрическими хромосомами, гипертритетраплоидия с минихромосомами встречались очень редко (таб. 2).

В результате исследований установлено, что по числу хромосом в клетке можно выделить несколько типов каллусов:

I тип - полиплоидные и диплоидные клетки (48,4%): 1-й цитотип - 4х = 32; 2-й цитотип - 3х = 24; 3-й цитотип - 2n = 16;

II тип - диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные клетки (32,3%): 1-й цитотип - 4х = 32; А (анеуплоидия); 2-й цитотип - 3х = 24; А; 3-й цитотип - 2n = 16; 3х = 24; А; 4-й цитотип - 2n = 16; 4х = 32; А; 5-й цитотип - 2n = 16;

III тип - диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные и анеуплоидные со структурными перестройками (19,3%).

Таблица 2 Числа хромосом и аберрации хромосом в каллусной культуре княжика сибирского 10-го пассажа

Число образцов каллусной культуры

Число клеток

Частота клеток с разным числом хромосом, %

2n

Анеуплоидия

Анеуплоидия и структурные аберрации

16

24

32

40

48

56

64

72

Ацентрический фрагмент

Дицентрик

Мини хромосома

31

389

22,9

21,9

29,6

1,3

4,4

3,6

1,5

1,0

10,8

1,5

0,8

0,8

В III типе каллусных культур преобладали цитотипы 4x = 32; А; ацентрические фрагменты. Единично отмечались цитотипы 4x = 32; А; ацентрические фрагменты и дицентрические хромосомы, а также цитотипы 4x = 32; А; ацентрические фрагменты, дицентрические и мини-хромосомы.

Таким образом, цитогенетический анализ клеток каллусной культуры 10-го пассажа княжика сибирского показал, что разные цитогенетические аномалии генерируются в новый уровень плоидности и новые числа хромосом. Полиплоидия может являться значительным резервом изменчивости, которая реализуется в формировании стабильных каллусов разной плоидности, что является одним из способов промышленного получения клеточной культуры и ее вторичных метаболитов.

Литература

1. Бокова В.С., Краснов Е.А. К фитохимическому и фармакологическому исследованию княжика сибирского // Тезисы докладов межвузовской конференции «Изучение препаратов растительного и синтетического происхождения». Томск. 1978. Ч. 2. С. 14-16.

2. Шилова И.В., Краснов Е.А., Андреева Т.И. и др. Исследование химического состава надземных частей Atragene sibirica L. и ее культуры ткани // Материалы Всероссийского совещания. Томск: Изд-во ТГУ, 1998. С. 79-81.

3. Карначук Р.А., Клепикова Т.В., Шилова И.В. и др. Культура ткани Atragene sibirica L. - продуцент биологически активных сапонинов // Материалы Международного совещания. Новосибирск, 1998. С. 29.

4. Карначук Р.А., Краснов Е.А., Дорофеев В.Ю., Шилова И.В. Клеточная культура княжика сибирского - перспективный источник лекарственных средств // Материалы Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 182-183.

5. Shoyama Y., Nishioka I., Hatano K. IV. Aconitum spp. (Monkshood) // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III / Ed. by Y.P.S. Bajaj. With 208 Figures. Springer - Verlag Berlin Heidelberg, 1991. P. 68-73.

6. Schmauder H.-P., Doebel P. XIX Nigella spp.: in vitro culture, regeneration, and the formation of secondary metabolites // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III / Ed. by Y.P.S. Bajaj. With 208 Figures. Springer - Verlag Berlin Heidelberg, 1991. P. 311-336.

7. Минаева В.Г. Лекарственные растения Западной Сибири. Новосибирск: Наука, 1992. 231 с.

8. Пухальский И.А. и др. Практикум по цитологии и цитогенетике растений. М.: КолосС, 2007. 198 с.

9. Кунах В.А. Цитогенетическая разнокачественность штаммов листового и стеблевого происхождения культуры тканей Haplopappus gracilis (Nutt). Gray // Цитология и генетика. 1971. Т. V, № 3. С. 241-249.

10. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Адонин В.И., Губарь С.И. Продуктивность и генетическая структура клеточных популяций женьшеня Panax ginseng С.А. Mey в культуре in vitro // Биотехнология. 2003. № 3. С. 25-35.

11. Ростовцева Т.С. Числа хромосом некоторых видов семейства Ranunculaceae Juss. // Ботанический журнал. 1976. Т. 61. С. 1133-1137.

12. Беляев В.А., Сипливинский В.Н. Хромосомные числа некоторых видов Байкальской флоры // Ботанический журнал. 1977. Т. 62, № 8. С. 1132-1142.

13. Шрагер Л.Н., Малахова Л.А. Анализ кариотипов двух видов семейства Ranunculaceae // Ботанический журнал. 1979. Т. 64, №5. С. 731-734.

14. Bayliss M.V., Gould A.R. Chromosomal variability in plant tissue culture // International Review Cytology Suppl. 1980. Vol. 11A. P. 113-144.

15. Nagl W. Evidence of DNA amplification in the orchid Cymbidium in vitro // Cytobios. 1972. Vol. 5. P. 145-154.

16. Roy S.C. Chromosomal Variations in the Callus Tissues of Allium tuberosum and A. cepa Brief Report // Protoplasma. 1980. Vol. 102. P. 171-176.

17. Sengupta J., Jha S., Sen S. Karyotype Stability in Long-Term Callus Derived Plants of Crepis tectorum L. // Biologia Plantarum (Praha). 1988. Vol. 30. P. 247-251.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • Березовый гриб как стерильная форма фитопатогенного гриба трутовика скошенного семейства гименохеновых грибов. Знакомство с причинами образования чаги. Рассмотрение основных групп тритерпеновых сапонинов. Анализ схемы строения молекулы флавоноидов.

    дипломная работа [1,3 M], добавлен 12.01.2014

  • Синтез флавоноидов в растениях. Биологическая активность флавоноидов и их классификация. Определение антиоксидантной активности ДГК методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Изучение перекисного окисления липидов в присутствии дигидрокверцетина.

    дипломная работа [2,4 M], добавлен 25.06.2009

  • Особенности роста и развития растений. Культура и морфогенетические особенности каллусных тканей. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Применение культур растительной ткани. Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений.

    реферат [7,0 M], добавлен 22.09.2009

  • Культура ткани в размножении пшеницы. Гормональная регуляция в культуре ткани, схема контроля органогенеза. Роль гуминовых кислот в процессе стимуляции роста растений, их влияние на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.

    курсовая работа [1,9 M], добавлен 05.11.2011

  • Флавоноиды как обширная группа полифенольных соединений, генетически связанных друг с другом. Знакомство с основными особенностями идентификации биологически активных веществ спектрофотометрическим методом в экстрактах листьев красной и чёрной смородины.

    статья [68,9 K], добавлен 22.08.2013

  • Метод пульс-электрофореза для разделения ДНК индивидуальных хромосом. Выделение ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки и измерение конечной концентрации ДНК. Выделение ДНК из культивируемых клеток: лимфоцитов, прокариот, грибов и растительных клеток.

    контрольная работа [576,0 K], добавлен 11.08.2009

  • Получение регенерантов из каллусной ткани и изучение их свойств. Тестирование индукции каллусного потенциала двух сортов шалота с различными гормонами и гормональными комбинациями. Исследование свойств регенерантов на предмет хромосомных перестроек.

    практическая работа [763,8 K], добавлен 14.08.2015

  • Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их применение в генной инженерии. Реакция лигирования; рестриктазные операции. Использование метода амплификации сегментов ДНК в полимеразной цепной реакции.

    презентация [985,3 K], добавлен 17.08.2015

  • Методы трансгенеза в животноводстве. Использование половых клеток семенников. Факторы повышения экспрессии трансгенов в организме животных. Особенности пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro. Перспективы генно-инженерных работ в животноводстве.

    реферат [38,6 K], добавлен 26.09.2009

  • Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.

    статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.