Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

Выпускная квалификационная работа

Начи Паола

Санитарно-показательные бактерии в аквариумах с различными гидробионтами в условиях замкнутых систем очистки и непрерывной санацией воды

Санкт-Петербург 2018 г

Содержание

Введение

1. Обзор научной литературы

1.1 Общая характеристика водных объектов, подлежащих гигиеническому контролю. Структура гигиенического контроля водных объектов в РФ

1.2 Методы выделения и оценки численности колиформных бактерий в водных образцах

1.3 Проблемы гигиенического контроля воды океанариумов и обьектов аквакультуры по численности колиформных бактерий

2. Объекты и методы исследования

2.1 Характеристика объектов исследования

2.2 Определение численности и выделение колиформных бактерий, очистка изолятов, создание коллекции штаммов, ее поддержание

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Общее микробное число и содержание колиформных бактерий в воде аквариумов с различными гидробионтами

3.2 Выделение колиформных бактерий и создание коллекции штаммов

3.3 Идентификация колиформных бактерий, выделенных из аквариумов с разными гидробионтами

«Колиформные бактерии как гигиенический показатель безопасности воды. Встречаемость энтеробактерии в микробиоте гидробионтов при гигиеническом контроле водных объектов».

1.1 Общая характеристика водных объектов, подлежащих гигиеническому контролю. Структура гигиенического контроля водных объектов в РФ

Водные объекты, подлежащие гигиеническому контролю, являются центральной системой городского водоснабжения: открытые водоемы, бассейны, аквапарки, аквариумы и предприятия аквакультуры. Причинами для их гигиенического контроля являются бациллоносительство людей и животных, попадание возбудителей в канализационные стоки и, как следствие, загрязнение воды патогенами желудочно-кишечных инфекций сальмонеллами, шигеллами, вибрионами, эшерихиями.

Гигиеническими показателями заражения воды патогенами являются санитарно-показательные бактерии желудочно-кишечного тракта людей и гидробионтов. Cанитарно-показательные бактерии - это бактерии, живущие в организме человека и животных (в нашем случае гидробионтов), в тех же органах и системах, в которых способны существовать патогенные микроорганизмы. Санитарно-показательные бактерии попадают во внешнюю среду вместе с экскретами, экскрементами и канализационными стоками. В качестве санитарно-показательных бактерий чаще всего используют «общие колиформы», «термотолерантные колиформы», Enterobacteriaceae, E.coli, Enterococcus, Staphylococcus aureus.

Общие колиформы - это аэробные и факультативно-анаэробные, грамотрицательные, неспорообразующие, мелкие палочковидные бактерии, способные расти в питательных средах в присутствии желчных солей, и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа в течение 24-48 часов при температуре 350С (в РФ - при 37+10С). Термотолерантные колиформные бактерий имеют все характеристики общих колиформ, дополнительно они способны ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (44+0,5)0С в течение 24 часов. Определение колиформных бактерий в документах разных стран вцелом сходно (Rompre et al., 2002; МУК 4.2.1884-04).

E.coli представляет собой термотолерантную колиформную бактерию, которая, образует индол из триптофана при температуре 44 ± 0,50С, дает положительный результат в тесте с метил-рот, не образует ацетилметилкарбинол (отрицательная реакция в тесте Фогеса-Проскауэра); она не способна использовать цитрат как единственный источник углерода (ISO 9308-2:2012).

Таблица 1. Признаки изолятов колиформ, позволяющие отнести их к виду E.coli, в соответствии с МУК 4.2.1884-04 и ISO 9308-2:2014.

По российским нормативным документам (MУK 4.2.1884-04) границы вида E.coli более широкие. К виду E.coli относят изоляты термотолерантных колиформ, способные образовывать индол из триптофана (MУK 4.2.1884-04).

В табл. 1. приведены сравнительные характеристики российского и международного стандартов по выявлению E.coli в воде.

В табл. 2. приведены рекомендации ВОЗ по предельно допустимому содержанию колиформных бактерий и E.coli в питьевой воде по сравнению с гигиеническими стандартами ряда стран (Rompre et al., 2002), в том числе РФ.

В РФ и европейских странах безопасность воды различных водных объектов контролируется на государственном уровне, в соответствии с требованиями официальных документов. В Российской Федерации таким документом в отношении открытых водоемов являются Санитарные правила и Нормы (СанПин 2.1.5.980-00).

Таблица 2. Рекомендации ВОЗ и требования ряда стран по предельному содержанию колиформных бактерий в питьевой воде.

В этом российском документе водные объекты подразделяются на две основные категории на основе характера их использования. Первая категория водоемов охватывает водные объекты, которые используются в качестве источника питьевой воды, бытового использования и водоснабжения для пищевой промышленности. Для этих водоемов содержание общих колиформных бактерий не должно превышать - 1000 КОЕ на 100 мл воды, для термотолерантных колиформ - не более 100 КОЕ на 100 мл воды.

Вторая категория включает водные объекты, используемые для рекреационных целей (для отдыха и купания), а также все водные объекты, расположенные в пределах населенных пунктов. Для этих водоемов содержание общих колиформных бактерий не должно превышать 500 КОЕ в 100 мл воды, для термотолерантных колиформ - не более 100 КОЕ / 100 мл воды.

Для таких водных объектов как плавательные бассейны и аквапарки в РФ введены в действие более жесткие требования в соответствии с СанПин 2.1.2.1331-03. Общие и термотолерантные колиформные бактерии не должны обнаруживаться в 100 мл воды (менее 1 клетки в 100 мл). Сравнение требований РФ по содержанию колиформ в воде различных объектов приведено в табл. 3.

Таблица 3. Гигиенические требования РФ к воде поверхностных водоемов, бассейнов и аквапарков.

Объектами государственного гигиенического контроля также являются крупнотоннажные аквариумы Океанариумов и предприятия аквакультуры. Эти объекты имеют ряд характеристик, которые принципиально отличают их от открытых водоемов, бассейнов и аквапарков, а именно:

- они имеют замкнутую систему циркуляции воды и используют непрерывный режим очистки и дезинфекции (УФ, озон) воды;

- в воду этих объектов постоянно поступают колиформные фекальные бактерии, присутствующие в желудочно-кишечном тракте гидробионтов;

- в таких замкнутых условиях формируются специфические микробиоценозы (биопленки, обрастания), способные существовать в режиме постоянной санации воды;

- в воду таких объектов регулярно попадают терапевтические препараты (антибиотики, красители), используемые для лечения гидробионтов;

- в воду таких объектов поступают кишечные бактерии через руки персонала, инструменты, оборудование, корма для животных.

Гигиенический контроль таких объектов очень сложен. В настоящий момент для этих объектов не разработаны принципы микробиологического контроля воды. В РФ вода подобных объектов оценивается по требованиям, предъявляемым к воде открытых водоемов (СанПиН 2.1.5.980-00). В СтПетербургском Океанариуме вода оценивается в соответствии с требованиями Вирджинского Аквариума (США) - не более 235 кл E.coli в 100 мл воды (Virginia Aquarium Water Quality Parameters Explained, 2016). Таким образом, единого обоснованного мнения по поводу гигиенического контроля воды подобных объектов на сегодняшний день не существует.

1.2 Методы выделения и оценки численности колиформных бактерий в водных образцах

Метод выделения и оценки численности колиформных бактерий и E.coli приведен в российском государственном документе - Методические указания МУК 4.2.1884-04 и в стандартах ISO (ISO 9308-1 и 9308-2:2012).

Для выделения общих колиформных бактерий объем воды фильтруют через мембранные фильтры. Фильтр переносят на среду Эндо (твердая диагностическая среда с лактозой и сульфитом). Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре (37 + 1) °C в течение 18 - 24 ч.

Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные типичные для лактозоположительных бактерий колонии: темно-красные, красные, с металлическим блеском и без него, слизистые с темно-малиновым центром с отпечатком на обратной стороне фильтра.

Выполняют оксидазный тест, и при наличии оксидазоотрицательных колоний дают положительный ответ о присутствии колиформ.

Термотолерантные колиформные бактерии выявляются сходным образом. После постановки оксидазного теста, выполняют посев типичных оксидазоотрицательных колоний на одну из подтверждающих сред (должна быть прогрета до температуры 44 °C) с лактозой. При числе колоний менее 15 они исследуются все, а более 15 - подсчитывают колонии разных типов и исследуют по 4 - 5 колоний каждого из них. Посевы сразу же переносят в термостат и инкубируют при температуре (44 + 0,5) °C в течение (24 + 1) ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

Если образцы воды являются мутными и содержат большое количество суспендированных частиц, способ фильтрации выполнить невозможно. В этом случае используют более сложный титрационный метод (метод НВЧ) и засев проводят в накопительные среды (МУК 4.2.1884-04; ISO 9308-2). В качестве типичных накопительных сред для выделения колиформ используют бульонные среды с добавлением лактозы, желчных солей и индикатором потребления лактозы (феноловый красный, бромтимоловый синий и др.).

Засев накопительных сред при титрационном методе проводят десятикратно понижающимися количествами посевного материала в тройной повторности.

При наличии в среде накопления помутнения и газообразования, а при высеве на подтверждающую среду типичных для лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него) выполняют оксидазный тест. При обнаружении оксидазоотрицательных колоний дают положительный ответ на наличие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы. В случае сомнений и обнаружения нетипичных по цвету и морфологии колоний подтверждают их способность к газообразованию при посеве 1 - 2 колоний каждого типа на среду с лактозой с последующей инкубацией посевов при температуре (37 + 1) °C в течение 24 ч.

Для определения термотолерантных колиформных бактерии работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии, а в среде накопления обнаружено газообразование. Делают посев 2 - 3 колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки в лактозный бульон, нагретый до 44 °C). Посевы инкубируют при температуре (44 + 0,5) °C в течение 24 ч. При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и подтверждения их способности ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °C дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды термотолерантных колиформных бактерий.

Одновременно c термотолерантными колиформными бактериями подтверждают наличие Е.coli, для чего по 2 - 3 типичные колонии с каждого сектора засевают параллельно в две пробирки: с лактозной средой и со средой, содержащей триптофан, для установления способности ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44°C и продуцировать индол. Положительный ответ о присутствии E.coli дают при наличии кислоты и газа в лактозной среде и при образовании индола из триптофана.

Численность колиформ и E.coli определяют по распределению присутствия или отсутствия колиформ в накопительных культурах. Для этого используют статистические таблицы МакКреди. Численность колиформ и E.coli выражают в виде «наиболее вероятного числа» (МУК 4.2.1884-04).

Методы для выделения колиформ в МУК 4.2.1884-04 и в стандартах ISO различаются по средам накопления, тестам и условиям их проведения (температура и продолжительность инкубации) (табл.1.).

1.3 Проблемы гигиенического контроля воды океанариумов и обьектов аквакультуры по численности колиформных бактерий

Встречаемость колиформных бактерий в воде открытых водоемов и в воде при искусственном содержании и разведении гидробионтов.

В современной научной литературе имеется обширная информация о наличии колиформных бактерии, E.coli и возбудителей желудочно-кишечных инфекций - Salmonella, Shigiella, Vibrio в гидробионтах в естественных водоемах, в пресной и в морской воде, а также в искусственных водоемах.

В этой связи представители рода Salmonella являются наиболее распространенными патогенами в природе, поэтому сальмонелезная инфекция широко распространена у людей и животных, включая гидробионтов (Litsky et al., 1955; Robinson, 1970).

Исследование, проведенное в Канаде (Bartlett et al., 1977), выявило присутствие сальмонелл в маленьких лягушках - Xenopus spp., Hymenochirus spp., и Pipa pipa, которые продавались в зоомагазинах как домашние животные, обитающие в аквариуме. При исследовании 16 торговых точек в трех городах Канады сальмонеллы были выделены из 21% образцов пресноводных аквариумных лягушек, и из 25% образцов аквариумной воды, содержащей этих лягушек. Были обнаружены следующие виды сальмонелл:

S. arizonae, S.bovis-morbificans, S.hadar, S.saint-paul, S.typhimurium и S.worthington. Было установлено, что явление бацилоносительства лягушек в отношении сальмонелл представляет серьезный риск для здоровья людей. По этой причине в Канаде был издан закон, запрещающий ввоз этих животных и их продажу населению.

Рептилии и другие холоднокровные животные (часто называемые «экзотическими животными») также могут выступать в качестве резервуаров сальмонелл, а случаи заражения связаны с прямым или косвенным контактом с этими животными (Marin et al., 2013).

Trachemysscripta elegans является самой распространенной домашней черепахой во всем мире. С 1963 года она была признана важным источником инфекции в случаях вспышек сальмонеллеза в США (Hersey & Mason, 1963; Centers for Disease Control and Prevention, 2010). По этой причине многими исследователями была изучена эпидемиология патогенных микроорганизмов в свободноживущих и домашних черепах (Lafuente et al., 2013; Hernбndez et al,. 2012; Zeitlin et al., 2004; Harris et al., 2010). В частности, результаты этих исследований показали, что зараженность сальмонеллами у домашних черепах варьировала от 0% до 72,2% (Nakadai et al., 2005; Hidalgo-Vila et al., 2008; Geue & Lцschner, 2002; Sбnchez-Jimйnez et al., 2001) и от 0% до 15,4% у свободноживущих черепах (Hidalgo-Vila et al., 2008; Mitchell & McAvoy, 1990; Readel et al., 2008).

Присутствие сальмонелл у черепах было подтверждено еще несколько лет спустя исследованием, проведенным в Восточной Испании (Marin et al., 2013). Были исследованы Европейская болотная черепаха (Emys orbicularis) и красноухая пресноводная черепаха (Trachemysscripta elegans) из 11 естественных прудов в регионе Валенсия. Сальмонеллы были выделены из европейской болотной черепахи в 8,0 ± 3,1% образцов и в 15,0 ± 3,3% образцов у красноухой пресноводной черепахи в 8 из 11 прудах. В природных прудах преобладали два серовара: S.thompson и S.typhimurium. Самая высокая частота выделения сальмонелл имела место при анализе содержимого кишечника (12,0 ± 3,0%), наиболее низкая частота выделения установлена для воды прудов, черепаховых контейнеров и для клоачных мазков (8,0 ± 2,5% и 3,0 ± 1,5% соответственно). Эти результаты подтверждают тот факт, что свободноживущие черепахи являются существенным фактором риска передачи сальмонелл (Marin et al., 2013).

Литературные данные свидетельствуют о наличие патогенов и колиформных бактерий в пресноводной аквариумной улитке, сиднейской скальной устрице, и разных видах рыб (Bartlett & Trust, 1976; Rowse & Fleet, 1982; Saheki et al., 1989).

Так, при исследовании 49 образцов пресноводной аквариумной улитки (Ampullaria spp.) в 33 торговых точках в 5 городах, Британской Колумбии (Bartlett & Trust, 1976) были выявлены 16 родов бактерий, преимущественно грамотрицательных. Основными представителями сем. Enterobacteriaceae были E.cloacae и E.hafniae. Значительное количество изолятов было отнесено к роду Citrobacter (C.freundii и C.diversus). Были выделены также и сальмонеллы серотипов S.florida, S.tennessee, S.havana, S.infantis,

S. saint-paul, S.newport, S.java и S.mikawasima.

В работе австралийских ученых (Rowse & Fleet, 1982) показано, что в сиднейской скальной устрице (Crassostrea commercialis) присутствует Salmonella charity. Устрицы являются фильтраторами и накапливают микроорганизмы в кишечнике из окружающей воды. Рост устриц в загрязненных водах может привести к их заражению человеческими патогенными бактериями и вирусами.

Рыбы активно аккумулируют в своем кишечнике большое количество бактерий из воды, осадков, грунта, пищи (Sugita et al., 1988). Хорошо известно, что пресноводные рыбы и их водная среда могут содержать человеческие патогенные бактерии, особенно из группы колиформ (Leung et al., 1992; Ramos&Lyon, 2000; Pullela et al., 1998). Уровень загрязнения продуктов аквакультуры патогенными бактериями будет зависеть от окружающей среды и бактериологического качества воды, в которой выращивают рыбу. Для нормальной микробиоты рыб колиформные бактерии не характерны, поэтому выявление фекальных колиформу рыб отражает уровень загрязнения окружающей среды (Cohen & Shuval , 1973).

Так, по данным обзора Кузьминой и др. (2016) в энтеральном содержимом даже свободноживущих пресноводных рыб имеет место преобладание представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter (C.freundii), Klebsiella, Proteus, Moraxella, Serratia, Hafnia (H.alvei). В пищеварительном тракте морских рыб также выявлены этеробактерии родов Escherichia и Enterococcus. У многих видов морских рыб в числе доминирующих отмечены представители р. Vibrio.

Из пищеварительного тракта рыб, почек, мышц и кожи разных видов рыб как умеренных, так и тропических вод был выделен широкий ассортимент патогенных и условно-патогенных бактерий, таких как E.coli, Mycobacterium spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp., Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp. и Enterococcus spp. (Sakata et al., 1980; Ogbondeminu & Okoye, 1992; Ogbondeminu, 1993). Следовательно, на сегодняшний день следует констатировать, что рыбы являются промежуточными хозяевами патогенных кишечных бактерий, опасных для людей (Hejkal et al., 1987; Buras, 1987).

Особое внимание исследователи уделяют объектам аквакультуры. Существует множество различных методов ведения аквакультуры во всем мире, начиная от интенсивных коммерческих хозяйств в ЕС и заканчивая многочисленными мелкими хозяйствами Индии, Вьетнама, Латинской Америки и т.д. Потенциальные риски биологической безопасности, связанные с аквакультурой, значительны, в первую очередь из-за вспышек заболеваний, связанных с употреблением зараженных продуктов аквакультуры (Reilly & Kaferstein, 1997) и повышением устойчивости бактериальных патогенов к антибиотикам в условиях аквакультуры (WHO, 1989; Del Rio-Rodriguez & Millar, 1997). Ниже мы приводим ряд данных о выявлении патогенных бактерий на предприятиях аквакультуры.

Так в префектуре Сидзуока, в Японии (Saheki et al., 1989) было проведено обследование зараженности сальмонеллами прудов для разведения угря. Было исследовано 23 образца (воды прудов, грунт, кожа, жабры, содержимое кишечник угрей и корма). Из 23 исследованных образцов 6 оказались зараженными сальмонеллами. Основными сероварами 56 изолятов Salmonella были S.java (43%), S.braenderup (36%) и

S.etnnessee (14%).

Результаты исследования, проведенного в Индии (Sivakami et al., 1996), показывают связь между отсутствием строгой гигиены и потенциально патогенными бактериями для людей, особенно E.coli в аквакультуре прудового карпа Catla catla, Labeo rohita, Cirrhinus mrigala и Cyprinus carp. Бактерий сем. Enterobacteriaceae выявляли в воде и различных тканях рыб. В кишечном тракте четырех видов рыб и в воде прудов было установлено присутствие Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa.

В более позднем исследовании (Gopal & Karunasagar, 2005), проведенном в Индии на фермах по разведению и пересадке тропических креветок было показано преобладание видов рода Vibrio. В образцах из гемолимфы и гепатопанкреаса были выделены V. parahaemolyticus, V.algonolyticus и V.cincinnatiensis.

Креветки могут быть инфицированы и бактериями рода Salmonella. Так в ряде работ приведены данные о выделении сальмонелл из белойкреветки (Penaeus merguensis) (Rattagool et al., 1990), из пресноводной креветки (Macrobrachium rosenbregii) (Jeyasekaran & Ayyoppan, 2002), из креветок из солоноватой воды (Bhaskar et al., 1995, Bhaskar et al., 1998).

В работе Рехулька и др. (Rehulka et al., 2012) показана возможность инфицирования коммерческих ферм по разведению рыб патогеном Edwardsiella tarda на стадии интродукции рыб, в частности естественно зараженной радужной форели (Oncorhynchus mykiss). E.tarda относится к наиболее важным патогенам при выращивании рыбы, в частности канального сомика (Ictalurus punctatus) (Meyer & Bullock, 1973), лобана (Mugil cephalus) (Kusuda et al., 1976), азиатского паралихта (Paralichthys olivaceus) (Nakatsugawa, 1983) и японского речного угряь (Anguilla japonica) (Miyazaki & Kaige, 1985). E.tarda вызывает заболевание также у змей (Sakazaki, 1962), птиц (White et al., 1969; White et al., 1973), крупного рогатого скота (Ewing et al., 1965; Arambulo et al., 1967). У людей E.tarda может вызывать менингит (Sonnenwirth & Kallus, 1968; Sachs et al., 1974), гастроэнтерит (King & Adler, 1964; Bockenmuhl et al., 1971; Van Damme & Vandepitte, 1980) и абсцессы (Fields et al., 1967).

В литературе имеются данные по инфицированию патогенными бактериями декоративных рыб. Так, по данным Смита и др.. (Smith et al., 2008) вода декоративных рыбных аквариумов обеспечивает основные условия для роста бактерий, поскольку большинство аквариумных рыб являются тропическими по происхождению и требуют тех же теплых, богатых питательными веществами и аэрированных сред, которые способствуют росту бактерий. В докладе Смита и др. (Smith et al., 2012) описывается состав бактериального сообщества и специфические потенциальные патогены, обнаруженные в образцах воды, взятых из 14 аквариумных танков, содержащих декоративных рыб-Carassius auratus и Gyrinocheilus aymonieri, приобретенных из семи магазинов аквариумов в Род-Айленде, США. В образцах воды было выявлено 11 бактериальные видов, которые могут вызвать заболевания у людей, рыб и других видов животных: Coxiella burnetii, Flavobacterium columnare, Legionella birminghamensis, Legionella pneumophila, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus, Aeromonas schubertii, Aeromonas veronii, Aeromonas hydrophila и Plesiomonas shigelloides. Представители родов Vibrio, Legionella и Mycobacterium были найдены как минимум в 10 из 14 аквариумных танков, а Cryptosporidium, Corynebacterium и Aeromonas были обнаружены в 3 из 14 аквариумных танков.

В исследовании Траста и Бартлетта (Trust & Bartlett, 1974) приведены результаты исследования бактерий в воде, поставляемой при покупке в 13 торговых точках с декоративными рыбами: Клинобрюхие (Gasteropelecus sternicla), Данио-рерио (Danio rerio), Скалярии (Pterophyllum). Показано, что количество фекальных колиформ достигает 105кл в 100 мл. Из 75% образцов были выделены: Citrobacter, Escherichia, Pseudomonas и Vibrio. Из 45-65% образцов были выделены Aeromonas, Alcaligenes, Enterobacter, Flavobacterium и Streptococcus. Реже выделялись Pseudomonas aeruginosa, Edwardsiella tarda и Klebsiella pneumoniae.

Аквариумы, содержащие декоративные рыбы, часто встречаются в школьных классах, медицинских и стоматологических кабинетах, заведениях питания, универмагах, домах престарелых и даже в больничных палатах. Очевидно, что присутствие потенциально патогенных микроорганизмов в этих аквариумы представляют опасность для общественности здоровье.

Имеются сведения (Trust & Bartlett, 1976) об ассоциации энтеробактерий и Pseudomonas aeruginosa с аквариумными растениями. В данном исследовании образцы декоративных аквариумных растений были приобретены в 33 торговых точках в 5 городах Британской Колумбии. Колиформные бактерии были выделены из всех 20 проанализированных образцов, фекальные (термотолерантные) колиформы, были выделены из 15 образцов. Семейство Enterobacteriaceae было представлено следующими видами: Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Enterobacter hafniae, Erwinia. Реже выявлялись Klebsiella pneumoniae и Clostridium perfringens. Присутствие сальмонелл установлено не было. Наиболее часто выделяемым патогеном людей являлась Pseudomonas aeruginosa. Как отмечают Карсон и др., (Carson et al., 1975), ассоциация этой бактерии с аквариумными растениями может иметь существенное значение для здоровья людей.

Колиформные бактерии в аквариумистике и в аквакультуре с непрерывной санацией и рециркуляцией воды.

Окружающая среда аквакультуры характеризуется колебаниями физико-химических параметров и микробиологических показателей, вызванных различными питательными нагрузками, трофическими изменениями, климатическими характеристиками и т. д. (Baccarin et al., 2005; Degefu et al., 2011; Santos et al., 2012), поэтому особое внимание уделяется чистоте и санитарным аспектам воды. По этой причине объекты аквакультуры, аквариумы и резервуары находятся под строгим контролем учреждений общественного здравоохранения. Следовательно, следует обращать особенное внимание на способы попадания бактерий в аквариумы. Хорошо известно (Bartlett & Trust, 1976; Bartlett & Trust, 1977) что гидробионты, приобретенные в зоомагазинах могут содержать колиформных бактерий, которыми они были инфицированы в естественных средах обитания, в центрах размножения.

Системы рециркуляции аквакультуры используются в аквариумах и для производства рыбы, где водообмен ограничен, а использование биофильтрации необходимо для снижения токсичности аммиака.

Известно (Summerfelt et al., 2001; Bebak-Williams et al., 2002), что системы рециркуляции аквакультуры являются экологически чистыми, потому что они постоянно санируются. Однако недостатком рециркуляционных систем является то, что если в систему вводится патогенный организм, он может существовать в системе неограниченно долго. Микроорганизмы переносятся в систему рециркуляции путем подачи ее с подпиточной водой (даже из источников подземных вод), с рыбопосадочным материалом, икрой, мальками, через аэрацию, корма для рыб, через насекомых-паразитов, оборудование, а также персонала/посетителей.

В настоящий момент при профессиональном крупнотоннажном разведении гидробионтов обязательно осуществляют санацию воды и инактивацию бактерий. Наиболее распространенные системы санации воды - озонирование и УФ-излучение (Blancheton, 2000; Liltved, 2002; Summerfelt, 2003; Summerfelt et al., 2004).

В условиях непрерывной санации воды, колиформы преимущественно распределяются на гидробионтах, декоре, на биофильтрах, грунте и других поверхностях в виде биопленок. Отмечается ведущая роль бактерии Acinetobacter calcoaceticus в склеивании бактерий в составе биопленки (Simoes & Vieira, 2007; Simoes et al., 2008; Trust & Bartlett, 1976).

В соответствии с экспериментальными данными Шаррера и др. (Sharrer et al., 2005) общие колиформные бактерии в рециркуляционной системе были восприимчивы к инактивации УФ. Полная инактивация колиформных бактерий была последовательно достигнута во всех применяемых УФ-дозах (75, 150, 300, 500, 980 и1800 мВт / см2), даже при самой низкой дозе 77 мВт / см2.

За несколько лет до публикации этих результатов, другие авторы пришли к такому же выводу (Oppenheimer et al., 1997; Emerick et al., 1999). Они сообщили о 3-4 log10 раз меньшей инактивации общих колиформных бактерий при аналогичных дозах УФ.

Согласно результатам исследования Шаррера и Саммерфелта (Sharrer & Summerfelt, 2007), когда применялся только озон, общее количество колиформных бактерий в воде уменьшалось до 2-18 КОЕ/100 мл. Однако, когда озонирование сопровождалось УФ-облучением, общее количество колиформных бактерий в воде, уменьшалось до 0-3 КОЕ/100 мл. Таким образом, объединение озонирования и УФ-облучения может эффективно дезинфицировать рециркулирующую воду практически до нуля до того, как она вернется в резервуар с гидробионтами.

Следующие исследования (Fleet, 1978; Son & Fleet, 1980), проведенные на образцах, взятых из различных объектов с замкнутой системой рециркуляции воды, показывают присутствие в этих объектах общих колиформных бактерий. Было продемонстрировано, что устрицы, загрязненные Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, Clostridium perfringens и Vibrio parahaemolyticus, могут быть очищены, так что численность этих бактерий не обнаруживается уже через 48 часов. Очистка осуществляется путем пересадки устриц в естественных водах, свободных от значительных уровней загрязнения, или путем переноса их в резервуары, через которые закачивается морская вода, которая была обеззаражена УФ, озоном или хлором (Fleet, 1978; Son & Fleet, 1980). Тем не менее, подобные обработки устриц в отношении элиминации E.coli и сальмонелл дали не такие же хорошие результаты. При очистке в резервуарах через 48 часов все еще наблюдаются остаточные уровни этих бактерий (более 0,03 клеток на 1 г фекалий). По-видимому, имеет место повторное заражение устриц через фекальные отложения, содержащие жизнеспособные микроорганизмы. Существуют некоторые доказательства для подтверждения этих предположений. Так Хейвен и др. (Haven et al., 1978) сообщили, что фекальные осадки устриц содержат жизнеспособные бактерии, а в более раннем исследовании Гоггинс (Goggins, 1964) предположил, что осадок фекалий может подвергаться разложению с последующим высвобождением захваченных микроорганизмов.

В исследовании Роуса и Флиита (Rowse & Fleet, 1982) устрицы (Crassostrea commercialis), зараженные S.charity и E.coli, экскретировали фекалии, содержащие жизнеспособные клетки этих бактерий. Количество жизнеспособных клеток в фекалиях зависело от начальной бактериальной зараженности устриц. Таким образом, фекалии можно рассматривать как концентрированный резервуар жизнеспособных бактерий с потенциалом для повторного загрязнения воды в резервуарах для очистки и, таким образом, для очистки очищенных устриц. Как S.charity так и E.coli были извлечены из фекалий, полученных от загрязненных устриц. Численность бактерий в фекалиях была выше для более загрязненных устриц. Устрицы, зараженные S.charity, на уровнях 930 и 43 клеток на г продуцировали фекалии, содержащие 3.3 x и 3.8 x клеток/г (сухая масса) соответственно. Аналогичным образом, устрицы с уровнями E.coli 430 и 43 клеток на г продуцировали фекалии, содержащие 1,8 Ч и 1,5 Ч клеток/ г соответственно.

После очистки устриц, фекалии, зараженные S.charity и E.coli, были источником повторного заражения устриц. Эта особенность снижает эффективность процесса очистки устриц и может привести к сохранению у очищенных устриц низких концентраций патогенных микроорганизмов.

Согласно требованиям РФ, уровень колиформных бактерий в воде аквакультуры также не должен превышать 500 КОЕ/100 мл воды. Это сложное требование, которое должно быть выполнено персоналом предприятий аквакультуры при непрерывном поступлении этих бактерий в воду с экскрементами гидробионтов. Однако большинство этих водных объектов соблюдают даже более строгие стандарты гигиены - не более 235 клеток E.coli в 100 мл воды (Virginia Aquarium Water Quality Parameters Explained, 2016).

Особенности изменения состава колиформные бактерий в условиях непрерывной санации в замкнутых водных системах.

Изменение состава колиформ, как санитарно-показательных бактерий, в замкнутых водных системах при непрерывной санации - важный вопрос для корректной оценки гигиенического состояния этих объектов. Тем не менее, он изучен далеко не достаточно, а научные данные по этому вопросу крайне ограничены (Цесулис, 2008; Аламмар, 2017; Вахрушев, 2018).

На каф. микробиологии СПбГУ еще в 2008 г (Цесулис, 2008) было показано, что в санируемой аквариумной воде не удается выявить E.coli. Позже этот факт был подтвержден в нашей группе в работе Аламмар Виждан Ахмед (2017). Было показано, что в аквариумах с рыбами в замкнутой системе с непрерывной санацией воды подавляющее большинство выделенных изолятов колиформ относятся к родам Klebsiella и Citrobacter (табл. 4).

Обогащение воды клебсиеллами может быть связано с наличием у них способности образовывать слизь, что способствует сохранению клетками жизнеспособности при воздействии озона и УФ-излучения.

Отсутствие E.coli в составе колиформ можно было объяснить их более высокой чувствительностью к процедуре санации воды и появлению сублетальных и летальных повреждений. Понижение жизнеспособности клеток E.coli могло привести к ложно отрицательному результату при их выявлении в связи с жестко нормированными температурными и временными границы проведения тестов в российском официальном методе (МУК 4.2.1884-04).

Таблица 4. Представительство родов колиформных бактерий в воде и обрастаниях аквариума №4СтПетербургского Океанариума (Аламмар, 2017).

Этот факт получил подтверждение в нашей группе в работе Р.А. Вахрушева (2018). Им было показано, что подавляющее количество (до 99%) колиформных бактерий в воде СтПетербургского Океанариума имеют сублетальные повреждения. Понижение жизнеспособности колиформ удалось восстановить проведением на первой стадии анализа часовой процедуры восстановления.

Разработанная процедура восстановления жизнеспособности колиформ позволила вернуться к вопросу о присутствии E.coli в санируемой аквариумной воде. Этот вопрос не потерял актуальности, поскольку до сих пор не ясно, по каким группам колиформных бактерий следует оценивать гигиеническое состояние воды данных водных объектов.

В связи с высоким содержанием колиформ в санируемой аквариумной воде, на пределе требований СанПиН 2.1.4.1074-01, необходимо переходить на более адекватное нормирование подобных объектов. Оценка гигиенического состояния воды по содержанию E.coli, как это делается в Вирджинском аквариуме (Virginia Aquarium Water Quality Parameters Explained, 2016), должна быть тщательно обоснована для СтПетербургского Океанариума. Следует опять вернуться к вопросу выявления E.coli в санируемой аквариумной воде, но теперь уже проводя процедуру восстановления жизнеспособности бактерий. Если E.coli будет выявлена, возникает вопрос, можно ли использовать этот показатель для воды аквариумов с разными гидробионтами или его целесообразно заменить на другой показатель, например «термотолерантные колиформы».

В этой связи на данном этапе исследований актуально оценить наличие E.coli в аквариумах с холоднокровными и теплокровными животными, с целью выработки единых требований по одному гигиеническому показателю. Ответы на эти вопросы представлены в данной работе.

2. Объекты и методы исследования

2.1 Характеристика объектов исследования

Характеристика аквариума №4 (рыбы).

Объектом исследования служила вода пресноводного аквариума № 4. Вместимость аквариума - 3,3 тонны. Температура воды - 17-180С. В аквариуме содержится рыба среднего размера: Сом европейский 30-40 см - 3 шт., Форель радужная 40-60 см - 2 шт., Форель золотая 40-50 см - 5 шт., Карп кои 30-40 см - 6 шт. Режим кормления - 5 раз в неделю (желированный корм - 750 г, рыба - 150 г). Чистка аквариума и грунта проводится без участия водолазной службы - 2 раза в месяц с подменой воды в объеме 30 %.

Аквариум № 4 (рис. 1) - открытого типа, водная поверхность не изолирована от экспозиционного помещения. Аквариум представляет собой имитацию реки с перекатом в центре, разделяющим аквариум на 2 части. Левую часть населяют радужная, золотая форель, карпы кои, правую - сомы. Левая часть аквариума декорирована небольшим водопадом, вода которого с высоты примерно 2,5 м по стене поступает в аквариум. Наличие водопада является дополнительным источником аэробиотической опасности не только для сотрудников, но и посетителей океанариума за счет разбрызгивания воды и образования водного аэрозоля. Системы жизнеобеспечения аквариума является замкнутой. Вода из аквариума по трубопроводу поступает в мешочный фильтр для механической очистки, и далее в буферную емкость. Далее вода подается с помощью насоса по системе трубопровода на 2 биофильтра, заполненных пластиковыми «спиралями», покрытыми активным илом. Очищенная вода санируется путем постоянного облучения ультрафиолетом. Мощность УФ-стерилизатора 225Вт, интенсивность излучения 65мДж/см2. Пробы воды (около 0,5 л) отбирали в стерильную емкость непосредственно из аквариума, под водопадом (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид аквариума № 4.

А - общий вид аквариума; Б - зона реки.

Характеристика аквариума №1 (черепахи).

Аквариум №1- закрытого типа, внешний вид аквариума представлен на рис. 2. Объем аквариума- 600 л. Температура воды 250С. В аквариуме содержится одна грифовая черепаха (35 см в длину). Режим кормления - 3 раза в неделю (по 40-80 г трески, горбуши или индейки). Чистка аквариума и грунта проводится без участия водолазной службы 2 раза в месяц с подменой воды в объеме 30%.

Система жизнеобеспечения аквариума замкнутая. Вода из аквариума по заборным трубкам для механической и биологической очистки попадает на 2 канистровых фильтра, где проходит через несколько слоев фильтрующих материалов (крупнозернистая, мелкозернистая губки, керамические трубочки и шарики). Санация воды производится за счет постоянного облучения ультрафиолетом. Мощность УФ-стерилизатора - 55 Вт.

Пробы воды отбирали непосредственно из аквариума.

Рис. 2. Внешний вид аквариума № 1.

Характеристики аквариума №11 (выдры).

Аквариум № 11 представляет собой изолированный от экспозиционного помещения вольер с сухопутной и водной часть, внешний вид аквариума представлен на рис. 3. Вместимость аквариума 8,5 тонн. В аквариуме содержатся 3 азиатские бескоготные выдры. Кормление осуществляется ежедневно 3 раза в день, дневной рацион составляют: треска 300 г, овощи 460-480 г, говядина или индейка 300 г, цыплята 120 г.

Чистка сухой части вольера осуществляется ежедневно, чистка водоема - 1 раз в неделю с подменой воды в объеме 30 %.

Системы жизнеобеспечения аквариума является замкнутой. Вода из аквариума по трубопроводу поступает на 2 песчаных напорных фильтра и далее на биофильтр, заполненный пластиковыми элементами, покрытыми активным илом. Очищенная вода санируется путем постоянного облучения ультрафиолетом. Мощность УФ-стерилизатора 225Вт, интенсивность излучения 65м Дж/см2.

Отбор проб осуществлялся непосредственно из аквариума.

Рис. 3.Внешний вид аквариума -№ 11.

2.2 Определение численности и выделение колиформных бактерий, очистка изолятов, создание коллекции штаммов, ее поддержание

Выявление и оценку численности колиформ проводили титрационным методом в соответствии с МУК 4.2.1884-04. Численность колиформ выражали в виде наиболее вероятного числа. Для этого из исследуемой воды после тщательного перемешивания делали десятикратные разведения с помощью стерильного физиологического раствора для засева в накопительную среду - лактозо-пептонный бульон (лактоза, пептон и индикатор потребления лактозы -бромтимоловый синий).

Колиформные бактерии являются лактозоположительными, в результате их размножения образуется значительное количество органических кислот, что приводит к снижению рН и изменению цвета среды с зеленого на желтый (рис. 4).

Рис. 4. Накопительные культуры колиформ в лактозо-пептонном бульоне.

Через 22-24 часа при 370С культивирования из пожелтевших накопительных культур делали высев на твердую диагностическую среду Эндо в чашках Петри. Посевы культивировали при 370С 16-18 часов. Состав среды Эндо (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0; дрожжевой экстракт - 1,0; натрия хлорид - 3,4; Д-(+)-лактоза - 10,0; натрия сульфит, безводный 0,8; натрия фосфат 3-зам. 12-водный - 0,5; фуксин основной 0,2; агар - 10,0; рН 7,4+0,2.