Морфологические и физиологические особенности микроорганизмов-продуцентов

КАПСУЛЫ, СЛИЗИСТЫЕ СЛОИ И ЧЕХЛЫ

Некоторые бактерии (пневмококки, клебсиеллы и др.) образуют капсулу - слизистое образование, прочно связанное с клеточной стенкой, имеющее четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала, её толщина 0,2 мкм. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. В ее образовании участвует цитоплазматическая мембрана. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, содержащих аминосахара, и капсулы полипептидной природы, например, у сибиреязвенной бациллы.

Выявление капсул осуществляется методом негативного контрастирования. Капсула гидрофильна, она препятствует фагоцитозу бактерий.

Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование, выявляемое при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слизь - мукоидные экзополисахариды , не имеющие четких внешних границ. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом.

Кроме того, что бактериальные экзополисахариды синтезируются бактериями путем секреции их компонентов, существует и другой механизм их образования - при действии внеклеточных ферментов на дисахариды. В результате этого образуются декстраны и леваны.

Капсула и слизь предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, так как они гидрофильны и хорошо связывают воду, препятствуют действию защитных факторов макроорганизма и бактериофагов и могут являться запасом питательных веществ.

Чехлы - это более сложные структуры. Обычно они имеют и более сложный химический состав, например, у Sphaerotilus natans чехол содержит: сахаров - 36, гексозамина - 11, белка - 27, липида - 5,2, фосфора - 0,5 %.

Капсулы, слизистые слои и гликокаликс, как известно, определяют специфические свойства поверхности бактериальных клеток, и некоторые компоненты этих структур являются специфическими антигенами.

Капсулы также защищают бактерии от хищных простейших и от действия антибактериальных агентов животного (фагоциты, антитела) или растительного (микроцины) происхождения. Капсулы некоторых почвен- ных бактерий защищают их от постоянной угрозы высушивания.

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА

Это важный и обязательный структурный элемент большинства про- кариотных клеток, который располагается под капсулой или слизистым чехлом, или непосредственно контактирует с окружающей средой. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50 % сухого вещества клетки. Это прочная, упругая структура, служащая механическим барьером между протопластом и внешней средой, придающая клеткам определенную, присущую им форму и поддерживающая высокое осмотическое давление в клетке.

Концентрация солей в клетке, как правило, намного выше, чем в окружающей среде, и поэтому между ними существует большое различие в осмотическом давлении. Клеточная стенка механически защищает клетку от проникновения в нее избытка воды, то есть сдерживает высокое осмотическое давление в клетке. Она участвует в процессе деления клетки и транспорте метаболитов.

Клеточная стенка прокариот резко отличается от таковой у эукариота как по строению, так и по химическому составу. Она содержит специфические полимерные комплексы, которые остутствуют в других структурах клетки. Химический состав и строение клеточной стенки постоянны для определенного вида и являются важным признаком при идентификации.

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к бактериям, делятся на две большие группы. В 1884 г. датский ученый Х. Грам предложил метод окраски (впоследствии этот метод стали называть «окраска по Граму»), в результате которого бактерии делятся на грамположительные (сине-фиолетовый) и грамотрицательные (красный цвет).

Если фиксированные бактерии окрасить сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, то образуется окрашенный комплекс (генциа- новый фиолетовый в комплексе с йодом). В зависимости от строения клеточной стенки при последующей обработке спиртом этот комплекс либо удерживается, либо вымывается. Если бактерии остаются с сине- фиолетовой окраской, то это свидетельствует о том, что обработка окрашенного по Граму мазка бактерий спиртом вызывает сужение пор в пепти- догликане и тем самым задерживает краску в клеточной стенке. То есть бактерии окрашиваются грамположительно.

Наоборот, грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают краситель, обесцвечиваются и при обработке фуксином окрашиваются в красный цвет вследствие меньшего содержания пептидоглика- на (1 - 10 % массы клеточной стенки). В состав клеточной стенки бактерий входят семь различных групп химических веществ (табл. 3).



Таблица 3

Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий (Rose, 1971 г.; Freer, Salton, 1971 г.)

Компоненты клеточной стенки	Грам Положи тельные эубактерии	Грамотрицательные эубактерии
		Внутренний слой (пепти- догликановый)	Внешний слой (наружная кле- точная мембрана)
Пептидогликан	+	+	-
Тейхоевые кислоты	+	-	-
Полисахариды	+	-	+
Белки	±	-	+
Липиды	±	-	+
Липополисахариды	-	-	+
Липопротеины	-	±	+

Примечание. (+) - присутствуют; (-) - отсутствуют; (±) - не у всех.

Клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий резко различаются по химическому составу и по ультраструктуре.

У грамположительных бактерий клеточная стенка толще (от 20 до 80 нм), чем у грамотрицательных, и пептидогликан (синонимы муреин, мукопептид) составляет основную массу ее вещества (от 40 до 90 %). Под электронным микроскопом она выглядит как гомогенный электронно- плотный слой.

Пептидогликан представлен параллельно расположенными молекулами гликана, состоящего из остатков N-ацетилглюкозамина и N- ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью (цв. вклейка, рис. III).

Гликановые молекулы связаны поперечной пептидной связью. Отсюда название этого полимера - пептидогликан. Основу пептидной связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D- аминокислот, например, L-аланин - D-глутаминовая кислота - мезодиами нопимелиновая кислота - D-аланин. В пептидогликане грамположительных бактерий вместо мезодиаминопимелиновой кислоты часто содержится L-диаминопимелиновая кислота или лизин. Элементы гликана (ацетилглю- козамин и ацетилмурамовая кислота) и аминокислоты тетрапептида (мезо- диаминопимелиновая и D-глутаминовая кислоты, D-аланин) являются отличительной особенностью бактерии, поскольку отсутствуют у животных и человека.

Пептидогликан ковалентно связан с тейхоевыми кислотами (от греч. teichos - стенка). Это уникальный класс химических соединений, представляющих собой полимеры, построенные на основе рибита (пятиатомного спирта), остатки которого соединены между собой фосфодиэфирными связями. Поскольку это длинные линейные молекулы, они пронизывают весь слой пептидогликана, достигая поверхности клеточной стенки, и являются основными антигенами грамположительных бактерий. Остающиеся свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, таким образом, они определяют поверхностный заряд клетки. Сахарные компоненты тейхоевых кислот входят в состав рецепторов для некоторых бактериофагов и определяют возможность адсорбции фага на клеточной поверхности.

В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов и белков.

Входящие в состав клеточной стенки полисахариды, липиды могут ковалентно связываться с ее макромолекулами в отличие от белков, которые формируют на ее внешней поверхности отдельный слой.

Таким образом, основными компонентами клеточной стенки грамположительных бактерий являются три типа макромолекул: пептидогликаны, тейхоевые кислоты и полисахариды, которые, ковалентно связываясь, образуют сложную структуру с весьма упорядоченной пространственной организацией.

Строение клеточной стенки у грамотрицательных бактерий намного сложнее. У них обнаружена многослойная клеточная стенка. В ее состав входит гораздо большее число макромолекул разного химического типа (рис. 4). Пептидогликан образует только внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегая к цитоплазматической мембране. Для разных видов грамотрицательных бактерий его содержание колеблется в широких пределах и существенно меньше (5 - 10 %), чем у грамположительных бактерий. Химическая структура пептидогликана грамотрицательных бактерий в основном сходна со структурой пептидогликана грамположительных бактерий. Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липо- сахарида.

Рисунок 4 - Схема строения клеточной стенки и цитоплазматической мембраны грамотрицательных бактерий: Л - липид; П - протеин; ЛПС - липополисахарид.



Специфическим компонентом наружной мембраны является липопо- лисахарид сложного молекулярного строения, занимающий около 30 - 40 % поверхности и локализованный во внешнем слое. Он состоит из трех компонентов: липида А, базисной части, или ядра, и О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигоса- харидными последовательностями. Липополисахарид закреплен в наружной мембране липидом А, придающим токсичность липополисахариду, отождествляемому поэтому с эндотоксином. От липида А отходит базисная часть липополисахарида. Наиболее постоянной частью ядра липополиса- харида является кетодезоксиоктоновая кислота. О-специфическая цепь, отходящая от ядра липополисахарида, определяет серогруппу, серовар (разновидность бактерий, выявляемая с помощью иммунной сыворотки) выделенного штамма бактерий. Таким образом, с понятием липополисахарида связаны представления об О-антигене, по которому можно дифференцировать бактерии.

Помимо типичной клеточной стенки грамотрицательных бактерий, у некоторых представителей этой группы обнаружены дополнительные слои разной электронной плотности, располагающиеся с внешней стороны от наружной мембраны. Но до настоящего времени не ясно, относятся ли они к клеточной стенке, являясь результатом ее последующего усложнения, или же представляют собой структурные элементы многослойного чехла.

Атипичные клеточные стенки прокариот. У некоторых скользящих бактерий (миксобактерии, флексибактерии), способных в процессе перемещения по твердому субстрату периодически менять форму клеток, например, путем изгибания, была обнаружена нетипичная для грамотрицательных бактерий эластичная клеточная стенка. Объяснением такой гибкости клеточной стенки этих бактерий может быть особенность строения пептидогликанового компонента (низкая сшитость этого компонента клеточной стенки).

У метанобразующих архей клеточные стенки содержат пептидогли- кан особого химического строения. У других представителей этой группы клеточная стенка состоит исключительно из кислого гетерополисахарида; у некоторых экстремально галофильных, метанобразующих и ацидотер- мофильных архей - только из белка. Археи с клеточной стенкой белковой природы не окрашиваются по Граму, остальные типы архей дают грамположительную реакцию.

Прокариоты, не имеющие клеточной стенки. Впервые бактерии, не имеющие клеточной стенки, были обнаружены при воздействии на них лизоцимом - ферментом из группы гликозидаз, содержащимся в яичном белке, слюнной жидкости и выделяемом некоторыми бактериями.

Бактерии с частично (сферопласты) или полностью (протопласты) утраченной клеточной стенкой можно получать при воздействии определенными химическими веществами в лабораторных условиях. При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием фермента лизоцима или пенициллина, а также защитных факторов организма образуются клетки с измененной, часто шаровидной, формой (протопласты).

После удаления ингибитора синтеза клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, то есть приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму.

Бактерии сферопластного или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов, но сохранившие способность к размножению, называются L- формами. L-формы могут возникать и в результате мутаций. Они представляют собой осмотически чувствительные шаровидные, колбовидные клетки различной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры. L-формы могут образовывать многие бактерии - возбудители инфекционных болезней

Функции клеточной стенки прокариот многочисленны, разнообразны и очень важны для клетки:

-механическая защита клетки от воздействия окружающей среды;

-поддержание ее внешней формы;

-обеспечение возможности существования в гипотонических растворах;

-транспорт веществ;

Образование периплазматического пространства у грамотрицательных бактерий, заполненного раствором со специфическими транспортными белками и гидролитическими ферментами. У грамположительных бактерий эти ферменты выделяются в окружающую среду, чтобы не происходило самопереваривание собственных молекул

Область Б - плазматическая мембрана и цитоплазматическая область, которая содержит геном клетки (ДНК) и рибосомы

МЕМБРАНЫ

Химический состав мембран. Мембраны бактерий структурно подобны мембранам клетки эукариот, за исключением того, что бактериальные мембраны состоят из насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот (редко полиненасыщенных жирных кислот) с 16 - 18 углеродными атомами и обычно не содержат стерины.

Содержимое клетки отделяется от клеточной стенки цитоплазматической мембраной - обязательным структурным элементом любой клетки, нарушение целостности которого приводит к потере клеткой жизнеспособности. На долю цитоплазматической мембраны приходится 8 - 15 % сухого вещества клетки. У большинства прокариот цитоплазматическая мембрана является единственной мембраной. В клетках фототрофных и ряда хемотрофных прокариот содержатся также мембранные структуры, располагающиеся в цитоплазме и получившие название внутриплазмати- ческих мембран. Их происхождение и функции будут рассмотрены ниже.

Цитоплазматическая мембрана - белково-липидный комплекс, который составляют 50 - 75 % белков, от 15 до 45 % липидов и небольшое количество углеводов. Липиды и белки составляют 95 % и более вещества мембран. Главным липидным компонентом бактериальных мембран являются фосфолипиды - производные 3-фосфоглицерина. Хотя у прокариота найдено множество различных фосфолипидов, набор их в значительной степени родо- и даже видоспецифичен. Широко представлены в бактериальных мембранах различные гликолипиды. Стерины отсутствуют у большинства прокариот, за исключением представителей группы микоплазм и некоторых бактерий. Так, в ЦПМ Acholeplasma содержится 10 - 30 % холестерина, поглощаемого из внешней среды, от общего содержания мембранных липидов. Из других групп липидов в мембранах обнаружены ка- ротиноиды, хиноны, углеводы.

Все липиды бактерий - производные глицерина - содержат один или несколько остатков жирных кислот, состав которых своеобразен. Полиненасыщенные жирные кислоты у бактерий отсутствуют. Исключение составляют цианобактерии, у разных видов которых найдены полиненасыщенные жирные кислоты типа С16:2, С18:2, С18:3, С18:4. Помимо обычных жирных кислот, то есть обнаруживаемых и в клетках эукариот, в составе мембранных липидов бактерий находят и кислоты, не встречающиеся, как правило, в мембранах эукариот.

Набор жирных кислот в мембранных липидах также чрезвычайно видоспецифичен. У некоторых грамположительных бактерий С15-жирная кислота с разветвленной цепью может составлять до 90 % всех жирных кислот липидов. Главная функция липидов - поддержание механической стабильности мембраны и придание ей гидрофобных свойств.

Особый состав липидов обнаружен в мембранах архей. У них не найдены типичные для бактерий эфиры глицерина и жирных кислот, но присутствуют эфиры глицерина и высокомолекулярных С20-, С40-спиртов, а также нейтральные изопреноидные С20-, С30-углеводороды.

На долю белков приходится больше половины сухой массы мембран. К мембранам с наиболее высоким содержанием белка относятся бактери- альные цитоплазматические мембраны. Цитоплазматическая мембрана E.coli содержит 27 основных белков и множество минорных белков, но ни один из основных белков не присутствует в преобладающих количествах. Поскольку цитоплазматическая мембрана прокариот многофункциональна и участвует в осуществлении разнообразных ферментативных процессов, был сделан вывод, что мембранные белки - это, как правило, ферменты.

Структура мембран. Мембранные липиды всех эукариот и части архей образуют бислои, в которых гидрофильные «головы» молекул обращены наружу, а гидрофобные «хвосты» погружены в толщу мембраны. Углеродные цепочки, прилегающие к гидрофильным «головам», довольно жестко фиксированы, а более удаленные части «хвостов» обладают достаточной гибкостью. У некоторых архей (ряд метаногенов, термоацидофи- лов) мембранные липиды, в состав которых входит С40-спирт, формируют монослойную мембрану, по толщине равную бислойной. Монослойная липидная мембрана обладает большей жесткостью по сравнению с бислой- ной. При «биологических» температурах мембранные липиды находятся в жидкостно-кристаллическом состоянии, характеризующемся частичной упорядоченностью структуры. При понижении температуры они переходят в квазикристаллическое состояние. Чем более ненасыщены и разветвлены остатки жирных кислот или чем большее число циклических группировок они содержат, тем ниже температура перехода из жидкостно- кристаллического состояния в квазикристаллическое.

«Жидкая» структура мембран обеспечивает определенную свободу молекул белков, что необходимо для осуществления процессов транспорта электронов и веществ через мембрану. Это же свойство обусловливает высокую эластичность мембран: они легко сливаются друг с другом, растягиваются и сжимаются.

В отличие от липидов у мембранных белков нет единого способа структурной организации. 30 - 50 % белка имеет конфигурацию б- спирали, остальная часть находится преимущественно в виде беспорядочного клубка. В зависимости от расположения в мембране и характера связи с липидным слоем мембранные белки условно можно разделить на три группы: интегральные, периферические и поверхностные. Интегральные белки полностью погружены в мембрану, а иногда пронизывают ее насквозь. Связь интегральных белков с мембранными липидами очень прочна и определяется главным образом гидрофобными взаимодействиями.

Одна из функций основных белков - формирование в мембране гидрофильных диффузионных пор диаметром примерно 1 нм, через которые осуществляется неспецифическая диффузия молекул массой до 600 - 900 Да. То есть через такие поры могут проходить сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Белки, пронизывающие наружную мембрану насквозь и образующие гидрофильные поры, называют поринами. Минорные белки выполняют специфические функции: участвуют в облегченной диффузии, активном транспорте веществ и являются специфическими рецепторами для фагов. Примером минорных белков могут служить белки, ответственные за специфический транспорт в клетку железосодержащих соединений.

Существует несколько моделей строения мембраны. Наибольшее признание получила модель, учитывающая основные данные, известные о мембранах, согласно которой в липидную основу включены асимметрично расположенные белковые молекулы (см. рис. 4). Некоторые из них образуют скопления на поверхностях липидного би- или моно слоя, другие частично или полностью погружены в него, третьи пронизывают его насквозь. В модели подчеркнута асимметрия строения мембраны, основанная на различиях в химическом строении и расположении молекул белка.

При избыточном росте по сравнению с ростом клеточной стенки цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты, то есть впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемых мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутриплазматически- ми мембранами (ВПМ). Среди ВПМ выделяют несколько видов (табл. 4)



Таблица 4

Мембраны прокариот

Прокариоты	Физиологи ческие группы	Мембраны
		Наруж- ная клеточ- ная	Цито- плазма- тиче- ская	Внутриплазматические
				фотосин- тетиче- ские	мезосо- маль- ные	про- чие
Грамположительные	Хемотрофы	-	+	-	±	±
Грамотрицательные	Фототрофы	±	+	±	±	-
	Хемотрофы	±	+	-	±	±

Примечание. (+) - присутствуют; (-) - отсутствуют; (±) - не у всех

Роль мезосом и внутриплазматических мембран до конца не выяснена. Полагают, что они участвуют в делении клетки, обеспечивая энергией синтез клеточной стенки, а также в секреции веществ, спорообразовании, то есть в процессах, сопровождающихся большой затратой энергии.

Функции цитоплазматической мембраны прокариот разнообразны и жизненно важны для клетки:

содержит ферменты, катализирующие конечные этапы синтеза мембранных липидов, компонентов клеточной стенки и некоторых других веществ, участвует в синтезе компонентов клеточной стенки;

играет важную роль в превращениях клеточной энергии. У бактерий, источником энергии для которых служат процессы дыхания или фотосинтеза, в цитоплазматической мембране расположены переносчики цепи электронного транспорта, функционирование которых приводит к генерированию энергии, используемой затем в клетке по разным каналам, в том числе и для образования энергии в форме АТФ. Содержит значительное количество ферментов, системы переноса электронов и является местом генерации энергии у бактерий;

обеспечивает избирательное поступление в клетку и выход из нее разнообразных веществ и ионов. Осуществляется это с использованием разных механизмов мембранного транспорта. Выделяют 4 типа транспортных систем, с участием которых происходит проникновение молекул в бактериальную клетку: пассивную диффузию, облегченную диффузию, активный транспорт и перенос химически модифицированных молекул (транслокация групп);

участвует в регуляции роста и клеточного деления;

участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами);

с ней связаны жгутики и аппарат регуляции их движения;

участвует в компартментализации и стабилизации рибосом;

участвует в образовании мезосом (участки инвагинации в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).

ЦИТОПЛАЗМА

Это сложная коллоидная система, в ней нет эндоплазматического ре- тикулума и других органелл, свойственных эукариотам, она неподвижна. Цитоплазма бактерий занимает основной объем клетки и состоит из растворимых белков. У некоторых видов есть микротрубочки - рапидосомы, сходные с микротрубочками простейших, и три типа органелл, окруженных белковыми мембранами: газовые пузырьки (у водных прокариот - цианобактерий); хлоробиум-везикулы (аппарат фотосинтеза у фотосинтезирующих); карбоксисомы, которые содержат фермент карбоксидисмута- зу, необходимый для фиксации СО2 в процессе фотосинтеза.

В цитоплазме располагается ядерный аппарат - генофор (нуклео- плазма), который не отделен мембраной. Кроме хромосомы имеются плаз- миды, иногда целый комплекс. Хромосома и плазмиды связаны со специфическими рецепторами цитоплазматической мембраны. В ней располагаются рибосомы и все компоненты белоксинтезирующей системы.

В цитоплазме содержатся различные макромолекулы (тРНК, аминокислоты, нуклеотиды и др.), могут быть мезосомы, которые участвуют в энергетическом обмене, формировании межклеточной перегородки при делении, спорообразовании и др., включения: капельки нейтральных липидов, воска, серы, полисахариды, поли-?-масляная кислота и полифосфаты (волютин). Они накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют роль запасных веществ для питания и энергетических потребностей. Зерна волютина выявляются у дифтерийной палочки в виде интенсивно окрашивающихся полюсов клетки.

Цитоплазматические элементы бактерий неизменно включают про- кариотическую хромосому и рибосомы. Хромосома - обычно одна большая молекула ДНК, замкнутая в кольцо, более или менее свободно лежащая в цитоплазме. Прокариоты иногда обладают небольшими внехромо- сомными циклическими ДНК, названными плазмидами.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ

Генетический аппарат, или нуклеоид, является эквивалентом ядра у бактерий. У прокариота это более компактное образование (диаметром около 2 нм), занимающее центральную область в цитоплазме и не отделенное от нее мембраной.

ДНК прокариот имеет существенные отличия в структурной организации от эукариотной ДНК: нуклеоид бактерий не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов).

Вся ДНК клетки (и хромосомная, и плазмидная) образует геном клетки. В течение роста клетки и её деления прокариотная хромосома копируется обычным полуконсервативным способом прежде, чем произойдет её распределение по дочерним клеткам. Однако процессы мейоза и митоза у прокариота отсутствуют. Репликация и сегрегация (разделение) про- кариотной ДНК координируются мембраной, возможно мезосомами. Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, но часто в экспоненциально растущей культуре количество ДНК может достигать массы 3, 4, 8 и более хромосом. Нередко в клетках при действии на них определенных факторов (температуры, рН среды, ионизирующего излучения, солей тяжелых металлов, некоторых антибиотиков и др.) происходит образование множества копий хромосомы. При устранении воздействия этих факторов, а также после перехода в стационарную фазу в клетках, как правило, обнаруживается по одной копии хромосомы.

Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специ фическими для ДНК методами по Фельгену или Гимзе.

На электронных микроскопических фотографиях ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК. Несмотря на отсутствие ядерной мембраны, нук- леоид довольно четко отграничен от цитоплазмы.

Длина молекулы в развернутом виде может достигать более 1 мм, то есть почти в 1000 раз превышать длину бактериальной клетки. Длительное время считали, что в распределении нитей хромосомы бактериальной ДНК не прослеживается никакой закономерности. Однако, если исходить из того, что молекула ДНК образует беспорядочный клубок, трудно объяснить процесс репликации и последующее распределение образовавшихся хромосом по дочерним клеткам. Было установлено, что хромосомы прокариот представляют собой высокоупорядоченную структуру, имеющую константу седиментации 1300 - 2000S для свободной и 3200 - 7000S для связанной с мембраной формы. В том и другом случае часть ДНК в этой структуре представлена системой из 20 - 100 независимо суперспирализованных петель. В обеспечении суперспирализованной организации хромосом участвуют молекулы РНК. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1*109 - 3*109 Да. В группе микоплазм генетический материал представлен молекулами, имеющими наименьшее для клеточных организмов количество ДНК 0,4*109 - 0,8*109 Да, а наибольшее содержание ДНК обнаружено у нитчатых циан бактерий 8*109 Да.

Прорастание спор включает три стадии:

Активация является обязательным условием прорастания. Она осуществляется различными воздействиями - кислой средой, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор.

Начальная стадия. Под влиянием внешних эффекторов происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, спора высвобождается от дипиколината кальция, под воздействием гидролитических ферментов разрушаются другие ее компоненты.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры из нее появляется («выклевывается») растущая новая вегетативная клетка. Она состоит из протопласта споры и ее клеточной стенки. В ней активизируются биосинтетические процессы; в результате новая вегетативная клетка при наличии необходимых питательных веществ удваивает свою биомассу и делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются, пока этому способствуют условия среды. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного генома.

Область В - запасные питательные вещества и внутри цитоплазматические включения

ВНУТРИЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включения. Одни из них следует рассматривать как активно функционирующие структуры, другие - как продукты клеточного метаболизма, не выделяющиеся наружу, но откладывающиеся внутри клетки. Некоторые цитоплазматические включения имеют явно приспособительное значение. И наконец, многие из них являются запасными веществами, отложение которых клеткой происходит в условиях избытка питательных веществ в окружающей среде, а потребление наблюдается, когда организм попадает в условия голодания.

К числу внутрицитоплазматических включений, выполняющих определенную функцию в фотосинтезе, относят хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий. В этих структурах локализованы пигменты, поглощающие кванты света и передающие их в реакционные центры, то есть выполняющие роль антенны. Хлоросомы имеют форму продолговатых пузырьков длиной 90 - 150 и шириной 25 - 70 нм, окруженных однослойной электронно-плотной мембраной толщиной 2 - 3 нм, построенной только из белка. Они располагаются в непосредственной близости от ЦПМ, плотно к ней примыкая. В хлоросомах локализованы бактериохло- рофиллы с, d или е. Водорастворимые пигменты белковой природы (фико- билипротеины) цианобактерий содержатся в особых структурах - фикоби- лисомах, расположенных правильными рядами на внешних поверхностях фотосинтетических мембран и под электронным микроскопом имеющих вид гранул диаметром 28 - 55 нм.

Карбоксисомы состоят из частиц рибулозодифосфаткарбоксилазы - фермента, катализирующего фиксацию СО2 на рибулозодифосфате в восстановительном пентозофосфатном цикле. До настоящего времени окончательно не выяснено, в какой форме находится фермент в карбоксисомах: в инертном или функционирующем состоянии. Имеются данные, что в активно растущей культуре больше фермента находится в растворимой форме. При переходе в стационарную фазу увеличивается доля рибулозоди- фосфаткарбоксилазы в составе карбоксисом. Эти данные указывают на возможную роль карбоксисом как структур, обеспечивающих защиту фермента от воздействия внутриклеточными протеазами и его консервирование.

К внутриплазматическим включениям, имеющим приспособительное

значение, относятся магнитосомы, газовые вакуоли, или аэросомы, обнаруженные у водных прокариот. Газовые вакуоли найдены у представителей 15 таксономических групп. Это сложноорганизованные структуры, напоминающие пчелиные соты. Состоят из множества газовых пузырьков, каждый из которых окружен однослойной белковой мембраной и заполнен газом, идентичным газу окружающей среды. Мембраны газовых пузырьков проницаемы для газов, но не проницаемы для воды



3. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность микробных клеток, процессы их питания, дыхания, роста, размножения, законамерности взаимодействия с окружающей средой.

3.1 Химический состав прокариотной клетки

Клетки прокариот содержат воду, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, минеральные вещества (табл. 6).

Вода - основной компонент бактериальной клетки, составляющий около 70 - 90 % ее массы. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18 - 20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе - потере клеткой воды в гипертоническом растворе - происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды они не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей. Остальные компоненты составляют 10 - 30 % сухой массы клетки.

Белки определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.

Нуклеиновые кислоты бактерий выполняют функции, аналогичные функциям нуклеиновых кислот эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка. Бактерии можно характеризовать (таксономически) по содержанию суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в молярных процентах (мол. %) от общего количества оснований ДНК. Более точной характеристикой микроорганизмов является гибридизация их ДНК. Основа метода гибридизации ДНК - способность денатурированной (однонитчатой) ДНК ренатурироваться, то есть соединяться с комплементарной нитью ДНК и образовывать двух цепочечную молекулу ДНК.

Таблица 6

Химический состав E. coli (по Neidhardt, 1987 г.)

Химический компонент	Общее количество, в % от сухого вещества	Молекулярная масса, Да	Количество молекул в клетке	Число разных видов молекул в клетке
Белок	55,0	4,7*104	2 350 000	1850
РНК:	20,5	-	-	-
23S	-	1,0*106	18 700	1
16S	-	5,0*105	18 700	1
5S	-	3,9*104	18 700	1
тРНК	-	2,5*104	198 000	60
иРНК	-	1,0*106	1 380	600
ДНК	3,1	2,5*109	2	1
Липиды	9,1	705	22000 000
Липополисахариы	3,4	4070	1 430 000	1
Пептидогликан	2,5	(904)n	1	1
Гликоген	2,5	1,0*106	4 300	1
Полиамины:	0,4	-	-	-
Путресцин	-	88	5 600 000	1
Спермидин	-	145	1 100 000	1
Метаболиты, кофакторы, ионы	3,5	-	-	800

Углеводы бактерий представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.

Липиды в основном входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например, наружной мембраны, где, кроме бимолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии туберкулеза.

Минеральные вещества бактерий обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.). Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.

3.2 Питание бактерий (конструктивный метаболизм прокариот)

Образ жизни прокариот состоит в постоянном воспроизведении своей биомассы. Совокупность протекающих в клетке процессов, обеспечивающих воспроизводство биомассы, называется обменом веществ, или метаболизмом.

Клеточный метаболизм складывается из двух потоков реакций, имеющих разную направленность: энергетического и конструктивного метаболизмов.

КОНСТРУКТИВНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ

Конструктивный метаболизм (биосинтез, анаболизм) - цепь последовательных реакций, в результате которых за счет поступающих извне веществ строится вещество клеток; это процесс, связанный с потреблением свободной энергии, запасенной в химической форме в молекулах АТФ или других богатых энергией соединениях.

Метаболические пути конструктивной и энергетической направленности состоят из множества последовательных ферментативных реакций и могут быть разделены на три этапа:

На начальном этапе воздействию подвергаются молекулы, служащие исходными субстратами. Иногда эту часть метаболического пути называют периферическим метаболизмом, а ферменты, катализирующие первые этапы превращения субстрата, периферическими;

Последующие превращения включают ряд ферментативных реакций и приводят к образованию промежуточных продуктов, или метаболитов, а сама цепь превращений объединяется под названием промежуточного метаболизма;

На последних этапах образуются конечные продукты конструктивных путей, которые используются для построения вещества клеток, а конечные продукты энергетических путей выделяются в окружающую среду.

Конструктивные и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. У большинства прокариот они тесно связаны между собой. Однако у некоторых прокариотных организмов можно выделить последовательности реакций, служащих только для получения энергии или только для биосинтеза. Связь между конструктивными и энергетическими процессами прокариот осуществляется по нескольким каналам. Основной из них - энергетический. Определенные реакции поставляют энергию, необходимую для биосинтезов и других клеточных энергозависимых функций.

Биосинтетические реакции, кроме энергии, нуждаются часто в поступлении извне восстановителя в виде водорода (электронов), источником которого служат также реакции энергетического метаболизма. И наконец, тесная связь между энергетическими и конструктивными процессами проявляется в том, что определенные промежуточные этапы и метаболиты обоих путей могут быть одинаковыми (хотя направленность потоков реакций, относящихся к каждому из путей, различна). Это создаёт возможности для использования общих промежуточных продуктов в каждом из метаболических путей. Промежуточные соединения такой природы предложено называть амфиболитами, а промежуточные реакции, одинаковые для обоих потоков, - амфиболическими.

Метаболизм прокариот отличается чрезвычайным разнообразием, которое есть результат способности этих форм жизни использовать в качестве источников энергии и исходных субстратов для построения веществ тела самый широкий набор органических и неорганических соединений. Такая способность обусловлена различиями в наборе клеточных периферических ферментов, воздействующих на исходные субстраты и видоизменяющих их молекулы в направлении, позволяющем им далее метаболи- зироваться по каналам промежуточного метаболизма. Промежуточный метаболизм прокариот не отличается существенным разнообразием от пери ферического метаболизма эукариот, хотя по сравнению с ним состоит из большего числа вариантов.

Мономеры, необходимые для построения основных клеточных компонентов, могут быть синтезированы клеткой или поступать в готовом виде из среды. Чем больше готовых соединений должен получать организм извне, тем ниже уровень его биосинтетических способностей, так как химическая организация всех свободноживущих форм одинакова.

ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ

Особенности питания бактериальной клетки состоят в поступлении питательных субстратов внутрь через всю ее поверхность, а также в высокой скорости процессов метаболизма и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Широкому распространению бактерий способствует разнообразие типов питания. Микроорганизмы нуждаются в углероде, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах.

Источники углерода. В конструктивном метаболизме основная роль принадлежит углероду, поскольку все соединения, из которых построены живые организмы, - это соединения углерода. Их известно около миллиона. Прокариоты способны воздействовать на любое известное углеродное соединение, то есть использовать его в своем метаболизме. В зависимости от источника углерода для конструктивного метаболизма все прокариоты делятся на две группы: автотрофы, к которым принадлежат организмы, способные синтезировать все компоненты клетки из углекислоты (аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.) и гетеротрофы, для которых источником углерода служат органические соединения.

Понятия «авто-» и «гетеротрофия» характеризуют, таким образом, тип конструктивного метаболизма. Если автотрофия - довольно четкое и узкое понятие, то гетеротрофия - понятие весьма широкое и объединяет организмы, резко различающиеся своими потребностями в питательных веществах.

Наибольшая степень гетеротрофности присуща прокариотам, относящимся к облигатным внутриклеточным паразитам (от греч. parasitos - нахлебник), то есть организмам, которые могут жить только внутри других живых клеток, например, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие.

Они являются патогенными для растений, животных и человека. Паразитический образ жизни привел к редукции некоторых метаболических путей у этих прокариот, что и обусловило полную их зависимость от метаболизма клетки хозяина.

МЕХАНИЗМЫ ПИТАНИЯ

Поступление различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран и др. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Да. Основным регулятором поступления веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана.

Условно можно выделить четыре механизма проникновения питательных веществ в бактериальную клетку: простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт, транслокация групп.

Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку - простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липидную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.

ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Ферменты распознают соответствующие метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), то есть метаболизма. Многие ферменты взаимосвязаны со структурами микробной клетки. Например, в цитоплазматической мембране имеются окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании и делении клетки. Окислительно-восстановительные ферменты цитоплазматической мембраны и ее производных обеспечивают энергией интенсивные процессы биосинтеза различных структур, в том числе клеточной стенки. Ферменты, связанные с делением и аутолизом клетки, обнаруживаются в клеточной стенке. Так называемые эндоферменты катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки. Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, усваиваемых клеткой в качестве источников энергии, углерода и др. Некоторые экзоферменты (пени- циллиназа и др.) инактивируют антибиотики, выполняя защитную функцию.

Различают конститутивные и индуцибельные ферменты. Конститутивные ферменты синтезируются клеткой непрерывно, вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде. Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются только при наличии в среде субстрата данного фермента. Например, кишечная палочка на среде с глюкозой практически не образует ?-галактозидазу, но резко увеличивает ее синтез при выращивании на среде с лактозой или другим ?-галактозидом.

Некоторые ферменты (так называемые ферменты агрессии) разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое распространение в инфицированной ткани микроорганизмов и их токсинов. К таким ферментам относят гиалуронидазу, коллагеназу, дезоксирибонуклеазу, нейраминидазу, ле- цитовителлазу и др. Так, гиалуронидаза стрептококков, расщепляя гиалу- роновую кислоту соединительной ткани, способствует распространению стрептококков и их токсинов.

Известно более 2000 ферментов. Они объединены в шесть классов: оксидоредуктазы - окислительно-восстановительные ферменты (к ним от- носятся дегидрогеназы, оксидазы и др.); трансферазы, переносящие от- дельные радикалы и атомы от одних соединений к другим; гидролазы, ус- коряющие реакции гидролиза, то есть расщепления веществ на более про- стые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы и др.); лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидроли- тическим путем (карбоксилазы и др.); изомеразы, превращающие органи- ческие соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза и др.); лигазы, или синтетазы, ускоряющие синтез сложных соединений из более простых (ас- парагинсинтетаза, глютаминсинтетаза и др.).

Различия в ферментном составе используются для идентификации микроорганизмов, так как они определяют их различные биохимические свойства: сахаролитические (расщепление сахаров), протеолитические (разложение белков) и другие, выявляемые по конечным продуктам расщепления (образование щелочей, кислот, сероводорода, аммиака и др.).

Ферменты микроорганизмов используют в генетической инженерии (рестриктазы, лигазы и др.) для получения биологически активных соединений, уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Ферменты применяют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения загрязнений белковой природы.

3.3 Дыхание прокариот (энергетический метаболизм)

Энергетический метаболизм (катаболизм) - это поток реакций, со провожающихся мобилизацией энергии и преобразованием ее в электрохимическую (?µН+) или химическую (АТФ) форму, которая затем может быть использована во всех энергозависимых процессах.

Существуют группы прокариот, энергетический метаболизм которых не связан с превращениями органических соединений (прокариоты с фото- лито- и хемолитотрофным типом энергетического обмена). По отношению к такого рода энергетическим процессам термин «катаболизм» неприменим. У них функционирует только один поток превращений органических соединений углерода - анаболический.

Энергетические процессы прокариот по своему объему (масштабности) значительно превосходят процессы биосинтетические, а их протекание приводит к существенным изменениям в окружающей среде. Разнообразны и необычны в этом отношении возможности прокариот, способы их энергетического существования. Все это вместе взятое сосредоточило внимание исследователей в первую очередь на изучении энергетического метаболизма прокариот.

Дыхание бактерий. Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление - отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление - присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным - нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч. aer - воздух, bios - жизнь) - жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксусное и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, то есть обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Облигатные аэробы - это прокариоты, для роста которых кислород необходим. К ним относится большинство прокариотных организмов.

Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут только на среде без кислорода, кото- рый для них токсичен. При наличии кислорода бактерии образуют пере- кисные радикалы кислорода, в том числе перекись водорода и супероксид- анион кислорода, токсичные для облигатных анаэробных бактерий, по- скольку они не образуют соответствующие инактивирующие ферменты. Аэробные бактерии инактивируют перекись водорода и супероксид-анион кислорода соответствующими ферментами (каталазой, пероксидазой и су- пероксиддисмутазой).

Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие. Они способны осуществлять анаэробное дыхание, называемое нитратным:

нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.

Среди облигатных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые сохраняются при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты - специальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами.

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением - самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции. Различают рост клеток и рост популяции. Каждый из них характеризуется своими особенностями и закономерностями. Под ростом индивидуальной клетки понимают увеличение ее биомассы, наступающее в результате синтеза клеточного материала. Объем клетки можно вычислить, если известны ее продольные и поперечные размеры. Для шаровидных клеток он определяется по формуле

V = 4/3рr3,

а для цилиндрических - по формуле

V = раr2, где r - радиус клетки, а - длина клетки.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами, так как являются ветвящимися бактериями, а также путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате чего образуются две одинаковые клетки (рис. 9).

Рисунок 9 - Процесс роста и размножения бактериальной клетки. Время генерации g представляет собой время между моментом образования бактерии и моментом, когда она расщепляется на две дочерние клетки

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается, и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.

Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки: прикрепленные к цитоплазматической мембране или ее производным (например, ме- зосомам) хромосомы по мере увеличения объема клетки удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления (рис. 10).

...