Получение и характеристика клеток линии СНО, несущих искусственную хромосому человека с геном фактора VIII свертывания крови

Последние модификации невирусных методов доставки позволили получить эффективность трансфекции сопоставимую с вирусными методами доставки. Так использование транспозона «Спящая красавица» позволяет получать стабильную долговремееную экспрессию, а его особенность встраиваться в определённые участки генома сильно уменьшает риск инсерционного мутагенеза. Использование нано-раковин также позволяет улучшить стабильность вектора. Сочетание невирусных методов доставки с геном-редактирующими технологиями позволяет улучшить безопасность генной терапии (Murali Ramamoorth et al, 2015).

Совмещение вирусных и невирусных метод доставки для максимальной оптимизации генной терапии.

В отличие от вирусных методов доставки невирусные методы характируются меньшей токсичностью, более дешевые и простые в производстве, но обладают меньшей эффективность трансфекции и временем экспрессии трансгена. Врмеменная экспрессия трансгена может быть использована, например пдля обеспечения временной экспрессии мРНК CRISPR/Cas9. Кратковременное присутствие мРНК CRISPR/Cas9 сильно увеличивает безопасность генно-терапевтического метода, за счёт уменьшения количества офф-таргетных модификаций. Такой метод был опробован на модельных мышах с наследуемой тирозинемией первого типа. За счёт доставки мРНК CRISPR/Cas9 липидными наночастицами, а гайд РНК за счёт ААВ вектора удалось предотвратитить быструю потерю веса в экспериментально группе мышей, в то время как контрольная группа за 14 дней потеряла 20% веса (один из симптомов заболевания). Иммуноцитохимия покала наличие фумарилацетоацетата, образование котрого нарушено при заболевании, в 6% гепатоцитов. При этом количество офф-таргетных модификаций составило менее 0.3%, что значительно меньше, чем при использовании вирусных методов доставки. При этом эффективность доставки оказалась мРНК Cas9 24%. При использовании ААВ вектора для доставки мРНК Cas9, что не намного выше. (Hao Yin, 2016)

Гемофилия как модельное генетическое заболевание.

Гемофилия относительно распространённое генетическое заболевание. Гемофилия А наиболее встречается 1:5000 среди мужчин. Гемофилия Б встречается в два раза реже.

Большинство случаев гемофилия проходят бессимптомно, проявляясь только при обширных травмах и хирургических операциях. В менее редких случаях(1-2%) наблюдаются сильные кровотечения даже при незначительных травмах. В 1% случаев гемофилии наблюдается спонтанные капиллярные кровотечения, а также хронические болезни суставов (из-за капиллярных кровотечений в суставах) (Geoffrey et al, 2015).

На данный момент гемофилия А лечится введением в кровь пациентов фактора свёртываемости 3 раза в неделю. Такое лечение в США обходится в 100 000$ на пациента ежегодно. Таким образом, лечение экономически и физически крайне обременительно для пациентов и медицинских страховых кампаний. (Kotterman et al, 2015)

Разрабатывается метод лечения гемофилии А на основе ААВ вектора с геном FVIII фактора свёртываемости (Gould et al, 2014). Несмотря на то, что на мышах терапия показала увеличения количества фактора свёртываемости в 1000 раз, терапия может сильно снизить свою эффективность из-за появления нивелирования векторных частиц иммунной системой. Кроме того в качестве побочного эффекта может развиться сильная воспалительная реакция, как было в одном из первых случаев применения вирусных векторов в генной терапии. Иммуносупрессия (курс глюкокортикоидов) традиционно используется при клинических испытаниях генно-терапевтических вирусных векторов. Иммуносупрессия позволяя обеспечить долговременную экспрессию трансгена, но при этом сильно увеличивает стоимость терапии. В связи со всем вышеперечисленным разработка генно-терапевтического метода лечения гемофилии Б с использованием ИХЧ с геном FVIII фактора свёртываемости и ИПС клеток вполне актуальна. Поскольку ИХЧ обеспечивает стабильную экспрессию трансгена в течении длительного периода времени (Kouprina et al, 2012)



2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Молекулярное клонирование

2.1.1 Рестрикция плазмиды 264-EF1-hIL2RG-DsRed-pA 5760 с целью получения фрагмента, содержащего промоторную последовательность EF1-alfa и инсуляторную последовательность СHS4. (рисунок 2.1.1).

1) Проводили рестрикцию с 20 мкг плазмиды 264-EF1-hIL2RG-DsRed-pA 5760 (далее плазмиды 5760) 0.1 мкл эндонуклеазы рестрикции PacI (NEB, кат.#R0547S) (10 000 е.а./мл) в 3мкл (10x буфер) буфере CutSmart(NEB, США, кат.#B7204S) в течении 3 часов при 37°. Объём рестрикционной смеси 30 мкл.

2) Выделяли ДНК из рестрикционной смеси с помощью набора «Clenup Standart для выделения ДНК из агарозного геля» («Евроген», США, кат.#BC022) в соответствии с рекомендациями производителя. Было получено 7.8 мкг ДНК.

3)Проводили частичную рестрикцию выделенной ДНК с рестриктазой XbaI (NEB, США, кат. #R145S). В результате оптимизации протокола частичной рестрикции были подобраны оптимальные условия для получения максимального количества целевого фрагмента 7 мкг ДНК(7.7592), 1.5 мкл рестриктазы (20,000 юнитов/мл), инкубация в течение 30 минут при 37°.

4) Электрофорез (2.8 вольт на сантиметр длины камеры), выделение фрагмента длиной 3,1 тыс. п. н. (рисунок2.1.2)

2.1.2-Рестрикция плазмиды 264 tDNA-optF8 6170 вырезание промотора CMV из векторной плазмиды(CMV-F8)

1) Проводили рестрикцию векторной плазмиды (264 tDNA-optF8 6170) 1 мкг 264 tDNA-optF8 6170 (далее CMV-F8) рестриктазами 0.5 мкл Spe1 (NEB, кат.#R0133S) ( 10,000 units/ml) и 0.5 мкл Pac1 (NEB, кат.#R0547S)( 10,000 units/ml) в 3 мкл буфера CutSmart(NEB, кат.#B7204S) 3 часа. Объём рестрикционной смеси 30 мкл. Избыточное количество рестриктазы связан с истёкшим сроком годности фермента (рестрикция проходит хуже чем с новым ферментом).

2) Электрофорез(2.8 вольт на см длины камеры), выделение из геля фрагмента длиной 16,2 тыс. п. н. с помощью набора «Clenup Standart для выделения ДНК из агарозного геля» («Евроген», кат.#BC022) в соответствии с протоколом набора. Фрагмент длиной 16.2 тыс п.н. (рисунок 2.1.3). Было получено примерно 300 нг «векторного» фрагмента

3) Проводили дефосфорилирование выделенного фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы (Termo Scientific, США, #EF0651).К 300 нг векторной ДНК, 1 мкл щелочной фосфатазы, 2 мкл буфера(10х) и доводили SQ (вода очистки SuperQ) до 20 мкл.

2.1.3 Лигирование и трансформация

1) Проводили лигирование 50 нг «векторного фрагмента» и 30 нг «фрагмента-вставки» 0.1 мкл лигазой T4(Promega, США, кат.#M1801) (10 юнитов/мл) в течение 1 часа при 22 °. Пропорция вектор/вставка рассчитывалась на NEBiocalculator. Соотношение вектор вставка 3 к 1.

З) Трансформация лигазной смесью (с плазмидой EF1-б-F8) компетентных бактериальных клеток:

2)Делили 100 мкл аликвоту компетентоных клеток Escherichia coli на 2 аликвоты по 50 мкл(на льду).

3)Добавляли к одной аликвоте лигазную смесь, а к другой дефосфорилированный векторный фрагмент в таком же количестве как в лигазной смеси (минус контроль).

4) Подвергали компетентные бактериальные клетки тепловому шоку в течение 44 секунд при температуре +42 °.

5)Добавляли 900 мкл среды LB без ампицилина и инкубировали 2 часа на +30°

6)Осаждали бактериальные клетки в центрифуге в течение 17 секунд на 12-ти тысячах оборотов.

7)Сливали супернатант и рассеиваивали компетентные клетки на чашки Петри с твёрдой средой LB (среда LB+агар-агар) с ампициллином

8)Инкубировали при +30 °С в течение 36 ч (оптимальные условия для наработки плазмиды размером примерно 20 кб)

9) Выделяли минипрепы, проверяли плазмиду рестриктазой Hind3.

Выделение минипрепа.

1)Отбирали зубочисткой колоний в 4 мл жидкой LB с антибиотиком ампицилин.

2)Инкубировали пробирки с колониями в шейкере при 30° примерно 24 часа.

3)Осаждали бактериальную пеллету в центрифуге в течение 17 секунд на 12000 оборотов в минуту.

4)Аспирировали супернатант и добавляли к пеллете 200 мкл ресуспендирующего буфера(50 мМ глюкозы, 25 мМ Tris-HCl(pH 8.0),10 мМ EDTA (ph 8.0)).

5)Перемешивали пипетированием и добавляли 400 мкл лизирующего буфера (0.2 N NaOH, 1% SDS)

6)Аккуратно перемешивали переворачиванием(5-6 раз) и добавляем 300 мкл нейтрализующего буфера (на 100мл буфера - ледяная уксусная кислота(100% концентрация) - 11,5 мл, 5 М KAc (ацетат калия) - 60 мл, H2O - 28.5 мл).

7)Аккуратно перемешивали переворачиванием 5-6 раз и центрифугируовали на 13000 оборотов в минуту в течение 5 минут.

8)Отбирали супентант и добавлли к нему 0.6 объёма изопропанола(600 мкл), перемешиваем и центрифугируем на 13000 оборотов в минуту в течение 30 минут.

9)Отбирали супернатант, подсушивали немного осадок и растворяли в 50 мкл воды, растворяли пеллету пипетированием, добавляли 50 мкл 10 молярного LiCl, перемешивали и инкубировали на -20 ° в течение 10 минут, затем центрифугировали на 13000 оборотов в минуту в течение 10 минут.

10)Отбирали супернатант в новую пробирку для центрифугирования и переосаждали 0.6 объёмами изопропанола(60 мкл).

11)Аспирировали супернатант и промываем осадок 500 мкл этанола(отмывка от солей ), центрифугировали 5 минут на 13000 оборотов в минуту, аспирируем этанол и высушиваем осадок(примерно 10 минут).

12)Растворяли осадок в воде(SQ) или TE буфере(10 мМ ЭДТА (ph 8.0)).

2.1.4 Проведение рестрикции с Hind3.

1) Проводили рестрикцию с эндонуклеазой рестрикции 0.1 мкл Hind3(NEB, кат.#R0104S) (10 000 юнитов/мл) 10 мМ ЭДТА (ph 8.0)) в 3 мкл буфера CutSmart, от 1.5-3.5 мкг ДНК (в разных пробах) в течение 3 часов. Объём рестрикционной смеси 30 мкл.

Проводили электрофорез рестрикционной смеси.

2) Добавление к каждой пробе по 6мкл загрузочного буфера(NEB, США,кат.# B7022S), пепетировали и загружали в кармашки геля с бромистым этидием, также загружали 5 мкл маркера моллекулярного веса (Termo Scientific, США, кат.№1333).

3) Прогоняли геля в течение примерно 30-40 минут на 70 вольт.

4) Проявляли геля на трансэлюминаторе и сравнивали(Bio-Rad, Chemidoc Touch) паттерна рестрикции с ожидаемым (10888, 3439, 2547, 1571, 873).

2.2 Временная трансфекция ИПС клеток и проверка экспрессии F8 фактора

2.2.1 Временная трансфекция

) Приготовляли среды для трансфекции. В opti-mem(также содержащий ростовой фактор 2500x LIF(лейкимия ингибитор фактор) - поддерживает мышиные ИПС клетки в не дифференцированном состоянии).

) Добавляли opti-mem (+ ростовой фактор 2500xLIF(лейкимия ингибитор фактор) - поддерживает мышиные ИПС клетки в не дифференцированном состоянии), добавление 5 мкл липофектомина fu-gene в каждую из 2 пробирок для центрифугирования, также в одну из оставшихся пробирок добавляем плазмиду CMV-F8 (концентрация 2900 мкг/мкл), а в другую - плазмиду Ef1-б -F8 (концентрация 1300 мкг/мкл) по 0.2 мкл каждой плазмиды.

3)Инкубировали 30 секунд при комнатной температуре и встряхивание на вортексе

4)Смешивали содержимого пробирок с плазмидой и липофектомином попарно и перемешивали на вортексе.

5)Инкубировали 10 минут при комнатной температуре.

6)Отбирали среду у реципиентных ИПС клеток аспиратором.

7)Промывали 3 мл PBS.

8) Добавляли по 1.5 мл opti-mem с LIF на каждую лунку

9)Добавляли содержимоого пробирок с липофектомином и плазмидами по каплям на две разные чашки с ИПС клетками (трансфекция плазмидами CMV-F8 и Ef1- б-F8 на разных чашках).

2.2.2 Проведение Вестерн-блоттинга.

1)Лизис клеточной культуры.

Наращивание клеток в 6-ти луночном планшете до 80-100% покрытия

А) Отбирали среды для культивирования аспиратором.

Б) Промывали эквивалентным объёму среды объёмом PBS.

В) Добавляли трипсина и инкубация 5 минут.

Г) Отбирали раствор трипсина с клетками в 15 мл фалькон.

Д) Осаждали клеточной пеллеты в центрифуге 3 минуты на 1.2 тысячи оборотов.

Ж) Отбирали среду с трипсином аспиратором и добавляли 100 мкл 1x буфера для нанесения на белковый электрофорез

З) Инкубировали 5 минут при 100 °.

2)Готовили 6% гель (для больших белков таких как F8 фактор(260 КДА)) для проведения Вестерн-блоттинга (хранение геля на +4 °).

3)Заливали камеру для белкового электрофореза SDS (трис-глициновый буфер).

4)Устанавливали гель в камеру и промывали карман.

5)Заливали пробы из рассчёта 10-15 мкг лизата на карман и 5 мкл маркера молекулярного веса (Thermo Scientific, кат.#26619).

6)Проводили белковый электрофорез на 8w на см длины камеры 3 часа

8)Собирали «сендвич» для переноса белка на мембрану - последовательно 3 салфетки, 2 ватмана, нитроцеллюлозная мембрана (Amersham, США,кат.# RPN2020D), гель, 2 ватмана, 3 салфетки.

9)Вымачивали «сендвич» в буфере для переноса(90% трисглициновый буфер и 10% этанол).

10)Устанавливали «сендвич» в камеру для полусухого переноса и выставляли параметры переноса (1А на 1 см^2 - 18 А в нашем случае), напряжение не более 25v.

11)Готовили раствор 2% сухого молока в PBS с 1% tween 20(разбавление 800 мл 5% сухого молока 1.4 PBS и 0.1 tween).

12)Инкубаировали мембраны в растворе сухого молока на 30 минут.

13)Разводили в 4000 раз первичных мышиных моноклональных антител на актин (фирма, кат номер) (0.5 мкл + 2 мл 2% сухого молока) и в 250 раз первичных овечьих антител на F8 фактор свёртывания (фирма, кат номер)(4мкл +1 мл 2% сухого молока).

14)Добавляли антител в контейнер с мембраной и раствором сухого молока и инкубация ночь при комнатной температуре.

15)Отмывали в PBS c 0.1 tween по 5 минут 3 раза.

16)Добавляли в раствор сухого молока с мембраной вторичных антител конъюгированных с пероксидазой хрена (фирма, кат номер) (анти-мышиные(на актин) - 0.5 мкл +2 мл сухого молока(1/4000), вторичные анти-овечьи (фирма, кат номер) (на F8) - 0.5 мкл на 2 мл(1/4000)).

17)Отмывали от вторичных антител 3 раза в PBS с 0.1 tween.

18)Добавляли раствор с субстратом пероксидазы хрена с субстратом для проявления мембраны(Thermo scientific, SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, #34075).

2.3 Интеграция плазмиды с F8 фактором за счёт cre-lox рекомбинации в ИХЧ.

А) День первый

Реагенты:

1. Cre-lox плазмида ( плазмида с геном Cre-lox рекомбиназы.

2. Плазмида EF1-б -F8 (с F8 и EGFP генами)

3. Липофектамин (Lipofectamin 2000 Reagent, Invitrogen, Cat№ 11668-019).

4. Среда opti-mem(Gibco, кат.#51985-026) для переноса (без дополнительных реагентов (таких как антибиотики и сыворотка), которые при трансфекции могут попасть в клетку и вызвать цитотоксический эффект).

2.3.1 Липофекция плазмидами с Cre-рекомбиназой и Ef1-б.

0) Высевали по 30 тыс. клеток линии СНО за 16 ч до трансфекции, содержащих ИХМ на лунку 24-луночного планшета в 1 мл среды для клеток СНО (среда DMEM (Gibco, Cat№61965) + 10% фетальной сыворотки (Sigma, Cat№ 12103С) + пенницилин/стрептомицин (Gibco, Cat№ 15140122) + глутамин (Gibco, Cat№ 25030081))

1)Добавляли по 100 мкл opti-mem в две пробирки для центрифугирования.

2)Добавляли по 5 мкл липофектамина в одну из пробирок и встряхивание на вортексе.

3)Добавляли во вторую пробирку 1мкл плазмиды

с Cre-рекомбиназой (2000 нг/мкл), 0.7 мкл векторной плазмиды(2900 нг/мкл)

4)Инкубировали 30 секунд

5)Смешивали содержимого двух пробиров и тщательное встряхивали на вортексе.

6)Инкубировали в течение 10 минут на комнатной температуре.

7)Добавляли 200 мкл opti-mem и 5 мкл липофектамина в новый эпиндорф и встряхивание на вортексе (минус контроль).

8)Меняли среду CHO клеткам(ооциты китайского хомячка) на opti-mem без сыворотки(в два раза меньше чем добавляем среды для культивирования обычно для увелечения концентрации липофектамина).

9)Добавляли смеси для трансфекции по каплям в одну чашку и смеси липофектамина с opti-mem без плазмиды (минус контроль) в другую чашку. Минус контроль нужен для понимания того, когда все клетки не получившие плазмиду на чашке с плюс контролем умрут.

Б) День второй.

1) Аспиририровали opti-mem среды спустя 8-12 часов инкубации, промываем PBS.

2)Добавляли среды для культивирования CHO клеток - DMEM-F-12 +10% сыворотки (Sigma, Cat№ 12103С), амфоторицин Б (1/1000 - 10 мкл на 10 см чашку), пенициллин/стрептомицин (Gibco, Cat№ 15140122) (1/1000), глутамин (Gibco, Cat№ 25030081) .

В) День третий. Пересев CHO клеток на среду с Hat-реагентом.

Отбор на hat(гипоксантин-аминоптерин тимидин) среде происходит следующим образом. Аминоптерин блокирует два этапа в биосинтезе пуринов и один в биосинтезе тимидина. При снабжении клеток гипоксантином и тимидином, они могут пережить воздействие аминоптерином за счёт пути реутилизации нуклеотидов. Это возможно при условии наличия рабочей тимидинкиназы и гена HPRT. Поскольку для поддержания ИХЧ используется нокаутные по гену HPRT клетки линии CHO.

1)Аспирировали старой среды.

2)Промывали эквивалентным количеству среды для культивирования объёмом PBS(3мл).

3)Добавляли трипсина.

4)Инкубировали с трипсином 5 минут

5)Ингибировали трипсина вдвое большим объёмом среды с сывороткой.

6)Отбирали клеток с трипсином и центрифугирование 3 минуты на 1.2 тысячи оборотов.

7) Готовили hat-среды. Хранение hat_реагента на -20 ° в сухом виде, хранение в разведённом виде (50x раствор 10 мл) - 1-2 месяца на +4 °.

8) Добавляли hat-реагента непосредственно к клеткам из рассчёта 1/50 (200 мкл на 10 мл среды для культивирования в 10-сантиметровые чашки).

9) Замяли среды на новую с hat-реагентом каждый день.

Фотографии с флуоресцентного микроскопа результатов cre-lox рекомбинации в CHO

4)Отбор клонов.

1)Отборали среды в 10см чашки и добавляли эквивалентный объём PBS.

2)Переносили клонов на 96-ти луночный планшет в 20 мкл трипсина (отбираются клоны с наиболее ярким EGFP- свечением).

3)Инкубировали 5 минут.

4)Добавляли 80 мкл среды и разбиваем клетки пипетированием.

5)Культивировали клонов со сменой Hat среды каждый день, а также содержащей антибиотик бластисидин.

6)При покрытии планшета на 80% пересевали на 24-х и 6-и луночные планшеты последовательно.

а) Аспирировали среды, промывка PBS, добавление трипсина

б) Инкубировали 5 минут.

в) Забирали клонов дозатором для пипетирования и перенесение в 96-луночный планшет

г) Добавляли 80 мкл среды и разбивание клеток пипетированием.

Характеристика CHO клонов.

2.3.3)Флуоресцентная гибридизация на стекле(FISH).

А) Приготовление метафазных пластинок.

1)Добавляли в чашку (с 80% покрытием клетками) кальцемид(100 мкл на 10 мл среды).

2)Инкубировали с кальцемидом минимум два часа. Клетки округляются и частично открепляются от чашки.

3)Собирали клетки.

а) Отбирали среду с плавающими клетками.

б) Добавляли PBS и отбор PBS вместе с открепившимися клетками в фалькон.

в) Добавляли трипсин к чашке с клетками и инкубация в течение 5 минут при 37% в CO2 инкубаторе.

г) Стучали по чашке для лучшего открепления клеток.

д) Добавляли 4 мл среды для ингибирования трипсина

е) Пипетировали и отборали клетки со средой и трипсином, добавляли в фалькон с клетками из пунктов а), б).

ё) Осаждали клеток 3 минуты на 1.2 тысячи оборотов

ж) Отбирали среду с PBS и трипсином аспиратором, оставляя только клеточную пеллету.

м) Разбивали клеточной пеллеты щелчками, добавление 1 мл PBS, перенесение в 15 мл фалькон.

н) Добавляли 9 мл PBS (для отмывки клеток от среды)

о) Осаждали клетки и аспирировали PBS.

4) Разбивали пеллету и добавляли по 10 мл KCl (при добавлении вращали фалькон, а KCl добавляли по капле) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.

5) Готовили фиксатора 3:1 (метанол и ледяная уксусная кислота соответственно) - по 4 мл на пробу, 16 мл - для 4 проб.

6) Добавляли 10 капель фиксатора в каждую пробу.

7) Откручивали на 1.5 тысячи оборотов 5 минут без затормаживаний центрифуги при остановке вращения центрифуги («breaks»)(предохлаждение до +4°).Фальконы с клетками оставляли на +4°.

8) Аспирировали и аккуратное разбивали клетки пальцем (не забывали, что клетки разбухшие и легко могут полопаться) до перехода клеток в сусензию.

9) Добавляли 1 мл фиксатора по каплям по стеночке в каждый фалькон.

10) 30-минутная инкубация на +4° .

11) Откручивали в центрифуге в течение 5 минут на 1.5 тысячи оборотов.

12) Аспирировали фиксатор и добавляли 1 мл нового, откручиваем 5 минут на 1.5 тысячи оборотов.

13) Повторяли пункты 12 ещё 2 раза, в конце оставлять клетки на +4 в 1 мл фиксатора (не отбирая его).

14) Готовили стёкла для приготовления метафазных пластинок. Отмывали стёкла от органики в 6 нормальном растворе HCl минимум 6 часов (для устранения органического фона). Затем отмывали в проточной (холодной) воде (из под крана). Отмывали в дистиллированной воде.

15)Аккуратно переводили клеток в суспензию. Отбор 50 мкл пипеткой, капали с высоты примерно 70 см на стёкла. Оставшиеся зафиксированные клетки хранили на -20°. Высушивали стёкла, накрывали и инкубировали минимум сутки до гибридизации (лучше больше).

2.3.4 ПЦР анализ ДНК CHO клеток с праймерами на ген F8 и CMV промотор.

Выделение ДНК с культуры CHO клеток в соответствии с протоколом набора GeneJet Genomic DNA Purification Kit (Termo scientific, #K0721).

На каждую ПЦР пробу добавляли по 20 мкл ДНК (низкая концентрация ДНК), 5 мкл буфера, 1 мкл прямого (ACGTCGTCTTTAGGTTGGGG) и 1 мкл обратного праймера (TCGGTGAACTCCACGAACAG), 1.25 мкл Taq полимеразы, доводили водой до 50 мкл.

Программа ПЦР:

1)Инициация - 95° - 1 минута.

2)35 циклов - пункты а)-в).

а) Денатурация - 95° - 30 секунд.

б) Отжиг - 58° - 30 секунд.

в) Элонгация - 72° - 30 секунд (из рассчёта 1 минута - на 1 тысячу пар оснований).

3)Финальная элонгация - 72°.

4)Хранение - +20°

5)Прогонка электрофореза ПЦР продуктов на 70 вольт примерно 30-40 минут. Проявление ДНК-электрофореза на трансэлюминаторе.

2.3.5 ПЦР анализ на наличие Cre-рекомбиназной вставки.

На каждую ПЦР пробу добавляли по 20 мкл ДНК (низкая концентрация ДНК), 5 мкл буфера, 1 мкл прямого (AAATGGGCAAAGGCAATAC) и 1 мкл обратного праймера (TCGACCGGTAATGCAGGCAA), 1.25 мкл Taq полимеразы, доводили водой до 50 мкл.

Программа ПЦР:

1)Инициация - 95° - 30 секунд.

2)35 циклов - пункты а)-в).

а) Денатурация - 95° - 30 секунд.

б) Отжиг - 56° - 30 секунд.

в) Элонгация - 72° - 30 секунд (из рассчёта 1 минута - на 1 тысячу пар оснований).

3)Финальная элонгация - 72°.

4)Хранение - +20°

5)Прогонка электрофореза ПЦР продуктов на 70 вольт в течение примерно 30-40 минут. Проявление ДНК-электрофореза на трансэлюминаторе.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Молекулярное клонирование.

Нами была получена плазмида Ef1- б-F8 с новым промотором Ef1- б и инсулятором cHS4(инсулятор куриного в-глобин-подобного гена), разделяющим промоторы Ef1- б (гена F8) и CAG(гена EGFP). Паттерн рестрикции подтвердил, что структура плазмиды соответствует ожидаемой. Секвинирование одной из проб(11) также не выявило несоответствий.

На фотографии ПЦР видно, паттерн проб 1,5,9,10,11,12 полностью соответствует ожидаемому (10888, 3439, 2547, 1571, 873).

Также проводилось секвенирование с праймерами на участки стыкующиеся при получении плазмиды. То есть секвенировался участок соединения EF1-б и F8 и соединения cHS4 и CAG. Выравнивание результатов сиквенирования не выявило несоответствий.

3.2 Временная трансфекция ИПС клеток гемофильной линии мышей (JAX Mice STRAIN DATASHEET - 004424) плазмидами плазмидой EF1-alpha-cHS4-tDNA-optF8 и 6170 264 tDNA-optF8 6170.

3.2.1 Временная трансфекция.

После временной трансфекции, небольшая часть ИПС клеток демонстрировала свечение в зелёном спектре(GFP-сигнал), что говорит о низкой эффективности трансфекции.



Уровень трансфекции 1-5% для обоих плазмид.

На фотографии электрофореза видно, что сигнал от F8 есть в ИПС клетках, транспецированных плазмидой EF1- б-F8 также как в CHO клетках со старым промотором (плюс контроль), хотя и более слабый (из-за низкой эффективности трансфекции(далеко не каждая клетка получила плазмиду, как было видно в предыдущем пункте), кроме того экспрессия в плазмиде проходит менее эффективно чем в хромосоме, и быстрей прекрашается (из-за разрушения плазмиды нуклеазами).

3.2.2 - Вестерн-блоттинг.

Вестерн-блоттинг подтвердил, что ген F8 под промотором EF1-б продуцирует FVIII фактор в ИПС клетках.

Как видно F8 под CMV промотор не продуцировался ни в составе плазмиды, ни в составе искусственной хромосомы. При этом даже не смотря на низкую эффективность трансфекции, F8 под промотором EF1-б продуцировался в составе плазмиды. Линия CHO с искусственной хромосомой, содержащая F8 фактор под промотором CMV использовалась в качестве плюс контроля. Сигнал от FVIII фактора свёртываемости есть в ИПС клетках, транспецированных плазмидой EF1- б-F8 также как в CHO клетках, содержащих искусственную хромосому с CMV-F8 (плюс контроль), хотя и более слабый (из-за низкой эффективности трансфекции (далеко не каждая клетка получила плазмиду, как было видно в предыдущем пункте), кроме того экспрессия в плазмиде проходит менее эффективно чем в хромосоме, и быстрей прекрашается (из-за разрушения плазмиды нуклеазами). Таким образом замена промотора CMV на Ef1-б, а также разделение промотора Ef1-б и CAG инсуляторной областью cHS4 позволяет добиться успешной продукции FVIII фактора свёртывания. Тем не менее замена CMV промотора ан EF1-б, а также разделение промотора EF1-б и CAG инсуляторной областью cHS4 позовлила добиться продукции FVIII фактора свёртывания крови.

3.3Характеристика CHO клонов.

После интеграция трансгенной конструкции за счёт Cre-lox рекомбинации ИХЧ (искусственной хромосомой человека и млекопитающих) в клетках линии CHO(не заражённых микоплазмой) и послеловательного отбора на селективной среде HAT и на среде с бластицидином было получено 15 клонов.

3.3.1 Характеристика CHO клонов по GFP сигналу.

Для характеристики использовались только быстрорастущие на селективных средах клоны, с хорошим уровнем продукцией GFP.



3.3.2 ПЦР ДНК CHO клонов с парймерами на трансгенную вставку

Как видно по рисунку ДНК-электрофореза продуктов ПЦР реакции с праймера на F8 и Ef1-б, F8 трансгенная вставка (с геном F8) присутствует во всех CHO клонах.

3.3.3 ПЦР с праймерами на ген Cre-рекомбиназы.

В 1, 3, 7 клонах было выявлено наличие вставки гена Cre-рекомбиназы. Эти клоны с геном Cre-рекомбиназы были отбракованы.

3.3.4 Вестерн-блоттинг CHO клонов

Вестерн-блоттинг показал продуцируемость F8 фактора во всех клонах, кроме трёх(8,7 и 1). Слабый сигнал от 9 клона на мембране связан с меньшим количеством взятых клеток (что видно по сигналу актина).

Анти-актин Анти-FVIII

Таким образом, ген FVIII фактора свёртывания эффективно экспрессируется в составе ИХЧ в CHO клетках.

3.3.5 FISH гибридизация

FISH гибридизация подтвердила присутствие ИХЧ в не амплифицированном, и не интегрированном состоянии в 6 из 15 клонов. ИХЧ присутствует отдельно от хромосом клеток линии CHO(22n+ИХЧ -кариотип). Кроме того размер ИХЧ соответствует размеру не амплифицированной ИХЧ.

Таким образом, было показано, что ген F8 под промотором Ef1-б присутствует в составе ИХЧ в CHO клетках, продуцирует FVIII фактор свёртывания крови, а искусственная хромосома присутствует в неамплифицированном и неинтегрированном в хромосомы клеток CHO виде. Также было показано отсутствие интеграции гена Cre-рекомбиназы в хромосомы CHO клеток. Временная транфекции в сочетании с Вестерн-блоттингом подтвердили способность конструкции Ef1-б-F8 продуцировать FVIII фактор свёртывания крови. Таким образом, есть все основания полагать, что после MMCT(перенос опосредованный микроклетками) переноса Ef1-б-ИХЧ из клеток CHO в ИПС клетки нокаутных по F8 фактору мышей (JAX Mice STRAIN DATASHEET - 004424) FVIII фактор свёртывания крови будет продуцироваться в них.

В итоге было получено 6 клонов подходящих по всем ключевым работам для дальнейших экспериментов.

Итоговая таблица характеристики СНО клонов.



ВЫВОДЫ

1) Замена промотора CMV на промотор EF1-б с добавлением инсулятора cHS4 способствует эффективной экспрессии гена фактора VIII свертывания крови (F8) в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках гемольной мыши (JAX Mice STRAIN DATASHEET - 004424).

2) Отобранные клоны клеток линии CHO подходят по ключевым критериям для дальнейшей работы с искусственной хромосомой человека, несущей ген фактора VIII свертывания крови (F8).



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Dean F. B., John R. Nelson, Theresa L. Giesler, and Roger S. Lasken. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. // Genome research. 2001. V. 11 P. 1095-1099

Geoffrey L. Rogers and Roland W. Herzog. Gene therapy for hemophilia. // HHS Public Access. 2015. V.20. P. 556-603

Gould J. Genie in a vector. // Nature. 2014. V. 515. P. S160-S161.

Hao Yin, Chun-Qing Song, Joseph R Dorkin. Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo. // Nature. 2016. V. 34. P. 328-334.

Katoh M. M. , Ayabe F. , Norikane S. et al. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004. V. 321 P. 280-290.

Kazuki Y., Masaharu Hiratsuka, Masato Takiguchi1. Complete Genetic Correction of iPS Cells From Duchenne Muscular Dystrophy. 2010. V. 18. P.386-393.

Kotterman M. A., Thomas W. Chalberg et al. Viral Vectors for GeneTherapy: Translational and Clinical Outlook. // The Annual Review of Biomedical Engineering. 2015. V. 17. P.63-89.

Kouichi Hasegawa, Norio Nakatsuji. Insulators prevent transcriptional interference between two promoters in a double gene construct for transgenesis. // FEBS Letters. 2002. V. 520. P. 47-52.

Kouprina N., William C. Earnshaw, Hiroshi Masumoto, Vladimir Larionov. A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy. // Cellular and Molecular Life Sciences. 2012. V. 70. P. 1135-1148.

Kouprina N. , Samoshkin A., Indri Erliandri. Organization of Synthetic Alphoid DNA Array in Human Artificial Chromosome (HAC) with a Conditional Centromere. // ACS Synthetic Biology. 2012. V. 1. P. 590?601.

Masashi Ikeno et al. Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes. // Nature. 2010. 1998. V.16 P. 431-439.

Megumi Nakano, Cardinale S. , Vladimir N. , Noskov et. al. Inactivation of a Human Kinetochore by Specific Targeting of Chromatin Modifiers. // Developmental Cell. 2008. V.14. P. 507-522.

Ramamoorth M., Aparna Narvekar. Non Viral Vectors in Gene Therapy- An Overview. // Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2015. V. 9 P. 1-6.

Sangmi Chunga, Therese Anderssona et al. Analysis of Different Promoter Systems for Efficient Transgene Expression in Mouse Embryonic Stem Cell Lines. // NIH Public Access. 2002. V. 20. P. 139-145.

Trounson and N. D. DeWitt. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. // Nature. 2016. V. 17. P. 194-200

Yishai Avior, Ido Sagi and Nissim Benvenisty. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. // Nature. 2016. V.17 P. 170-182.

Yuichi I., Jung-Hyun K. et al. Human Artificial Chromosome with a Conditional Centromere for Gene Delivery and Gene Expression. // DNA Research. 2010. V. 17. P. 293-301.

Yuji S., Toshihito Gomibuchi , Tatsuichiro Seto et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. // Nature. 2016. V. 538. P. 388-391.

Размещено на Allbest.ru

...