Токсигенные свойства микроскопических грибов

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, г. Москва, Россия

ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Россия, 109240, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14).

Токсигенные свойства микроскопических грибов

Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Седова, С.А. Шевелева, В.А. Тутельян

Аннотация

Авторский коллектив:

Ефимочкина Наталья Рамазановна д-р биол. наук, в.н.с. лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома,

Седова Ирина Борисовна канд. биол. наук, с.н.с. лаборатории энзимологии питания ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Россия, 109240, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14).

Шевелева Светлана Анатольевна д-р мед. наук, зав. лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Россия, 109240, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14).

Тутельян Виктор Александрович академик РАН, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Россия, 109240, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14).

Микроскопические грибы, инфицирующие растения в период вегетации, а также сельскохозяйственную продукцию при хранении, могут попадать в пищевые продукты и корма для животных и загрязнять их своими токсичными метаболитами - микотоксинами. Видовой состав и доля каждого из видов в комплексе выявляемых грибов могут меняться с изменением условий выращивания или хранения, что сопровождается изменениями в спектре микотоксинов. Наряду с известными и контролируемыми загрязнителями этого рода могут повышаться уровни содержания ранее не учитываемых токсичных грибных метаболитов, нуждающихся в дальнейшем изучении и оценке опасности их появления в продуктах питания. Обзор посвящен рассмотрению грибов из родов Fusarium, Aspergillus и Pйnicillium, представители которых могут продуцировать как уже регламентируемые в продуктах растениеводства микотоксины, так и прогнозируемые. В обзор включены также виды Alternaria spp., изучение которых выявило частую встречаемость и широкий спектр продуцируемых токсичных метаболитов, пока не нормируемых в пищевых продуктах.

Ключевые слова: микроскопические грибы; микотоксины; пищевые продукты; Fusarium; Alternaria; Aspergillus; Pйnicillium.

Annotatіon

Natalia R. Efimochkina, Irina B. Sedova, Svetlana A. Sheveleva, Viktor A. Tutelyan

Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow, Russian Federation

Toxigenic properties of mycotoxin-producing fungi

Microscopic fungi that infect plants during the growing season and agricultural products during storage can get into food and animal feed and pollute them with their toxic metabolites mycotoxins. The species composition and proportion of each species in the complex of fungi may vary with changes in growing or storage conditions, which is accompanied by changes in the spectrum of mycotoxins. In addition to known and controlled pollutants of this kind, the levels of previously unaccounted toxic fungal metabolites may increase, requiring a further study and assessment of the risk of their occurrence in food. The review is devoted to the consideration of fungi from the genera Fusarium, Aspergillus and Pйnicillium, whose representatives can produce mycotoxins both already regulated in plant products and predicted. The review also includes species Alternaria spp., the study of which revealed a frequent occurrence and a wide range of produced toxic metabolites, not yet normalized in food.

Most mycotoxic fungi can multiply and accumulate toxic metabolites in a wide range of habitats of these microorganisms. We showed that microorganisms are extremely widespread in nature, and under favorable conditions with high humidity and optimal temperature (See Table 1) can affect various food products, animal feed and vegetable resources causing significant economic damage. Since it is difficult to identify toxin-producing fungi contaminating different substrates including food products and animal feed, mycotoxinology studies are conducted in accordance with a strict procedure including detection of species composition of fungi and their distribution by geographical zones, and determination of substrates contaminated with mycotoxins, as well as the composition of mycotoxins and the mechanism of their action on humans and animals.

The paper presents data on the properties of toxigenic fungi of the genera Aspergillus, Alternaria, Fusarium and Pйnicillium, the most important from the point of view of food and animal feed safety. A special attention is paid to the problem of detecting producers of emerging mycotoxins among these fungi (See Table 2), which include fusaproliferin, beauvericin, enniatins, moniliformin, tenuazonic acid, tentoxin, alternariol and its methyl ether, mycophenolic acid, citrinin, fusaric acid, sterigmatocystin, emodin and asperglaucid (Gruber-Dorninger C et al., 2017, Jestoi M, 2008, Fraeyman S et al., 2017, Serrano AB, 2015).

The review discusses the problems and prospects of applying the methods of DNAidentification of toxigenic fungi, touched upon in works of Gagkaeva TYu et al., 2017, Stakheev AA et al., 2018, Dupont J, 2010, Gromovykh TI et al., 2014, Rodriguez A et al., 2011. We enumerate the difficulties that prevent a widespread introduction of PCRdiagnostics including the specifics of fungal DNA extraction, peculiarities of qualitative PCR for multinuclear cells of filamentous fungi, and the necessity to differentiate inactivated and viable mold forms. We showed that molecular methods of micromycete identification should be improved in order to search for target DNA sequences and markers which correlate with mycotoxigenic strains in the studied substrate. An important part of the research was to identify mycotoxin biosynthesis genes and evaluate their expression. Selection and improvement of DNA methods of food control for toxigenic fungi are needed for adequate risk evaluation of food contamination with mycotoxins, ensuring its safety and preventing mycotoxicosis.

The paper contains 2 Tables and 81 References.

Key words: microscopic fungi; Fusarium; Alternaria; Aspergillus; Penicillium; mycotoxins; food products.

Основная часть

Одной из наиболее актуальных проблем обеспечения безопасности пищи является оценка загрязнения продовольственного сырья и готовых продуктов микроскопическими плесневыми грибами потенциальными продуцентами микотоксинов. Микотоксины - разнообразные по химическому строению вторичные метаболиты грибов, обладающие токсичными для человека и сельскохозяйственных животных свойствами. Появление микотоксинов в продуктах растительного происхождения может быть связано с микроскопическими грибами, которые инфицируют растения в период вегетации и загрязняют урожай уже к моменту уборки (фитопатогенные грибы), или с грибами, которые развиваются на продуктах при уборке и хранении, особенно при повышенной влажности (плесени хранения). Наличие токсигенных грибов и микотоксинов в сельскохозяйственных продуктах сопряжено с опасностью развития микозов и микотоксикозов тяжелых заболеваний людей и животных, возникающих не только при употреблении пищевых продуктов и кормов, пораженных различными токсинообразующими микромицетами, но и при тесном контакте с ними [1-5].

Некоторые тяжелые формы микотоксикозов известны со средних веков и широко распространены в развивающихся странах. К ним относится эрготизм, связанный с употреблением хлеба, изготовленного из зерна, зараженного спорыньей (Claviceps purpurea). В Европе это заболевание, сопровождающееся гангреной конечностей, возникало достаточно часто в XrV-XVI вв. Алиментарную токсическую алейкию, которая развивается вследствие употребления перезимовавших в поле злаков, инфицированных некоторыми видами Fusarium, в России в середине XX в. регистрировали во многих регионах страны. Определенные виды риса, контаминированные Pйnicillium citreoviridae и P islandicum («желтоокрашенный рис»), причина массовых токсикозов в Японии в XVII в.

Случавшиеся время от времени отравления не привлекали широкого внимания исследователей вплоть до начала 60-х гг. прошлого века, когда было отмечено несколько вспышек гибели домашних животных и птиц, связанных с кормлением смесями, содержащими арахис, инфицированный Aspergillusflavus [6]. Открытие афлатоксинов токсичных метаболитов этого гриба, положило начало развитию микотоксинологии. Основной целью исследований было выявление токсичных метаболитов наиболее распространенных грибов и оценка потенциальной опасности попадания их в пищевые продукты и корма для животных. К настоящему времени основные микотоксины, наиболее часто встречающиеся в продуктах растениеводства, достаточно хорошо изучены [7, 8]. Их содержание регламентируется в большинстве стран мира путем введения предельно допустимых концентраций содержания микотоксинов в сырье и готовых продуктах, которые согласовываются между странами в условиях международной торговли [9]. Список регламентируемых микотоксинов включает: афлатоксин B1 и его метаболит афлатоксин М1, появляющийся в молоке сельскохозяйственных животных, дезоксиниваленол, токсин Т-2, зеараленон, фумонизины, патулин и охратоксин А, продуцируемые грибами из родов Aspergillus, Fusarium и Penicillium.

Между тем число грибов, встречающихся в продуктах растениеводства, не ограничивается продуцентами регламентируемых микотоксинов. Видовой состав обнаруживаемых грибов динамичен и зависит как от общего состояния окружающей среды, подверженной усиливающемуся воздействию антропогенных и техногенных факторов, трансформирующих почвенные и растительные экосистемы, так и местных условий в регионе выращивания сельскохозяйственной культуры, ее вида и сортовых особенностей, применяемой агротехники и используемых агрохимикатов, в том числе фунгицидов. Большое влияние как на растения, так и на микромицеты оказывают погодные условия. Резкие колебания и аномальные погодные явления, прогнозируемое глобальное потепление климата могут существенным образом отразиться на структуре фитопатогенных комплексов. С изменением соотношения фитопатогенных видов может изменяться набор токсичных метаболитов в растениях [10-12]. Выявление тенденций в динамике фитопатогенных комплексов, изучение факторов, способных перевести минорные токсинообразующие виды грибов в разряд сопутствующих или лидирующих, позволят предвидеть угрозу накопления появляющихся потенциальных микотоксинов. В зарубежной литературе появилось выражение «emerging mycotoxins». Одним из первых его использовал M. Jestoi (2008) [13]. Он обобщил данные о фузапролиферине, боверицине, энниатинах и монилиформине, продуцируемых некоторыми распространенными видами Fusarium, и призвал обратить внимание на дальнейшее изучение этих метаболитов как токсичных контаминантов растительных продуктов, которые могут пополнить список регламентируемых «традиционных» микотоксинов. Впоследствии это выражение распространили на другие микотоксины, для которых не определены допустимые концентрации и которые пока законодательно не регулируются. Получение новых данных об этих соединениях стало возможным благодаря широкому внедрению современных аналитических методов, основанных на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии [14-15]. К числу эмерджентных микотоксинов в настоящее время также относятся тенуазоновая кислота, тентоксин, альтернариол и его метиловый эфир, микофеноловая кислота, цитринин, фузариевая кислота, стеригматоцистин, эмодин и асперглауцид [10, 16, 17]. Источником эмерджентных микотоксинов могут быть представители видов как из родов Aspergillus, Fusarium и Pйnicillium, так и виды грибов из других родов. Повышенное внимание исследователей в последнее время привлекают часто встречающиеся виды Alternaria spp., характеризующиеся набором нескольких токсичных метаболитов, детектируемых в продуктах. Токсикологические аспекты таких метаболитов активно изучаются.

Отдельного рассмотрения заслуживают факты обнаружения продуцентов новых микотоксинов среди известных видов токсигенных грибов, имеющих ограниченный ареал распространения, что затрудняет оценку потенциального риска загрязнения этими микотоксинами продовольственного сырья. К числу малоизученных относят, в частности, синтезируемый эндемичными штаммами Fusarium graminearum микотоксин NX-2, который обнаруживают в зерне пшеницы только в южной части Канады и северной части США [18, 19]. Отмечая многообразие и широкий спектр токсических метаболитов плесневых грибов из различных семейств и родов, следует рассматривать токсинообразование не только как функцию адаптации к условиям среды обитания, но и как ответную реакцию метаболизма грибов на сигналы, исходящие от окружающей среды при смене экологической ниши. Филогенетические исследования показывают, что токсигенные свойства формировались у плесневых грибов в результате длительной эволюции. Результаты секвенирования геномов 93 видов Fusarium позволили выявить наличие генов, ответственных за синтез 26 групп вторичных метаболитов, дифференциация токсигенных свойств в этих таксонах фузариев происходила более 90 млн лет назад [20].

Растительные продукты являются основой пищевых рационов всех категорий населения, поэтому вопросы неблагоприятных последствий для человека при их загрязнении вторичными метаболитами микроскопических грибов являются приоритетными с точки зрения безопасности пищи.

Обнаружение новых и недостаточно изученных штаммов микромицетов и усиление их токсигенных свойств требуют изучения особенностей и экологии эмерджентных микопатогенов для обоснования эффективных способов снижения их негативного воздействия на организм человека и животных, в том числе путём разработки и внедрения критериев безопасности пищевой продукции, новых технологий контроля и мер профилактики загрязнения пищевой продукции микотоксинами.

Таблица 1 [Table 1] Оптимальные условия для роста плесеней и накопления некоторых видов микотоксинов [Conditions for growth of molds and accumulation of certain mycotoxins]

Примечания. « -» нет данных [no data]. aw активность воды [water activity].

Наиболее важными факторами, способствующими росту токсигенных плесеней и накоплению микотоксинов в продуктах, являются повышенные температура и влажность (табл. 1), когда происходит усиление активности окислительных и гидролитических ферментов и создаются условия для размножения микромицетов [21, 22]. Относительная влажность, при которой практически не происходит размножения плесеней, составляет 14-15%.

Большинство микотоксинов являются сложными органическими соединениями с различными химическими структурами; так, фумонизин Bj это пропан-1,2,3-трикарбоксильный диэфир 2-амино-12,16-диметил3,5,10,14,15-пентагидроксиикозана. Другие фумонизины серии В имеют сходную структуру, однако фумонизин В2 не гидроксилирован по С-10, а фумонизин В3 не имеет гидроксильной группы по С-5 позиции. Подробно описана структура афлатоксинов лактокумариновых соединений с элементным составом ДДД ДДД С17Н14Об и C17H14O7. В зависимости от строения молекулы, хроматографических и флуоресцирующих свойств они подразделяются на афлатоксины Bp B2, В3, Gp G2, Mp M2, и ряд других [4, 23].

Исследования в области микотоксинологии включают определение видового состава токсинообразующих грибов, строения микотоксинов, их распространения по географическим зонам, выявление микотоксинов и загрязненных ими субстратов, а также механизма действия на человека и животных.

Наличие грибных контаминантов определяют классическими микологическими методами, основанными на выращивании микроскопических грибов на селективных питательных средах с добавлением различных антибактериальных препаратов. Для идентификации используют морфологические признаки и тесты (пигментообразование, строение конидий и гиф, вторичные метаболиты), позволяющие определить родовую принадлежность, однако для подтверждения видовой принадлежности их часто бывает недостаточно. Большие надежды возлагаются на быстро развивающиеся молекулярно-генетические методы диагностики.

Несмотря на длительность и трудоемкость микроскопических и морфологических исследований, методы ДНК-идентификации пока ограничены в применении. Это связано, в частности, с особенностями пробоподготовки при выделении грибной ДНК, требующей специальных условий лизиса наружных клеточных структур, которые у плесеней более грубые и плотные, нежели у других микроорганизмов. При постановке количественной ПЦР учитываются особенности разных типов клеток в составе филаментных грибов, включая гифы, аскоспоры и вегетативные споры. Поскольку споры бывают моноили мультинуклеарными, результаты ПЦР могут выявлять большее число копий ДНК, нежели реальное количество присутствующих жизнеспособных форм плесеней в исследуемой пробе [24, 25]. Подбор и совершенствование ДНК-методов контроля на наличие токсигенных грибов необходимы для адекватной оценки риска загрязненности пищевой продукции микотоксинами, обеспечения ее безопасности и предупреждения микотоксикозов.

Ниже приведены сведения о свойствах отдельных представителей токсигенных грибов потенциальных возбудителей микотоксикозов, наиболее значимых с точки зрения безопасности пищевых продуктов и кормов.

Alternaria spp.

Род Alternaria впервые описан в 1933 г. на основе изучения морфологии конидий, объединяет группу филаментных грибов, входящих в тип Ascomycota, семейства Dematiaceae, первоначально известных как Alternaria tenuis или Torula alternate. Морфологически грибы рода Alternaria формируют быстро растущие серые, коричнево-черные или черные колонии. Конидиофоры Alternaria (2-6*20-50 нм) расположены одиночно или маленькими группами, прямые или изогнутые. Споры эллипсоидной формы (9-18*2063 нм), часто с конусовидными или цилиндрическими концами, с гладкой поверхностью. Характерный признак для дифференциации видов Alternaria наличие или отсутствие цепочек конидий и их число. Виды, имеющие 10 и более конидий, известны как Longicatenatae, от трех до пяти конидий Brevicatenatae, только 1 спору Noncatenatae.

Alternaria spp. плесневые грибы, распространенные повсеместно, характеризуются многообразием видов, число которых превышает 80 наименований. Большая часть из них сапрофиты, живущие в почве, на поверхности растений (кустарников, злаковых и зерновых культур), в пищевом сырье [26-28]. Многие виды Alternaria spp. растительные патогены, они вызывают обесцвечивание поверхностей листьев, после чего следует поражение внутренних структур, снижающее их жизнеспособность, качество и питательную ценность, что наносит экономический ущерб, могут поражать зерно и фрукты [29, 30]. Виды Al. alternata, Al. brassicicola, Al. chartarum, Al. stemphylioides, Al. dianthicola, Al. infectoria, Al. pluriseptata и Al. tenuissima относят к оппортунистическим патогенам, способным вызывать у иммунодепрессивных лиц микотические кератиты, респираторные заболевания, воспаления синусовых пазух, язвенные кожные инфекции [31-33]. Кроме того, Al. iridis упоминается как вид, вызывающий аллергические реакции у человека.

Оптимальной температурой роста для Alternaria spp. является 25-28°С, при этой температуре происходит быстрое размножение с образованием серо-белых колоний, которые на 5-е сут становятся черно-зелеными с пигментированными оливково-коричневыми гифами, конидиофорами и спорами.

Споры грибов рода Alternaria легко разносятся ветром, попадая на поверхность растений или кожные покровы человека и животных, на слизистые оболочки носа и дыхательных путей. Прорастание спор сопровождается выделением фитотоксинов, микотоксинов и других метаболитов (более 70), которые распределяются на группы по воздействию на растения, человека и животных как пищевые и кормовые контаминанты [26, 34]. К ним относятся также эмерджентные микотоксины альтернариол, монометиловый эфир альтернариола и тенуазоновая кислота. Их обнаруживают в большинстве исследованных проб зерновых продуктов, растительных масел, в томатопродуктах, винах, фруктовых соках и кормах [13]. Тенуазоновая кислота ассоциируется с пневмониями, синуситами, дерматомикозами, феогифомикозами и инвазивными инфекциями [27]. Альтернариозы наиболее распространены в тропических и субтропических регионах.

Традиционные методы идентификации грибов рода Alternaria основаны на определении морфологических характеристик колоний, вегетативных гиф, конидий, конидиофор, особенностей споруляции. Для детекции альтернариатоксинов используют иммуноферментный анализ, высокоэффективную жидкостную хроматографию, газовую хроматографию, массспектрометрию и другие методы выявления микотоксинов [35, 36].

Молекулярная техника идентификации Alternaria spp. ориентирована в первую очередь на анализ специфических последовательностей ITS I и ITS II регионов 5,8S гДНК методами ПЦР в различных модификациях, ПДРФ, RAPD и др. [37]. Для выявления токсигенных Alternaria в пищевых субстратах разработаны методы на основе ПЦР в реальном времени с наборами праймеров целевых генов альтернариатоксинов [27]. Так, методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с праймерами, детектирующими наличие генов, ответственных за синтез AM-токсина I и тентоксина, удается выявить ДНК токсигенных штаммов с высокой чувствительностью на уровне 4 пг грибной ДНК, что соответствует примерно 75 геномным эквивалентам Alternaria [38].

Aspergillus spp.

Первое упоминание о грибах рода Aspergillus датируется 1729 г., когда структуру спорообразования у них сравнили с окроплением освященной водой у католиков (aspergillum), что и отразилось в названии этой таксономической группы.

Aspergillus spp. плесневые грибы с септированными гифами, конидиальные головки обнаруживаются в естественных условиях внешней среды на опавших листьях, в хранящемся зерне, компосте, сене и других растительных субстратах, подверженных гниению. При росте на питательных средах формируют разнообразно окрашенные колонии, умеренно или быстро растущие, от шерстистых до ватообразных. Гифы септированные, бесцветные. Конидиеносцы гладкостенные, хрупкие. Конидиальные головки с фиалидами на метулах (иногда без метул). Конидии шаровидные, эллиптические, гладкие или шероховатые [22].

Род Aspergillus относится к типу Ascomycota, это один из самых распространенных на земле микроорганизмов, он включает более 250 видов, как полезных, так и вредных для человека в зависимости от видовой принадлежности и питательного субстрата. Для адаптации в разнообразных экологических нишах аспергиллы синтезируют бесчисленное множество метаболитов, часть из которых широко используется человеком. Так, в медицинских целях применяют препарат ловастатин, продуцируемый A. terreus, один из первых коммерчески успешных средств, снижающих холестерин. Большое число антибиотиков, противоопухолевых и антимикотических агентов являются продуктами метаболизма Aspergillus. Штаммы аспергиллов видов

A. niger, A. oryzae, A. aculeatus, A. carbonarius широко используют в биотехнологии для производства ферментных препаратов и органических кислот, в том числе амилаз, лимонной кислоты и др. [39].

В целом это обширная группа почвенных сапрофитов, принимающих участие в процессах переработки природных соединений и органических отходов. К сожалению, полезная роль Aspergillus несопоставима с их негативным воздействием на сельскохозяйственное сырье, приводящим к серьезным потерям и порче растительных продуктов. Кроме того, виды A. fumigatus, A. niger, A. flavus являются возбудителями заболеваний человека и животных [22, 40].

Аспергиллез плесневый микоз, наиболее часто встречается у грузчиков зерновых культур, мукомолов, работников пивоваренных заводов, контактирующих с заплесневелым зерном, сотрудников биотехнологических и фармацевтических производств. Вдыхание спор гриба сопровождается инфицированием легочной ткани, прорастанием гифами кровеносных сосудов, тромбозами, некрозами, геморрагическими инфарктами. Поражение легких характерно только для лиц с иммунодефицитом, у которых оно протекает как острая пневмония. У детей на фоне хронических гранулематозных заболеваний также может развиться легочный аспергиллез. Вдыхание спор у здоровых людей может сопровождаться аспергиллезным синуситом, реже хроническими гранулематозными воспалениями с распространением гиф в ткани и головной мозг [41].

В отличие от большинства фитопатогенов, вызывающих специфические заболевания растений, грибы Aspergillus являются оппортунистическими патогенами, не обладают избирательностью в отношении организма хозяина и часто становятся контаминантами пищи. Большинство видов Aspergillus spp. обнаруживаются в виде плесени на поверхности растительных продуктов, загрязняя их на разных этапах сельскохозяйственного производства в процессе выращивания и сбора урожая, при переработке и хранении зерна, овощей, сена и кормов. Порча сопровождается изменением сенсорных свойств, пигментацией, появлением признаков гниения и др. Основным негативным аспектом загрязнения аспергиллами является синтез их вторичных метаболитов микотоксинов и накопление их в пищевых продуктах и кормах [42].

В число микотоксинов, продуцируемых грибами рода Aspergillus, кроме регламентируемых в пищевых продуктах афлатоксина В1, его метаболита в молоке лактирующих животных афлатоксина М1, охратоксина А и патулина, входят стеригматоцистин, циклопиазоновая кислота, пеницилловая кислота, цитринин и др. Наиболее токсичными являются афлатоксины и охратоксин А [6, 42, 43].

Афлатоксины термоустойчивые органические соединения, не разрушающиеся при автоклавировании, поэтому прошедшие термическую обработку продукты, приготовленные из заплесневелого сырья, могут явиться причиной заболевания.

Присутствие Aspergillus spp., продуцирующих афлатоксины Bp B2, GpG2 в пищевом сырье, ассоциируется с гепатоканцерогенным действием и потому обусловливает высокую степень риска для здоровья людей. Афлатоксины могут накапливаться в таких сельскохозяйственных культурах, как хлопок, арахис и другие орехи, кукуруза, соя, пшено, овес, рис, пшеница, сорго, рожь, специи [1, 6].

По данным мониторинга загрязненности микотоксинами отечественного продовольственного зерна урожаев 2013-2016 гг., содержание афлатоксина В1 превышало максимальный допустимый уровень (МДУ) в 4% изученных партий [44]. Согласно ежегодным отчетам Системы быстрого реагирования при появлении опасностей, связанных с пищевыми продуктами и кормами (The Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF), в странах Евросоюза в 2016-2017 гг. наиболее часто превышение МДУ этого микотоксина выявляли при контроле орехов, сухофруктов и специй, импортируемых из различных регионов мира: афлатоксин Bt обнаруживали в арахисе из Китая, Индии, США, Египта, в фисташках из Турции, Ирана, США, в фундуке из Турции, Азербайджана и Боливии; в сушеном инжире из Турции, в перце чили из Индии и в специях из Индонезии и Эфиопии [45, 46]. Афлатоксин Mj обнаруживали в Турции, Аргентине, Бразилии и других странах в различных видах сыров из молока коров, коз и овец в количествах, представляющих существенный риск для здоровья потребителей [47, 48].

Охратоксин А может контаминировать разные виды пищевых продуктов зерно, бобовые, овощи, кофе, сушеные фрукты, различные виды чая, пиво, вино, мясо, специи, при этом его содержание варьирует от 0,1 до 100 нг/г. В специях (в черном, красном и кайенском перце, в тмине, кардамоне, кориандре, куркуме) охратоксин А выявляли на уровне от 1 до 100 нг/г [49].

Мониторинговые исследования загрязнения зерна в России позволили дважды выявить загрязнение проб пшеницы урожая 2016 г. охратоксином А на уровне, превышающем МДУ [50]. Исследование виноградных вин, потребляемых в России, показало загрязнение этим микотоксином 30% исследованных образцов (в количестве от 0,14 до 0,64 мкг/л), преимущественно охратоксин А выявляли в красных полусладких и десертных винах [51].

Охратоксин А обладает нефротоксическими, канцерогенными, тератогенными и иммунотоксическими свойствами [52]. Способностью продуцировать этот токсин обладают представители рода Aspergillus, распространенные в регионах с теплым или жарким климатом, тогда как в более холодных климатических зонах охратоксины синтезируют грибы рода Pйnicillium. Причем аспергиллы выделяют два типа охратоксинов типа А и В, последний обладает значительно меньшей токсичностью. В табл. 2 представлены известные и новые продуценты охратоксина А и афлатоксинов рода Aspergillus [22].

Таблица 2 [Table 2] Афлатоксигенные и охратоксигенные Aspergillus spp., контаминирующие пищу [Aflatoxigenic and ochratoxigenlc foodborne Aspergillus spp. ]

Исследования на наличие Aspergillus spp. проводят микологическими методами, основанными на выращивании микроскопических грибов на питательных средах в чашках Петри c последующим анализом микро- и макроморфологических свойств культуры. Несмотря на длительность и трудоемкость микроскопических и морфологических исследований, новые методы ДНК-идентификации охратоксигенных и афлатоксигенных Aspergillus spp. в пище менее распространены и используются в основном для научных исследований [24].

Предлагаются варианты видоспецифической качественной ПЦР для продуцентов охратоксина А (A. carbonarius, A. ochraceus, A. niger), количественной ПЦР для A. westerdijkiae [53]. Для продуцентов афлатоксинов могут также использоваться качественные модификации ПЦР, главным образом с целью детекции видов A. flavus и A. parasiticus [54]. Кроме того, выявление A. parasiticus может осуществляться в мультиплексной ПЦР с 4 парами праймеров, амплифицирующих гены aflR, aflD, aflM, aflP (регуляторы синтеза афлатоксинов) с величинами ампликонов 1032, 400, 538, 1025 bp соответственно. Описана процедура постановки количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией для детекции A. flavus [25, 55].

Fusarium spp.

Род Fusarium состоит из большого числа видов микромицетов, многие из них продуцируют широкий спектр биологически активных вторичных метаболитов, в том числе микотоксинов. Фузариотоксины входят в число основных микотоксинов, загрязняющих зерно и зернопродукты во всех регионах возделывания зерновых. Являясь факультативными фитопатогенами, Fusarium могут контаминировать зерно своими метаболитами как при вегетации растений в полевых условиях, так и при хранении зерна с влажностью более 13-15%.

Грибы рода Fusarium на питательных средах образуют хлопьевидные быстрорастущие колонии с плотным воздушным мицелием. Гифы септированные, бесцветные. Конидиеносцы простые или разветвленные. Конидиогенные клетки монофиалиды и полифиалиды. Образуют макроконидии и микроконидии, могут образовывать хламидоспоры. Морфолого-культуральные признаки на питательных средах для многих видов Fusarium весьма близки и допускают неоднозначную идентификацию. Молекулярно-генетические методы диагностики с использованием специфичных для вида ДНК-маркеров позволяют уточнять видовую принадлежность [44-51], а дополнительное использование ДНК-маркеров генов биосинтеза токсинов дает возможность оценить токсигенность [56-59]. В результате возможна переидентификация видов. Так, изолят, ранее известный как F. tricinctum, из которого был выделен метаболит, получивший название Т-2 токсин, на поверку оказался F. sporotrichioides. Вид F. tricinctum не относится к числу трихотеценпродуцирующих. Изолят F nivale, давший название микотоксину ниваленол, вероятно, был ошибочно идентифицирован, поскольку позднее вид F. nivale был исключен из рода Fusarium и теперь известен как Microdochium, включающий два вида: M. nivale (син. F. nivale) и M. majus [60]. Эти фитопатогены, не образующие трихотецены, часто связаны с гибелью проростков и прикорневыми гнилями зерновых культур, но могут также входить в состав фитопатогенных комплексов, вызывающих поражение колосьев, известное под названием фузариоз колоса заболевания зерновых культур, сопровождающегося загрязнением зерна фузариотоксинами [60].

Основными возбудителями фузариозного поражения колосьев являются виды F. graminearum и F. culmorum. Развитие заболевания сопровождается накоплением дезоксиниваленола (ДОН) представителя трихотеценов типа В. ДОН обладает иммуносупрессивными, нейротоксичными и тератогенными свойствами. F. graminearum и F. culmorum, наряду с дезоксиниваленолом, могут продуцировать микотоксин из другой химической группы зеараленон. Грибной метаболизм способен смещаться в сторону повышенного образования зеараленона при развитии фузариев на зерне в случае запаздывания с уборкой урожая из-за дождей и при хранении влажного зерна. Зеараленон обладает выраженным гормоноподобным эстрогенным действием. Хроническое отравление приводит к раннему созреванию и бесплодию. С зеараленоном связывают случаи преждевременного полового созревания детей в Пуэрто-Рико и Венгрии. Полагают, что он может способствовать развитию рака шейки матки [6].

Регламенты содержания дезоксиниваленола и зеараленона в зерне и зернопродуктах установлены в РФ, странах Европейского союза и ВТО (Комиссией «Кодекс Алиментариус»).

Зеараленон периодически обнаруживается в зерне, в частности в кукурузе, которая может быть поражена гнилью в початках, обычно от 0,1 до 200 мкг/г продукта. Зеараленон также обнаруживают в пшенице, ячмене, овсе, сорго, кунжуте, сене, кукурузном силосе, кукурузном масле и крахмале из кукурузы. МДУ в продуктах питания зеараленона в России составляет 0,2 мг/кг (крупа, мука) и 1,0 мг/кг (зерно, отруби). Содержание зеараленона регламентируется в зерновой продукции в ряде стран мира [6]. При анализе более 300 партий отечественного зерна кукурузы урожаев 1999-2016 гг. зеараленон обнаруживали в среднем в 7% проб, при этом частота его обнаружения в 2006 г. достигала 21%, в 2015 г. 22% и в 2013 г. 100%. Содержание токсина в контаминированных образцах варьировало от 0,005 мг/кг до 0,315 мг/кг, но не достигало МДУ [44].

Для Российской Федерации ДОН является превалирующим загрязнителем зерновых культур. Высокие уровни его содержания в зерне пшеницы, выращенном в южных регионах страны (в Краснодарском и Ставропольском краях) после 2014 г., связывают с распространением фузариоза растений. Мониторинг загрязнения этим микотоксином продовольственного зерна в 2014-2016 гг. свидетельствует о том, что в 30% проб пшеницы он присутствовал в количестве от 0,05 до 5,85 мг/кг, в 6 % проб зафиксировано превышение МДУ (0,7 мг/кг) по данному показателю [50].

Превалирование ДОН среди микотоксинов, обнаруживаемых в зерне разных стран, обусловило широкий интерес исследователей к F. graminearum как главному продуценту ДОН. В настоящее время F. graminearum рассматривается как комплексный вид (F graminearum sensu lato), дифференцированный по меньшей мере на 15 видов [61], отдельные представители которых, как, например, F asiaticum, отличаются повышенной встречаемостью изолятов, продуцирующих ниваленол еще один представитель трихотеценов типа В [62]. Из других фузариев ниваленол способны продуцировать изоляты F. poae. Токсические свойства ниваленола меньше изучены в сравнении с ДОН. Появляются данные, что он не менее токсичен, чем ДОН, и может усиливать негативное воздействие ДОН, если присутствует в смеси [63].

F. poae обладает способностью продуцировать не только трихотецены типа В (ниваленол), но и трихотецены типа А, в частности, диацетоксисцирпенол. По мнению некоторых исследователей, возможный вклад F. poae в загрязнение зерна микотоксинами недооценен [64].

К числу малоизученных микотоксинов фузариев в настоящее время относят трихотеценовый микотоксин типа А (3а-ацетокси-7а,15-дигидрокси12,13-эпокситрихотекс-9-ен), синтезируемый отдельными штаммами F. graminearum. Региональная популяция нового хемотипа NX-2 сформировалась в результате трансвидовой эволюции вида, представители которого обычно продуцируют трихотецены типа B. Показано, что штаммы-продуценты микотоксина NX-2 могут занимать эволюционную нишу, отличную от F. graminearum типа B [65].

Наиболее известными продуцентами трихотеценов типа А являются филогенетически близкие к F. poae виды F. sporotrichioides и F. langsethiae, образующие токсин Т-2, который почти на порядок токсичнее трихотеценов типа В для млекопитающих. Эти виды встречаются обычно в географических зонах с холодным климатом.

Грибы могут развиваться на зерновых культурах при позднем сборе урожая или перезимовавших под снегом. Алиментарный путь отравления связан с употреблением хлеба, выпеченного из фузариозного зерна, содержащего микотоксины. Отравления токсином Т-2 сопровождаются тошнотой, рвотой, некротическими изъязвлениями языка и глотки, геморрагическими воспалениями многих органов.

В странах Европы отмечается тенденция к усилению загрязнения зерна одним из самых токсичных среди трихотеценовых микотоксинов токсином Т-2. По данным Научного объединения по вопросам, связанным с пищей (Scientific Co-operation on Questions relating to Food, SCOOP), частота его обнаружения в зерне пшеницы, ячменя, овса, ржи и кукурузы может составлять 20% [66]. Систематический анализ загрязнения токсинами Т-2 и НТ-2 отечественного продовольственного зерна кукурузы в последние 10 лет свидетельствует о широкой распространенности этих контаминантов: частота обнаружения токсина Т-2 в 2008, 2012, 2013 и 2016 гг. составляла 44, 50, 100 и 33% соответственно [44]. В России и странах Евразийского экономического союза установлен гигиенический регламент содержания токсина Т-2 в зерне и продуктах его переработки на уровне 0,1 мг/кг, не более.

Важной группой фузариотоксинов являются фумонизины, которые продуцируют в основном фитопатогенные виды F verticillioides (син. F moniliforme), F. proliferatum, часто обнаруживаемые на кукурузе. Наиболее распространены фумонизины В1, В2 и В3, из них фумонизин В1 превалирует и наиболее токсичен. Эти токсины являются этиологическими агентами эзофагальной карциномы людей, а также вызывают лейкоэнцефалопатию, массивные некрозы сердечной мышечной ткани у лошадей при использовании загрязненных кормов [48]. Кукуруза может быть совместно инфицирована F graminearum и продуцентами фумонизинов. Наиболее благоприятными условиями для инфицирования F. graminearum является теплая и влажная погода на стадии выбрасывания нитевидных пестиков из початков кукурузы. F. verticillioides сильнее поражает при жаркой и сухой погоде, особенно после опыления. Облегчает инфицирование повреждение початков насекомыми. F. proliferatum успешнее инфицируют при меньших по сравнению с F. verticillioides температурах [67].

Фумонизины, наряду с ДОН, токсином Т-2 и зеараленоном, входят в группу нормируемых в пищевых продуктах фузариотоксинов.

Кроме этих микотоксинов, представители рода Fusarium продуцируют другие активно изучаемые токсины, загрязняющие зерно и зернопродукты и отнесенные к группе эмерджентных. Так, F. proliferatum кроме фумонизинов может продуцировать фузапролиферин. У часто встречающихся в некоторых регионах видов F. poae, F. avenaceum и F. tricinctum обнаружена способность продуцировать боверицин, энниатины и монилиформин. Авторы работы [68], проанализировав 20 распространенных видов Fusarium, сообщили о частой встречаемости среди грибных метаболитов фузариевой кислоты. Это вещество продуцировали изоляты видов F. temperatum, F. subglutinans, F. musae, F. tricinctum, F. oxysporum, F. equiseti, F. sacchari, F. concentricum,

F. andiyazi. Кроме того, фузариевую кислоту совместно с фумонизинами биосинтезировали F proliferatum, F verticillioides, F fujikuroi и F solani.

Авторитетным центром по сбору публикуемой информации о микотоксинах в Европейском союзе является EFSA (European Food Safety Authority), который обобщает, анализирует и периодически публикует накапливающиеся данные по оценке рисков, связанных с тем или иным микотоксином, в виде научного мнения (Scientific Opinion) в своем журнале EFSA Journal. Публикуемая информация служит научной основой при подготовке регулирующих законов.

Определение родовой и видовой принадлежности фузариев, как и других возбудителей микотоксикозов, базируется на применении как традиционных культурально-морфологических тестов, так и методов детекции нуклеиновых кислот на основе ПЦР-анализа и секвенирования геномов Fusarium spp. [69-71].

Основной задачей ПЦР-тестирования является обнаружение кластеров генов, ответственных за экспрессию фумонизинов и других фузариотоксинов. Поскольку видоспецифическая идентификация не является определяющим признаком токсигенных свойств (одни и те же токсины могут вырабатываться различными видами грибов), она может служить лишь косвенным подтверждением присутствия токсигенных штаммов в исследуемых образцах продовольственного сырья [71, 72]. Наиболее информативным подходом является обнаружение и количественное определение уровней токсинпродуцирующих видов Fusarium spp. и их метаболитов; эти данные используют для выявления так называемых хемотипов [73].

Pйnicillium spp.

Pйnicillium spp. это аскомицеты, относящиеся к классу Eurotiomycetes, семейству Trichocomaceae. Из 250 официально признанных видов только несколько имеют полный цикл размножения, они представлены группой Talaromyces или Eupenicillium. Остальные утратили эти признаки в процессе эволюции и составляют четыре подгруппы в составе рода Penicillium (Aspergilloides, Biverticillium, Penicillium и Furcatum). Biverticillium филогенетически связаны с группой Talaromyces, тогда как остальные три с Eupenicillium [74].

Первичным местом обитания грибов рода Penicillium является почва. Это весьма изменчивый и повсеместно распространенный род микромицетов, значительная часть которых устойчиво ассоциируется с пищей. Некоторые виды Penicillium spp. используются в производстве определенных видов сыров и мясных продуктов, включая сыры с голубой или белой плесенью, сырокопченые и сыровяленые колбасы (Penicillium roqueforti, P camamberti, P glaucum и др.). В то же время токсигенные грибы рода Penicillium являются загрязнителями пищевых продуктов и кормов, вызывая их порчу и контаминацию микотоксинами [75, 76].

Как и у других токсигенных микромицетов, основной риск возникновения заболеваний связан с попаданием микотоксинов Penicillium spp., в том числе охратоксина А и патулина. Наиболее часто отравления обусловлены употреблением продуктов, выработанных из загрязненного и заплесневевшего сырья. Наибольший риск микотоксикозов сохраняется в странах с тропическим климатом, где отсутствует соответствующее государственное регулирование в этой области [74].

При культивировании на агаризованных питательных средах пенициллы формируют плоские бархатистые колонии, с радиальными бороздками, от серовато-зеленых до тускло-зеленых, с белой или сероватой или бледно-желтой периферической частью, могут окрашивать среду в красно-коричневый, красный, желтый, лимонно-желтый цвет. Гифы септированные, бесцветные, конидиеносцы гладкие, мутовчатые, количество метул вариабельно. Конидии шаровидные, шероховатые или гладкие.

Pйnicillium spp. относятся к оппортунистическим сапрофитам, они нетребовательны к питательным субстратам, строгие аэробы, способны расти в широком диапазоне физико-химических параметров влажности, температуры, рН среды, содержания воды, солей, металлов и др. По природным источникам и месту обитания некоторые виды пенициллов избирательны: P expansum развивается в яблоках, P digitatum и P. italicum в цитрусовых, P. brevicompactum, P chrysogenum в сухих кормах, P. roqueforti адаптированы к сырам. Это мезофильные грибы с оптимальной температурой роста 25°С, некоторые виды психротолерантны, обладают способностью расти при низких температурах, контаминируя продукты даже при холодильном хранении. Между тем несколько видов Talaromyces имеют аскоспоры, устойчивые к нагреванию, а потому их можно обнаружить в пастеризованных продуктах, например в фруктовых соках [40].

Penicillium spp. это быстро растущие грибы, которые формируют большое количество экзоспор, легко распространяемых по воздуху; они важный компонент природных биоаэрозолей, откуда могут попадать в пищевые субстраты. При определенном уровне влажности (aw > 0,80) некоторые виды колонизируют различные объекты, в том числе упаковочные материалы, вызывая загрязнение и порчу продуктов [40].

По сравнению с родами Aspergillus и Fusarium, Penicillium являются менее токсигенными грибами, многие продуцируют токсины только в лабораторных условиях и не реализуют эти свойства в пищевых продуктах. В некоторых случаях микотоксины пенициллов не стабильны, а такие виды, как P. roqueforti и P. camamberti, не обладают способностью синтезировать вредные метаболиты, что определяет их использование в сыроделии в качестве заквасочной микрофлоры при производстве сыров типов рокфор и камамбер.

Охратоксин А и патулин, уровни которых в пищевых продуктах регулируются законодательно, являются наиболее значимыми метаболитами Penicillium spp.

Патулин продукт метаболизма нескольких видов плесневых грибов, встречающихся на поверхности фруктов, во фруктовых изделиях и других пищевых продуктах. Это вещество обладает канцерогенными и мутагенными свойствами. Среди представителей рода Pйnicillium наиболее известны продуценты P. expansum возбудитель коричневой гнили в яблоках, грушах, айве, абрикосах, персиках и томатах и P. urticae встречающийся иногда на этих же плодах и вызывающий гниение [4]. Анализ загрязненности патулином производимых в Сербии фруктовых соков подтвердил его присутствие в 51,4% проб, среднее содержание токсина составило 4,3 мкг/кг, в 0,7% проб выявлено превышение МДУ 0,05 мг/кг [77].

Охратоксин А, продуцентом которого преимущественно является P. verruculosum, часто обнаруживают в кукурузе, зерне ячменя, овса, риса, ржи, сорго, пшеницы, в бобах кофе и в винограде [52]. К числу других важных микотоксинов, ассоциируемых с заболеваниями от пищи, относятся цитринин, пенитрем А, циклопиазоновая и пеницилловая кислоты, ксантомегнины.

К потенциально патогенным грибам рода Pйnicillium относятся виды P brevicompactum, P chrysogenum, P. citrinum, P commune, P decumbens, P expansum, P purpurogenum, P. rugulosum и P spinulosum. Три вида вызывают патологические процессы у животных: P. aurantiogriseum, P. griseofulvum, P verruculosum. Многие из этих видов психротолерантны, их выделяют из разных видов продуктов: P citrinum, P. decumbens и P spinulosum обнаруживают в зерне, орехах, бобовых, специях, в свежих овощах; P brevicompactum часто встречаются в сухих продуктах (зерно, мука), а также в мясных продуктах, в яблоках и других фруктах, хранящихся в холодильнике. P. commune преимущественно находят в производственных помещениях на сыродельных заводах, пенициллы этого вида вызывают плесневение и порчу сыров. P. expansum основная причина порчи фруктов (яблок, клубники, винограда, персиков) и орехов.

Для выделения и культивирования грибов рода Penicillium используют общеупотребительные агаровые среды, в том числе сусло-агар, среду Чапека, глицерин, нитратный агар, с инкубацией посевов в течение 5-7 сут при 25°С. Для идентификации используют морфологические признаки и тесты (пигментообразование, строение конидий и гиф, вторичные метаболиты), позволяющие определить родовую принадлежность, однако для подтверждения видовой специфичности их бывает недостаточно.

Трудности в оценке частоты заболеваемости, обусловленной видами Penicillium spp., связаны с недостатком быстрых и чувствительных методов их идентификации, поскольку традиционная диагностика по морфологическим признакам зачастую приводит к ошибкам.

Полифазный подход с применением комплекса фенотипических и генетических анализов позволяет не только подтвердить принадлежность к определенному виду, но и определить характер токсинообразования пищевых изолятов Penicillium spp. Для этой цели описаны и рекомендуются методики, опирающиеся на знания о последовательностях ITS-региона гДНК, поскольку фундаментальные исследования в области микологии и таксономии позволили получить обширную электронную базу данных (GenBank; BOLD) об этой разнородной филогенетической группе грибов [78]. Для детекции токсигенных штаммов используют такие целевые последовательности, как гены поликетаз синтазы, полигалактуронозы и ряд других специфических ферментов, продукция которых ассоциируется с токсинообразованием у соответствующих видов Pйnicillium spp. [79-81]. Однако на данном этапе методические рекомендации по молекулярной диагностике грибов этого рода крайне недостаточны для использования в пищевой микологии.

Выводы

Таким образом, большинство микромицетов продуцентов микотоксинов способны размножаться и накапливать метаболиты в широком диапазоне условий обитания этих микроорганизмов, повсеместно распространены и адаптированы к неблагоприятным воздействиям. Поэтому создание надлежащих условий производства и хранения сельскохозяйственного сырья и вырабатываемых из него продуктов является необходимой частью системы обеспечения безопасности и снижения риска возникновения пищевых микотоксикозов. Углубленные исследования по данной проблеме позволят решить вопросы дифференцированного нормирования и гигиенической регламентации плесневых грибов и новых видов микотоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах.

микроскопический гриб токсичный сельскохозяйственный

Литература

1. Тутельян В.А., Кравченко Л.В. Микотоксины (Медицинские и биологические аспекты). М. : Медицина, 1985. 320 с.

2. Покровский А.А., Кравченко Л.В., Тутельян В.А. Афлатоксины. М. : ВИНИТИ АН СССР. Токсикология. 1977. Т 8. 107 с.

3. Билай В.И. Пидопличко Н.М. Токсинообразующие микроскопические грибы. Киев :Наукова думка, 1970. 291 с.