Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. в Томской области по морфометрическим и молекулярно-генетическим маркерам

Размещено на http://www.allbest.ru/

Национальный исследовательский Томский государственный университет

Разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera L. в Томской области по морфометрическим и молекулярно-генетическим маркерам

Н.В. Островерхова, С.А. Россейкина, О.Л. Конусова, А.Н. Кучер, Т.Н. Киреева

г. Томск, Россия

Аннотация

Представлены результаты исследования породного состава и генетического разнообразия медоносных пчел, обитающих на территории Томской области. Всего исследовано 337 пчелиных семей, полученных с 65 пасек области. На основании анализа изменчивости морфометрических признаков (показатели крыла, а именно кубитальный и гантельный индексы, дискоидальное смещение) и вариабельности локуса COI-COII мтДНК установлено, что большинство исследованных пчелиных семей представляют собой гибриды, имеющие происхождение от среднерусской породы по материнской линии (зарегистрированы варианты PQQ и PQQQ локуса COI-COIIмтДНК). Выявлены пасеки в Чаинском, Тегульдетском, Молчановском, Зырянском и Томском районах, где сохранились и разводятся медоносные пчелы среднерусской породы. Согласно данным о вариабельности 9 микросателлитных локусов, ядерный геном гибридных пчел, имеющих происхождение, как от среднерусской, так и карпатской пород, более близок по спектру и частоте аллелей изученных ДНК- маркеров геному среднерусской породы. Обсуждаются факторы, определяющие генетическое разнообразие медоносных пчел.

Ключевые слова: Apis mellifera; генетическое разнообразие; морфометрический метод; локус COI-COII мтДНК; микросателлитные локусы.

In Siberia, the honeybee was introduced about 230 years ago. It was the dark- colored forest bee Apis mellifera mellifera L., that was cultivated in Siberia as the most adapted to the harsh climatic conditions of the region. At the end of the last century, bees of the southern breeds, mainly Apis mellifera carpathica subspecies (a derivative of A. m. carnica subspecies), were actively imported to Siberia. Introgressive bee hybridization leads to the reduction of the range of native subspecies and the formation of hybrids, modifies the genetic pool of local honeybee populations leading to the loss of their genetic identity. Russia, including Siberia, still has unique abilities to preserve the aboriginal populations of the honeybee. For Siberia, such a unique subspecies is the dark-colored forest bee A. m. mellifera, which is considered endangered in Europe. At present, the knowledge of honeybee subspecies living in Siberia, including Tomsk region, is insufficient; data on the genetic diversity of honeybees are fragmentary. In this regard, the aim of this work was to identify the biological diversity of the A. mellifera honeybee living in Tomsk region using morphometric and molecular genetic markers.

A total of 337 bee colonies obtained from 65 apiaries of Tomsk region were investigated using mtDNA analysis (variability of the COI-COII locus) and morphometric method (analysis of wing parameters: cubital and hantel indexes, discoidal shift) (See Fig. 1). The genetic diversity of honeybees was studied using 9 microsatellite loci (A008, AC117, A043, A113, A024, Ap243, Ap049, H110, SV185); a total of 106 bee colonies and 893 individuals were investigated.

According to the analysis of variability of the COI-COII mtDNA locus, 62.9% of bee colonies were of A. m. mellifera origin on maternal line, 29.1% of bee colonies were of the origin from the southern subspecies and 8.0% were from mixed colonies. Three variants of the mtDNA COI-COII locus were registered: PQQ, PQQQ (characteristic of A. m. mellifera) and Q (characteristic of subspecies of the southern origin) (See Fig. 2). According to a morphometric study, about 56% of the studied bee colonies conformed to the A. m. mellifera standard according to the majority of morphometric parameters, but for some individual characteristics (mainly the indicator “discoidal shift”), a deviation from the values adopted for this subspecies was recorded. About 24% of the studied bee colonies are more consistent with the A. m. carpathica standard, but also have some signs characteristic of A. m. mellifera (hybrids based on the A. m. carpatica subspecies). Finally, a comparative analysis of the variability of morphometric parameters and variability of the COI-COII mtDNA locus allowed us to identify bee colonies (the so-called “inverted colonies”), which corresponded to the A. m. mellifera standard according to morphometric parameters, but had the Q variant of mtDNA (colony origin from the southern bee subspecies on the maternal line) or, on the contrary, the colonies were the A. m. carpathica subspecies according to morphometric parameters, while mtDNA was specific for A. m. mellifera (See Table 1). Consequently, the study of honeybees in Tomsk region using a comprehensive approach, including morphometric and mtDNA analysis, showed that most bee colonies are represented by hybrid forms both on the basis of A. m. mellifera subspecies and on the basis of A. m. carpathica; hybrids based on A. m. mellifera prevail (See Fig. 3). No large areas were found with a genetically homogeneous array of bees, originating from A. m.

mellifera subspecies. At the same time, the apiaries, where A. m. mellifera bees are preserved and bred, were identified in some districts of Tomsk region (Molchanovsky, Chainsky, Zyryansky, Teguldetsky, Tomsky) (See Fig. 3). In order to characterize the genetic diversity of honeybees in Tomsk region, as well as to assess the process of bee hybridization, we analyzed the variability of nine microsatellite loci in honeybees (See Table 2). A comparative analysis of the variability of the studied microsatellite loci in purebred bees (A. m. mellifera and A. m. carpathica) showed differences in the spectrum and/or frequency of alleles between subspecies for most loci. In addition, for some loci (A008, A043, A113, A024, and Ap049), the predominant alleles were recorded (the frequency of their registration was more than 0.40), and the spectrum of these alleles differed in bees of different evolutionary lineages (M and C) (See Table 2). Evaluation of genetic diversity on heterozygosity of most of the studied loci revealed similar results for two bee subspecies, namely lower values of the observed heterozygosity compared with the expected heterozygosity (See Table 2). The revealed differences between honeybees of A. m. mellifera and A. m. carpathica subspecies on the variability of the studied loci were used to assess the genetic diversity of hybrid bees obtained from apiaries of Tomsk region. We have established that both in hybrids based on A. m. mellifera subspecies (variants PQQ and PQQQ of the COI-COII mtDNA locus) and in hybrids based on subspecies of the southern origin (variant Q of the COI- COII locus) the nuclear genome is more consistent with the A. m. mellifera genome in the spectrum and/or frequency of alleles of the studied DNA markers. Using the Principal Coordinate Analysis (PCoA) method (See Fig. 4 and 5), we showed that the genetic diversity of honeybees living in apiaries of Tomsk region is not determined by a single indicator (geographical localization and isolation of apiaries, the bee breed (origin), the level of gene introgression), but by the complex effect of the above factors, whose importance to a certain extent depends on human activity.

Thus, the study of genetic diversity, which is determined by numerous factors, as well as evaluation of the level of introgression between aboriginal and adventive subspecies of honey bees are important to establish the effects of hybridization and to preserve the gene pool of local bee subspecies. To preserve and restore the unique gene pool of A. m. mellifera, a Coordinating Council on the problems of selection, rational use and protection of A. m. mellifera gene pool was created in 2019 in Russia. Two researchers from “Apis” Scientific and Production Center, Tomsk State University are its members. The success of measures to preserve aboriginal bee ecotypes will primarily depend on detecting and restoring the unique surviving populations, creating bee nurseries and reserves, as well as on studying the current state of various honeybee populations to understand genetic processess going on in them.

The paper contains 5 Figures, 2 Tables and 46 References.

Key words: Apis mellifera L.; genetic diversity; morphometric method; COI-COII locus mtDNA; microsatellite loci.

The authors declare no conflict of interest.

Введение

Генетическое разнообразие, характерное для природных популяций медоносной пчелы, является одним из наиболее важных условий, необходимых для существования и устойчивого развития пчеловодства [1--3]. В настоящее время во всем мире наблюдается глобальная потеря разнообразия и численности пчел [4-9], поэтому одной из основных задач пчеловодства является сохранение аборигенных подвидов и популяций медоносной пчелы [3, 10-14]. Нативные подвиды наиболее приспособлены к местным природно-климатическим условиям, и их исчезновение означает потерю уникальных генетических комбинаций (и признаков), сформированных путем естественного отбора в течение длительного периода времени. Основными причинами потери генетического разнообразия медоносной пчелы Apis mellifera L. рассматриваются замещение естественных популяций более миролюбивыми и продуктивными коммерческими (неместными) подвидами, распространение паразитов и патогенов медоносной пчелы, а также бессистемное использование пестицидов и ядохимикатов [10, 11, 13-19]. Мониторинг местного подвида (экотипа) медоносной пчелы и ограничение интродукции коммерческих пчелиных семей позволят снизить уровень межпородной гибридизации пчел и сохранить генетическое разнообразие и уникальный генофонд аборигенных пчел [11].

В Сибири первоначально культивировалась среднерусская пчела (темная лесная) Apis mellifera mellifera L., которая была завезена 230 лет назад, как наиболее адаптированная к суровым природно-климатическим условиям региона, таким как низкие температуры, продолжительная зима и короткий летний взяток. C конца XX в. отмечен массовый завоз пчел южного происхождения, преимущественно карпатской пчелы Apis mellifera carpathica [20], в результате чего на территории Сибири изменились представленность подвидов медоносной пчелы и их генотипический состав. Однако изученность медоносных пчел в Сибири недостаточна, а имеющиеся данные фрагментарны и не дают целостного представления о породном составе, текущем состоянии популяций и их генофонда, что является препятствием для более полного понимания путей развития популяций A. mellifera, реальной оценки процесса гибридизации пчел и его последствий, а также решения задач практического пчеловодства. Кроме того, в отличие от других регионов России и Европы, где отмечены такие негативные процессы в популяциях медоносной пчелы, как коллапс пчелиных семей [4-9, 21, 22], на территории Томской области зарегистрированы только единичные случаи массовой гибели семей, поэтому значительный интерес представляет оценка биологического разнообразия и адаптационного потенциала медоносной пчелы в условиях Сибири.

Систематические исследования медоносной пчелы на территории Сибири, включая Томскую область, были начаты в 2004 г. сотрудниками научно-практического центра «Апис» Томского государственного университета. Первоначально породный состав медоносных пчел на территории Томской области изучался с использованием классического морфологического метода, включающего исследование окраски тела, крыловых показателей и других морфометрических признаков [23]. Начиная с 2009 г. для исследования медоносных пчел стали применяться молекулярно-генетические методы с использованием ДНК-маркеров митохондриального (мтДНК) и ядерного геномов и выполнены пилотные исследования с целью первичной характеристики генетического разнообразия пчел, а также поиска высокополиморфных информативных ДНК-маркеров [24-30].

Однако следует указать, что классические морфометрические признаки и маркеры митохондриального и ядерного геномов, широко применяемые для исследования породного состава медоносных пчел, обладают разной информативностью [31-35]. Так, анализ полиморфизма мтДНК позволяет определить происхождение пчелиных семей только по материнской линии; исследования изменчивости ядерного генома (в том числе и микросател- литных локусов) все еще не получили широкого распространения (мало информации по породной и территориальной специфичности генофондов), а морфометрические признаки, с учетом широкого распространения межпородной гибридизации, не всегда позволяют корректно определить породный состав медоносных пчел [31, 36, 37]. В связи с этим только использование комплекса разных методов исследования обеспечит четкую и полную идентификацию подвидов медоносной пчелы.

В данной статье представлены результаты 10-летнего комплексного исследования медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, с использованием морфометрического и молекулярно-генетических методов (проведен анализ вариабельности локуса COI-COII мтДНК и микросател- литных локусов ядерного генома).

Цель работы - выявить биологическое разнообразие медоносной пчелы Apis mellifera, обитающей на территории Томской области, по морфометрическим и молекулярно-генетическим маркерам.

Материалы и методики исследования

Материалом для исследования послужили образцы рабочих особей, полученных с 65 пасек 47 населенных пунктов 13 районов Томской области (рис. 1). Исследование медоносных пчел проведено с использованием морфометрического и молекулярно-генетических методов.

Для исследования породного состава медоносных пчел первоначально проведен анализ мтДНК (изучена вариабельность локуса COI-COII), чтобы определить происхождение пчелиной семьи по материнской линии. Анализировалось 3-5 особей от семьи. Затем для более полной характеристики пчелиной семьи и ее соответствия стандарту породы выполнен морфометрический анализ (20-30 особей от семьи). Всего исследовано 337 пчелиных семей.

Для оценки генетического разнообразия медоносных пчел проведен анализ изменчивости 9 микросателлитных локусов; изучено 5-15 особей от семьи. Анализ ядерного генома выполнен для медоносных пчел, полученных от 106 семей; всего 893 особи.

Морфометрический метод

Изучены основные породоопределяющие морфометрические показатели крыла: кубитальный и гантельный индексы, дискоидальное смещение [17, 26]. Полученные результаты морфометрического исследования сравнивали со стандартами значений, принятыми для рабочих особей разных пород пчел [10, 27, 28].

Рис. 1. Карта локализации исследованных пасек Томской области (здесь и на рис. 2, 3):

1 - с. Парабель; 2 - окр. г. Колпашево; 3 - д. Новоабрамкино; 4 - с. Чалково; 5 - с. Леботер; 6 - с. Подгорное; 7 - д. Стрельниково; 8 - с. Гореловка; 9 - с. Высокий Яр, д. Крыловка; 10 - с. Парбиг; 11 - с. Бакчар; 12 - д. Сарафановка; 13 - с. Могочино; 14 - с. Соколовка; 15 - с. Кривошеино; 16 - с. Монастырка; 17 - с. Каргала, с. Старая Шегарка; 18 - с. Баткат; 19 - д. Тихомировка; 20 - урочище Кужербак; 21 - с. Новиковка; 22 - д. Цветковка; 23 - д. Крутоложное; 24 - с. Тегульдет;

25 - с. Дубровка; 26 - с. Зырянское; 27 - с. Окунеево; 28 - д. Губино; 29 - с. Рыбалово, д. Кудринский участок; 30 - окр. г. Томска, д. Просекино, с. Коларово; 31 - п. Синий Утес; 32 - д. Кандинка; 33 - с. Курлек; 34 - с. Яр; 35 - д. Кусково; 36 - п. Заречный (Малиновское сельское поселение); 37 - с. Семилужки; 38 - д. Бодажково;

39 - с. Межениновка; 40 - д. Большое Протопопово; 41 - п. Заречный (Межениновское сельское поселение); 42 - д. Еловка. Пасеки, расположенные на расстоянии менее 20 км друг от друга, отмечены одной точкой.

Примечание. В северных районах Томской области (Александровском, Каргасокском, Верхнекетском) пчеловодство отсутствует из-за суровых природно-климатических условий

[Fig. 1. Map of sample locations in Tomsk region. Here and in Fig. 2 and 3, the numbers indicate the studied settlements: 1 - v. Parabel; 2 - vicinity of Kolpashevo; 3 - v. Novoabramkino;

4 - v. Chalkovo; 5 - v. Leboter; 6 - v. Podgornoe; 7 - v. Strelnikovo; 8 - v. Gorelovka; 9 - v. Vysoky Yar, v. Krylovka; 10 - v. Parbig; 11 - v. Bakchar; 12 - v. Saraphanovka; 13 - v. Mogochino; 14 - v. Sokolovka;

15 - v. Krivosheino; 16 - v. Monastyrka; 17 - v. Kargala, v. Staraya Shegarka; 18 - v. Batkat;

19 - v. Tichomirovka; 20 - v. Kuzherbak; 21 - v. Novikovka; 22 - v. Tsvetkovka; 23 - v. Krutolozhnoe;

24 - v. Teguldet; 25 - v. Dubrovka; 26 - v. Zyryanskoe; 27 - v. Okuneevo; 28 - v. Gubino;

29 - v. Rybalovo, v. Kudrinsky uchastok; 30 - vicinity of Tomsk, v. Prosekino, v. Kolarovo;

31 - v. Sinii Utes; 32 - v. Kandinka; 33 - v. Kurlek; 34 - v. Yar; 35 - v. Kuskovo; 36 - v. Zarechnyi (Malinovskoe rural settlement); 37 - v. Semiluzhki; 38 - v. Bodazhkovo; 39 - v. Mezheninovka;

40 - v. Bol'shoe Protopopovo; 41 - v. Zarechnyi (Mezheninovskoe rural settlement); 42 - v. Elovka.

Apiaries located at a distance less than 20 km from each other are marked as a single point.

Note. In the northern districts of Tomsk region (Aleksandrovsky, Kargasoksky, Verkhneketsky), there is no beekeeping due to harsh climatic conditions]

Молекулярно-генетические методы

Для проведения молекулярно-генетического исследования использованы образцы пчел, которые хранились в 96%-ном спирте при температуре 4°С. Выделение ДНК из индивидуальных особей проведено модифицированным методом экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ [18, 29].

Выделенная ДНК анализировалась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, маркирующих межгенный локус COI-COII митохондриального генома. Использованы следующие последовательности праймеров: F-5-CACATTTAGAAATTCCATTA, R-5- ATAAATATGAATCATGTGGA [29]. Продукты амплификации фракционировали в 1,5%-ном агарозном геле, окрашивали в бромистом этидии, визуализировали в ультрафиолетовом свете и документировали с использованием специальной программы для визуализации гель-электрофореза.

Изучен полиморфизм 9 микросателлитных локусов: А008, Ap049, А043, AC117, Ap243,H110, A024, A113, SV185. ПЦР проводили согласно описанной ранее методике с применением специфических праймеров [30]. Использовали один меченный флуоресцентной меткой праймер из каждой пары. Гено- типирование выполнено на базе Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» (НИИ медицинской генетики ТНИМЦ РАН, г. Томск) на генетическом анализаторе ABI Prism 3730 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) с применением стандартов длины молекул ДНК GeneScan500- ROX в условиях, рекомендуемых производителем. Размер фрагментов проанализирован с помощью программного обеспечения GeneMapper Software.

Для статистической обработки данных (расчет частот аллелей со стандартной ошибкой, показателей наблюдаемой (Ho) и ожидаемой (He) гетерозиготносте) использованы стандартные методы, применяемые при изучении генетического разнообразия популяций [31, 32]. Оценка статистически значимых различий между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью проведена с использованием ^-критерия Стьюдента. Морфометрические данные представлены в виде среднего арифметического значения со стандартной ошибкой. Для оценки дифференциации различных подвидов медоносной пчелы и определения уровня генетической гетерогенности выборок пчел из популяций различной географической локализации использован метод главных координат (Principal Coordinates Analysis, РСоА), основанный на расчете генетических дистанций между выборками пчел. Расчеты проведены в программах Microsoft Office Excel 2010, StatSoft STATISTICA 8.0 for Windows, GENALEX 6 [32].

Результаты исследования и обсуждение

Распространение пород медоносной пчелы в Томской области

Для выявления породного состава медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, проведено комплексное исследование, включающее морфометрический и молекулярно-генетический анализ (полиморфизм локуса СOI-COII мтДНК) медоносных пчел.

Генетическое разнообразие медоносных пчел по митохондриальной ДНК

Согласно данным анализа полиморфизма мтДНК (вариабельность локуса COI-COII) у медоносных пчел Томской области зарегистрировано три варианта локуса COI-COII мтДНК: PQQ, PQQQ (характерны для А. т. те1- Ы/ега, эволюционная линия М) и Q (свойствен породам южного происхождения, эволюционная линия С). Из исследованных 337 пчелиных семей 62,9% семей имели происхождение по материнской линии от среднерусской породы, 29,1% семей - от пород южного происхождения и 8,0% составляли смешанные семьи, которые формируются пчеловодами путем объединения нескольких семей, в том числе семей разного происхождения, с целью их усиления (в этих семьях регистрировались особи с вариантами локуса COI- COII, характерными как для среднерусской, так и для «южных» пород медоносной пчелы) (рис. 2).

Для пчелиных семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (всего идентифицировано 212 семей), характерна генетическая гетерогенность по локусу COI-COII: в 85,3% семей регистрировался вариант PQQ, у 10,7% - вариант PQQQ, а у 4,0% семей выявлены как особи с вариантом PQQ, так и пчелы с вариантом PQQQ (от общего числа семей среднерусской породы). Среди пчелиных семей смешанного породного состава (выявлено 27 семей) наиболее часто регистрировались семьи с вариантами PQQ и Q (85,2% семей от общего числа смешанных семей), реже - с вариантами PQQQ и Q (11,1%), а в одной семье (3,7%) в с. Курлек Томского района были выявлены пчелы со всеми зарегистрированными вариантами локуса COI- ШП - PQQ, PQQQ и Q.

В различных районах Томской области пчелиные семьи отличались между собой по частоте регистрации вариантов локуса COI-COII мтДНК. На северных территориях области (Парабельский, Колпашевский, Чаинский, Бакчарский, Молчановский, Кривошеинский и Тегульдетский районы) выявлено 95,9% пчелиных семей (всего исследовано 194 пчелосемьи), однородных по варианту локуса мтДНК: 67,0% семей имели происхождение от среднерусской породы (зарегистрировано два варианта локуса мтДНК - PQQ и PQQQ); 28,9% семей происходили от пород южного происхождения. Остальные пчелосемьи (4,1%) имели смешанное происхождение (выявлены разные аллели локуса COI-COII в одной семье - PQQ и Q). Так, в Па- рабельском и Кривошеинском районах выявлены пчелиные семьи только с вариантом PQQ, в Тегульдетском - только с вариантом PQQQ. На пасеках Колпашевского, Чаинского, Молчановского и Бакчарского районов выявлены семьи разного происхождения (зарегистрированы варианты PQQ и Q). При этом на пасеках Чаинского и Молчановского районов преобладали пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы (86 и 95% соответственно), тогда как на пасеках Колпашевского и Бакчарского районов, наоборот, преобладали семьи южного происхождения (93 и 65% соответственно). В Бакчарском и Чаинском районах также выявлено несколько смешанных пчелиных семей, особи которых имели варианты PQQ и Q (рис. 2).

Рис. 2. Распространенность вариантов локуса COI-COII мтДНК (PQQ, PQQQ и Q) у медоносных пчел на территории Томской области

[Fig. 2. Distribution of the COI-COII mtDNA locus variants (PQQ, PQQQ, and Q) in honeybees in Tomsk region]

В южных районах области (Асиновском, Первомайском, Зырянском, Томском, Шегарском и Кожевниковском) однородные по вариантам локуса С01- С011 мтДНК пчелиные семьи (всего изучено 143 семьи) составили 80,4%, тогда как смешанные семьи - 19,6%. Среди смешанных семей выявлено 6,3% семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (у особей зарегистрированы варианты PQQ или PQQQ), и 13,3% семей разного породного происхождения (у особей зарегистрированы варианты PQQ/PQQQ или Q). Всего в южных районах выявлено 57,3% пчелиных семей, имеющих происхождение от среднерусской породы (зарегистрированы варианты PQQ или PQQQ), 29,4% - семьи южного происхождения, 13,3% - смешанные семьи, пчелы которых имели разное породное происхождение.

Пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы, были зарегистрированы на пасеках всех южных районов области. При этом преобладали пчелы с вариантом PQQ (65,9% от общего числа семей среднерусской породы), реже встречались семьи с пчелами, имеющими вариант PQQQ (23,1%), и смешанные семьи с пчелами, имеющими варианты PQQ или PQQQ (11,0%). Например, в Кожевниковском районе во всех исследованных семьях у пчел выявлен только вариант PQQ; в Первомайском районе половина исследованных семей имела происхождение от среднерусской породы (зарегистрирован вариант PQQ) и половина семей - южного происхождения (выявлен вариант Q); в остальных районах - у пчел выявлены все варианты локуса COI-COП (PQQ, PQQQ и Q). Семьи смешанного состава были выявлены на пасеках Шегарского и Томского районов, причем зарегистрированы сочетания вариантов локуса мтДНК - PQQ и Q (67%), PQQQ и Q (33%).

Таким образом, на основе анализа полиморфизма локуса COI-COП мтДНК установлено различное происхождение медоносных пчел на пасеках Томской области, хотя и преобладали пчелиные семьи, имеющие происхождение от среднерусской породы. Тот факт, что на одной и той же территории обитают пчелы разных пород, позволяет предположить высокий уровень гибридизации. Поскольку анализ мтДНК позволяет установить происхождение медоносной пчелы (семьи) только по линии матки без оценки вклада «отцовских» генов, пчелы с пасек Томской области были изучены с использованием морфометрического анализа.

Характеристика морфометрической изменчивости медоносных пчел

Изучена изменчивость трех породоопределяющих морфометрических показателей (кубитального и гантельного индексов, дискоидального смещения) у медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области (табл. 1). Для всех изученных морфометрических показателей выявлен значительный уровень вариабельности. Так, для пчел, обитающих на пасеках Томской области, значения кубитального и гантельного индексов зарегистрированы в пределах 1,00-5,56 и 0,643-1,250 отн. ед. соответственно (среднее значение кубитального индекса изменялось в пределах - 1,45-3,41 отн. ед.; среднее значение гантельного индекса - 0,789-1,125 отн. ед.). Что касается качественного показателя «дискоидальное смещение», то у изученных пчел отмечены все три варианта признака (отрицательное, нейтральное и положительное).

При сравнении полученных данных значений экстерьерных признаков со стандартными показателями, принятыми для рабочих особей разных пород медоносной пчелы [10, 27, 28], установлено, что среди всех исследованных пчелиных семей 13,5% семей демонстрировали полное соответствие крыловых параметров стандарту среднерусской породы, 5,3% - стандарту карпатской породы, 2,2% - серой горной кавказской породы. Например, по всем исследованным крыловым показателям стандарту среднерусской породы соответствовали пчелиные семьи с пасек с. Чалково (Чаинский район) и с. Тегульдет (Тегульдетский район), а также семья N° 2 с пасеки с. Могочино (Молчановский район) и семья № 2 с пасеки с. Дубровка (Зырянский район); стандарту карпатской породы - пчелиная семья с пасеки в д. Цветковка (Асиновский район) и семья № 1 с пасеки в окр. г. Томска (см. табл. 1).

Около 56% исследованных семей соответствовали стандарту среднерусских пчел по большинству морфометрических показателей, но по отдельным признакам (преимущественно показателю «дискоидальное смещение») регистрировалось отклонение от принятых для этой породы значений. Так, отклонение только одного показателя «дискоидальное смещение» от стандарта среднерусской породы показано для семьи № 1 с пасеки с. Дубровка (Зырянский район), для двух семей с пасеки с. Заречный (Томский район), для семьи с пасеки с. Еловка (Кожевниковский район), что может указывать на следы гибридизации с породами южного происхождения. Отклонение нескольких морфометрических показателей у особей пчелосемьи от стандарта среднерусской породы, например кубитального индекса и дискоидально- го смещения, позволяет нам рассматривать эти семьи как гибриды на основе среднерусской породы (например, пчелосемьи с пасек с. Гореловка и д. Стрельниково Чаинского района, семья с пасеки с. Рыбалово Томского района и др.).

Наблюдалась также противоположная картина, когда пчелиные семьи по исследованным параметрам крыла более соответствовали стандартам пород южного происхождения, но также имели отдельные признаки, характерные для среднерусской породы (гибриды на основе «южных» пород пчел). Так, выявлено 23,6% семей (от общего числа исследованных), пчелы которых имели большинство морфометрических показателей, характерных для карпатской породы, например, семьи № 1 и № 3 с пасеки с. Подгорное (Чаин- ский район), семья с пасеки п. Синий Утес (Томский район).

Наконец, при использовании сравнительного анализа изменчивости морфометрических признаков и вариабельности локуса С01-С011 мтДНК были идентифицированы пчелиные семьи (так называемые «семьи-перевертыши»), которые по морфометрическим показателям соответствовали среднерусской породе, тогда как мтДНК (выявлен вариант Q) указывала на происхождение семьи по материнской линии от породы южного происхождения (например, семья № 2 с пасеки п. Курлек Томского района) или, наоборот, по морфометрическим показателям семья более соответствовала «южной» породе, тогда как по мтДНК (вариант PQQQ) - среднерусской (например, семья № 1 с пасеки п. Курлек).

Таким образом, исследование породного состава медоносных пчел Томской области с использованием морфометрического и мтДНК-анализа показало, что большинство пчелиных семей представлено гибридами между местным подвидом (среднерусской пчелой А. т. твШ/вта) и завезенными коммерческими линиями южного происхождения (преимущественно карпатской пчелой А. т. саграМса), что характерно для многих регионов России и Европы. Так, в Европе выявлен высокий уровень интрогрессии между

Значения морфометрических показателей у рабочих особей некоторых пчелиных семей с пасек Томской области подвидами разных эволюционных линий - М (А. т. твШ/вта и А. т. 1Ъепса) и С (А. т. 1щшЫса и А. т. сагтса) и произошла замена аборигенных подвидов медоносной пчелы завезенными [3, 10-12]. На территории России процессы интродукции подвидов из южных областей страны в более северные и восточные регионы (Урал, Сибирь, Алтай), где традиционно разводилась среднерусская пчела, также приобрели массовый характер в последние десятилетия [29, 40, 43].

[Values of morphometric indicators in workers of some bee colonies from apiaries of Tomsk region]

Примечание. N - число исследованных образцов; Lim - пределы значения признака; М±т - среднее значение признака (±стандартная ошибка); Z - суммарная проба с пасеки (минимум 10 пчелиных семей). * - Европейский стандарт подвидов пчел, основанный на значениях кубитального и гантельного индексов [28]; ** - стандарты пород пчел, принятые в России.

[Note. N - Number of samples examined; Lim - Limits of the value of the sign; M±m - Mean value of the sign ± the standard error of the mean; E - Total sample from the apiary (minimum 10 bee colonies). * - European breed standard based on values of cubital and hantel indexes [28]; ** - Russian breed standard].

Существование на одной территории (часто на одной пасеке) разных пород медоносной пчелы повышает уровень гибридизации медоносных пчел и создает неблагоприятный фон для сохранения генофонда среднерусской пчелы А. т. твШ/вта, первоначально культивируемой на территории Томской области. В отличие от многих стран Европы, где темная лесная пчела признана исчезающим подвидом и популяции А. т. твШ/вта являются уникальными [3, 10-14], на территории Томской области сохранились локальные популяции (пасеки) пчел, близких по комплексу признаков к среднерусской породе (рис. 3). Так, пчелиные семьи среднерусской породы выявлены на пасеках с. Могочино (Молчановский район), с. Чалково (Чаинский район), с. Тегульдет (Тегульдетский район), д. Дубровка (Зырянский район), с. Се- милужки и п. Заречный (Томский район). Исследованные пасеки в с. Мого- чино, с. Тегульдет и с. Чалково расположены на относительно изолированных территориях северных районов области (Молчановский, Тегульдетский и Чаинский районы соответственно) и рассматриваются как потенциально «чистые», хотя отмечен единичный завоз пчел южного происхождения в эти районы. Пасеки в д. Дубровка, с. Семилужки и п. Заречный расположены в южных районах области (Зырянский и Томский), характеризующихся хорошо развитым пчеловодством и близким расположением пасек друг к другу. Вместе с тем пасека в п. Заречный (Томский район) существует более 50 лет и специализируется на разведении среднерусских пчел (по словам пчеловода, на пасеку в течение длительного времени не завозились новые семьи и постоянно проводится контроль породности семей).

В условиях повсеместной гибридизации пчел необходимо совершенствовать генетические методы контроля чистоты пчелосемей. Эти исследования требуют молекулярных подходов как наиболее информативных и надежных. Так, исследования, контролирующие интрогрессию между эндемической А. т. теЫ^ет и интродуцированными подвидами С-линии на территории Европы и России, проводились с использованием локусов мтДНК и микро- сателлитных локусов, ПЦР-ПДРФ и SNP маркеров [10-13, 32, 34, 35, 40, 44]. На основании широкомасштабных исследований, выполненных на территории Европы (поиск информативных маркеров был проведен из числа более 1 000 SNP с применением 5 различных аналитических методов), было разработано 5 панелей, состоящих из 48, 96, 144, 192 и 284 маркеров, информативных для определения предкового происхождения особей, которые авторы предлагают использовать для выявления и оценки примеси С-линий (в частности, А. т. 1щшиса и А. т. сагпгса, а также сочетание этих подвидов) в М-линию А. т. теЫ^ет [13, 32]. Однако, для оценки примеси других подвидов линии С и/или их сочетаний (а также более сложных комбинаций) в М-линию требуется тестирование разработанных панелей. Наконец, уменьшенные варианты панелей (48 или 96 маркеров) не подходят для стандартного генетического анализа популяций, в том числе для определения аллельного разнообразия или для оценки изоляции расстоянием, генетического дрейфа или эффекта «горлышка бутылки» [13].

В настоящем исследовании для оценки характеристики генетического разнообразия медоносных пчел, обитающих на пасеках Томской области, а также оценки процесса гибридизации пчел проведен анализ вариабельности микросателлитных локусов у медоносных пчел.

Рис. 3. Распределение пород и гибридов медоносной пчелы на пасеках Томской области согласно результатам анализа мтДНК и морфометрических показателей [Fig. 3. Distribution of honeybee subspecies and hybrids at apiaries of Tomsk region according to the analysis of mtDNA and morphometric parameters]

Разнообразие медоносных пчел Томской области по микросателлитным локусам

Для характеристики генетического разнообразия медоносных пчел, обитающих на территории Томской области, и выявления высокополиморфных

ДНК-маркеров была изучена изменчивость 9 микросателлитных локусов (А008, АСЮ, А043, А113, А024, Ар243, Ар049, НПО, SVI85) (табл. 2). Были сформированы четыре выборки, включающие образцы чистопородных и гибридных пчел:

среднерусские пчелы, полученные от семей А. т. твШ/вга и имеющие варианты PQQ или PQQQ локуса С01-С011 мтДНК (М-линия); регистрировалось соответствие стандарту породы по морфометрическим признакам;

карпатские пчелы, полученные от семей А. т. саграШса, завезенных на территорию области из пчелопитомника, и имеющие вариант Q локуса С01-С011 мтДНК (С-линия); регистрировалось соответствие стандарту породы по морфометрическим признакам;

пчелы, полученные от гибридных семей на основе среднерусской породы (выявлены варианты PQQ или PQQQ локуса С01-С011 мтДНК, однако наблюдается несоответствие морфометрических показателей стандарту среднерусской породы);

пчелы, полученные от гибридных семей на основе карпатской породы (выявлен вариант Q локуса С01-С011 мтДНК, однако наблюдается несоответствие морфометрических показателей стандарту карпатской породы).

Все исследованные локусы были полиморфными: минимальное число аллелей зарегистрировано для локуса АС117 (4 аллеля); максимальное - для локуса А113 (15 аллелей); среднее число аллелей на локус - 8. Для пчел среднерусской породы минимальное число аллелей выявлено для локуса Н110 (3 аллеля), максимальное - для локуса А113 (11 аллелей); для пчел карпатской породы минимальное число аллелей выявлено для локуса Ар243 (1 аллель); максимальное - для локуса А008 (9 аллелей); среднее число аллелей на локус для обеих пород составило 5. Кроме того, изученные локусы отличались по вариабельности спектра аллелей у пчел двух выборок (среднерусская и карпатская породы). Например, по локусу Ар243 у пчел карпатской породы зарегистрирован только один аллель «255» (все исследованные особи были гомозиготными), тогда как у пчел среднерусской породы выявлено 8 аллелей.

В результате сравнительного анализа вариабельности изученных микро- сателлитных локусов у чистопородных пчел (среднерусских и карпатских пчел) для большинства локусов выявлены различия по спектру и/или частоте регистрации аллелей между подвидами. Кроме того, для некоторых локусов (А008, А043, А113, А024 и Ар049) зарегистрированы преобладающие аллели (встречались с частотой более 0,40), спектр которых отличался у пчел разных эволюционных линий (М и С) (см. табл. 2). Так, для локуса А008 преобладающим аллелем у А. т. твШ/вга (линия М) был аллель «162» (частота регистрации 0,87), тогда как у А. т. саграШса (линия С) - аллель «174» (частота регистрации 0,46); для локуса А113 преобладающий аллель у А. т. саграШса - «212» (частота регистрации 0,91), у А. т. твШ/вга - аллель «218» (частота регистрации 0,57).

Таблица 2 [Table 2] Частота регистрации (±ошибка) преобладающих аллелей 9 микросателлитных локусов у пород медоносной пчелы (Apis mellifera mellifera и Apis mellifera carpathica) и г...