Получение и характеристика клеток линии СНО, несущих искусственную хромосому человека с геном фактора VIII свертывания крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

Кафедра генетики и биотехнологии

Выпускная квалификационная работа бакалавра

По направлению подготовки «биология»

Основная образовательная программа бакалавриата «биология»

Получение и характеристика клеток линии СНО, несущих искусственную хромосому человека с геном фактора VIII свертывания крови

Воропаев Иван Николаевич



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИПС - индуцированные плюрипотентные клетки

ПСК - плюрипотентные клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ААВ - адено-ассоциированный вирус

ИХЧ - искусственная хромосома человека

FISH - флуоресцентная гибридизация на стекле

RCA-амплификация - амплификация по типу катящегося кольца

TetR- тетрациклиновый оператор

ZFN, TALEN, CRISPR/CAS9 - методы генетического редактирования

MLV- вирус лейкоза мыши

CHO - раковая линия ооцитов китайского хомячка

клетка стволовой плюрипотентный терапия



ВВЕДЕНИЕ

Гемофилия А является распространённым генетическим заболеванием (1-2 больных на 10 000 в разных популяциях), вызванным мутациями в гене фактора свёртываемости VIII (F8). Традиционный метод лечения заболевания, переливание крови, позднее заменённый инъекциями FVIII (фактор заместительная терапия).

Разрабатываются гено-терапевтические методы лечения. Лечения гемофилии за счёт адено-ассоциированного вирусного вектора (ААВ) показал многообещающие результаты на мышах (ссылка). Тем не менее, генная терапия с использованием вирусных векторов имеет побочные эффекты, такие как воспалительная реакция и инсерционный мутагенез. ИХЧ характеризуется потенциально неограниченной емкостью, стабильной экспрессией трансгена и отсутствием недостатков вирусных методов доставки (ссылка). Ранее было продемонстрировано использование ИХЧ для лечения миодистрофии Дюшен (ссылка)а. В связи со всем вышеперечисленным разрабатывается метод лечения гемофилии с использованием ИХЧ.

До нашей работы в лаборатории была получена ИХЧ с расположенными «голова к голове» генами F8 и EGFP под промоторами CMV и CAG соответственно. Наблюдалась продукция FVIII фактора в клетках линии CHO, но продукция FVIII фактора в в индуцированных плюрипотентных клетках отсутствовала. В статье (Sangmi Chunga et al, 2002) было показано, что ген с CMV (цитомегаловирус) промотором экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках на очень низком уровне (примерно 1% от уровня экспрессии гена с EF промотором). Кроме того в статье (Kouichi Hasegawa et al, 2002) было показано интерференция промотора CAG на тканеспецифичный промотор при расположении генов голова к хвосту. В результате такой интерференции более слабый тканеспецифичный промотор не экспрессировался. При разделении промоторных участков инсулятором cHS4(куриный HS4 инсулятор) ген под CAG промотором и ген под тканеспецифичным промотором нормально экспрессирвоались.

В связи с этим было необходимо заменить в трансгенной плазмиде(CMV-F8) промотор CMV на болеее сильный промотор фактора 1 б элонгации эукариот(pEF1- б), разделить промоторы EF1- б и CMV инсулятором cHS4, а также проверить экспрессируемость гена F8 данной конструкции в индуцированных плюрипотентных клетках и клетках линии CHO . В связи с чем были сформированы цели и задачи нашей работы. Таким образом в результате работы должны быть получены CHO клоны с ИХЧ, содержащей ген FVIII фактора свёртываемости под промотором EF1-б, геном EGFP под промотором CAG, а также cHS4 инсуляторной последовательностью, разделяющей промоторы(рис).



Цель работы:

Получение и характеристика клонов клеток линии CHO, несущих искусственную хромосому человека с геном фактора VIII свёртывания крови под промотором гена эукариотического фактора элонгации 1 (EF1-б).

Задачи:

1) Конструирование векторной плазмиды с геном фактора VIII свёртывания крови (F8) под промотором EF1-б, инсулятором cHS4 и геном EGFP под промотором CAG;

2) Временная трансфекция индуцированных плюрипотентных стволовых клеток плазмидой с EF1-б-F8 и CAG-ЕGFP и оценка уровня продукции фактора VIII свёртывания крови методом вестерн-блоттинга;

3) Липофекция с последующей Cre-рекомбинацией с целью включения плазмиды в искусственную хромосому человека, находящуюся в клетках линии CHO;

4) Последовательный отбор рекомбинантных клонов на селективной среде HAT и на среде с бластицидином;

5) Характеристика рекомбинантных клонов клеток линии CHO методами ПЦР, вестерн-блоттинга, FISH и отбор клонов, пригодных для переноса искусственной хромосомы человека в индуцированные плюрипотентные клетки.

Искусственная хромосома человека.

Искусственная хромосома человека (ИХЧ) - один из векторов доставки трансгена. В отличие от вирусных методов доставки, имеет потенциально неограниченный размер для доставки трансгена. Благодаря этому возможно получение трансгенных клеточных линий и организмов со всеми регуляторными элементами гена, максимально приближая уровень экспрессии трансгена в различных тканях к таковому in natura. ИХЧ присутствует в трансгенных тканях как дополнительная к кариотипу ткани хромосома. Например, клетки линии CHO(раковая линия ооцитов китайского хомячка) с ИХЧ имеют кариотип 23n. Поскольку ИХЧ не интегрируется в геном трансформируемой ткани, отсутствует риск инсерционного мутагенеза и опосредованного им возникновения онкологических заболеваний у пациентов, что также является преимуществом ИХЧ по сравнению с вирусными методами доставки.

Существует два наиболее развитые стратегии получения ИХЧ. Сборка ИХЧ за счёт теломерной трункации природной хромосомы - 21 ИХЧ. Также существует стратегия получения ИХЧ де-ново из при альфа-сателлитных повторов. Каждый метод получения ИХЧ описывается более подробно в соответствующем разделе (Kouprina, review, 2012).

Была продемонстрирована компенсация отсутствия дистрофина при миодистрофии Дюшенна за счёт 21 ИХЧ с геном дистрофина. Экспрессию дистрофина наблюдалась как в ИПС клетках человека и мыши, так и в химерных мыших полученых при инъекции мышиных ИПС с 21 ИХЧ в бластоцисту мыши. Химерные мыши тканеспецифично экспрессировали дистрофин. Таким образом, ИХЧ может использоваться для генной терапии наследственных заболеваний. Также была продемонстрирована наследуемость ИХЧ в ряду поколений. То есть вектор стабильно наследуется как при митотическом так и при мейотическом делении (Kazuki, 2010).

Одна из первых ИХЧ, составленная из рицентромерных альфосателитных повторов.

В 1998 году из альфосателитных повторов прицентромерной области 21 хромосомы была сконструирована одна из первых искусственных хромосом млекопитающих. YAC клон содержавший около 100 кб альфосателитных повторов прицентромерной области 21 хромосомы последовательно трансфецировали линейными модифицирующими векторами с селективными маркерами, ARS репликации(для автономного поддержания в дрожжах), теломерными последовательностями дрожжей и человека, а также гомологичным YAC-вектору участком. В результате гомологичной рекомбинации был получен линейный модифицированный YAC-вектор, имеющий альфосателитную прицентромерную последовательность 21 хромосомы человека, теломерные последовательности человека, селективный маркер млекопитающих (бластицидин). После выделения из геля линейным модифицированным YAC-вектором трансформировали клеточную линию HT1080(клетки фиброкарциномы человека). В результате гомологичной рекомбинации в линии HT1080 была получена ИХМ размером примерно 2.4-5.5 мб, состоящая из тандемно-повторённых модифицированных YAC-векторов, стабильно наследуемая на среде с бластицидином. Присутствия в ИХМ контаминирующей ДНК из линии HT1080 выявленно не было. Эффективность сохранения ИХМ для разных клонов составила 99.5-98.4% за одно деление. Различные анализы не выявили перестроек и контаминации ДНК из линии HT1080. Совмещение FISH гибридизации с непрямой иммунно-флуоресценцией подтвердило наличие кинетохорных белков CENP-A, CENP-B, CENP-C, что говорит о нормальном функционировании центромерной области ИХМ (Masashi et al, 2010). Таким образом, была получена стабильно наследуемая (эффективность сохранения ИХМ 99.5-98.4% за одно деление) искусственная хромосома млекопитающих, составленная из прицентромерных альфосателитных повторов человека, содержащая теломерные последовательности человека. Отсутствие сайта для загрузки трансгена является большим недостатком данной ИХМ.

Рис.2 Схематическое изображение конструирования модифицированного YAC с прицентромерной альфосателлитной областью. YAC, содержащий прицентромерную альфосателитную последовательность 21 хромосомы человека, последовательности для стабильного поддержания в дрожжевых клетках - CEN , ARS; AMP, 1/2URA - участок гомологичный гену прототрофности по урацилу. После трансфекции YAC-модифицирующим вектором 1, левое плечо YAC замещается модифицирующим вектором 1 за счёт гомологичной рекомбинации в дрожжевых клетках. После трансфекции модифицирующим вектором 2 правое плечо замещается на модифицирующий вектор 2. Каждый из этапов замещения, опосредованного гомологичной рекомбинацией, сопровождается отбором на селективной среде по маркерам прототрофности и устойчивости к антибиотикам, присутствующим в модифицирующих векторах 1 и 2. Модифицирующие вектора, в неинтегрированном в YAC виде, не могут стабильно наследоваться из-за присутствия теломерных последовательностей только на одном из своих концевых участков. Таким образом, за счёт последовательной двух-шаговой модификации был получен модифицированный YAC c с прицентромерной альфосателлитной областью, hTEL - теломерными последовательностями человека; последовательностями для поддержания в дрожжевых клетках - CEN, ARS, yTEL, селективными маркерами - LYS, URA, TRP1, Bsr, Neo.

hTEL - теломерными последовательностями человека

yTEL - теломерная последовательность

CEN (центромерная последовательность дрожжей)

ARS (дрожжевая точка начала репликации)

1/2URA - участок гомологичный гену прототрофности по урацилу

Neo - ген устойчивости к антибиотику неомицину

URA - ген прототрофности по урацилу

TRP - ген прототрофности по триптофану

AMP (ген устойчивости к ампициллину)

LYS - ген прототрофности по лизину

YAC- искусственная хромосома дрожжей

Центромер любой хромосомы представлен альфастелитными повторами мономеров примерно по 171 основание, формирующих High order repeats(HOR) кластеры размером 0.2-2 мб. В каждом мономере есть CENP-B бокс представленный 17 основаниями. У всех эукариот, кроме трипаносоматид в центромерном регионе есть специфичные модификации гистона H3, распологающие в CENP-A области HOR. Нуклеосомы с CENP-A(необходимым для выполнения кинетохорной функции центромера) представлены в области HOR, характеризующейся наличием маркеров жёлтого центрохроматина H3K4me2 и H3K36me2, а также некоторыми другими гистоновыми модификациями. Кроме того в CENP-A области наблюдается транскрипция необходимая для нормальной сборки кинетохора.

Конструирование 21 усечённой ИХЧ с Cre-lox сайтом для загрузки трансгена. Гибридная линия DT40(#21) (раковая куриная B-клеточная линия, содержащая 21 хромосому человека) трансформировалась линейными ДНК фрагментами(Дq-TEL/Puro/21q), содержащими теломерные последовательности человека, ген устойчивости к пуромицину, гомологичную последовательность к прицентромерному участка q-плечу 21 хромосомы человека. В результате гомологичной рекомбинации (линия DT40 характеризуется повышенной частотой гомологичной рекомбинации) между участками гомологии 21 хромосомы и модифицирующего вектора в DT40(#21) линии и последующего отбора на пуромицине был получен клон с мини-хромосомой 21ДqИХЧ. Такая минихромосома не содержит генов в q-плече, и содержит всего 1 ген в p плече (в p-плече 21 хромосомы человека картирован всего 1 ген). Затем линия трансформировала линейным вектором модифицирующим вектором Cre/21q с центральными элементами: lox-P сайт и ген неомицина без промотера (после интеграция трансгена целостность гена неомициновой устойчивости восстанавливается, позволяя отбирать трасформантов на среде с неомицином), геном устойчивости к бластисидину, фланкированными двумя участками гомологии Дq 21ИХЧ. В результате гомологичной рекомбинации и последующего отбора трансформантов в Дq был интегрирован Lox-P сайт для загрузки трансгенов. Таким образом, был получен, стабильно поддерживаемый на среде с бластицидином клон DT40(#21), с мини-хромосомой, содержащей lox-P сайт в Дq для загрузки трансгена. Затем клон с мини-хромосомой трансформировался линейным модифицирующим вектором (Дp-TEL/Hygro/21p), с участком гомологии к прицентромерному району p-плеча 21 хромосомы, геном устойчивости к гигромицину и теломерными последовательностями человека. За счёт гомологичной рекомбинации p плечо было заменено последовательностью модифицирующего вектора Дp-TEL/Hygro/21p. Отбирали колонии устойчивые к гигромицину. Так была получена 21ДpqИХЧ. ПЦР анализ, Саузерн-блоттинг и Fish гибридизация с зондами к альфосателитной ДНК подтвердили структуру мини-хромосомы 21ДqИХЧ и 21ДpqИХЧ микрохромы.

Затем осуществляли MMCT перенос минихромосомы и микрохромосомы в CHO клетки (как в наиболее удобную донорную линию для ИХЧ). Помимо клонов с консенсусной структорой ИХЧ были выявлены клоны с делецией участков ИХЧ, что указывает на необходимость проверки структуры ИХЧ после MMCT переноса.

Также осуществляли Cre-lox-опосредованная вставка гена EGFP с восстановлением целостности гена неомициновой устойкивости. Только 1 клон из двадцати отобранных клонов не экспрессировал GFP из-за делеции участка EGFP. Эффективная экспрессия трансгена на среде без антибиотиков не изменялась изменений в течение 30 дней (дальнейшие наблюдения не велись).

Было показано присутствие белков CENP-A,B,C в характерном для нормального кинетохора количестве. Что свидетельствует о нормальном функционировании центромера 21ИХЧ. Наблюдались варьирования количества копий ИХЧ как правило связанные с тем что CHO представлены как диплоидными так и тетраплоидными клетками. ( Katoh, 2004)



ИХЧ с условным кинетохорм. В 2008 году была получена ИХЧ с условным кинтетохором, состоящая из синтетических альфоидных димеров. В результате нескольких циклов рестрикции/лигирования плазмиды синтетический димер (нарабатываемый в векторной плазмиде), состоящий из мономера природного альфосателитного мономера прицентромерной области 17 хромосомы с CENP-B боксом, а также мономера прицентромерной области 17 хромосомы, в котором CENP-B бокс замещён на тетрациклиновый оператор, был замкнут в кольцевую структуру, состаящую из 10 димеров (Megumi Nakano, 2008). После чего с кольцевой структурой проводилась RCA амплификация(амплификация по типу катящегося кольца). В результате RCA амплификации на однонитевой ДНК-матрице температурно-независимо отжигаются гексамерные праймеры. По мере того как новосинтезированная цепь догоняет впередистоящий праймер, она отодвигает его, а также синтесированную с этого праймера цепь. На освободившемся от комплимерного взаимодействия однонитевом продукте амплификации также температурно независимо отжигаются праймеры и синтезируется комплиментарная цепь. (Dean, 2001) Таким образом, за счёт высокопроцессивной полимеразы Phi 29 из кольцевого продукта размером примерно 3кб может быть получен тандемно-повторённый линейный двунитевой RCA-продукт размером 5-10 кб. RCA-продукт котрансформировался с челночным вектором, содержащим селективный маркер для поддержания в бактериях, бактериальный репликон, ARS для репликации в дрожжах, дрожжевую центромерную последовательность, бластицидин для селекции в клетках млекопитающих, а также две гомологичные RCA-продукту последовательности на концах линейного вектора) в дрожжевые клетки. За счёт гомологичной рекомбинации между RCA-продуктами, а также между RCA- продутами и челночным вектором был получен кольцевой вектор размером 50 кб, составленный из альфосателитной последовательности, а также содержащий кассеты для поддержания в бактериях, дрожах и млекопитающих. После выделения вектор трансфецировали в линию HT1080, где за счёт гомологичной рекомбинации между трансфецируемыми векторами образовавалась кольцевая ИХЧ размером 1.1 мб. В дальнейшем в ИХЧ за счёт трансфекции вектором с участками гомологии к ИХЧ и Cre-Lox кассетой и селективным маркером была получена ИХЧ с lox-P сайтом для встраивания трансгена. Эффективная экспрессия трансгена наблюдалась в течение 12 недель (дальнейшие наблюдения не велись) (Yuichi Iida et al, 2010). Детальная характеристика ИХЧ структуры методами Fiber-Fish и Саузер блот было показано что ИХЧ составлена из 14 фрагментов размером 25-150 кб. За счёт специально подобранных сочетаний праймеров было определено, что ИХЧ содержит 15% инвертированной ДНК, вероятно образовавшиеся в процессе формирования ИХЧ в линии HT1080. Кроме того ИХЧ содержит неэкспрессируемый участок, захваченный в процессе формирования ИХЧ из 13 хромосомы HT1080. (Kouprina, William et al, 2012) Данная ИХЧ составлена из синтетических альфоидных повторов, поэтому имеет условный кинетохор, который позваляет при связывании тетрациклинового оператора ИХМ с химерными белками, содержащими тетрациклиновый репрессор и белок модификатор хроматина, индуцируемо утрачивать ИХМ при необходимости. Так было показано, что при экспресии гена химерного белка TetR-tTs, состоящего из тетрациклинового репрессора и белка-сайленсера транскрипции центрохроматин модифицируется в гетерохроматин, что приводит к сайленсингу прицентромерной транскрипции и уменьшению эффективности сохранения ИХЧ в 72 раза. При экспрессии гена химерного белка TetR-tTa, состоящего из тетрациклинового репрессор и белка активатора транскрипции, активируется прицентромерная транскрипция, в результате чего центрохраматин модифицирется в эухроматин, а эффективность сохранения ИХЧ уменьшается в 6 раз. Таким образом, спустя 30 дней после начала экспрессии генов белков TetR-tTs и TetR-tTa, 97% и 27 % клеток соответственно теряют ИХЧ (Megumi Nakano et al, 2008).

Перспективы использования плюрипотентных стволовых клеток

Благодаря высокой степени сходства человеческих и мышиных генов (минимум 80% генов человека имеют мышиные ортологи) возможно использование мышей для моделирования заболеваний человека. Однако некоторые заболевания человека трудно смоделировать на мышах из-за различающихся фенотипов одного и того же заболевания у разных пациентов. Например онкологические заболевания часто вызваны мутациями в нескольких генах, которые не всегда известны и кроме того специфичны для каждого пациента. Большое количество компонентов влияющих на развитие комплексных генетических заболеваний, а также то, что не все из них определены, также сильно осложняет моделирование на животных. В связи с этим огромным потенциалом обладает работа с культурой клеток полученных из биопсии конкретного пациента. Таким образом можно изучать различные свойства раковых клеток, например способность к метастазированию. С другой стороны многие дифференцированные клетки не делятся ни в организме, ни в клеточной культуре, что сильно осложняет моделирование заболевания. Сейчас стало возможным индуцировать плюрипотентные клетки (способные дать начало клеткам всех зародышевых листков) из которых можно получить дифференцированные клетки потенциально любой ткани, если разработан протокол дифференцировки клеток для данной ткани. Благодаря этому возможно моделирование заболеваний, для которых до этого по вышеперечисленным причинам не существовало моделей (Yishai Avior et al, 2016).

Получение плюрипотентных клеток

Для получения плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) с генетическими заболеваниями можно использовать различные стратегии. Так, за счёт искусственного оплодотворения с использованием яйцеклетки и сперматозоида здоровых людей, дальнейшего выделения из бластоцисты и выведения в культуру эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) можно получить достаточное для лабораторных работ количество ЭСК. После чего ЭСК подвергаются генетическому редактированию или отбираются ЭСК претерпевшие спонтанные хромосомные аберрации. Кроме того ЭСК с генетическими заболеваниями могут быть получены за счёт искусственного оплодотворения яйцеклетки или сперматозоида человека с генетическим заболеванием, далнейшей преимплантационной генетической диагностики или преимплантационного генетического скрининга и последующего выведения ЭСК с генетическими заболеваниями в культуру. Также эмбриональные стволовые клетки могут быть получены за счёт перенесения ядра соматической клетки пациента с генетическим в безъядерную яйцеклетку и последующего выведения в культуру ЭСК с генетическим заболеванием. Индуцированные плюрипотентные клетки (ИПС) с гентическими заболеваниями могут быть получены за счёт репрограммирования факторами плюрипотентности соматических клеток (фибробластов или клеток крови) пациента с генетическим заболеванием (фибробластов или клеток крови). В случаях, когда хорошо известна природа заболевания, ИПС с генетическим заболеванием могут быть получены за счёт генетического редактирования ИПС, полученных в результате ре-программирования соматических клеток здорового человека (Yishai Avior et al, 2016).

Моделирование заболеваний на ПСК клетках

Основанное на ПСК моделирование заболеваний наиболее удачно для моногенных заболеваний с высокой степенью пенетрантности и ранним периодом проявления в онтогенезе, таких как гемофилия.

Трёхмерное культивирование нескольких типов клеток вместе позволяет воспроизвести многие фенотипические особенности заболевания, которые невозможно воспроизвести при традиционном двумерном культивировании моноткани. С использованием трёхмерного культивирования был успешно смоделирован муковисцидоз (Schwank, G. et al., 2013 цит по (Yishai Avior et al, 2016).

С использованием ПСК были успешно смоделированы многие моногенные заболевания такие как синдром Лёша-Нихен (Urbach, A. Et al, 2004, цит. по Yishai Avior, 2016), адренолейкодистрофия (Jang et al, 2011 цит. Yishai Avior et al, 2016), вегето-сосудистая гистония (Lee et al., 2009, цит. по Yishai Avior et al, 2016), хромосомные заболевания, например Синдром Дауна (Chen et al, 2014, цит. по Yishai Avior et al, 2016), комплексные заболевания (заболевания с неопределённой генетической природой): сердечная недостаточность (Matsa et al, 2011, цит. по Yishai Avior et al, 2016) Паркинсонизм (Ren et al, 2015 цит. по Yishai Avior et al, 2016) болезнь Альцгеймера (Hossini et al, 2015, цит. по Yishai Avior et al, 2016).

На основе ПСК моногенные заболевания могут быть смоделированы за счёт генетического редактирования ЭСК и ИПС полученных от здоровых людей, за счёт выведения в культуру ЭСК клеток из абортивного материала или за счёт ре-программирования соматических клеток пациента.

Хромосомные заболевания моделируют за счёт отбора ЭСК клеток претерпевших спонтанные хромосомные аберрации, изолирования ЭСК с генетическими аномалиями из аббортивных эмбрионов или за счёт ре-программирования соматических клеток пациентов с хромосомными аномалиями.

Для комплексных заболеваний очень часто известны не все генетические детерминанты. Моделирование комплексных заболеваний проще всего осуществить за счёт ре-программирование соматических клеток пациента с комплексным заболеванием с последующей дифференцировкой ИПС. Для моделирования комплексных заболеваний на ЭСК клетках ипсользуют перенос ядра соматической клетки, полученной от пациента с комплексным заболеванием, в безъядерную яйцеклекту. Затем из бластоцисты получают ЭСК и выводят их в культуру.

Комплексные заболевания могут быть достаточно просто смоделированы с использованием ИПС, при наличии протокола получения дифференцированных клеток, определяющих фенотип заболевания (Yishai Avior et al, 2016).

Ген нейронального аполипопротеинового рецепора (SORL1(sortilin related receptor)) участвующего в процессинге амилоидного белкового предшественника(APP). Аллели гена SORL1 «защищающие» от развития болезни Альцгеймера или «способствующие» её развитию были определены за счёт дифференцированных из ИПС нейронов и нейроглий. Также было определено, что мозговой нейротрофического фактора «защищает» от развития заболевания.

Из ИПС пациента с синдромом Бругада были получены кардиомицы с электрофизиологичекими патологиями характерными для данного заболевания (Davis et al, 2012, цит. по Yishai Avior et al, 2016).

При моделировании заболеваний проявляющихся в позднем онтогенезе разработаны стратегии для «состаривания» дифференцированных клеток, полученных из ИПС. «Состаривание» может проводится за счёт воздействия стрессоров, таких как пероксид водорода, MG-132, конканамицин А (Nguyen et al, 2011, цит. по Yishai Avior, 2016) или за счёт экспрессии белков(прогерин) вовлечённых в болезни преждевременного состаривания, например прогерия Хатчинсона-Гилфорда (Miller et al, 2013, цит. по Yishai Avior et al, 2016 ).

ПСК позволяют также смоделировать и эпигенетические заболевания, поскольку эпигенетический паттерн в некоторых случаях сохраняется в процессе репрограммирования. Так был смоделирован синдром лицевых аномалий первого типа, обусловленный нонсенс мутацией в гене де-ново-ДНК метилазы. Кроме того за счёт моделирования на дифференцированных из ИПС было определено, что отсутствие длинной не кодирующей РНК IPW, вовлечённой в регуляцию импринтированного региона способствует появлению синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана (Cruvinel et al, 2014, цит. по Yishai Avior et al, 2016).

За счёт совместного культивирования глиальных клеток и нейронов дифференцированных из ИПС была определена роль мутации в гене SOD1 для глиальной токсичности по отношению к нейрону (Burkhardt, M. F. et al, 2013, цит. по Yishai Avior et al, 2016).

Трёхмерное моделирование позволяет получать из ПСК и культивировать целые органы. Так за счёт трёхмерного моделирования были воспроизведены органы: глаз, гипофиз, головной мозг, органоиды пищеварительного тракта. В дальнейшем был смоделирована микроцефалия(Lancaster et al, 2013, цит. по Yishai Avior et al, 2016). Последнее сильно облегчает поиск методов лечения для соответствующих заболеваний, поскольку фенотип заболевания не воспроизводится в монокультуре, дифференцированных из ПСК клеток, должным образом.

Поскольку в отличие от ЭСК, ИПС в некоторых случаях сохраняют эпигенетический статус (например, паттерн метилирования) клеток из которых они были репрограммированы, заболевания смоделированные на ИПС и ЭСК не равнозначны. Поэтому важно сопоставлять данные моделирования одного и того же заболевания на ЭСК и ИПС. Например, при моделировании синдрома ломкой Х-хромосомы ген FMR1 транслировался в ЭСК, но не транслировался в дифференцированных клетках.( Eiges. et al, 2007, цит. по Yishai Avior et al, 2016). В тоже время в ИПС ген FMR1 не транслировался из-за сохранения эпигенетического статуса соматических клеток. После получения дифференцированных клеток из ИПС ген FMR1 также не транслировался (Urbach et al, 2010, цит. по Yishai Avior et al, 2016). В дальнейшем было выяснено, что замолкание транскрипции FMR1 гена, вызванное эпигенетическими модификациями в промоторе, обусловленными увеличение количества тринуклеотидных повторов происходит в процессе развития.

Кроме вышеописанных примененний ПСК могут быть использованы при определении проверке эффективности медикаментов для лечения различных заболеваний с идентифицированным клеточным фенотипом. Так ПСК могут быть использованы для проверки эффективности лечения кандидатным медикаментом, например одобренным для лечения нарушений в одном и том же сигнальном пути, что и заболевание пациента. Так может быть ускорен переход к клиническим испытаниям. Кроме того ПСК могут использоваться для высокопроизводительного скрининга миллиона соединений (медикаментов или интерферирующих РНК) за одно исследование и не требует предварительной информации о соединениях участвующих в скрининге (Yishai Avior et al, 2016).

ИСК способствуют развитию персонализированной медицины. При таком подходе каждому пациенту подбирается наиболее эффективный медикамент под конкретный случай заболевания. Кроме того одобрения метода лечения на клеточной культуре может ускорить переход к клиническим испытаниям. Так произошло с медикаментом блокирующим натриевый канал (одобрен FDA для эпилептиков), показавшем эффективность для лечения бокового амиотрофического склероза на культуре клеток. После подтверждения эффективности на культуре дифференцированных из ИПС нейронов препарат прошёл сразу ко второй фазе клинических испытаний. Благодаря этому менее чем за два года препарат от in vitro исследований получил одобрение клинических испытаний (McNeish, et al 2015, цит. по Yishai Avior et al, 2016).

Особенности применения ПСК в клинической практике

Введение использования ИПС в клинической практике требует множества предварительных проверок, таких как лабораторные исследования, доклинические и клинические испытания. Такие проверки замедляют внедрение ПСК в клиническую практику. Тем не менее, они не обходимы для избежания понижения эффективности терапевтического действия клеток дифференцированных из ПСК из-за их иммунного отторжения, а также побочных эффектов, таких как тератомообразование.

Для доклинической проверки ПСК трансплантантов используются иммуно- некомпетентные мыши, которые переносят трансплантацию человеческих дифференцированных из ПСК клеток. Трансплантация дифференцированных из ПСК клеток пациентам также сопровождается иммуно-супрессией, в противном случае могут возникать заболевания типа реакция «Трансплантант против хозяина». При таких заболеваниях у пациента развивается иммунная реакция на трансплантируемую ткань или клетки (Trounson et al, 2016).

Случаи успешного применения ПСК-терапии вклинической и докслинической практике

Появление цитотоксичности у астроцитов из-за выработки провоспалительных факторов способствует дегенерации мотонейронов при боковом амиотрофическом склерозе. Цитотоксичность возникает из-за наличия мутаций в гене супероксид дисмутазы 1. Были одобрены 1 и 2 стадии клинических испытаний для глиальных предшественников экспрессирующих GDNF (глиальный нейротрофический фактор), способствующий выживанию мотонейронов, глиальный нейротрофический фактор (Novel cellular therapeutic approach for ALS gets FDA clearance for first-in-human trials. Q Therapeutics, цит. по (Trounson et al, 2016).

Болезнь Штаргардта связана с мутациями в гене АТФ-связывающего белка ABCA4, гене ELOVL жирноксилотной элонгазы 4 или проминине 1. Мутации способствуют накоплению димеров витамина-А в цитоплазме, что способствует появлению флуоресцентных гранул (гранул липофусцина). Это приводит к дегенерации клеток сетчатки, ухудшению зрения и даже его потере. При миотрофической макулярной дегенерации наблюдается аномальный рост сосудов сетчатки, что вызывает кровоизлияния и рубцевание в субретинальном слое, также приводящие к ухудхению и потере зрения. Трансплантация пигментных клеток эпителия сетчатки с использованием полимерной подстилки на животных показала эффективное сохранение зрения для этих заболеваний (Song et al, 2015, цит. по Trounson et al, 2016).

Пациенты с диабетом первого типа зависимы от инсулиновых инъекций, из-за элиминации бета-клеток поджелудочной железы в ходе аутоимунной реакции. Пластиковая капсула, защищающая от иммунного ответа хозяина, с дифференцированными из ПСК бета-клетками показала эффективный контроль уровня глюкозы на грызунах. В данный момент терапевтический метод проходит 1 и 2 стадии клинических испытаний.

Инфаркт сопровождается недостатком кровоснабжения в миокарде, который приводит к гибели клеток миокарда. Дифференцированные из ЭСК кардиомициты были трансплантированы трансплантированые нечеловекообразным приматам. После трансплантации обнаруживалась аритмия слабой и средней тяжести. 40% поражённой инфарктом зоны было восстановлено трансплантантными клетками. При трансплантации кардиомиоцитов на людях, аритмии не обнаруживалось (Yuji Shiba1 et al, 2016).

Аспекты регулирования применения ПСК-терапии

Клетки для доклинических и клинических испытаний тщательно охраняются и содержатся в очень чистых условиях для предотвращения патогенного загрязнения. Также проводятся проверки на отсутствие мутаций в онкогенах, генах домашнего хозяйства и в генах потенциально влияющих на клеточную функцию, кроме того проверяется хромосомная стабильность. Проверки осуществляются с участием специальных регуляторных служб, таких как FDA. Важность проверок показали случаи в Японии, когда спонтанные мутации в дифференцированных из ПСК пигментных клетках, привели к опухолеобразованию. В Японии введена новая система регулирования клинических испытаний, позволяющая применять временно одобренную терапию в случае наличия данных подтверждающих эффективность терапии с использованием ПСК без 2 и 3 этапа клинических испытаний. Кроме того во многих странах существуют специальные условия для использования терапии не прошедшей все стадии клинических испытаний при отсутствии альтернативных методов лечения и смертельности заболевания. Не смотря на жесткую регулируемость ПСК-терапии, множетство случаев использования небезопастной и не эффективнй клеточной терапии детектируется по всему миру (в том числе и в США). Например, детектировались случаи тератогенеза при использовании ПСК-терапии. Главный лимитирующий фактор выхода ПСК-терапии в клиническую практику - высокая стоимость клинических испытаний, которые далеко не всегда окупаются (Trounson et al, 2016).

Вирусные методы доставки трансгена в генной терапии

Первые вирусные векторы

Главные условия для успешного введения генотерапевтического метода доставки в клиническую практику - низкая генотоксичность и имммуногенность, высокая эффективность доставки и экспресии трансгена (Kotterman et al, 2015).

Первый вирусный вектор, использовавшийся в генной терапии - MLV(вирус мышиного лейкоза). Он применялся для лечения комбинированной иммунная недостаточности ассоциированной с аденозин-дезаминазным деффицитом. Терапия имела слабый эффект и требовала добавочной фермент заместительной терапии (Bordignon et al, 1995, цит. по Kotterman et al, 2015).

Дальнейшие попытки применить MLV вектор для лечения сцепленного с X-хромосомой комбинированного иммунодиффицита, а также ассоциированного с аденозин-дезаминазной недостаточностью иммунодиффицита позволили восстановить функционирование иммуной системы у 18 из 20 и 8 из 10 пациентов соответственно, без использования фермент заместительной терапии (Aiuti et al, 2002, 2009, цит. по Kotterman et al, 2015).

В дальнейшем у 5 пациентов после лечения комбинированного иммунодиффицита сцепленного с X-хромосомой развилась клональная Т-клеточная лейкимия, которую удалось вылечить только у 4 пациентов. Заболевание развилось из-за встраивания вирусного вектора в локус протонкогена. Кроме того использование аденовирусного вектора при лечении орнитин-транскарбомоилазной недостаточности привело к системному воспалению, отказу множества органов и смерти у одного из пациентов. Эти драматические эпизоды продемонстрировали необходимость улучшения безопасности вирусных векторов, а также строгих проверок вируса на безопасность перед клиническим использованием (Kohn at al, 2009, цит. по Kotterman, 2015).

Современные вирусные векторы

Лентивирусный вектор

Лентивирус позволяет обеспечить долговременную экспрессию трансгена. Также он встраивается в открытые рамки считывания, обечпечивая минимальный риск инсерционного мутагенеза, в отличие от MLV вируса, встраивающегося в регуляторные области, в том числе протоонкогенные. Трансдуцирет и делящиеся неделящиеся клетки Лентивирусные вектора третьего поколения собираются из трёх плазмид:1)плазмида с трангеном фланкированным LTR-повторами 2)Две плазмиды с белками обеспечивающими упаковку вируса gag(структурные белки), pol(обратная транскритаза, интеграза и протеаза необходимая для сборки вирусного вектора) и rev(содержит сигнал ядерной локализации) 3) плазмида с белками капсида. Важным нововведением было удаление cis-элементов и вспомогательных белков, что позволило улучшить безопасность вектора. Кроме того в одном из LTR повторов был удалены промоторный участок (Kotterman et al, 2015).

.

В результате сравнения MLV и лентивирусных векторов выяснилось, что инсерционный мутагенез и геннотоксичность MLV вектора опосредуется его интегразой и LTR повторами, в то время как интеграза и LTR повторы обеспечивают лентивирусу более безопасный паттерн интеграции (Kotterman et al, 2015).

Был случай клональной экспансии стволовых клеток крови у пациента при лечении бета-таласемии лентивирусным вектором, развившейся из-за встраивания трансгена в HMGA2 ген. Заболевание проявилось только спустя 4 года после лечения. Тем не менее дополнительные исследования показали отсутствие предпочтительного встраивания лентивирусного вектора в ген HMGA2 или селективного преимущества, опосредованного таким встраиванием.

Аденоассоциированный вирусный вектор

Преимущество аденоассоциированного вирусного (ААВ) вектора по сравнению с лентивирусным вектором в том, что он не нейтрализуется каскадом комплемента и другими компонентами сыворотки крови. Кроме того трансген присутствует в трансдуцированных клетках в эписомном (неинтегрированном) состоянии, что позволяет избежать инсерционного мутагенеза. ААВ вектор трансдуцирует как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Вектор собирается из трёх плазмид: 1) плазмида с трасгеном фланкированным инвертированными повторами, 2) плазмида с генами rep (обеспечивает репликацию, регуляцию транскрипции, интеграцию в геном, сборку вируса) и cap(кодирует структурный белок 60-мерного каписида), 3) плазмида с хелперными вирусными генами необходимыми для сборки ААВ вектора. Альтернативная рамка считывания cap кодирует белок ядерной локализации и сборки вируса. Благодаря удалению rep гена из вируса обеспечивается эписомное состояние вектора. Тем не менее, интеграция в геном встречается в 0.1-0.5% случаев для большинства тканей и 5-10% определённых тканей (печень мышей). Kotterman et al, 2015).



Неинтегративные вирусные векторы - аденовирусный, на основе вируса оспы, вируса герпеса.

Аденовирусный вектор

Аденовирусный вектор позволяет вместить до 30 кб трансгенной вставки. Обладает низкой иммуногенностью благодаря удалению из генетического материала вектора генов вирусных белков (Kotterman et al, 2015).

Вектор на основе вируса герпеса

Делеция генов литического цикла в векторе на основе вируса герпеса позволила уменьшить генетическую токсичность и иммуногенность вектора, а также обеспечила не компетентность к репликации in vivo. Вирусы с генами литического цикла, благодаря способности реплицироваться в активно делящихся клетках используются при лечении онкологических заболеваний (Kotterman et al, 2015).

Вектор на основе вируса оспы

Вектор на основе вируса оспы обеспечивает устойчивую экспрессию трансгена размером вплоть до 25 кб. Удаление гена тимидинкиназы позволило обеспечить репликацию только в делящихся клетках. Вектор на основе вируса оспы использовался для литического разрушения активно делящихся клеток, с активированный путём рецептора-Ras. Вектор также обеспечивал экспрессию трансгенного гранулоцитарно-макрофагальноый колоний стимулирующий фактора, что позволило дополнительно активировать противоопухолевый иммунитета (Kotterman et al, 2015).

Применение лентивирусных и ретровирусных векторов в клинической практике

После лечения иммунной недостаточности (ADA-SCID и X-SCID) ex vivo за счёт MLV вектора 8 пациентам больше не требовалассь фермент-заметсительная терапия, у 9 наблюдалось качественное и количественное улучшение функционирования Т-лимфоцитов, 5 продемонстрировали антиген-специфичный ответ на вакцинацию (Aiuti et al, 2011, цит. по Kotterman, 2015).

X-сцепленная адено-лейкодистрофия(ALD) обусловлена мутацией в гене ABCD1, задействованном в транспорте жирных кислот. Заболевание характеризуется накоплением длинных цепей жирных кислот повреждающих миелиновый слой, что вызывает нейродегенерацию и смерть. Спустя 36 месяцев после терапии вектром на основе псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с ABCD1 трансгеном ни у одного из пациентов не обнаруживалось признаков развития заболевания ( Cartier et al, 2010, цит. по Kotterman, 2015).

Также лентивирусный вектор с бета-глобиновым трансгеном использовался для лечения бета-таласемии. Даже спустя три года после терапии пациенты сохранили уровень гемоглобина почти на уровне среднего по популяции. Также лентивирусная терапия позволии улучшить функционирование Т-лимфоцитов для пациентов с синдромом Вискота-Олдрича, без признаков клональной экспансии. Пациенты с метахроматической лейкодистрофией демонстрировали нормальные когнитивные и моторные функции даже спустя 2 года после терапии с использованием лентивирусного вектора (Cavazzana-Calvo et al, 2010, цит. по Kotterman, 2015).

Была опробована методика создания CART клеток. CART клетки - это Т лимфоциты с Т-клеточным к клетке подлежащей уничтожению и костимуляторным рецептором. При лечении двух видов B-клеточной лейкимии использовали CART клетки с T-клеточным рецептором к CD19 (экспрессируется B-клетками). Полная ремиссия наблюдалась у 2 из 3 (Kalos et al, 2011, цит. по Kotterman, 2015.) и 4 из 5 пациентов (Brentjens et al, 2011, цит. по Kotterman et al, 2015) для разных форм лейкимии. Дальнейшие исследования выявили, что данный вид иммунотерапии иммеет эффект только на пациетах, предварительно проходивших курс химиотерапии ( Brentjens et al, 2013 , цит. по Kotterman et al, 2015).

Клиническое применение аденоассоциированного вирусного вектора.

В 2012 году Европейское агенство по лекарственным средствам одобрило применение адено-ассоциированного вирусного вектора для лечения липопротеинлипазной недостаточности (Carpentier et al, 2012, цит. по Kotterman et al, 2015).

Для лечения Амавроза Лебера был испытан ААВ вектор с геном изомеразы хроматофора сетчатки. У более 30 пациентов после терапии улучшилось субъективное и объективное зрение, сохранившиеся даже через 3 года. Одна из причин большого успеха терапии состоит в низком уровне иммунного ответа при инъекции вектора под сетчатку и возможности использования малого количества вектора. (Bainbridge et al, 2008, цит. по Kotterman et al, 2015.)

Использование ААВ вектороа в комбинации с коротким курсом глюкокортикоидов (для подавления иммунного ответа на клетки с трансгеном) позволило вылечить фенотипически проявления гемофилии Б (Nathwani et al, 2011, цит. по Kotterman et al, 2015.) .

Лечение идиопатических (комплекных заболеваний) также возможно с использованием ААВ векторов. Пациенты с сердечной недостаточностью 3 и 4 класса после терапии ААВ вектором с трансгеном SERCA2 при внутрикоронарном введении демонстрировали улучшение функций левого желудочка и уменьшение частоты случаев сердечно-сосудистых осложнений (Jessup et al, 2011, цит. по Kotterman, 2015.). При лечении Паркинсонизма ААВ вектором с геном декарбоксилазы глутаминовой кислоты наблюдались улучшения моторных функций спустя 12 месяцев после терапевтической инъекции, а также наблюдалось сокращение интенсивности таламического метаболизма, характерной для заболевания (LeWitt et al, 2011, цит. по Kotterman et al, 2015). Кроме того инъекция ААВ вектора с трансгеном дофаминергического нейропротекторного фактора(GDNF) в путамен и субстанцию Нигра улучшила моторные показатели у пациентов с Паркинсонизмом (Marks et al, 2008, цит. по Kotterman et al, 2015). Инъекция ААВ вектором с геном декарбоксилазы L-аминокислот также позволила улучшить моторные показатели для больных Паркинсонизмом (Muramatsu et al, 2010, цит. по Kotterman, 2015.). Терапия с использованием ААВ вектора, секретирующего антитела к васкулярному эндотелиальному фактору роста, пациентам с влажной формой возрастной макулярной дегенерацией позволила улучшить зрение пациентов (clinicaltrials.gov identifierNCT01494805 , цит. по Kotterman et al, 2015).

Клинические приминения неинтегративных вирусные векторов.

Терапия с использованием аденовирусного вектора против ВИЧ способствовала увеличению случаев ВИЧ в эксперименталной группе (один из эффектов действия вектора - клональная экспансия Т лимфоцитов, что «сыграло на руку» ВИЧ вирусу) (Buchbinder et al, 2008, цит. по Kotterman, 2015). Вакцина против гриппа стимулировала увеличение количества антиген-специфичных Т-лимфоцитов. (Peters et al, 2013, цит. по Kotterman, 2015) Также аденовирусный вектор экспрессирующий тимидинкиназу показал эффективность при лечении онкологических заболеваний. (Aguilar et al, 2011, цит. по Kotterman, 2015) Онколитический аденовирус лизирующий клетки с недостатком продукции белка p53 показал эффективность при лечении позних стадий рака головы и шеи. (Nemunaitis at al, 2000, цит. по Kotterman, 2015)

Внутривенная инфекция позволяет доставить вектор на основе вируса оспы в целевые раковые клетки, что невозможно для онколитических аденовирусов и векторов на основе вируса герпеса. Такой подход позволяет лечить начальные стадии рака, а также прогрессирующие метастазы. Так после терапии вектором с геном гранулоцит-макрофаг колоний стимулирующим фактора два из 7 пациентов с меланомой продемонстрировали полное избавление от заболевания. (Mastrangelo et al, 1998, цит. по Kotterman, 2015) Внутри-опухолевая инъекция вектора на основе вируса оспы пациентам с гепатоцитарной карциномой увеличила выживаемость в среднем на 14.1 месяцев (Heo, 2013, цит. по Kotterman et al, 2015).

Традиционные методы лечения генетических заболеваний часто требуют фермент замещающей терапии. Годовая стоимость фермент замещающей терапии в США для гемофилии А и Б обходится в 100 000 долларов и требует инъекции каждые 2 дня. Генная терапия может уменьшить стоимость терапии и частоту терапевтических инъекций (Kotterman, 2015). Кроме того вирусные вектора могу помочь в лечении заболеваний, не имеющих эффективных методов лечения (лечение B-клеточных лимфом CART клетками) (Kotterman et al, 2015).

Невирусные методы доставки.

Вирусные методы доставки трансгена имеют различные ограничения - такие как риск инсерционного мутагенеза (может привезти к канцерогенезу), иммуногенность, ограничение по размеру трансгена, сложность и высокая цена получения вирусного вектора. Невирусные методы доставки доставки не обладают многими из этих недостатков. За счёт невирусных методов доставки можно доставлять терапевтическую ДНК, мРНК, интерферирующие РНК(Murali Ramamoorth et al, 2015).

Выделяют разновидности невирусных систем доставки трансгена:1) доставка трансгена физическими методами (электропорация, гидродинамическая доставка, магнетофекция, сонопорация), 2) доставка за счёт синтетических векторов : а) вектора включающие липиды и липосомы б) вектора собранные из линейных и разветвлённых полимеров в)полимеросомные вектора г) векторы с пептидами вызывающими образование клеточных пенетраций (Murali Ramamoorth et al, 2015).

Важнейшая задача доставляющего вектора - защита терапевтической ДНК от внутриклеточных нуклеаз и внеклеточных нуклеаз. Также важно чтобы вектор не взаимодействал с клеточными и внеклеточными компонентами сыворотки крови, поскольку это может приводить к иммунной нейтралицации вектора или нарушению её локализации. Образование векторных агрегатов в тканевых жидкостях также нежелательно. Вектор также должен упешно проникать в клетку, при этом не попадая в эндосому. Не маловажно попадание терапевтической ДНК в ядро, а РНК в цитоплазму для полноценного функционирования. Также важно, чтобы вектор мог трансфецировать и делещиеся и неделящиеся клетки (Murali Ramamoorth et al, 2015).

Невирусные методы можно использовать для доставки ДНК, мРНК, малых интерферирующих РНК и микро РНК. Для невирусных векторов доставки важно обеспечить: 1) стабильность нуклеиновой кислоты, 2) высокую эффективность доставки терапевтической молекулы в целевые клетки и целевые компартменты клетки (ДНК в ядро, а РНК в цитоплазму), при этом обеспечив защиту от эндосомной деградации, 3)минимальное попадание терапевтической молекулы в нецелевые клетки, 4)минимальный цитотоксический эффект, 5)стабильную долговременную экспрессию терапевтической молекулы (Murali Ramamoorth et al, 2015).

Таблица 1 составлена по (Murali Ramamoorth et al, 2015)

Метод трансфекции	Механизм	Эффективные ткани для трансфекции	Плюсы	Минусы
Прямая инъекция (без вектора)	Эндоцитоз	Мышцы, кожа, печень, кардиомиоциты, твёрдоклеточные опухоли	Безопасность и простота метода	Низкая эффективность трансфекции
Баллистическая ДНК	Электрический разряд стимулирует выстреливание золотыми частицами с молекулами ДНК на поверхности	Рак яичников (модели in vitro и in vivo)	Пластичность метода, низкая токсичность, хорошая эффективность	Образует отверстия в мембране клеток
Электропорация	Образование временные отверстий в мембране из-за изменения мембранного потенцала под действием электрического тока	Кожа, мышцы	Достаточно эффективный	Повреждает трансформируемую ткань. Ткань должна быть доступна для электродов. Трудно трансформировать внутренние органы.
Сонопора-ционное образование кавитационных пузырьков	Создание временно проницаемой мембраны	Мозг, роговица, почки, брюшная полость, мышцы, сердцы, клетки крове-носных сосудов	Безопасность и адаптивность метода	Низкая эффективность
Магнитофекция	Эндоцитоз и пиноцитоз	Линии клеток труднотрансформируемые другими методами	Адаптивность и низкая цитотоксичность	Временная трансфекция
Неорганические моллекулы	Эндоцитоз	Клеточные культуры	Лёгкость получения, стабильность материала, поверностно активное-вещество(легко адсорбируется клетками и клеточными компонентами)	Низкая эффективность
Липидные вектора	Заключение ДНК в нано-частицы из липидов, поглощение наночастицы клеткой за счёт эндоцитоза	Клетки лёгочного эпителия, клетки эндотелия, гепатоциты, миоциты	Безопасность, низкая токсичность	Низкая эффективность, для некоторых показана иммуно-генность
Полиплексы и дендримеры	Заключение ДНК в нано-частице вектора, эффект губки (избегание эндосомной деградации)	Ротовая полость, лёгкие	Низкий уровень иммунного ответа	Активирует каскад комплемента, низкая эффективность, цито-токсичность
Poly-DL co-glucosidase	Частицы могут заключать в себе белки (например антигены патогенных организмов). Наночастицы фагоцитируют-ся антиген-презентирующими клетками вызывая антиген-специфический имунный ответ	Внутривенное введение	Эффективно вызывают антиген-специфический иммунный ответ. Одобрен FDA для доставки белков. Биодеградируемый.

Улучшение невирусных векторов доставки.

Для улучшения различных проблем невирусных методов разработаны различные приёмы. Так ДНК конденсируется протаминами (компактизует хроматин) или липидами для избежания разрушения ДНК компонентами внеклеточного матрикса. Для стабилизации ДНК, ДНК заряд также маскируется ПЭГ покрытием. Для проникновения в клетку векторная нано-частица содержит лиганд к клеточному рецептору и через рецептор-опосредованный эндоцитоз проникает внутрь клетки (трансферрин, эпидермалбный фактор роста, аргинилглициласпартатная кислота (распространённый пептидный мотив клеточной адгезии), антитела). Для проникновения терапевтической нуклеиновой кислоты в цитоплазму или ядро вектор как губка впитывает ионы хлора, при этом повышается осмотическое давление в эндосоме и она разрушается - PEI, DOPE-содержащие вектора. Проникновение в ядро за счёт сигнала ядерной локализации на белках вирусных белках Tat, Rev (Murali Ramamoorth et al, 2015).

...